一种粘质沙雷氏菌及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，更具体的涉及一种促生兼具生物修复土壤的粘质沙雷氏 菌及其用途。
【背景技术】
[0002] 植物根际促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)是指自由生活 在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制 有害生物的有益菌类。当病害发生时施用PGPR微生物可以干扰植物与病原的互作，形成有 益于植物的新的平衡。
[0003] PGPR微生物防病促生机制是多种方式综合作用下的结果，包括PGPR微生物转化 土壤中植物不能直接利用的养分、产生调节植物生长的植物激素、产生挥发性气体、产生抑 制病原菌侵染的抑菌物质以及诱导植物产生抗病性等。目前许多PGPR菌株已被广泛应用 并成功商业化。
[0004] 另外，目前，在我国各地区的土壤中有不同程度的铅污染现象。土壤、水和肥料中 重金属铅可被植物吸收，然后通过农产品进入人体，从而危害人体健康。
[0005] 针对土壤重金属污染，植物-微生物修复技术由于效果显著、消耗小、无二次污染 等优点受到广大科研工作者的青睐。研宄表明，微生物，尤其是植物根际微生物与植物相互 作用，可以有效地提高土壤修复效果。筛选可以富集重金属铅的微生物，在防治植物病害、 促进植物生长的同时，为污染土壤的修复提供微生物资源。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明人进行了锐意研宄，结果发现：从土壤中分离获得菌株 Sa，通过观察菌株Sa的形态学特征，分析其生理生化特性以及同时结合16Sr DNA序列同源 性分析鉴定该菌株Sa为粘质沙雷氏菌，同时研宄了菌株Sa在防病、促生、定殖及对Pb2+的 吸附方面的作用，从而完成本发明。
[0007] 本发明的目的在于提供一种促生兼具生物修复土壤的粘质沙雷氏菌，其中，该 粘质沙雷氏菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO. 10711。
[0008] 本发明所提供的从土壤中分离出来的菌株Sa经过形态学鉴定、生理生化特征分 析以及16s rDNA序列同源性分析被鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)，该菌株 Sa已于2015年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC NO. 10711。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种植物枯萎病的防治剂，其中，包含保藏编号为 CGMCC NO. 10711的粘质沙雷氏菌。作为萌芦科植物的实例，具体可举出萌芦、瓢瓜、黄瓜、冬 瓜，南瓜、丝瓜、西瓜以及甜瓜中的一种多种。
[0010] 特别的，作为黄瓜，可举出品种为津绿11号的黄瓜。
[0011] 本发明的又一目的在于提供一种植物生长促进剂，其中，包含保藏编号为CGMCC NO. 10711的粘质沙雷氏囷。
[0012] 作为萌芦科植物的实例，具体可举出萌芦、瓢瓜、黄瓜、冬瓜，南瓜、丝瓜、西瓜以及 甜瓜一种或多种。
[0013] 特别的，作为黄瓜，可举出品种为津绿11号的黄瓜。
[0014] 本发明的在一目的在于提供一种土壤修复剂，其中，包含保藏编号为CGMCC NO. 10711的粘质沙雷氏囷。
[0015] 由本发明提供的粘质沙雷氏菌菌株Sa能够吸附重金属，特别的，粘质沙雷氏菌菌 株Sa能够对土壤中的二价铅离子进行吸附、沉淀、氧化和还原，从而有效的降低土壤中铅 的毒性。经本发明人研宄发现，粘质沙雷氏菌菌株Sa能够加快植物对土壤中重金属污染物 的富集作用，从而获得更好的效果。
[0016] 本发明提供的一种保藏号为CGMCC NO. 10711的粘质沙雷氏菌，对黄瓜枯萎病有良 好的防治效果，防治效果可高达57.3% ;还能够在黄瓜幼苗内定殖并对幼苗有显著的促生 作用；此外，通过原子吸收仪测定培养基中Pb2+的浓度变化，可以得知该粘质沙雷氏菌可 以吸附培养基中的Pb 2+，吸附效果好，吸附率可达47. 63%。
[0017] 保藏说明
[0018] 囷种名称：粘质沙雷氏囷
[0019] 拉丁名：（Serratia marcescens)
[0020] 菌株编号：Sa
[0021] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0022] 保藏机构简称：CGMCC
[0023] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0024] 保藏日期：2015. 4. 10
[0025] 保藏中心登记入册编号：CGMCC NO. 10711。
【附图说明】
[0026] 图1为实施1中通过MEG5. 0软件构建获得的系统发育树。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过实施例对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而 变得更为清楚、明确。
[0028] 在下述实施例中：
[0029] 黄瓜品种为"津绿11号"，由天津市绿丰园艺心技术开发有限公司提供；黄瓜枯 萎病菌（Fusarium oxysporum)，由天津农学院植物病理实验室提供；DNA分子标记（DNA Marker)以及PCR扩增试剂，由宝生物工程（大连）有限公司提供；细菌基因组DNA提取试 剂盒，由北京索莱宝科技有限公司（Solarbio)提供；Bio-Tek胶回收试剂盒，由美国Omega 生物技术有限公司提供；细菌通用引物，由上海生工生物工程有限公司提供；PCR仪，由美 国Bio-Rad公司提供；电泳仪，由日本Mupid公司提供；凝胶成像系统，由英国UVItec公司 提供；原子吸收分光光度计（AA-6300C)，由岛津（Shimadzu)公司提供；培养基：马铃薯 200g/L，葡萄糖 20g/L。
[0030] 实施例一粘质沙雷氏菌菌株Sa的分离以及鉴定
[0031] 1、粘质沙雷氏菌菌株Sa的分离
[0032] 通过包括下述步骤的方法从天津市西青区黄瓜根际土壤中分离获得：
[0033] (1)取IOg黄瓜根际土壤先加入到90mL无菌水中，然后接着加无菌水进行稀释，分 别形成无菌水的稀释度为1 : 1〇2、1 : 1〇3、1 : 1〇4、1 : 1〇5、1 : IO6的土壤稀释液，最后 进行充分振荡；
[0034] (2)吸取步骤（1)中稀释度为 I : 102、1 : 103、1 : 104、1 : 105、1 : IO6的土壤 稀释液各100 μ L相应的涂布于分别含有400、600、800、1000、1200、1400mg/l的硝酸铅的LB 固体培养基中，然后置于28°C下培养Id ;
[0035] (3)挑取经Id培养后长出的单菌落，然后在LB培养基平板上纯培养，获得菌株 S& 〇
[0036] 2、粘质沙雷氏菌菌株Sa的形态学鉴定
[0037] 对上述步骤1中处于对数生长期的菌株Sa采用革兰氏染色法进行染色，然后通过 光学显微镜观察粘质沙雷氏菌菌株Sa的形态学特征。
[0038] 通过观察，菌株Sa的单菌落为圆形，菌落中央凸起，红色，不透明，湿润，边缘整 齐。另外，菌株Sa的细胞呈短杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢。
[0039] 3、粘质沙雷氏菌菌株Sa的生理生化特征分析
[0040] 参考《伯杰氏系统细菌学手册》（第九版），同时参照《微生物学实验》（沈萍，范秀 容，李广武.微生物学实验（第四版）.北京：高等教育出版社，2007.)对菌株Sa的生理生 化特性进行测定，结果如下表1所示。
[0041] 表 1
[0042]
[0043] 注：在上述表1中，" + "表示阳性，""表示阴性。
[0044] 4、粘质沙雷氏菌菌株Sa的16s rDNA序列同源性分析
[0045] 菌株Sa的PCR扩增：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取步骤1中分离得 到的菌株Sa的16s rDNA作为PCR扩增模板后，利用PCR仪并以细菌通用引物27F 5' -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，1527R5，-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3，进行 16s rDNA 的 扩增。
[0046] 在上述扩增过程中，扩增体系为100 μ L !IOXBufTerlO μ L，脱氧核糖核苷三磷 酸（dNTP)4yL，细菌通用引物（primer)27F 4yL，细菌通用引物（primer) 1527R 4yL， TaqDNA聚合酶1 μ L，扩增模版DNA 1 μ L，加灭菌去离子水补至100 μ L ;PCR扩增程序为： 94°C预变性5min，然后94°C变性40s，50°C复性40s，72°C延伸45s循环35次，最后72°C充 分延伸10min，4°C保存。
[0047] PCR扩增产物的纯化：取5 μ LPCR扩增产物在1 %琼脂糖凝胶上进行电泳测试。
[0048] 目的片段测序：在电泳仪上进行电泳测试后，用Bio-Tek胶回收试剂盒回收 目的片段后由北京华大基因进行测序，将测定的序列提交至GenBank，获得序列号为： KM596774,再通过BlAST进行序列同源性检索分析。将测序结果与GenBank数据库中相关 菌株的16S rDNA进行比较后，使用MEGA5.0软件来构建系统发育树，从而确定出菌株Sa的 分类学地位。
[0049] 根据图1所示的结果，发现菌株Sa与GenBank登录号为M59160和KF155286的粘 质沙雷氏菌株（Serratia marcescens)同源性高达100%。
[0050] 注：GenBank是美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)建立的DNA序列数据库，从公共资源中获取序列数据，
[0051] MEGA5. 0为专用于构建系统发育树的软件，
[0052] BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白质数据库或DNA数据 库中进行相似性比较的分析工具，
[0053] 一般以同源性彡99%作为种水平的鉴定标准。
[0054] 鉴于上述对菌株Sa的形态学鉴定、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分 析结果，将步骤1中分离得到的细菌Sa鉴定