一种格氏沙雷氏菌（Serratia grimesii）C13及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种菌株，特别是一种格氏沙雷氏菌（5krraiia巧C13,本发 明还公开了该菌株的用途。
【背景技术】
[000引泥餓（必/端·?//77化？a化化/別化)因为它鲜嫩的肉质，丰富的营养，且具有高 蛋白低脂肪等特点，有食用、药用的双重价值，现已成为我国主要的淡水经济鱼类之一。然 而随着泥餓养殖规模的扩大而引发的泥餓病害问题也日趋严重，给泥餓养殖业造成了很大 的经济损失。凡隆气单胞菌UeiOWonasKertwii)是引发泥餓细菌病害的病原菌之一，它 侵染泥餓后，泥餓表现为身体发红，体表有出血点，严重的情况下皮肤会产生溃瘍灶，死亡 率能够高达60%。泥餓病害的防治多采用抗生素，进而引发病原菌的耐药性及抗生素的残留 等环境的二次污染。
[0003] 益生菌是通过改善内源性微生物，对动物或人类施加有益影响的单一或混合的 活微生物，益生菌W其不会对养殖动物造成危害、环境友好而备受重视，近年来广泛应用于 水产病害防治。因此，研发新的益生菌应用于水产病害防治具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的较强抑制凡隆 气单胞菌生长的益生菌格氏沙雷氏菌（5krra巧C13。
[0005] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供了前述格氏沙雷氏菌Werraiia 鮮i曲esii ) C13的用途。
[0006] 本发明所要解决的技术问题是通过W下的技术方案来实现的。本发明公开了一种 格氏沙雷氏菌鮮i曲esii)C13,其特点是：其保藏号为CCTCCNo:M2015473。
[0007] 本发明菌株格氏沙雷氏菌巧'ia?e5ii)C13 (?下简称格氏沙雷氏菌C13 或者C13)菌株已于2015年7月23日保藏在中国典型培养物保藏中屯、CCTCC，保藏编号 为CCTCCNo:M2015473 ;保藏单位地址：中国武汉市武汉大学，电话：027-68754052,邮编： 430072ο
[0008] 本发明所述的格氏沙雷氏菌巧C13,进一步优选的技术方案 是，其保藏方法为：挑取格氏沙雷氏菌C13菌落接入5mL牛肉膏蛋白腺液体培养基中， 28°C，160巧m摇床培养过夜；取1.5血离屯、管，按1:1的比例将发酵液与灭过菌的30 % 甘油混合装入其中，颠倒数次混匀后放入-70 °C冰箱保存。
[0009] 本发明所述的格氏沙雷氏菌巧C13,进一步优选的技术方案 是，其分离筛选方法如下： (1)分离纯化：从泥餓养殖池采集水样，将采集的水样按浓度梯度进行稀释涂布于牛肉 膏蛋白腺固体培养基上，选择菌落分散度适宜的平板，根据菌落颜色、大小、形状、边缘整齐 度、质地特征，挑选出不同特征的菌落，将其多次Ξ区划线直到得到纯培养物C1-C16共16 个纯培养物； (2) 发酵：挑取上述纯培养物单个菌落分别接入5mL牛肉膏蛋白腺液体培养基中， 28°C，160rpm摇床培养过夜，得发酵液用于筛选； (3) 筛选：病原菌凡隆气单胞菌UerowonasKertwii)同步进行活化，制得菌液；采 用双层琼脂平板法进行抑菌筛选：先在培养皿中的底层倒入牛肉膏蛋白腺固体培养基，待 其凝固后，再倒入含有凡隆气单胞菌UerowonasKenwii)菌液的牛肉膏蛋白腺半固体培 养基；在上层半固体培养基上打孔，注入适量步骤（2)所得发酵液，放在28°C的培养箱中培 养，第Ξ天观测抑菌圈大小；筛选得到C13菌株。
[0010] 本发明所述的格氏沙雷氏菌巧'i曲esii)C13可W用来制备抗凡隆气单 胞菌UerowonasKeronii)水产药物。
[0011]W下对本发明格氏沙雷氏菌C13进行进一步地阐述。
[0012] 菌株C13的分离筛选及保存 1. 1凡隆气单胞菌括抗菌的分离纯化 从连云港岗璋农场9号泥餓养殖池于2013年7月14日、7月29日、8月14日、8月29 日、9月14日和9月29日等6个日期采集水样，将采集的水样按浓度梯度进行稀释涂布于 牛肉膏蛋白腺固体培养基上，选择菌落分散度适宜的平板，根据菌落颜色、大小、形状、边缘 整齐度、质地等特征，挑选出不同特征的菌落，将其多次Ξ区划线直到得到纯培养物，共16 个，编号依次为C1，C2,C3……C16。
[0013] 1.2纯培养物的保藏 挑取上述纯培养物单个菌落接入5血牛肉膏蛋白腺液体培养基中，28°C，160rpm摇床 培养过夜。取1.5mL离屯、管3-5支，按1:1的比例将发酵液与灭过菌的30 %甘油混合装 入其中，颠倒数次混匀后放入-70 °C冰箱保存。其余发酵液用于括抗菌的筛选。
[0014] 凡隆气单胞菌括抗菌的筛选 病原菌凡隆气单胞菌同步进行活化，制得菌液。采用双层琼脂平板法进行抑菌实验：先 在培养皿中的底层倒入牛肉膏蛋白腺固体培养基，待其凝固后，再倒入含有凡隆气单胞菌 菌液的牛肉膏蛋白腺半固体培养基。在上层半固体培养基上打孔，注入一定量筛选出的括 抗菌的菌液，放在28°C的培养箱中培养，第Ξ天观测抑菌圈大小。
[0015] 通过Ξ次实验从中筛选出5株具有括抗效果的菌株，见表1。经第四次实验，从运 5个菌株中挑选出抑菌效果明显，而且表现较稳定的C13菌株用于后续实验。
[0016] 表1括抗菌株的抑菌实验
注:+表示对凡隆气单胞菌具有括抗作用，++表示具有较强的括抗作用，-则表示无括 抗作用。W表示已淘汰 3括抗菌C13的菌株鉴定 1. 1 C13的形态特征观察 通过Ξ区划线得到单菌落，肉眼观察结合低倍放大镜，从颜色、大小、形状、边缘整齐 度、质地等方面描述单菌落形态特征。结果表明。C13菌落呈淡黄色，楠圆形，边缘不整齐， 表面光滑、湿润、不透明，与培养基紧密结合，如图1。在显微镜（4X10)下观察C13单个菌 落，结果见图2。革兰氏染色如图3。
[0017] 的leSrRNA基因鉴定 (1)C13菌株基因组DNA提取及16SrDNA扩增 按细菌基因组DNA常规提取方法提取C13总DNA，并用细菌16SrRNA基因通用引物 27F/1492R扩增C13 16SrDNA片段，结果如图4。
[001引 由图4看出，扩增到的16SrDNA片段约1500bp，条带清晰。PCR扩增产物送上海 生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果为1450bp。
[0019] (2)C13菌株的系统发育地位分析 使用NCBI(美国国立生物技术信息中屯、）网站中的BLAS软件，将C13的16SrDNA序列与已知菌株的16SrDNA序列比较其同源性。通过比较显示，C13的16SrDNA序列与 巧'i曲esii(T)DSM30063的同源性最高，达到96 %。用MEGA5. 10绘制C13的 系统发育树，与况?rraiia鮮i曲esii灯）DSM30063的遗传距离也达到90 (见图5)，因此 敬碱名丸Serratia grimesii
[0020] 的生长曲线及同步抑菌活性鉴定 取5mL括抗菌发酵液接种于100mL牛肉膏蛋白腺液体培养基中，28°C，160rpm培养， 每2h取样品4mU其中3mL用分光光度计测定ODe。。，不接菌的培养基作对照，绘制生长 曲线；另1mL用于检测抑菌活性，每个菌株的实验重复3次。从实验结果可W看出，C13延 滞期为0h~2h，对数期为2h~10h，10h后进入稳定期。10h后开始产生抑菌圈，24h 时抑菌圈最大，达到1.12cm。因此发酵培养时W培养24h收获菌液为宜。
[0021] 的发酵条件优化 5. 1培养基起始抑对括抗菌抑菌活性的影响 将100mL的牛肉膏蛋白腺液体培养基装于2