专利名称：固定化沙雷氏菌脂肪酶、制备方法及其催化拆分地尔硫卓手性前体的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及固定化沙雷氏菌脂肪酶、粘质沙雷氏菌胞外脂肪酶 的固定化，以及固定化脂肪酶在医药前体生产中的应用。
背景技术：
地尔硫卓(Diltiazem)是上世纪70年代发现并合成的苯并噻平类韩离子通道阻滞剂， 它作用于冠脉血管及末梢血管的血管平滑肌及房室结，对钙通道有阻滞作用，能抑制钙 离子向细胞内流入，降低血管平滑肌细胞内游离钙离子的浓度而使血管平滑肌松弛；并 能有效地扩张小动脉血管，增加冠脉血流量，降低冠状静脉氧差，有降低心率和血压作 用。可用于室上性心律失常，典型心绞痛，变异型心绞痛，老年性高血压等病症的治疗。 由于该药疗效确切，毒副作用小，是心血管疾病治疗的重要药物。
对甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，简称MPGM，其左旋异构体[(2及,35)-(-)-MPGM]是心 血管药物地尔硫卓合成的重要中间体，目前有不少单位在进行(-)-MPGM的开发制备。 粘质沙雷氏菌脂肪酶是催化(土)-MPGM水解拆分，制备光学纯(-)-MPGM的优良生物催 化剂[中国专利ZL200410067046.1]。由于游离脂肪酶的稳定性相对较低，难以重复使用， 而且酶液中的复杂组分给产品的纯化处理带来较多麻烦，因此有必要对脂肪酶进行固定 化。
日本的田边公司[丄Feiwewt 5i^wg.， 1994, 78: 59-63]使用中空纤维膜对沙雷氏菌脂 肪酶进行截留固定化，并使用固定化了脂肪酶的中空纤维膜反应器进行(土)-MPGM的 水解拆分。固定化脂肪酶能重复使用5批次，当上载的酶失活时，可以将其洗脱之后上 载新酶。尽管如此，由于膜传质阻力的存在，导致反应速率较慢，第一轮反应需要23h 才能达到反应终点。在先前研究中，我们发现环氧树脂(如EupergitC)和硅藻土是比较好 的沙雷氏菌脂肪酶固定化载体[催化学报，2007， 28: 175-179]，固定化脂肪酶可以重复 使用5~10批。尽管如此，使用环氧树脂共价偶联法进行酶的固定化，载体价格比较昂贵，固定化酶成本高；而使用硅藻土吸附法进行固定化，虽然固定化方法非常简单，酶 上载容量也较大，但是固定化酶的稳定性仍不够高，反应和分离操作也不太方便，这些 问题限制了这两种固定化方法的工业化应用。壳聚糖是一种天然高分子化合物，表面拥有大量羟基和氨基，生物相容性好，将其 用于酶的固定化具有许多显著的优点廉价、无毒、拥有很好的亲水性、高孔隙度以及 大的表面积；可操作性强，能通过多种方式与酶结合；制备的固定化酶的空间阻碍低， 传质阻力小。另外，壳聚糖是一种可生物降解材料，在其固定化的酶完成催化剂的使用 寿命周期后容易进行处理，且对环境友好。在本发明中，发明人使用壳聚糖作为沙雷氏菌脂肪酶的固定化载体，载体价格低， 酶的上载容量以及酶活回收率较高，使用固定化脂肪酶催化(土)-MPGM的水解拆分，反 应速率快，对映选择性好，产品光学纯度高，固定化酶可以多次重复使用，应用成本低。发明内容本发明目的是提供一种固定化沙雷氏菌脂肪酶。本发明目的还提供一种上述固定化沙雷氏菌脂肪酶的制备方法。本发明另外一目的是提供一种上述固定化沙雷氏菌脂肪酶的在医药前体生产中的 应用，用固定化脂肪酶催化(土)-MPGM的水解拆分，制备光学纯的(2及,3S)-(-)-MPGM， 作为合成心血管药物地尔硫卓的手性中间体。本发明的采用的沙雷氏菌脂肪酶是由粘质沙雷氏菌经发酵培养产生的胞外脂肪酶。本发明的固定化沙雷氏菌脂肪酶该固定化酶以天然高分子化合物壳聚糖为载体骨 架，酶通过戊二醛的交联作用共价结合固定在壳聚糖载体表面。本发明的固定化沙雷氏菌脂肪酶的制备方法如下1、沙雷氏菌脂肪酶固定化载体的制备由于壳聚糖干粉结构紧密，相对表面积较小，直接使用壳聚糖粉进行脂肪酶的固定 化，酶的上载量低，因此需要对壳聚糖进行适当的预处理，提高酶的上载能力。壳聚糖 具有可溶于稀酸溶液(包括甲酸、乙酸等有机酸和盐酸、硫酸等无机酸)，不溶于碱性溶 液的性质，因此先将壳聚糖溶解于一定浓度的酸溶液中，所用的酸可以是甲酸、乙酸等有机酸，也可以是盐酸、硫酸等无机酸，壳聚糖溶液的浓度为0.5 5Y。重量/体积(w/v)， 酸的浓度为0.5~5%( ")。然后用碱中和壳聚糖溶液中的酸，获得固化成型的壳聚糖载 体。这里选择二种方法制备壳聚糖固定化载体，分别为在搅拌状态下，在含有0.5%~5%重量壳聚糖、0.5~5%重量酸的水溶液中，缓慢加入 浓度为0.5~10%重量的碱水溶液，生成壳聚糖凝胶沉淀；或者将含有2%~5%重量壳聚糖、 2~5%重量酸的水溶液逐滴滴入浓度为10~50%重量的碱水溶液中，生成壳聚糖小球；所 述的酸是甲酸或乙酸短链有机酸、或盐酸或硫酸无机酸；所述的强碱是一价金属的氢氧 化合物。2、沙雷氏菌脂肪酶的固定化选择戊二醛作为交联剂使沙雷氏菌脂肪酶共价偶联到上述制备壳聚糖凝胶沉淀或 壳聚糖小球的壳聚糖载体上，将制备的壳聚糖凝胶沉淀或壳聚糖小球的壳聚糖载体、粘 质沙雷氏菌脂肪酶液和戊二醛在0 4(fC反应1 24 h，所述的壳聚糖载体、粘质沙雷氏 菌脂肪酶液的重量比为l: 5~1: 20，壳聚糖载体和戊二醛的重量比为100: 1~10: 1。 进一步的描述可以如下1) 将所述的壳聚糖凝胶沉淀或壳聚糖小球的壳聚糖载体直接投入粘质沙雷氏菌脂 肪酶液中，在搅拌状态下加入戊二醛进行偶联固定化至戊二醛的终浓度为0.2%~2%重 量/体积，抽滤、洗涤，洗去未结合的戊二醛和蛋白质，储存于4。C备用。2) 将壳聚糖载体投入浓度为1~10%重量的戊二醛溶液中反应，使载体表面接上戊 二醛臂，抽滤、洗涤，洗去过量的戊二醛；将预处理后的壳聚糖载体按10~30%重量的 湿重投入沙雷氏菌脂肪酶液中，搅拌反应l 10h，抽滤、洗涤，洗去未结合的蛋白质， 储存于^C备用。固定化沙雷氏菌脂肪酶活力的测定方法为称取一定质量的固定化脂肪酶，置于IO ml磷酸钾缓冲液(IOO mM， pH 7.0)中，30°C预热3 min后，加入60 pi 100 mM的对硝基 苯酚丁酸酯(溶于二甲基亚砜)，搅拌反应3min后，取0.5ml反应液，加入等体积丙酮 终止反应，离心后测定405 nm的吸光度，以不加酶的样品作为空白对照。酶活力单位 的定义为在上述条件下，每分钟催化1.0pmol对硝基苯酚丁酸酯水解所需的酶量定义 为一个活力单位(U)。本发明的固定化脂肪酶可以用于催化拆分(士)-MPGM:酶促反应在水-有机两相体系中进行，有机相选择甲苯、异丙醚、甲基叔丁基醚等水 不溶性溶剂，有机相占反应体系总体积的5~95%，有机相中底物(土)对甲氧苯基縮水甘 油酸甲酯(士)-MPGM的浓度为0.05-1.5 mol/L。固定化脂肪酶的用量为1000-10,000 U/L，反应温度为20~40°C，优选为30。C;反应pH为7.0~9.0，优选为8.0-8.5。每批反 应至剩余底物的对映体过量值(")高于99%时终止，回收固定化脂肪酶，重新开始下一 批次反应。每批反应完毕后，反应液静置分层，取上清有机相，用一定浓度的亚硫酸氢钠溶液 洗涤，随后干燥、浓縮、精制，即可获得光学纯的地尔硫卓手性中间体(2及,3S)-(-)-MPGM。采用本发明所公开的固定化沙雷氏菌脂肪酶催化拆分制备(-)-MPGM，固定化酶易 于制备，反应条件温和，具有很好的工业应用开发前景。
图1用壳聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶重复拆分(士)-MPGM;图2壳聚糖固定化酶催化拆分(i)-MPGM的反应进程 ( )第一批；(■)第二批；(fe)第三批；(X)第四批；(*)第五批；(*)第六批；(+)第 七批。具体的实施方式下述实施例将有助于进一步理解本发明，但不能限制本发明的内容。实施例1壳聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶分别取0.5g壳聚糖，制备壳聚糖凝胶和壳聚糖小球，具体制备方法如下壳聚糖凝胶将0.5g壳聚糖，溶于50mlP/。的醋酸溶液中，磁力搅拌状态下缓慢 加入l。/。的NaOH溶液至溶液呈碱性，抽滤收集析出的壳聚糖絮凝体，水洗至中性，备 用。壳聚糖小球将0.58壳聚糖，溶于20ml2.5y。的醋酸溶液中，用注射器逐滴滴到 20。/。NaOH溶液中，抽滤收集获得的小球，水洗至中性，备用。将获得的壳聚糖载体投入到50ml 1%的戊二醛水溶液中，30。C振摇12h，抽滤，比酶活(U/g) 23.6 酶活回收率(％) 31.0 蛋白上载量1.2(mg/g)10.0 6.50.5说明书第5/6页洗涤。投入50ml沙雷氏菌脂肪酶发酵液(5000U/L)中，4。C搅拌固定化2h，抽滤、洗 涤。酶固定化的结果如表1所示。表l壳聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶壳聚糖小壳聚糖絮凝体球实施例2壳聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶在10L热水中，加入100g壳聚糖以及100ml醋酸，搅拌使壳聚糖溶解，缓慢滴 加lmol/L的NaOH至溶液呈弱碱性。抽滤，洗涤析出的壳聚糖凝胶，将获得的凝胶加 到10 L沙雷氏菌发酵液中(脂肪酶活力约5000 U/L)，加入50 ml戊二醛(50%)，室温搅 拌反应2h，抽滤、洗涤，洗去未反应的戊二醛和蛋白质，获得固定化酶湿重约1.5kg， 活力为21 U/g。实施例3壳聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶在异丙醚-水两相体系中催化拆分(士)-MPGM取10g壳聚糖絮凝体固定化沙雷氏菌脂肪酶，总活力为230U，加到250ml三口烧 瓶中，加入50ml含有1.04g(土)-MPGM的异丙醚以及50ml水，30°C， 200 rpm搅拌 反应，滴加氨水控制反应液pH恒定为8.5。间歇取样，分析剩余底物浓度以及ee值。 每批反应剩余底物的ee值达到99.9%以上时终止反应，抽滤收集固定化沙雷氏菌脂肪 酶，用水洗涤后，重新开始下一批反应。固定化沙雷氏菌脂肪酶重复使用30批，仍然 保留了较高的活力(图1)。 、实施例4壳聚糖固定化酶在甲苯-水两相体系中催化拆分(士)-MPMG 取1 kg固定化沙雷氏菌脂肪脂肪酶(21 U/g)投入10 L三口烧瓶中，加入624 g(士)-MPGM (3.0 mol)，加3 L甲苯以及3 L自来水，30°C, 200 rpm搅拌反应，流加氨 水控制反应pH恒定为8.5。间歇取样，待剩余底物的"值高于99%时终止反应，抽滤 回收固定化脂肪酶，洗涤后，补加15g新鲜固定化沙雷氏菌脂肪酶后重新进行下一批反 应。连续反应7批，反应进程结果如图2所示，反应总产率为1.3 kg (-)-MPGM/kg固定 化酶。
权利要求
1、一种用壳聚糖载体固定化粘质沙雷氏菌脂肪酶，其特征为该固定化酶以天然高分子化合物壳聚糖为载体骨架，酶通过戊二醛的交联作用共价结合固定在壳聚糖载体表面。
2、 一种如权利要求1所述的壳聚糖载体固定化粘质沙雷氏菌脂肪酶的制备方法， 其特征是通过下述步骤1)在搅拌状态下，在含有0.5%~5%重量壳聚糖、0.5~5%重量酸的水溶液中， 缓慢加入浓度为0.5~10%重量的碱水溶液，生成壳聚糖凝胶沉淀；或者将含有2%~5% 重量壳聚糖、2~5%重量酸的水溶液逐滴滴入浓度为10~50%重量的强碱水溶液中， 生成壳聚糖小球；所述的酸是甲酸或乙酸短链有机酸、或盐酸或硫酸无机酸；所述 的碱是一价金属的氢氧化合物；2)将l)制备的壳聚糖凝胶沉淀或壳聚糖小球的壳聚糖载体、粘质沙雷氏菌脂 肪酶液和戊二醛在(K40。C反应1 24 h，所述的壳聚糖载体、粘质沙雷氏菌脂肪酶液 的重量比为l: 5~1: 20，壳聚糖载体和戊二醛的重量比为100: 1~10: 1。
3、 如权利要求2所述的壳聚糖载体固定化粘质沙雷氏菌脂肪酶的制备方法，其特征 是步骤(2)的反应是将所述的壳聚糖凝胶沉淀或壳聚糖小球的壳聚糖载体直接投入粘 质沙雷氏菌脂肪酶液中，在搅拌状态下加入戊二醛进行偶联固定化，戊二醛的终浓度为 0.2%~2%重量/体积；或者将制备的1~30%湿重壳聚糖载体投入到戊二醛溶液中反应， 再将预处理后的壳聚糖载体投入粘质沙雷氏菌脂肪酶液中偶联固定化。
4、 如权利要求l所述的壳聚糖载体固定化粘质沙雷氏菌脂肪酶的用途，其特征是用 于催化拆分(土)对甲氧苯基縮水甘油酸甲酯制备左旋对甲氧苯基縮水甘油酸甲酯。
5、 如权利要求3所述的壳聚糖载体固定化粘质沙雷氏菌脂肪酶的用途，其特征是所 述的制备在20 4(rc， (士)对甲氧苯基縮水甘油酸甲酯和固定化脂肪酶反应l 24h;反应 在水-有机两相体系中进行，所述的的(土)对甲氧苯基縮水甘油酸甲酯溶解在有机相中， 浓度为0.05~1.5摩尔/升；水相溶液的pH为7.0 9.0;固定化脂肪酶的用量为IOO(MO,OOO U/L;有机相体积占反应体系总体积的5~95%。
全文摘要
本发明公开了一种固定化沙雷氏菌脂肪酶、制备方法及其催化拆分地尔硫卓手性前体的用途，该固定化酶可以催化拆分地尔硫卓手性前体--外消旋对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(±)-MPGM]。本发明使用壳聚糖作为沙雷氏菌脂肪酶的固定化载体，用戊二醛作为交联剂，使沙雷氏菌脂肪酶共价结合到固定化载体上。将固定化酶应用到(±)-MPGM的酶促水解拆分反应中，固定化酶可以重复使用多次，显示了良好的操作稳定性和实际应用可行性。
文档编号C12P7/62GK101532007SQ20091004789
公开日2009年9月16日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者江 潘, 许建和, 赵丽丽, 陆雅臣 申请人:华东理工大学;江苏华荣生物科技有限公司