一种猴头菌的培养基、生物转化菌丝体、生物转化菌丝体的提取物及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种猴头菌的培养基、生物转化菌丝体、生物转化菌丝体的提取物及其用途。该猴头菌的培养基是在基础培养基中加入中药半枝莲，包括基础培养基和半枝莲，每100份的培养基中包括基础培养基70～50份，半枝莲30～50份；所述基础培养基包括如下重量份的各组分：麦麸490～350份，玉米粉140～100份，谷糠63～45份，白糖7～5份，水400～600份。该生物转化菌丝体是将猴头菌接入上述培养基经菌丝转化培养所得的产物。该生物转化菌丝体的提取物是将猴头菌丝体经水提后再减压浓缩，最后真空冷冻干燥而制备出来的。该生物转化菌丝体的提取物具有抗胃肠道癌作用，作用明显优于猴头菌丝体或半枝莲的抗胃肠道癌作用，可用于制备抗胃肠道癌药物。
【专利说明】
-种猴头菌的培养基、生物转化菌竺体、生物转化菌竺体的提 取物及其用途
技术领域
[0001] 本发明设及生物制药技术领域，特别设及一种猴头菌的培养基、生物转化菌丝体、 生物转化菌丝体的提取物及其用途。
【背景技术】
[0002] 猴头菌是一种猴头菌科磨茹(真菌），在中药用于治疗胃肠道疾病已经超过2000年 的历史了，一系列小分子化合物如erinacines，被认为具有神经再生，并且可W透过血脑屏 障修复受损神经组织。猴头菌还有抗溃瘍，抗炎，抗微生物，免疫调节，提高肝功能，抗衰老， 降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加屯、脏输出、和改善备注循环等作用，包含猴头菌的 医用制剂在中国广泛使用。
[0003] 猴头菌丝体中的活性物质最重要的是多糖及糖蛋白，目前国内外对猴头多糖的研 究表明，猴头菌多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨隧细胞的吞隧功能，促进溶血 素的形成，抗白细胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌多糖备 受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。《中国 药典》记载了猴头菌丝体(参见2015年版一部的第1614-1615页），本发明所述的猴头菌丝体 就是该标准记载的猴头菌丝体。
[0004] 当前，从高等真菌及其培养物中进行筛选和发现活性成分，应用于抗肿瘤、抗病 毒、和治疗糖尿病等，不仅成为国家重点研究新药的发展方向，也是当今世界各国开发生物 医药的热点。但是，目前并未见到中药作为猴头菌的培养基经过生物转化后的新型药用菌 丝体应用于胃肠道癌的报道。
[0005] 半枝莲(学名：Scutellaria barbata D.Don)，别称:半支莲(植物学大辞典）、松叶 牡丹、龙须牡丹、金丝杜酷、洋马齿宽、太阳花、午时花，是马唇形科黄琴属多年生草本植物。 半支莲全草入药，具有清热解毒、活血桂疲、消肿止痛、抗癌等功能。性寒味酸，全草含多种 维生素、微量元素及氨基酸等成分。有凉血解毒，散疲止痛，消肿和清热利湿之功效。半枝莲 含有生物碱、黄酬类武、酱体W及酪类、较质等。其所含的半枝莲素，系一种黄酬类化合物 (2，5-二径基-6，7，8-S甲氧基黄酬），此外，还有另两种黄酬类化合物汉黄等素（5，7-二径 基-8甲氧基黄酬)和5-径基-7,8-二甲氧基黄酬。动物实验证实，半枝莲对肉瘤180、艾氏腹 水癌、脑瘤22等均有一定抑制作用。
[0006] 日本学者在通过体外实验对800种中药作抗肿瘤活性筛选时发现有88种中药对肿 瘤细胞增殖的抑制率在90% W上，其中半枝莲对JTc-26瘤细胞体外抑制率达100%，其对正 常细胞的抑制率则仅为50%。在观察运些中药的临床抗肿瘤疗效时发现，即使是对治疗乏 术的晚期肿瘤，亦有改善症状、抑制肿瘤增殖和延长患者生命的作用。实验还证实，用美蓝 试管法，半技莲对急性粒细胞型白血病细胞有轻度抑制作用；用细胞呼吸法，对急性粒细胞 型白血病细胞和抑制率大于75%。半枝莲制剂还对W256.U14.S186.EAC、ESC等动物肿瘤均 有一定抑制作用。除抗癌作用外，半枝莲还有抑菌、利尿、止咳、平喘等多种药理作用。
[0007] 胃肠道癌如肝癌、胃癌、结直肠癌是最常见的癌症之一，据美国癌症学会估计约占 所有癌症的25%。胃癌在世界上发病率在癌症中位于第四位，中国有很高的发生率和死亡 率(50%的死亡病例发生在中国），胃肠道癌的治疗包括手术、化学药物治疗、放射治疗与免 疫疗法。化学治疗是最常用的方法，虽然无法彻底治疗。过去的几十年里，分子生物学的发 展在胃癌的治疗上取得了一定的进展，但药物耐受和毒性依然限制了治疗方法的进步。
[0008] 生物转化"菌丝体"是指利用菌丝体(包括真菌）的代谢功能，使有机物分解的生物 化学反应过程。W适宜的培养基为营养，通过菌丝体的生长代谢和生命活动产生丰富的次 生代谢产物。借鉴中医药组方思想，将单味中药、具有类似或协同作用的中药作为部分培养 基进行菌丝体转化，不同菌株诱变"次生"代谢不同的生物活性成分，再实行"定向培养、双 向转化"生物转化工艺，可获得不同生物活性物质原料，目的是增强功效或者降低药物毒副 作用。
【发明内容】
[0009] 本发明旨在克服现有技术的不足，跨学科创新，结合微生物学、中药学等多学科， 提供一种新原料(半枝莲)作为猴头菌的培养基成分，即本发明的目的在于提供一种生物转 化菌丝体、生物转化菌丝体的提取物及其用途。所述生物转化菌丝体的提取物的制备方法 简单，成本较低，提取物用于制备抗胃肠道癌药物。
[0010] 基于上述目的，本发明的一种猴头菌的培养基，包括基础培养基和半枝莲，每100 份的培养基中包括基础培养基70~50份，半枝莲30~50份;所述基础培养基包括如下重量 份的各组分：
[0011] 麦教490~350份，玉米粉140~100份，谷慷63~45份，白糖7~5份，水400~600份。
[0012] 在本发明中，优选的，所述基础培养基包括如下重量份的各组分：
[0013] 麦教420份，玉米粉120份，谷慷54份，白糖6份，水500份。
[0014] 在本发明中，优选的，每100份的培养基中包括基础培养基60份，半枝莲40份;所述 基础培养基包括如下重量百分数的各组分:麦教70%、玉米粉20%、谷慷9%、白糖1%。此为 最佳猴头菌培养基配比。
[0015] 本发明还提供了一种生物转化菌丝体，将猴头菌类菌株接种至所述的培养基中， 在20~27°C下，培育30~40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体。
[0016] 在本发明中，优选的，所述猴头菌类菌株为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers。
[0017] 在本发明中，优选的，所述猴头菌科真菌猴头菌化ricium e;rinaceum(Bull. ex 化.化ers.的菌丝体与其附生含有半枝莲成份的固体培养基的干燥混合物。
[0018] 进一步的，本发明还提供了一种生物转化菌丝体的提取物，所述提取物通过W下 步骤制备得到：
[0019] (1)将所述的生物转化菌丝体进行水提，50-70°C下用水浸泡2-3次，每次浸泡2-5 小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的6~10倍，得到提取液；
[0020] (2)将步骤（1)中的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在50-70°C条件下 抽真空干燥，即得生物转化菌丝体的提取物。
[0021 ]在本发明中，优选的，所述用水浸泡的溫度为60°C ;将减压浓缩所得的浓缩液在60 °c条件下抽真空干燥。
[0022] 更进一步的，本发明还提供了所述的生物转化菌丝体的提取物在制备抗胃肠道癌 药物中的用途。
[0023] 在本发明中，优选的，所述胃肠道癌为食管癌、胃癌、结肠癌或肝癌。
[0024] 本发明的生物转化菌丝体的提取物采用简单的处理工艺制备得到，其抗肿瘤效果 就达到预料不到的技术效果，经生物转化的"菌丝体"的抗肿瘤效果好于所有的天然植物来 源的中药材，如果进一步分离纯化富集有效成分，其抗肿瘤效果将更好，可用于制备抗胃肠 道癌药物。
[0025] 猴头菌是一种药用真菌，能很好地吸收培养基中营养，彻底转化培养基，产生新的 活性物质及代谢物，为此，本发明将中药半枝莲加入到猴头菌的基础培养基中，作为猴头菌 的培养基成分之一，并对中药材半枝莲渗入猴头菌的培养基的比率进行调配，最终选择中 药材半枝莲最佳渗入的比率为40%。半枝莲占40%比率时，菌丝体生长情况较好，总黄酬、 野黄琴巧含量较高。
[0026] 猴头菌对半枝莲进行中药菌丝体转化，得到新的菌丝体。本发明对所得的生物转 化菌丝体进行提取，得到的生物转化菌丝体的提取物进行了体外抗胃肠道肿瘤细胞活性筛 选试验，水提样品WIC50值和Emax为评价指标，试验结果表明：生物转化菌丝体的提取物对 胃肠道肿瘤细胞均有较好的抑制作用，体外抗癌作用由强到弱为:生物转化菌丝体〉半枝莲 药材〉猴头菌丝体 > 猴头菌丝体+半枝莲，该生物转化菌丝体的提取物抗胃肠道癌作用明显 优于猴头菌丝体或半枝莲的抗胃肠道癌作用，而且生物转化菌丝体的IC50值大于单独半枝 莲药材和单独猴头菌丝体的IC50值之和，Emax大于单独半枝莲药材和单独猴头菌丝体的 Emax之和，运说明猴头菌中丰富的酶系通过结构修饰或降解作用，把半枝莲中的活性成分 转化成活性更强的成分，或增强了半枝莲中的活性成分(如总黄酬）的产量，或把非活性成 分转化成活性成分，活性成分相互促进达到增强抗癌功效的目的；同时进行人胃癌(MGC80- 3)移植裸小鼠体内抑瘤试验，试验结果表明：生物转化菌丝体的提取物对人胃癌(MGC80-3) 荷瘤裸鼠具有明显的抑瘤作用。因此，生物转化菌丝体的提取物可用于制备抗胃肠道癌药 物。
[0027] 本发明低溫水浸泡生物转化菌丝体，在50-70°C下水浸泡，无高溫破坏，既能溶解 有效成分但又不破坏有效成分;50-70°C减压浓缩，不会破坏有效成分，特别是活性酶类物 质;为了不影响有关活性物质，本发明优选采用60°C条件下抽真空干燥。
【附图说明】
[002引图1为皿-4体内抗胃癌MGC80-3移植瘤疗效和动物毒性图；
[0029] 图2为皿-4对人胃癌移植荷瘤裸鼠瘤体抑瘤影响图；其中，注:给药后Di〇;A.模型对 照组;B.皿-4低剂量组;C.皿-4中剂量组;D.皿-4高剂量组;E.氣尿喀晚组;F.氣尿喀晚+HB- 4组;G 皿-4(2000mg/kg)组；
[0030] 图3为皿-4对人胃癌移植荷瘤裸鼠瘤体解剖图；
[0031] 图4为皿-4体内抗胃癌MGC80-3移植瘤体重下降率的影响结果图。
【具体实施方式】
[0032] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，W下结合具体实施例，对本发 明进一步详细说明。
[0033] 实施例1
[0034] -种生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：
[0035] (1)取农副产品麦教490g、玉米粉140g、谷慷63g、白糖7g，W及中药材半枝莲粗粉 (半枝莲)300g，混匀，加入500g水拌匀，即得猴头菌的培养基。再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在 27 °C条件下转化培养40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；
[0036] (2)取生物转化菌丝体，60°C水浸泡2次，每次浸泡2小时，水的重量为生物转化菌 丝体重量的6倍，得到提取液；
[0037] (3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60°C条件下抽 真空干燥，即得提取物。
[003引实施例2
[0039] -种生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：
[0040] (1)取农副产品麦教420g、玉米粉120g、谷慷54g、白糖6g，w及中药材半枝莲粗粉 (半枝莲)400g，混匀，加入500g水拌匀，即得猴头菌的培养基;再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在 20°C条件下转化培养40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；
[0041 ] (2)取生物转化菌丝体，60°C水浸泡3次，每次浸泡3小时，水的重量为生物转化菌 丝体重量的8倍，得到提取液；
[0042] (3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60°C条件下抽 真空干燥，即得提取物。
[0043] 实施例3
[0044] -种生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：
[0045] (1)取农副产品麦教350g、玉米粉lOOg、谷慷45g、白糖5g，W及中药材半枝莲粗粉 (半枝莲)500g，混匀，加入500g水拌匀，即得猴头菌的培养基;再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在 25 °C条件下转化培养30天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；
[0046] (2)取生物转化菌丝体，60°C水浸泡3次，每次浸泡4小时，水的重量为生物转化菌 丝体重量的10倍，得到提取液；
[0047] (3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60°C条件下抽 真空干燥，即得提取物。
[004引实施例4半枝莲渗入比例试验
[0049]基础培养基投料W干料计，比率固定为:麦教70 %、玉米粉20%、谷慷9%、白糖1 % (不包括水）。本发明把中药材半枝莲作为培养基成分之一，中药材半枝莲渗入的比率分别 占猴头菌培养基总量的30%、40%、50 %，设计实验方案，总投料5000g，分别按上述实施例 1、实施例2、实施例3所述的步骤配制培养基，加水500g混匀、灭菌、接种、培养，平行对照，培 养条件完全一致，培养过程中观察菌丝体生长状况、生长周期、污染情况、生长速度，挖瓶后 烘干称重计算收率，检测样品中的纤维素酶、麦角酱醇含量(考察转化是否彻底）、总黄酬含 量、野黄琴巧含量，干燥后的样品分别标注为皿-1、皿-2、皿-3。试验结果统计如下表1所示： [(K)加]表1 「AAC 4 I
[0052] 试验结果表示:半枝莲占 50%时污染率高、生长速度慢、生长周期长、纤维素酶麦 角酱醇含量低，生物转化不彻底;而半枝莲占 30 %时生长速度较快、生长周期短，但总黄酬、 野黄琴巧含量低;半枝莲占 40 %比率时最为合适，菌丝体生长情况较好，兼顾各优势，为最 佳比率。
[0053] 实施例5体外抗胃肠道肿瘤细胞活性筛选试验
[0化4] 1.试验材料
[0化5] 1.1细胞株
[0056]人食管癌细胞6〇曰-109、人胃癌细胞16〔80-3、人结肠癌细胞1〇￥〇购自于中科院上 海细胞库，高转移人肝癌细胞株MHCC97-H购自于上海复祥生物科技有限公司。
[0化7] 1.2供试品
[005引样品编号:HTJ表示猴头菌丝体，B化表示半枝莲中药材，HTJ+B化表示60%的猴头 菌丝体+40%半枝莲中药材，皿-3、皿-4、皿-5分别表示猴头菌的培养基中半枝莲渗入比例 为30 %、40%、50%的生物转化菌丝体。上述样品平行操作进行如下处理:60°C水浸泡3次， 每次浸泡4小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的10倍;将提取后获得的提取液减压浓 缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60°C条件下抽真空干燥，即得五种提取物，分别编号为HTJ， BZL，HT J+BZL，皿-3，皿-4，皿-5。
[0化9] 1.3阳性对照品
[0060] 注射用顺销(孤P)，由齐鲁制药有限公司生产，批号：1100331DB;10mg/瓶。
[OOW] 1.4主要试剂
[0062] 高糖DMEM培养基，HyClone公司，批号NXJ0709，500ml/瓶;胎牛血清，HyClone公司， 批号NXC0582，500ml/瓶;嚷挫蓝，sigma公司，批号M邸H7489V，Ig/瓶;二甲亚讽，国药集团化 学试剂有限公司，批号20120705,500ml/瓶;膜蛋白酶，北京鼎国昌盛生物技术有限公司，批 号 04D10151，25g/瓶。
[0063] 1.5主要仪器
[0064] CJ-IF型医用净化工作台（中屯、编号058,苏州冯氏实验动物设备有限公司）；台式 低速离屯、机（中屯、编号101，湖南省凯达实业发展有限公司）；DMIL型倒置显微镜（中屯、编号 027,Leica);3111型C〇2培养箱（中屯、编号147 JhermohMR-QSA酶标仪（中屯、编号007,深圳 迈瑞）；无菌针式过滤器(millipore)。
[00化]2.试验方法
[0066] 2.1细胞培养与接种
[0067] 6。日-109、]\?^：80-3、]\^〇：97-山1^〇￥〇肿瘤细胞株在37°(：、5%〇)2的饱和湿度环境下， 含10 %胎牛血清的高糖DMM完全培养基中培养、传代。接种时用0.25 %膜蛋白酶消化液消 化，加细胞培养基吹打成均匀细胞悬液，将细胞制成5 XioVml的细胞悬液，每孔10化1接种 于96孔板中。
[0068] 2.2供试品配制与细胞生长抑制测定
[0069] 称取一定量供试品，用DMEM完全培养基配制成5000iig/ml的最高浓度工作液，用 0.22皿无菌针式过滤器过滤除菌，然后依次配制成1500、500、150、50、15iig/ml的工作液。 DDP用DMEM完全培养基配制成浓度为50、15、5、1.5、0.75、0.1化邑/1111的工作液。待细胞贴壁 后换用含不同浓度供试品和DDP的工作液，每个浓度设3个复孔。分别于加药后48小时后，每 孔加MTT溶液(培养基配成5mg/ml，过滤后避光保存）2化1，4小时后将上清液吸出，每孔加 MlT溶解液DMSO 15化1，震荡待化rmazan完全溶解，酶标仪492nm测定OD值。
[0070] 3.试验结果
[0071 ]如下表2中见，各样品对4种肿瘤细胞均有较好的抑制作用，W皿-4号效果最佳。
[0072] 表2不同HTJ培养物体外抗胃肠道肿瘤细胞活性筛选结果
[0073]
[0074] 从表2中可W看出，体外抗癌活性由强到弱为:生物转化菌丝体〉半枝莲药材〉猴头 菌丝体 > 猴头菌丝体+半枝莲，而且生物转化菌丝体的IC50值大于单独半枝莲药材和单独 猴头菌丝体的IC50值之和，Emax大于单独半枝莲药材和单独猴头菌丝体的Emax之和，结合 实施例4的结果说明猴头菌中丰富的酶系可能通过结构修饰或降解作用，把半枝莲中的活 性成分转化成活性更强的成分，或增强了半枝莲中的活性成分(如总黄酬）的产量，或把非 活性成分转化成活性成分，活性成分相互促进达到增强抗癌功效的目的。
[0075] 实施例6皿-4号样品提取物对人胃癌(MGC80-3)移植裸小鼠体内抑瘤试验
[0076] 1.实验材料
[0077] 1.1 药品 [007引1.1.1供试品
[0079] 皿-4号样品提取物，规格：126. Ig/袋;批号：20150723,由湖南新汇制药股份有限 公司提供。
[0080] 1.1.2阳性对照品
[0081] 氣尿喀晚注射液(批号:FA150603,上海旭东海普药业有限公司产品），临用时用 0.9 %氯化钢配制。
[0082] 1.2实验动物
[0083] 雄性BALB/c-nu裸小鼠，90只，SPF级，体重12~15g，由湖南斯莱克景达实验动物有 限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2014-0003;在湖南省药物安全评价研究中 屯、屏障环境B区实验室饲养，实验动物质量合格证号:N043004700004931，实验动物使用许 可证号:SYXK(湘)2014-0008。实验期间环境溫度20 °C~26 °C，湿度40 %~70 %。
[0084] 1.3细胞株
[0085] 人胃癌细胞(MGC80-3)购于中科院细胞库，在湖南省药物安全评价研究中屯、细胞 室内传代培养;DMEM高糖培养基（批号：041012-UY，Corning公司产品）；胎牛血清（批号： NYL1009 ,HyClone 公司产品）。
[00化]1.4主要仪器
[0087] AUY-220分析天平（日本岛津）；数显游标卡尺(永康正丰五金）。
[0088] 2.研究内容
[0089] 2.1前期试验结果
[0090] 皿-4号提取物单次灌胃给予ICR小鼠最大浓度0.15g/ml，最大体积40ml/kg(相当 于6g/kg)，当日1次，未见明显急性毒性反应。
[0091 ] 2.2. HTJ-4对人移植胃癌荷瘤裸鼠模型的影响
[0092] 2.2.1人胃癌细胞(16〔80-3)的培养
[0093] 用DMM培养基加10%新生牛血清，并加入青链霉素各50U/ml，在5%C02的细胞培 养箱中培养。按1:4的比例进行传代，传代时细胞进入对数生长期，长满瓶底70~80%。
[0094] 2.2.2造模分组
[00M]取对数生长期的人胃癌(MGC80-3)细胞，用PBS洗涂2次，再用无血清DMEM重悬后计 数，调整细胞浓度为IX IO7个/ml的细胞液接种于90只裸小鼠右侧蔽窝下，每只裸鼠接种 0.2ml (即2 X IO6个细胞/只），制备荷瘤裸小鼠。观察瘤体生长情况，用游标卡尺测量瘤体的 长(a)和宽(b)，按瘤体积公式V= 1/2 Xa X b2计算瘤体体积，选择肿瘤瘤体体积达到200皿3 W上且无溃破的荷瘤裸小鼠，按瘤体体积兼顾体重进行随机分组，分为7组，分组给药见表 3。模型对照组灌胃给予蒸馈水，给予体积为0.2ml/10g，氣尿喀晚组动物腹腔注射给药，注 射体积0.1 mlAOg，其余各组灌胃给予相应体积药液。
[0096] 表3动物分组及剂量设计
[0097]
[009引 3.结果评价
[0099] 3.1动物生存质量及存活时间评价
[0100] 试验期间每天观察动物的饮食、饮水、行为活动和瘤体的状况，详细记录各组动物 的体重变化及死亡情况。
[0101] 3.2瘤体体积、体重的测定
[0102] 在试验过程中，从分组、给药开始，每周用游标卡尺测量2次并记录肿瘤长(a)、宽 化）、体重;计算肿瘤体积并比较各组间肿瘤生长曲线的差异，分析体重变化趋势。
[0103] 按照W下公式计算肿瘤体积:V=1/2X长(a)X宽(b)2
[0104] 3.3根据肿瘤体积进行疗效评价
[0105] 按照W下公式计算相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增殖率T/C%:
[0106] RTV = VtAo
[0107] Vt:每天测量肿瘤体积，Vo:初始瘤体积(给药前）
[010引 T/C% =给药组的RTV平均值/对照组的RTV平均值X 100%
[0109] 相对肿瘤抑制率= 100%-相对肿瘤增殖率(T/C%)
[0110] 如果相对肿瘤抑制率<60%，为无效;如果相对肿瘤抑制率>60%，经统计学处理 P<0.05为有效。
[0111] 3.4根据肿瘤重量进行疗效评价
[0112] 试验结束后，实验结束时处死动物，剥离瘤体，称重并拍照。根据瘤重计算抑制率。 肿瘤生长抑制率=(模型对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/模型对照组平均瘤重X 100 %，肿瘤生长抑制率<40 %为无效;肿瘤生长抑制率>40 %，并经统计学处理P<0.05为有 效。
[0113] 3.5统计方法
[0114] 采用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料均采用均数±标准差(X±s)表示，统 计学资料采用SPSS17.0软件进行统计处理。多组间比较方差齐时用单因素方差分析，两两 比较，采用t检验。P<0.05表示有统计学意义，P<0.Ol表示所检验的差别有非常显著性意义。
[0115] 4.结果
[0116] 4.1皿-4提取物抗荷MGC80-3胃癌移植瘤鼠的活性
[0117] 裸鼠连续灌胃19天，氣尿喀晚联合皿-4组有1只动物出现死亡，其余裸鼠的外观体 征、行为活动及动物的一般状况未见明显异常，经大体解剖肉眼观察未见明显的异常脏器， 如图1所示。
[0118] 4.2皿-4提取物对人胃癌荷瘤裸鼠瘤体体积的影响
[0119] 如表4和图1所示，皿-4提取物低剂量、氣尿喀晚能明显降低给药后D4、Dio~化術瘤 裸鼠瘤体体积，与模型对照组比较有显著性差异(P<〇. 05或P<0.0 l);皿-4提取物高剂量能 明显降低给药后D4、Di3~化9荷瘤裸鼠瘤体体积(P<0.05);氣尿喀晚联合皿-4能明显降低给 药后Dio~Di6荷瘤裸鼠瘤体体积(P<0.05);皿-4提取物（2000mg/kg)能明显降低给药后〇4、 Dio、Di6荷瘤裸鼠瘤体体积(P<0.05)。
[0120] 如表5和图2所示，图2为给药后D10,皿-4对人胃癌移植荷瘤裸鼠瘤体的影响图。 皿-4提取物低、中、高剂量、氣尿喀晚及氣尿喀晚联合皿-4提取物、皿-4提取物(2000mg/kg) 给药期间相对肿瘤抑制率分别为：〇4相对肿瘤抑制率45.8 %、27.2 %、62.3 %、62.7 %、 43.4%、58.9% ;D7相对肿瘤抑制率31.6%、16.1%、53.0%、38.3%、38.4%、36.0%;〇1〇相 对肿瘤抑制率46.1%、31.9%、50.0%、58.1%、44.7%、50.4%;〇13相对肿瘤抑制率36.9%、 16.2%、39.8%、49.9%、37.2%、31.4% ;Di6相对肿瘤抑制率33.8%、16.0%、39.6%、 61.2%、47.4%、45.1% ;Di9相对肿瘤抑制率40.9%、36.1%、41.2%、44.3%、45.7%、 36.2%。
[0121]
[0122] 表5HTJ-4对胃癌荷瘤裸鼠相对肿瘤抑制率的影响（之±S)
[0123]
[0124] 4.3皿-4提取物对人胃癌荷瘤裸鼠瘤体重量的影响
[0125] 如表6和图3所示，皿-4提取物低、中、高剂量、氣尿喀晚组、氣尿喀晚联合皿-4提取 物组、HB-4提取物（2000mg/kg)肿瘤生长抑制率分别为20.6%、9.7%、6.4%、27.0%、 20.7%、1.3%。
[0126] 如表7和图4所示，皿-4提取物低、中、高剂量、氣尿喀晚组、氣尿喀晚联合皿-4提取 物组、皿-4 提取物(2000mg/kg)最大肿瘤移植率为 46.1%、36.1%、62.3%、32.7%、47.4%、 58.9%。模型对照组、皿-4提取物低、中、高剂量、氣尿喀晚组、氣尿喀晚联合皿-4提取物组、 皿-4 提取物(2000mg/kg)最大体重下降率分别为 3.4%、3.4%、5.0%、3.8%、8.9%、5.8%、 3.7%。
[0127] 表細TJ-4对胃癌荷瘤裸鼠瘤重的影响（
[012 引
[01巧]注:与模型对照组比较，作<0.05，^P<0.0 l。
[0130] 表7HTJ-4体内抗胃癌MGC80-3移植瘤疗效和动物毒性 「01311
[0132] W上结果表明，皿-4即培养基中半枝莲渗入比例为40%的生物转化菌丝体对人胃 癌(MGC80-3)荷瘤裸鼠具有明显的抑瘤作用。皿-4提取物采用简单的处理工艺制备得到，其 抗肿瘤效果就达到预料不到的技术效果，经生物转化的"菌丝体"的抗肿瘤效果好于所有的 天然植物来源的中药材，如果进一步分离纯化富集有效成分，其抗肿瘤效果将更好，可用于 制备抗胃肠道癌药物。
[0133] 所属领域的普通技术人员应当理解：W上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非 旨在暗示本公开的范围（包括权利要求)被限于运些例子;在本发明的思路下，W上实施例 或者不同实施例中的技术特征之间也可W进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面 的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内， 所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种猴头菌的培养基，其特征在于，包括基础培养基和半枝莲，每100份的培养基中 包括基础培养基70~50份，半枝莲30~50份;所述基础培养基包括如下重量份的各组分： 麦麸490~350份，玉米粉140~100份，谷糠63~45份，白糖7~5份，水400~600份。2. 根据权利要求1所述的猴头菌的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括如下重量 份的各组分： 麦麸420份，玉米粉120份，谷糠54份，白糖6份，水500份。3. 根据权利要求1所述的猴头菌的培养基，其特征在于，每100份的培养基中包括基础 培养基60份，半枝莲40份;所述基础培养基包括如下重量百分数的各组分:麦麸70 %、玉米 粉20%、谷糠9%、白糖1 %。4. 一种生物转化菌丝体，其特征在于，将猴头菌类菌株接种至如权利要求1-3任一项所 述的培养基中，在20~27°C下，培育30~40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体。5. 根据权利要求4所述的生物转化菌丝体，其特征在于，所述猴头菌类菌株为猴头菌科 真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull. ex Fr.)Pers〇6. 根据权利要求5所述的生物转化菌丝体，其特征在于，所述猴头菌科真菌猴头菌 Hericium erinaceum(Bull · ex Fr · )Pers ·的菌丝体与其附生含有半枝莲成份的固体培养 基的干燥混合物。7. -种生物转化菌丝体的提取物，其特征在于，所述提取物通过以下步骤制备得到： (1) 将如权利要求4-6任一项所述的生物转化菌丝体进行水提，50-70°C下用水浸泡2-3 次，每次浸泡2-5小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的6~10倍，得到提取液； (2) 将步骤（1)中的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在50-70°C条件下抽真 空干燥，即得生物转化菌丝体的提取物。8. 根据权利要求7所述的生物转化菌丝体的提取物，其特征在于，所述用水浸泡的温度 为60°C ;将减压浓缩所得的浓缩液在60°C条件下抽真空干燥。9. 权利要求7或8所述的生物转化菌丝体的提取物在制备抗胃肠道癌药物中的用途。10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述胃肠道癌为食管癌、胃癌、结肠癌或 肝癌。
【文档编号】A61K36/07GK106064993SQ201610605434
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】何述金, 周代俊, 周邦维
【申请人】湖南新汇制药股份有限公司