造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒及其应用的制作方法

专利名称：：造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及利用STR检测造血干细胞移植后的嵌合状态的诊断试剂盒及其应用。
背景技术：
：造血干细胞是血液成分之一，是生成各种血细胞的最起始细胞，又称造血多能干细胞，存在于骨髓、胚胎肝、外周血及脐带血中。它既具有高度自我更新能力，又具有进一步分化各系统祖细胞的能力。近代输血就利用这两种能力，对受血者用放射或大剂量化学药物使其免疫系统受抑后输入献血者的造血干细胞，让它在受血者骨髓内留存并分化增殖，这即是造血干细胞移植。造血干细胞移植现正日益广泛地用于白血病、许多恶性肿瘤及某些遗传性疾病的治疗，由于造血干细胞可从骨髓、外周血、脐血、胎肝获得，因此临床上出现了骨髓移植、外周血干细胞移植、脐血细胞及胎肝移植，而根据造血干细胞的来源又可以分为自体、异体同基因(如双胞胎)、以及异基因(如父母、同胞或无血缘关系的供者)移植。随着移植理论和技术的发展及骨髓库的完善，异基因造血干细胞移植在临床上的应用越来越广泛。为判断移植是否成功、监控病人的复发情况并及时地实施免疫抑制治疗、预后等，需要对移植后供者细胞在受者体内的情况进行检测并观察其变化趋势，因此移植后动态检测血细胞的嵌合状态对判断移植效果、实施临床早期干预治疗具有重要的意义。从遗传学上说，异基因的供受者血细胞嵌合体本质上是两个不同基因型个体细胞的混合。因此，利用染色体上的遗传标记可以区分供受者细胞并对供受者细胞比例进行定量分析。传统的嵌合体分析手段包括基于第一代和第二代遗传标记检测的RFLP-PCR和VNTR/STR-PCR技术，以及基于染色体片段分析的FISH技术，由于FISH仅能用于性别不合的供受者，因此其应用局限性较大。短串联重复序列(shorttandemr印eat，STR)是基因组染色体上的一些简单重复序列，STR具有高度多态性和体细胞稳定性，在家系中可以稳定地遗传,STR-PCR现己成为鉴别不同个体DNA的强有力的工具，最早在法医学领域用于亲子鉴定。由于该方法重复性好，敏感高效，因此已成为目前国际骨髓移植登记处推荐的检4测供受嵌合状态的金标准。由于尚未有专门的嵌合体分析试剂盒，目前通常采用亲子鉴定试剂盒来实现STR-PCR技术在嵌合体分析中的应用。以下为国际上最著名的亲子鉴定试剂盒生产商-PE应用生物技术有限公司的产品的试剂盒名称和同时扩增的位点AmpFlSTRCOfilerPCRAmplificationKit:D3S1358,D16S539，THOl，TP0X，CSF1P0，D7S820，Amelogenin;AmpFlSTRIdentifilerPCRAmplificationKit:CSF1P0,D2S1338,D3S1358,D5S818,D7S820,D8S1179,D13S317,D16S539,D18S51,D19S433,D21S11,FGA，THOl，TP0X，vWA，Amelogenin;AmpFCSTRMiniFilerPCRAmplificationKit:D8S1179,D3S1358,THOl,D19S433,vWA,D5S818,TPOX;AmpFlSTRProfilerPlusIDPCRAmplificationKit:D3S1358,vWA，FGA,D8S1179,D21S11,D18S51,D5S818,D13S317,D7S820,Amelogenin.AmpFfSTRProfilerPlusPCRAmplificationKit:D3S1358,D5S818,D7S820,D8S1179,D13S317,D18S51,D21S11,FGA，andvM.;A即FfSTR⑧ProfilerPCRAmplificationKit:CSFIPO，D3S1358,D5S818,D7S820,D13S317,FGA,THOl,TPOX,andvWAAmpFlSTRSEfilerPCRAmplificationKit:D2S1338'D3S1358,D8S1179,D16S539,D18S51,D19S433,D21S11,SE—33，FGA,vWAAmpFlSTRSGMPlusPCRAmplificationKit:D2S1338,D3S1358,D8S1179,D16S539,D18S51,D19S433，D21S11，TH01，FGA'vWAAmpF￡STRSinofilerPCRAmplificationKit:D8S1179,D21S11,D7S820,CSFIPO,D3S1358,D5S818,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA，D12S391,D18S51,Amelogenin,D6S1043,FGA这些试剂盒中会含有一些与嵌合率检测无关的检测位点如性别位点，而且，由于亲子判断是对多个位点的定性分析，与嵌合率分析要求定量不同，因此在STR位点选取时，其对信息性的要求也是有差异的，'而所谓的信息性是指在供受者对间一方具有另一方没有的独特条带或称为等位基因片段的案例占所有案例的百分比，独特条带需与其它条带至少相差2个重复序列。信息性高表示说明能够清楚地定量辨别出不同个体的能力，信息性低则表示清楚地定量辨别出不同个体的能力较弱。理想信息位点就是该位点上供受者间具有可明确分辨的条带或片段，而且供受者间具有的所有条带不会彼此影响，从而对计算嵌合率所需要的原始数值-电泳后产生与荧光信号对应的峰高或峰面积产生影响。根据我们的经验结合国际上已有的观点，我们认为一般理想信息位点需符合4个要求1、该位点为4个核苷酸的重复，2、供受者间至少有一个独特的等位基因片段，3、独特的等位基因满足与双方的其它任何等位基因的序列长度至少相差2个重复序列的条件，4、一方的任何等位基因序列长度都必须和另一方的等位基因序列长度不能只相差一个重复序列。亲子检测试剂盒中会包含一些信息性不够高的位点和性别位点等，而且电泳迁移后位置类似的不同荧光标记的等位基因片段的峰高或峰面积会彼此影响，这些位点的定量结果易受干扰。如果要采用亲子鉴定试剂盒获得嵌合率信息，需要同时扩增多对引物，而不能只对某一个信息位点进行追踪检测，而且由于信息性不够高的位点也同时参与实验，浪费了人力和财力，且其定量的精确性不够高。当不能得到信息位点时，也无法灵活增加其它可提供理想信息的位点。近年来，随着嵌合体分析在白血病复发及白血病微残余灶监测上的广泛应用，临床实践对嵌合体分析技术的检测灵敏度和定量的精确性也提出了更高的要求。以便于医生更早地采取医疗干预措施以得到更良好的治疗效果。
发明内容本发明的目的是提供造血干细胞移植后的嵌合状态的诊断试剂盒及其检测方法，解决现有试剂盒只能同时扩增多对引物，不能在移植后只对信息位点进行追踪检测；而且采用目前商品化试剂所没有的引物对，这些引物对在供受者间提供信息性较高的试剂，因而适合拼装单信息位点的检测；可用于嵌合状态的定量追踪。本发明公开了一种造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒，试剂盒中含有下列STR位点的特异性引物D3S3045、D4S2366、D4S2639、D5S818、D13S317、D18S1002、D20S481和D22S689，这些位点均为4bp的片段重复。本发明对已知的STR位点进行了研究筛选，选择出具有较高信息性且大部分为其它亲子鉴定试剂盒所没有的STR位点，这些STR位点均满足重复片段为4bp。研究表明，符合这些条件的STR位点，用作嵌合率的定量分析时，干扰小，数据精准度高，并适合亚洲人群。所述STR位点的特异性引物为经荧光标记的特异性引物。优选的，上述STR位点对应的特异性引物为SEQIDNO.1-SEQIDNO.16。各特异性引物与STR位点的对应关系如下表所列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>为了方便在确定供受者之间的信息位点后，只对信息位点进行跟踪，本发明的试剂盒中，各STR位点对应的特异性引物分别独立包装(如分装在不同的小包装中)。除引物外，试剂盒中还可包括dNTP、Mg"或Taq-Gold酶等PCR常用试剂，试剂盒也可仅包含引物，在使用时与另购的其他PCR常用试剂配合使用。本发明还进一步公开了上述造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒的使用方法，包括下列步骤1.分别以骨髓移植术前供者及受者的造血干细胞DNA为模板，用试剂盒中的所有引物分别PCR扩增，将PCR扩增产物变性后上遗传分析仪的毛细管电泳，根据电泳结果确定等位基因；根据得到的供受者的等位基因，确定理想信息位点。2.以移植后受者的造血干细胞DNA为模板，用步骤1确定的理想信息位点对应的引物PCR扩增；3.将步骤2获得的PCR扩增产物变性后，上遗传分析仪的毛细管电泳，取得扩增产物对应的峰高或峰面积数据，并据此计算嵌合率。上述步骤l中的理想信息位点是指符合l、供受者间至少有一个独特的等位基因片段，2、独特的等位基因满足与双方的其它任何等位基因的序列长度至少相差2个重复序列的条件，3、除独特等位基因片段外，一方的任何等位基因的序列长度和另一方的任何等位基因序列长度至少相差2个重复序列或相同。在将试剂盒中的所有引物分别PCR扩增，并将PCR扩增产物变性后上遗传分析仪的毛细管电泳后，对应同一信息位点扩增的产物片段，供者和受者会出现不同的出峰情况，毛细管电泳时显示出峰的位置不同且对应至少相差l个重复单元的分子量的峰为不同的峰，反之则为相同的峰。如果对应同一信息位点扩增的产物片段，不同的峰对应至少相差2个重复单元的分子量，则产生这些峰的位点满足之前的条件1和2，可视为信息位点，如果除了这些峰以外，供者或受者在该位点产生的其它峰，都没有与另一方的任何峰只相差一个重复单元，则该信息位点还满足条件3，可进一步被视为理想信息位点，可单独用于移植后嵌合率的追踪检测。如某位点上供者为16，18两个等位基因，受者为13，19两个等位基因，则满足条件1和2，有两个独特的等位基因13，16，但是由于18，19只相差一个重复片段大小，且分属于不同个体，就不符合要求3，该位点就不符合理想信息位点的要求。但是需要注意的是，对于条件3的判断，至少相差2个重复序列的要求是针对不同方提出的，只相差一个重复片段大小的2个等位基因均属于同一方，且与另一方的片段都至少相差2个片段，则仍符合理想信息位点要求。如某位点上供者为16、17两个等位基因，受者为13、19两个等位基因，则满足条件1和2，13、19为独特等位基因，16、17两个等位基因不能算作独特等位基因，但与另一方的片段都至少相差2个片段，所以也满足条件3的要求，所以该位点符合理想信息位点要求。上述步骤1和步骤2中PCR扩增的条件为95°C，8min;94°C,lmin，65°Clmin，72°C，lmin，2个循环；94°C,lmin,61°Clmin，72。C，'lmin，2个循环；894。C'lmin,58°Clmin，72。C,lmin,25循环；94°C,lmin'55°Clmin，72°C,lmin'5循环；60°C，10min。上述步骤2中，移植后标本只需扩增理想信息位点，只需加入理想信息位点的引物。上述嵌合率即指移植后的受者外周血细胞中来源于供者造血干细胞所占的比例。受者源性细胞所占比例称为残留率，嵌合率+残留率=1。由于人的染色体是成对的，对应一个STR位点，同一对染色体上，两条染色体的序列可能相同，也可能不同，因此，对应一个STR位点的扩增产物，毛细管电泳时可能出现一个或两个峰，根据与毛细管电泳时同时加入的分子量标准物比对，可以获知被检测个体的等位基因是对应多少重复序列的分子量大小的片段，并根据荧光的强弱，获得出现片段处的峰的面积和峰高。对应不同的情况，嵌合率的计算公式分别如下当供者与受者对应一个信息位点各有两个峰，且供受者间只有一个峰不同，另一个峰相同时，嵌合率计算公式为(dA)/(rA+dA);相同的峰在计算时不计入内当供者有两个峰dAl,dA2，受者有两个峰rAl，rA2，各峰均不同时，嵌合率计算公式为(dAl+dA2)/(rAl+rA2+dAl+dA2);当供者有两个峰dAl,dA2，受者只有一个峰rAl,各峰均不同时，嵌合率计算公式为卜((2XrAl)/(2XrAl+dAl+dA2))或(dAl+dA2)/(2XrAl+dAl+dA2);当受者有两个峰rAl，rA2，供者有一个峰dAl，各峰均不同时，嵌合率计算公式为(2XdAl)/(2XdAl+rAl+rA2);当供者与受者对应一个信息位点均只有一个峰时，嵌合率计算公式为dAl/(rAl+dAl)。上述公式中，r代表受者，d代表供者，A:表示峰高或峰面积。不同的峰指供者和受者对应同一信息位点扩增的产物片段，其毛细管电泳时显示出峰的位置不同，且对应至少相差1个重复序列的分子量的峰。反之则为相同的峰。本专利所用的大部分位点都是现有亲子鉴定的产品中所欠缺的，这些位点可拼装也可单独检测，而且信息性也比较高，可以灵活用于信息位点的追踪以及作为其它产品的补充，9解决了目前产品只能扩增全部位点的弊病，可以只需扩增理想信息位点，用于追踪嵌合率的变化，因而更经济，结果检测更简单明了，避免了不同荧光的彼此干扰，所以更适合于嵌合物的定量分析。并且可以作为疑难亲子鉴定的补充试剂，或司法鉴定时的补充试剂盒。图1:供受者间不同浓度混合样品用D22S689STR检测到的混合比例标准曲线横坐标表示的是检测样品中混入的受者供者DNA比例，纵坐标是本试剂盒检测出的混入的受者供者DN八比例数据，Rawdata表示没有经过校正得到的原始受者供者DNA比例(残留率)，因为仪器测量DNA含量可能有偏差，需要根据50%混入时的原始数据，进行数学模型校正，Calibrated表示本试剂盒检测出的经数学模型校正的受者供者的DNA比例，Expected表示理论上预期应该得到的受者供者的DNA比例。可以发现Calibrated与Expected基本重合，说明测出的结果与预期结果基本一致。图2:D4S2366位点提示一例病人的嵌合率变化提示复发A:供者格局，B:病人移植后30天的格局C:病人移植后170天的格局由图可以看出30天时病人的格局已经与供者的格局一致(124，132)，说明已经植入91.54%，但到170天时病人自身的格局回复为自身格局为主体(116)，嵌合率跌至为20.11%，提示复发。图3:D22S689格局变化提示病人的异基因造血干细胞已经植入A:7天，嵌合率0%B:14天，嵌合率9.21%C:21天，嵌合率95.1%D:27天，嵌合率95.7%结果表明，7天时病人只有自己的格局(206，210)，14天时供者的格局(194，222)逐渐呈现，而21天起病人体内细胞大部分为供者源性的细胞，27天时供者源性的细胞依然为主，未复发。黑色三角为分子量定位标志。具体实施例方式以下列举具体实施例以进一步阐述本发明，应理解实施例并非用于限制本发明的保护范围。实施例1STR位点的筛选对亚洲人的造血干细胞DNA进行STR位点信息性的分析，试验方法1、在获得病人知情同意后，抽取16例骨髓造血干细胞移植的病人及其供者的外周血2ML，其中5例为非血缘关系的供受者对，ll例为同胞之间的供受者对。根据天根全血DNA抽提试剂盒(天根公司，中国北京)说明书，抽取基因组DNA。测定DNA浓度(核酸蛋白检测仪，Eppendorf,德国)后，稀释成10ug/mL，分装保存。2、分别用TAMRA、FAM、HEX分别标记合成不同引物(委托上海生工)，用于扩增。扩增位点见表l。3、PCR扩增扩增体系为20uL，包含0.2mMdNTP，2mMMg2+，4uM引物，Taq-Gold(应用生物科技公司-PE公司，美国)l个单位，10ug/mLDNAl-2uL，于PE9600扩增仪上扩增。每个供者或受者各扩增8管，每管内只有一对引物。扩增参数为95'C，8min;94。C,1min,65°C1min，72。C,1min;2个循环；94。C,1min,61°C1min,72°C,1min,2个循环；94。C,lmin，58。Clmin,72。C，lmin，25循环；94。C，lmin,55。Clmin，72。C,lmin，5循环；60°C，10min。4、扩增结束后于1.5%琼脂糖电压100V,30分钟电泳,确认扩增成功后，进入下一步分析。5、上述各位点扩增产物等量合并成l管后,取luL,加入luL甲酰胺变性剂和R0X-500内标(由16条带有R0X荧光素标记的双链DNA片段组成，分子量分别是70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490、500bp，可用作分子量标准物)后，95。C2分钟后于4。C5分钟，于ABI3100遗传分析仪(ABI，美国)上电泳。6、根据荧光信号确定扩增片段位置，与分子量标记物比对，确定片段分子量大小，从而确认该位点的等位基因。实验数据用Genescangenotype软件收集分析。7、总结每对供受者间不同位点的等位基因，计算信息性、供者信息性、受者信息性、理想位点信息性。信息性计算为供受者对间某一方在某个位点中至少具有一条另一方没有的等位基因，而且这个等位基因与其它等位基因之间至少相差2个重复片段，即具有独特的等位基因案例占所有检测案例的比例；、供者信息性为供受者对间供者至少具有一条另一方没有的等位基因，该等位基因与其它等位基因之间至少相差2个重复片段的案例占所有检测案例的比例；受者信息性则计算供受者对间受者至少具有一条独特等位基因案例占所有检测案例的比例。11理想位点的信息性计算符合理想信息位点的案例占所有案例的百分比，理想信息位点即在符合信息性计算的基础上，除了具有独特的等位基因外，其它的任何等位基因片段与另一个体的片段在序列长度上不能只相差l个重复片段，但同一个体的2个片段可以只相差1个重复片段。8、根据实验步骤7，统计计算历年来由上海司法鉴定研究所用PE公司亲子鉴定试剂盒得到的16例移植供受者的各位点的信息性，并列于表2。其中2对为同胞，14对为非血缘关系的供受者对。试验结果1、本研究配置的STR位点信息性总结如表1。表1本研究试制的试剂盒STR位点信息性的分析结果位点电泳条带引物序列信息性供者信息性受者信息性理想位点信息性D3S3045172-2005，TAMRA-ACCAAATGAGACAGTGGCAT.0.750.630.50.383，ATGAGGACGGTTGACATCTGD4S2366112-1405，HEX-TCCTGACATTCCTAGGGTGA0.870.730.870.193，AAAACAAATATGGCTCTATCTATCGD4S2639160-2005，FAM-AAGGTTCCAGGACACATTCA0.620.540.460.393，CTTGAAAGCTCCATAATCATACGD5S818126-1665，TAMRA-GGGTGATTTTCCTCTTTGGT0.530.530.470.063':TGATTCCAATCATAGCCACAD13S317171-2035，HEX-ACAGAAGTCTGGGATGTGGA0.870,730.730.383，GCCCAAAAAGACAGACAGAA12D18S1002282-3145，TAMRA-CAAAGAGTGAATGCTGTACAAACAGC0.850,850.850.233':CAAGATGTGAGTGTGCTTTTCAGGAGD20S481213-2735，TAMRA-TGGGTTATGAGTGCACACAG0.770,620.540.313，AACAGCAAAAAGACACACAGCD22S689198-2305，FAM-TATGTACAGACCTGCAACTTGC0.850.690.770.313,:CCTGCCTGCCTATCTATCTG2、总结以往的用现有的PE公司试剂盒得到的信息性于表2。表2、PE公司试剂盒分析移植病人得到的位点信息性位点信息性供者信息性受者信息性理想位点信息性D8S11790.470.470.470.20D21S110.130.130.130D7S8200.630.380.630.5CSF1P00.190.190.130.13D3S13580.310.250.190.19■10.500.250.420.42D16S5390.440.380.380.25D2S13380.630.500.630.38D19S4330.130.130.130vWA0.470.330.470.33TPOX0.460.230.310.38D18S510.560.500.560.38FGA0.560.560.500.3813表2中所列的位点大部分为目前最权威法医学个体识别检测试剂盒AmpFlSTRIdentifilerPCRAmplificationKit所具有的.由于Amelogenin为性别位点，不能提供信息性，所以未列入表2中3、比较表1、表2，表1中的信息性普遍高于表2，而表1、表2平均理想位点信息性分别为0.28、0.27,无明显差距.可能是由于本试剂盒的对象具有较多的遗传特征类似的同胞移植供受者对，而PE试剂盒的研究对象多数为无血缘关系的供受者对,导致了本试剂盒信息性高,但理想信息性与本试剂盒的信息信相比要低很多。但至少说明本研究选用的位点信息性不低于现有的最权威的商品化亲子鉴定试剂盒所选用的位点。实施例2试剂盒的装配分别合成SEQIDNO.1-SEQIDNO.16的引物。对所有编号为奇数的正向引物均采用5，荧光标记TAMRA或FAM或HEX,具体见表1，。将标记好的不同引物分别装厶不同的0.5mL塑料管中，密封避光后装入试剂盒，完成试剂盒的装配。实施例3试剂盒检测嵌合率的准确率评估试验方法1.在例1的实验基础上随机选用一例供受对的样品，确定理想信息位点为D22S689STR位点，受者具有16，17等位基因，供者具有13，20等位基因。2.受者移植前的DNA、供者DNA均放置于37°C30分钟，DNA浓度预先调整为10ug/mL。3.梯度样品制备等体积混合上述的DNA，配制50%供者受者DNA，并作为梯度样品的起始品，分别依次与供者的DNA混合，形成75%、87.5%、93.75%、96.8%、98.4%、99.2%的嵌合率的梯度样品；50%供者受者DNA混合样品作为起始样品，分别依次与受者移植前DNA混合，形成25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%、0.8%的嵌合率的梯度样品。75M的嵌合样品制备是等体积混合5(^样品和供者DNA，62.5%样品是用75%样品等体积混合受者移植前DNA，37.5%的样品是等体积混合50%样品和受者移植前0船。整个梯度样品R/DDNA包括0呢(即移植前受者DNA)、0.8%、1.56%、3.13%、6.25%、12.5%、25%、37.5%、50%、62.5%、75%、87.5%、93.75%、96.8%、98.4%、99.2%、100%(即供者DNA)。144、PCR扩增扩增体系为20uL，包含0.2mMdNTP，2mMMg2+,4uMSEQIDNO.15和SEQIDNO.16，Taq-Gold(应用生物科技公司,美国)l个单位，DNA1-2uL，于PE9600扩增仪上扩增。5、扩增参数为95'C,8min;94。C,lmin,65。Clmin,72。C,lmin，2个循环；94。C，1min,61°C1min,72。C,1min,2个循环；94。C,1min,58°C1min，72。C,1min,25循环；94。C,1min,55°C1min,72。C,1min,5循环；60°C，10min。6、取上述扩增产物luL,加入luL甲酰胺变性剂和R0X-500内标(分子量标记物)后95。C2分钟后于4'C5分钟，于ABI3100遗传分析仪(ABI，美国)上电泳。7、根据荧光信号确定扩增片段位置，与分子量标记物比对，确定片段分子量大小，从而确认该位点的等位基因，并与例1中该供受者的D22S689的结果进行对照，确认梯度样品在13，16，17，20等位基因对应的片段大小处出现条带，说明样品无误，继续以下实验。8、实验数据用Genescangeotype软件收集，得到峰高和峰面积。9、计算嵌合率选用当供者有两个峰dAl,dA2，受者有两个峰rAl，rA2，各峰均不同时，嵌合率计算公式为(dAl+dA2)/(rAl+rA2+dAl+dA2);分别用峰面积和峰高计算，此时dAl,dA2对应13、20等位基因的峰，rAl，rA2对应16、17等位基因的峰。得到不同梯度样品对应的嵌合率。10、嵌合率的校正由于DNA浓度测定在不同仪器上会有些差异，这些差异可能会使检测到的浓度与实际浓度有偏移,本研究尝试用数学模型对这些偏移进行校正。设DNA浓度校正系数为X，，r代表受者，d代表供者，A:表示峰高或峰面积(dAl+dA2)XX/(rAl+rA2+(dAl+dA2)XX)=0.5,即X=(rAl+rA2)/(dAl+dA2)，此时rA和dA对应的是理论上50%混合的梯度样品时各峰的峰高或峰面积，计算得到DNA浓度校正系数X;1-(dAl+dA2)XX/(rAl+rA2+(dAl+dA2)XX)即为校正后的残留率，(dAl+dA2)XX/(rAl+rA2+(dAl+dA2)XX)为校正后的嵌合率；计算梯度样品中其它各浓度时的供者或受者的峰高或峰面积，填入上述公式，即可得到梯度样品中各浓度对应的校正残留率。实验结果1、根据步骤10计算得到校正残留率，绘制梯度样品的标准曲线图1。2、根据峰高与蜂面积分别计算得到嵌合结果，列于表3。从表3中可观察到峰高与蜂面积分别得到的嵌合率非常接近，用得到的原始数据计算两者的相关系数ri.999979，在其它标本中也得到类似结果，说明用峰高或峰面积都可以计算，不影响结果的判读，有些研究者倾向于用峰面积来计算，但在我们的数据中没有观察到两者有明显差异，经过校正的标准曲线得到的值与期望值差距基本小于0.015，提示检测误差率小于1.5%。每组的变异系数(CV)也均小于5%，校正的峰高组和峰面积组分别为0.77%和1.704%。说明本试剂盒检测嵌合率具有较高的准确性和精确性。表3根据峰高和峰面积计算得到的结果比较_经校正的计算峰经校正的计算峰~非校正的计算峰已知比例高得到的的残留非校正的计算峰面积得到的的残面积得到的残留R/DDNA率高得到的残留率留率率0細％0.000%'0.000%0.000%0.000%0.780%0.855%1.177%0.711%0.980%1.560%1.367%1.879%1.208%1.661%3.125%3.306%4,510%2.821%3.855%6.250%6.770%9.115%6.417%8.651%12.500%13.174%17.326%12.959%17.056%25細％26.427%33.161%26.172%32.8700/o37.500%37.433%,45.246%37.723%45.553%50扁％50細％57.997%50.520%58.510%62,500%62.299%69.534%62.343%69.574%75.000%74.612%80.234%74.626%80.246%87.500%87.954%90.979%88駕0/091.746%93.750%92.588%94.522%93.291%95.051%96"00%97.582%98.238%98.238%98.718%98.400%99.117%99.359%99.325%99.510%99.220%謂細％100細％100扁％100.000%CV0.7700/03.911%1.704%4.007%已知比例R/DDNA:按照试验方法步骤2制备的人为混合供受者的DNA梯度样品实施例4试剂盒的实际应用1本试剂盒可有效检出移植病人的移植后的嵌合变化，从而提示移植物究竟为植入或排1.供者与受者外周血DNA的获得在得到知情同意后，抽取移植病人l移植前、移植后7，14，21，27，30，170天以及供者外周血2mL，根据天根全血DNA抽提试剂盒(天根公司，中国北京)说明书，抽取基因组DNA。测定DNA浓度(核酸蛋白检测仪，Eppendorf,德国)后，稀释成10ug/mL，分装保存。2.分别以移植前供者与受者的DNA为模板，取实施例2制得的试剂盒中的各对引物，分别PCR扩增，扩增体系0.2mMdNTP，2mMMg2+，4uM引物，Taq-Gold酶1个单位以及10ugDNA，终体积为20uL。PCR反应条件:95。C，8min;94°C,lmin，65°Clmin,72°C，lmin，2个循环；94°C，lmin，61°Clmin，72°C，lmin'2个循环；94°C，lmin，58°Clmin，72°C，lmin，25循环；94°C,lmin,55°Clmin,72°C，lmin，5循环；60°C，10min。3.将来自同一供者的所有PCR产物各取luL混合，取混合产物luL加入luL甲酰胺变性剂和ROX-500内标(由16条带有ROX荧光素标记的双链DNA片段组成，分子量分别是70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490、500bp,可用作分子量标准物)后95。C2分钟后于4'C5分钟，于ABI3100遗传分析仪(ABI，美国)上电泳，获得供者的扩增格局，同样方法获得受者的扩增格局，将供者与受者的扩增格局进行比对，扩增格局提示D4S2366位点中，病人有一个峰116，供者有两个峰124，132，符合理想信息位点的特征。4.移植后标本只需扩增信息位点，只需加入信息位点的引物。因此在移植后，仅对其移植后样品追踪D4S2366。以移植后受者的DNA为模板，用D4S2366对应的引物扩增，取luL上述PCR产物加入1uL甲酰胺变性剂和R0X-500内标后95。C2分钟后于4°C5分钟，于ABI3100遗传分析仪上电泳，取得峰高和峰面积。扩增格局如图2所示5.嵌合率的计算，采用下列公式计算嵌合率(124峰面积+132峰面积)/(2X116峰面积+124峰面积+132峰面积)。由图2可以看出30天时病人的格局巳经与供者的格局一致(124，132)，己经植入91.54%，但到170天时病人自身的格局回复为自身格局为主体(116)，嵌合率跌至为20.11%，提示复发。实施例5试剂盒的实际应用217采用实施例2的试剂盒，采用与实施例4相同的方法，检测另一对供者与受者。将供者与受者的扩增格局进行比对，扩增格局提示D22S689位点中，病人有2个峰206、210，供者有2个峰194，222，符合信息位点的特征。在移植后，对其移植后样品追踪D22S689。以移植后受者的外周血细胞DNA为模板，用D22S689对应的引物扩增，取luL上述PCR产物加入1uL甲酰胺变性剂和ROX-500内标后95°C2分钟后于4'C5分钟，于ABI3100遗传分析仪上电泳，取得峰高和峰面积。扩增格局如图3所示。嵌合率的计算，采用下列公式计算嵌合率(194峰面积+222峰面积)/(206峰面积+210峰面积+194峰面积+222峰面积)。图3结果表明，7天时病人只有自己的格局(206，210)，14天时供者的格局(194，222)逐渐呈现，此时嵌合率为9.2%;而21天起病人体内细胞大部分为供者源性的细胞，此时嵌合率为95.1%;27天时供者源性的细胞依然为主，嵌合率为95.8%，说明来自供者的造血干细胞的外周血细胞在受者体内逐渐增加，植入成功，目前无复发。实施例5-19采用实施例2的试剂盒，采用与实施例4相同的方法，对15例病人移植后的追踪检测嵌合物，结果如下病例名移植后曰期嵌合物比例病例名移植后日期嵌合物比例RXR70%RWR70%149.21%14100%2195.06%2194.17%2795.78%9096.93%3097.50%18096.27%RWLR70%RCR1493.62%1598.64%2190.75%2296.14%2693.07%2690.04%3183.71%3091.54%18090.24%17020.11%36591.03%18RGR78.65%RGHR1488.73%1447.28%2191.44%2196.02%2793.96%2695.91%3390.47%3096.04%5192.52%RHR71.92%9291.19%21100%18094.24%26100%RYR70%30100%1464.63%180100%2199.09%RCZR1391.53%3098.36%25100%RSYR726.86%32100%1492.28%RMR770.12%2175.85%14100%2691.99%2197.37%腿1457.14%26100%21100%31100%2698.29%41100%30100%RYXR70%45100%21100%10094.47%26100%RWZR70%30100%1487.99%RSR2198.58%2188.63%27100%2690.04%33100%3091.65%48100%4093.12%90100%5592.68%180100%18094.36%上述结果说明的本发明试剂盒的成功运用。序列表<110>上海市血液中心<120>造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒及其应用〈130>PCNXY090121〈160〉16<170>Patentlnversion3.1〈210>1〈211>20〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223>引物〈400>1accaaatgagacagtggcat20〈210〉2〈211〉20〈212>廳<213〉artificialsequence〈220>〈223〉引物〈400〉2atgaggacggttgacatctg20<210>3〈211〉20〈212>■〈213〉artificialsequence<220〉〈223>引物〈400〉3tcctgacattcctagggtga20〈210>4<211〉25〈212〉DNA〈213>artificialsequence〈220>〈223〉引物〈400〉4aaaacaaatatggctctatctatcg25〈210〉5〈211〉20〈212〉腿〈213>artificialsequence〈220>〈223〉引物<400〉5aaggttccaggacacattca20〈210>6〈211>23〈212〉腿〈213〉artificialsequence〈220〉<223>引物〈400〉621cttgaaagctccataatcatacg23〈210〉7〈211>20〈212〉腿〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400>7gggtgattttcctctttggt20<210>8〈211〉20〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220>〈223〉引物<400>8tgattccaatcatagccaca20〈210〉9〈211>20〈212〉■〈213〉artificialsequence<220><223〉引物〈400〉9ac卿agtctgggatgtgga20〈210〉10〈211〉20〈212〉腿〈213〉artificialsequence<220><223>引物〈400〉10gcccaaaaagacagacagaa20〈210〉11<211〉26〈212〉廳〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉11caaagagtgaatgctgtacaaacagc26〈210>12〈211〉26〈212〉腿〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉12caagatgtgagtgtgcttttcaggag26<210>13<211〉20〈212〉腿〈213〉artificialsequence23〈220>〈223>引物〈400>13tgggttatgagtgcacacag20<210〉14<211>21〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉14aacagcaaaaagacacacagc21〈210〉15〈211〉22〈212〉腿〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉15tatgtacagacctgcaacttgc22〈210〉16〈211〉20〈212〉DNA<213>artificialsequence〈220〉〈223>引物〈400〉16cctgcctgcctatctatctg20权利要求1.一种造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒，试剂盒中含有下列STR位点的特异性引物D3S3045、D4S2366、D4S2639、D5S818、D13S317、D18S1002、D20S481和D22S689。2.如权利要求1所述造血千细胞移植后嵌合状态分析试剂盒，其特征在于，所述STR位点的特异性引物选自SEQIDNO.1-SEQIDNO,16。3.如权利要求1所述造血千细胞移植后嵌合状态分析试剂盒，其特征在于，所述STR位点的特异性引物经荧光标记。4.如权利要求1所述造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒，其特征在于，所述各STR位点对应的特异性引物分别独立包装。5.如权利要求1-4中任一权利要求所述造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括独立包装的dNTP、Mg"或Taq-Gold酶中的一种或多种试剂。6.如权利要求1-5中任一权利要求所述造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒的使用方法，包括下列步骤a.分别以骨髓移植术前供者及受者的外周血细胞DNA为模板，用试剂盒中的所有引物分别PCR扩增，将PCR扩增产物变性后上遗传分析仪的毛细管电泳，根据电泳结果确定等位基因；根据得到的供受者的等位基因，确定理想信息位点；b.以移植后受者的外周血细胞DNA为模板，用步骤a确定的理想信息位点对应的引物PCR扩增；c.将步骤b获得的PCR扩增产物变性后，上遗传分析仪的毛细管电泳，取得扩增产物对应的峰高或峰面积数据，并据此计算嵌合率。7.如权利要求6所述造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒的使用方法，其特征在于，所述理想信息位点符合下列条件供受者间至少有一个独特的等位基因片段；独特的等位基因满足与双方的其它任何;等位基因的序列长度至少相差2个重复序列的条件；一方的任何等位基因的序列长度和另一方的任何等位基因序列长度至少相差2个重复序列的STR位点。8.如权利要求6所述造血千细胞移植后嵌合状态分析试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤a和步骤b中PCR扩增的条件为95。C,8min;94°C，lmin,65°Clmin，72°C，lmin,2个循环；94°C,lmin，61°Clmin，72°C,lmin,2个循环；94°C,lmin，58°Clmin，72°C，lmin,25循环；94°C，lmin，55°Clmin，72°C，lmin，5循环；60°C，10min。9.如权利要求6所述造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤c对应不同的情况，嵌合率的计算公式分别如下当供者与受者对应一个信息位点各有两个峰，且供受者间只有一个峰不同，另一个峰相同时，相同的峰不予考虑，嵌合率计算公式为(dA)/(rA+dA);当供者有两个峰dAl，dA2，受者有两个峰rAl，rA2，各峰均不同时，嵌合率计算公式为(dAl+dA2)/(rAl+rA2+dAl+dA2);当供者有两个峰dAl,dA2，受者只有一个峰rAl，各峰均不同时，嵌合率计算公式为l-((2XrAl)/(2XrAl+dAl+dA2))或(dAl+dA2)/(2XrAl+dAl+dA2);当受者有两个峰rAl，rA2，供者有一个峰dAl，各峰均不同时，嵌合率计算公式为(2XdAl)/(2XdAl+rAl+rA2);当供者与受者对应一个信息位点，均只有一个峰dAl和rAl时，嵌合率计算公式为dAl/(rAl+dAl);上述公式中，r代表受者，d代表供者，A:表示峰高或峰面积。全文摘要本发明涉及造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒及其应用，本发明的试剂盒中含有下列STR位点的特异性引物D3S3045、D4S2366、D4S2639、D5S818、D13S317、D18S1002、D20S481和D22S689。本发明的试剂盒采用了目前商品化试剂所没有的引物对，这些引物对在供受者间提供信息性较高的试剂，因而适合拼装单信息位点的检测；可用于嵌合状态的定量追踪。文档编号C12Q1/68GK101509040SQ200910047838公开日2009年8月19日申请日期2009年3月19日优先权日2009年3月19日发明者朱自严,颖杨申请人:上海市血液中心