一株猴头菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株猴头菌及其应用。本发明公开了一株猴头菌，其保藏号为CGMCC?No.9224。本发明公开的培养保藏编号为CGMCC?No.9224的猴头菌(Hericium?erinaceus)L547的操作简单、成本低廉、产量高，可达1.2％(按照固体培养基干重量计算)。本发明所公开的L547及其发酵液的提取物具有降血糖和抗肿瘤作用，具有广阔的应用前景。
【专利说明】—株猴头菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株猴头菌及其应用，属于制药领域。
【背景技术】
[0002]猴头菌又名猴头、猴头菇、猴头蘑等，是一种大型真菌，属担子菌纲、多孔菌目、齿菌科、猴头属。据报道，猴头菌所含有丰富的营养成分:蛋白质、脂肪、纤维素、多糖、氨基酸等(袁亚宏，岳田利，王云阳等。猴头菇营养液提取工艺研究。中国食品学报，2005，2，65-68。)。猴头菌在临床上应用于胃肠疾病治疗，主要治疗胃炎、十二指肠溃疡等，制作了猴头糖浆、猴头饼干、猴头菇菌片等。目前研究最多的是猴头菌多糖，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂等生理功能(陈明。抗癌菌类药常用种类及近代研究进展。食用菌，1994,40-41。卢耀环，李长砺，周于奋。猴头菇对小鼠抗疲劳作用的实验研究。生理学报，1996,98-101。)另外猴头菌还有增进食欲、增强胃粘膜屏障机能、提高淋巴细胞转化率，提升白细胞等作用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一株猴头菌及其应用。
[0004]本发明提供一株猴头菌，其保藏号为CGMCC N0.9224。
[0005]上述猴头菌的菌丝体及菌丝体的发酵物及其发酵物的提取物也属于本发明的保护范围。
[0006]一种制备上述发酵物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:将所述猴头菌的菌丝体在液体培养基中进行培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到固体培养基中进行培养，得到所述发酵物；
[0007]所述液体培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为葡萄糖、麦芽提取物和酵母提取物；所述葡萄糖在所述液体培养基中的浓度为3.0-6.0g/L,所述麦芽提取物在所述液体培养基中的浓度为8.0-10.0g/L，所述酵母提取物在所述液体培养基中的浓度为
2.0-5.0g/L ；
[0008]所述葡萄糖在所述液体培养基中的浓度具体为4.0g/L，所述麦芽提取物在所述液体培养基中的浓度具体为10.0g/L，所述酵母提取物在所述液体培养基中的浓度具体为
4.0g/L ；
[0009]所述麦芽提取物购自北京索莱宝科技有限公司；
[0010]所述酵母提取物购自北京索莱宝科技有限公司；
[0011]所述在液体培养基中进行培养的条件为25-28°C，避光，培养7-10天，具体为25°C，避光，培养7天或10天；
[0012]所述固体培养基为如下(1)-(6)任一所示的米和水按照SO-1OOg =10rnl的比例组成:
[0013](I)大米；
[0014](2)糙米；
[0015](3)糯米；
[0016](4)薏米；
[0017](5)紫米；
[0018](6)黑米；
[0019]所述固体培养基中所述米与所述水的比例具体为80g:100ml ；
[0020]所述将种子培养液接种到固体培养基中进行培养的条件为25_28°C，避光，培养30-50天，具体为25°C，避光，培养30天或40天；
[0021]所述种子培养液与所述固体培养基中所述米的比例为10ml:80_100g ;
[0022]所述菌丝体是将所述的猴头菌接种到PDA培养基上进行预培养得到的；
[0023]所述预培养的条件为25_28°C，避光，培养直到菌丝体长满PDA培养基表面，具体为25°C，避光，培养直到菌丝体长满PDA培养基表面。
[0024]一种制备上述提取物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:将上述发酵物冻干，再将其用体积百分含量为90-98%的乙醇水溶液95-105?进行回流提取，得提取液，即得。
[0025]上述方法中，所述发酵物冻干后与所述乙醇水溶液的比例为Ig:3-5ml ；
[0026]所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为95% ；
[0027]所述回流提取的温度为100°C ;
[0028]所述提取的次数为3-4次，具体为3次；
[0029]所述回流提取的时间为50_70min/次，具体为60min/次。
[0030]一种培养基也属于本发明的保护范围，由如下(1)-(6)任一所示的米和水按照80-100g:100ml的比例组成:
[0031](I)大米；
[0032](2)糙米；
[0033](3)糯米；
[0034](4)薏米；
[0035](5)紫米；
[0036](6)黑米。
[0037]上述培养基中，所述米与所述水的比例为80g:100ml。
[0038]上述猴头菌、上述菌丝体或发酵液或提取物在制备预防和/或治疗糖尿病的产品或抑制血糖升高的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0039]上述猴头菌、上述菌丝体或发酵液或提取物在制备预防和/或治疗癌症的产品或抑制癌细胞生长和/或增殖的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0040]上述应用中，所述癌为肝癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、血癌、胃癌或乳腺癌;
[0041]所述癌细胞具体为肝癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结直肠癌细胞、宫颈癌细胞、白血病细胞、胃癌细胞或乳腺癌细胞，再具体为人肝癌细胞、人前列腺癌细胞、人肺癌细胞、人结直肠癌细胞、人宫颈癌细胞、人白血病细胞、人胃癌细胞或人乳腺癌细胞；
[0042]所述人肝癌细胞具体为人肝癌细胞!fepG2， 所述人前列腺癌细胞具体为人前列腺癌细胞PC3,所述人肺癌细胞具体为人肺癌细胞A549、所述人结直肠癌细胞具体为人结直肠癌细胞HCT-15、所述人宫颈癌细胞具体为人宫颈癌细胞HeLa、所述人白血病细胞具体为人白血病细胞K562、所述人胃癌细胞具体为人胃癌细胞SGC-7901、所述人乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞MCF-7。
[0043]本发明提供的培养保藏编号为CGMCC N0.9224的猴头菌(Hericium erinaceus)L547的操作简单、成本低廉、产量高，可达1.2% (按照固体培养基干重量计算)。本发明提供的L547及其发酵液的提取物具有降血糖和抗肿瘤作用，具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1为L547中分离得到的11个化合物。
[0045]图2为L547发酵物HE-El的高效液相色谱图。
[0046]图3为L547发酵物HE-E2的高效液相色谱图。
[0047]图4为L547发酵物HE-E3的高效液相色谱图。
[0048]图5为L547发酵物HE-E4的高效液相色谱图。
[0049]图6为L547发酵物HE-E5的高效液相色谱图。
[0050]图7为L547发酵物HE-E6的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0051 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0052]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053]α-葡萄糖苷酶购自Sigma，货号为G5003。
[0054]4-硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷购自北京百灵威科技有限公司，货号为270305。
[0055]链脲霉素购自北京百灵威科技有限公司，货号为Μ02540。
[0056]wistar雄性大鼠(SPF级)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0057]闻糖闻脂词料:由基础鼠词料(购自北点维通利华实验动物技术有限公司)、鹿糖、炼猪油和蛋黄组成；所述猪油在所述高糖高脂饲料中的质量百分含量为18%，所述蔗糖在所述闻糖闻脂词料中的质量百分含量为20% ,所述蛋黄在所述闻糖闻脂词料中的质量百分含量为3%，所述基础鼠饲料在所述高糖高脂饲料中的质量百分含量为59%。
[0058]麦芽提取物购自北京索莱宝科技有限公司。
[0059]酵母提取物购自北京索莱宝科技有限公司。
[0060]人肝癌细胞!fepG2购自ATCC，产品目录号为HB-8065。
[0061]人前列腺癌细胞PC3购自ATCC，产品目录号为CRL-1435。
[0062]人肺癌细胞A549购自ATCC，产品目录号为CCL-185。
[0063]人结直肠癌细胞HCT-15购自ATCC，产品目录号为CCL-225。
[0064]人宫颈癌细胞Hela购自ATCC，产品目录号为CCL-2。
[0065]人白血病K562细胞购自中山医科大学实验动物中心。
[0066]人胃癌细胞SGC-7901购自ATCC，产品目录号为SGC-7901。
[0067]人乳腺癌细胞MCF-7购自ATCC，产品目录号为HCC1428。
[0068]实施例1、菌的培养、化合物的制备及功能评价
[0069]猴头菌菌株L547已于2014年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC N0.9224，分类命名为猴头菌(Hericium erinaceus)。
[0070]一、菌株活化
[0071]将猴头菌菌株L547菌种接种到PDA培养基的斜面上，进行预培养，预培养的条件为:25°C，避光，培养7天(25°C _28°C，避光，培养7_10天均可)。
[0072]二、种子培养
[0073]在步骤一的预培养中，待菌丝长满整个斜面后，在无菌条件下将菌丝体转接到PDA如下液体培养基中进行培养，得到种子培养液。培养的条件为:25°C，避光，培养7天(25 0C -28 0C，避光，培养7_10天均可)。
[0074]液体培养基:葡萄糖4.0g/L, Malt Extract (麦芽提取物)10.0g/L,YeastExtract (酵母提取物)4.0g/L,余量为水。
[0075](上述液体培养基中，葡萄糖3.0-6.0g/L, Malt Extract (麦芽提取物)8.0-10.0g/L, Yeast Extract (酵母提取物)2.0-5.0g/L 均可)
[0076]三、发酵培养
[0077]液体培养基培养7天后，取1ml步骤二得到的种子培养液分别接种到装有80g(80-100g均可)大米的如下固体培养基的500ml三角瓶中，共重复接种20瓶，25°C，避光，培养40天(25°C -28°C，避光，培养30-50天均可)，得到L547的发酵物。
[0078]固体培养基:由80g大米和10ml水组成。
[0079](上述固体培养基中，大米与水的比例在80_100g:100ml均可)
[0080]四、提取物的制备
[0081]将步骤三得到的L547发酵物冷冻干燥，称重，重量为1800克。用6L体积百分含量95% (90% -98%均可)乙醇的水溶液(发酵物与乙醇的水溶液的比例为Ig:3-5ml均可)，100C (95 0C -105°c均可)回流提取3次(3-4次均可)，每次I小时(50_70min均可)，合并乙醇提取液，减压浓缩干燥得到19.6克提取物，将提取物记作HE-E1。
[0082]五、化合物的分离纯化
[0083](一 )将粗提物HE-El通过硅胶柱色谱分离，先用200g硅胶装柱(柱子为直径5cm，高40cm的玻璃柱)，再将15gHE_El用甲醇溶解与15g硅胶拌样，进行上样。以正己烷:乙酸乙酯体系(正己烷:乙酸乙酯的体积比为1:0，50:1,30:1,20:1,15:1，10:1，4:1,2:I)，二氯甲烷:甲醇体系(二氯甲烷:甲醇的体积比为1:0，100:1,50:1,30:1,20:1,10:1，5:1)依次进行梯度洗脱，每个梯度洗3个保留体积，每个体积500ml，根据薄层层析色谱行为分析，在正己烷:乙酸乙酯(体积比为1:0)体系得到馏分I ;在正己烷:乙酸乙酯(体积比为50:1)中得到馏分2，3，4;在正己烷:乙酸乙酯(体积比为30:1)中得到馏分5，6，7;在正己烷:乙酸乙酯(体积比为20:1)中得到馏分8，9，10;在正己烷:乙酸乙酯(I体积比为10:1)中得到馏分11，12 ;在正己烷:乙酸乙酯(体积比为4:1)中得到馏分13，14 ;在正己烷:乙酸乙酯(体积比为2:1)中得到馏分15 ;在二氯甲烷:甲醇(体积比为1:0)中得到懼分16 ;在二氯甲烷:甲醇(体积比为100:1)中得到馏分17 ;在二氯甲烷:甲醇(体积比为50:1)中得到馏分18 ;在二氯甲烷:甲醇(体积比为30:1)中得到馏分19 ;在二氯甲烷:甲醇(体积比为20:1)中得到馏分20;在二氯甲烷:甲醇(体积比为10:1，5:1)中得到馏分21 ;共得到21个馏分，将各馏分冷冻干燥后，分别命名为HE-El-1至HE-E1-21。
[0084](二)HE-E1-12(1.45g)利用LH20凝胶柱层析进行分离，上样前先饱和层析柱(层析柱直径为1cm，高为50cm，柱填料LH20的质量为40g)，用体积百分含量50 %的甲醇水溶液将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，半小时后打开开关，流出500ml洗脱液；随后以3ml体积百分含量50%的甲醇水溶液将HE-E1-12(1.45g)样品溶解，湿法上柱，加入洗脱剂(体积百分含量50%的甲醇水溶液)洗脱，15ml收集一个洗脱液，接取得到洗脱液后通过TLC点板监测，监测过程中通过照射254nm紫外灯判断不同馏分，得到15个馏分，将各馏分冷冻干燥后，分别命名为HE-E1-12-1至HE-E1-12-15。其中，HE-E1-12-6为第120_150ml洗脱收集的馏分，HE-E1-12-12为260-300ml洗脱收集的馏分。
[0085]对馏分HE-E1-12-6以体积百分含量65%甲醇的水溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，收集24.5分钟的色谱峰，得到化合物6 ;对馏分HE-E1-12-12以体积百分含量70%甲醇的水溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，收集32分钟的色谱峰，得到化合物11。
[0086]上述HPLC的其余条件如下:
[0087]以色谱甲醇将样品配制为10mg/ml的溶液，上样量为15ul,色谱柱为Kromasil10 X 250mm C18半制备柱，柱温为25°C，21nm波长进行检测。
[0088](三)HE-E1-19(3.45g)利用ODS反相硅胶柱分离，先用50g0DS反相硅胶装柱(柱子的直径为3cm，高为30cm)，再将HE-E1-19 (3.45g)用甲醇溶解与5gODS反相硅胶拌样，进行上样。用体积百分含量为30 %，50 %，70 %，90 %甲醇的水溶液依次进行洗脱，每个洗脱体系洗3个保留体积，每个保留体积为100ml，根据薄层层析色谱行为，照射254nm紫外灯判断不同馏分，在体积百分含量为30%的甲醇水溶液中得到馏分1-5 ;在体积百分含量为50%的甲醇水溶液系统中得到馏分6-10(其中馏分10的洗脱体积为280-300ml);在体积百分含量为70%的甲醇水溶液系统中得到馏分11-16(其中馏分12的洗脱体积为60-100ml，馏分15的洗脱体积为220-250ml，馏分16的洗脱体积为260_280ml);在体积百分含量为90%的甲醇水溶液系统中得到馏分17-20 ;共得到20个子馏分，将各个馏分冷冻干燥，分别命名为 HE-E1-19-1 至 HE-E1-19-20。
[0089]对HE-E1-19-10以体积百分含量26%乙腈的酸水(此处的酸水为体积百分含量为
0.01%三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，收集26分钟的色谱峰，得到化合物I ;对册41-19-12以体积百分含量22%乙腈酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01%三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，分别收集23，25.2，27.1,29.2分钟的色谱峰得到化合物2,3,4,5 ;对HE-E1-19-15以体积百分含量30%乙腈酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01%三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，分别收集32，35.5分钟的色谱峰得到化合物7，8 ;对HE-E1-19-16以体积百分含量40%乙腈酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01%三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，收集26.1,27.5分钟的色谱峰得到化合物9，10。
[0090]上述HPLC的其余条件如下:
[0091]以色谱甲醇将样品配制为10mg/ml的溶液，上样量为15ul每次，色谱柱为Kromasil 10 X 250mm C18半制备柱，柱温为25°C，210nm波长进行检测
[0092]六、化合物的鉴定
[0093]通过应用各种现代波谱技术如质谱、红外、核磁共振技术鉴定了上述化合物1-11的结构式如图1所示，其中化合物1-5，7-10为新的异吲哚类化合物。
[0094]各化合物的NMR确证数据如表1-表3所示。
[0095]表1化合物2-4的NMR数据
[0096]
【权利要求】
1.一株猴头菌，其保藏号为CGMCC N0.9224。
2.权利要求1所述猴头菌的菌丝体及菌丝体的发酵物及其发酵物的提取物。
3.一种制备权利要求2所述发酵物的方法，包括如下步骤:将权利要求1所述猴头菌的菌丝体在液体培养基中进行培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到固体培养基中进行培养，得到所述发酵物； 所述液体培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为葡萄糖、麦芽提取物和酵母提取物；所述葡萄糖在所述液体培养基中的浓度为3.0-6.0g/L，所述麦芽提取物在所述液体培养基中的浓度为8.0-10.0g/L，所述酵母提取物在所述液体培养基中的浓度为2.0-5.0g/L ； 所述在液体培养基中进行培养的条件为25-28°C，避光，培养7-10天，具体为25°C，避光，培养7天或10天； 所述固体培养基为如下(1)-(6)任一所示的米和水按照SO-1OOg =10ml的比例组成:
(1)大米； (2)糙米； (3)糯米； (4)薏米； (5)紫米； (6)黑米； 所述固体培养基中所述米与所述水的比例具体为80g:100ml ； 所述将种子培养液接种到固体培养基中进行培养的条件为25-28°C，避光，培养30-50天，具体为25 °C，避光，培养30天或40天。
4.一种制备权利要求2所述提取物的方法，包括如下步骤:将权利要求2所述的发酵物冻干，再将其用体积百分含量为90-98%的乙醇水溶液95-105?进行回流提取，得提取液，即得。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述发酵物冻干后与所述乙醇水溶液的比例为Ig:3-5ml ； 所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为95% ； 所述回流提取的温度为100°C ； 所述提取的次数为3-4次，具体为3次； 所述回流提取的时间为50-70min/次，具体为60min/次。
6.一种培养基，由如下(1)-(6)任一所示的米和水按照80-100g:100ml的比例组成: (1)大米； (2)糙米； (3)糯米； (4)薏米； (5)紫米； (6)黑米。
7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于:所述米与所述水的比例为80g:100ml。
8.权利要求1所述的猴头菌，权利要求2所述的菌丝体或发酵液或提取物在制备预防和/或治疗糖尿病的广品或抑制血糖升闻的广品中的应用。
9.权利要求1所述的猴头菌，权利要求2所述的菌丝体或发酵液或提取物在制备预防和/或治疗癌症的产品或抑制癌细胞生长和/或增殖的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述癌为肝癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、血癌、胃癌或乳腺癌； 所述癌细胞具体为肝癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结直肠癌细胞、宫颈癌细胞、白血病细胞、胃癌细胞或乳腺癌细胞，再具体为人肝癌细胞、人前列腺癌细胞、人肺癌细胞、人结直肠癌细胞、人宫颈癌细胞、人白血病细胞、人胃癌细胞或人乳腺癌细胞。
【文档编号】A61P3/10GK104164370SQ201410394902
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】刘宏伟, 汪锴, 宝丽, 韩俊杰 申请人:中国科学院微生物研究所