专利名称：日本血吸虫蛋白酶体α5亚基重组抗原及其表达、纯化与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物，具体涉及日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基(SjPSM Α5)重组抗原及 其表达、纯化以与在制备日本血吸虫病免疫预防疫苗中的应用。
背景技术：
日本血吸虫病是一种人兽共患寄生虫病。虽然在血吸虫病的防治上已经取得了巨 大成功，但是由于中间宿主钉螺难以消灭及血吸虫重复感染现象严重，全面控制血吸虫病 传播仍不容易。吡喹酮自问世以来，以其高效、低毒、使用方便、价格低廉等优点在血吸虫病 临床治疗和防治工作中得到广泛应用，并成为目前治疗血吸虫病的唯一药物，几十年来，未 见有新的治疗血吸虫病的药物出现。然而，近年来在曼氏血吸虫上已经有了吡喹酮抗性虫 株的报道，耐药虫株的出现引起了人们的高度关注。因此，加强抗血吸虫高效疫苗的开发和 新药物靶标的筛选显得格外重要。血吸虫童虫是在宿主体内发育早期阶段的虫体，也是虫体发育的关键阶段，虫体 比较脆弱，容易受到外界影响和宿主免疫系统的攻击。血吸虫在终宿主体内从尾蚴发育到 成虫，在形态和生理上都发生了很大的变化，这些变化的实现是以蛋白合成、降解途径的正 常进行为基础的。假如在童虫阶段对血吸虫的蛋白降解途径进行人为干预，则有可能使血 吸虫在宿主体内的蛋白降解途径受阻，继而对血吸虫之后的生长发育产生重要影响，对控 制血吸虫病有着重要的意义，同时也可为抗血吸虫疫苗和潜在药物靶标的研究提供基础。日本血吸虫PSM Α5基因是蛋白酶体诸多亚基中的成员之一。蛋白酶体途径是细 胞内除溶酶体途径之外主要的蛋白降解途径。在泛素依赖性的蛋白降解途径中，绝大多数 底物的降解要先与多个泛素分子共价结合进行降解标记，泛素偶联的蛋白被蛋白酶体识别 并迅速降解。蛋白酶体广泛地存在于酵母、果蝇、吸虫以及小鼠等生物中，但至今对日本血 吸虫蛋白酶体的研究还没有报道。蛋白酶体的α亚基既可以自身装配成环，也为β环装 配所必需，并提供了蛋白酶体活化因子ΡΑ700和ΡΑ28的结合位点；同时α亚基位于20S蛋 白酶体的入口处，一方面能控制蛋白质的进入，另一方面又能阻止部分水解的底物从活性 位点释放，这些都说明α亚基可能在蛋白酶体的结构和功能中起着重要的作用。血吸虫从 尾蚴侵入终宿主体内到发育为成虫，在大小、形态、生物学和生理学等方面都发生了很大变 化，这些变化的实现以大量内源性蛋白的降解为基础，而蛋白酶体又在这一过程中起着重 要的作用。通过对蛋白酶体结构和功能的深入研究，了解各亚基的作用及相互之间的关系， 将会对整个蛋白酶体在血吸虫蛋白降解、生长发育中所起的作用有更深的认识。本发明人应用生物信息学方法和基因工程技术研制的重组抗原pET28a(+)_SjPSM A5在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内的抗重组抗原的特异性IgG抗体迅速产生，并且维持 在一个较高的水平，同时诱导了 23. 29%的减虫率和35. 24%的肝组织减卵率。特异性抗体 在杀伤虫体中可能起了一定的作用，该重组蛋白具有潜在的抗血吸虫病作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究设计日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基(SjPSM Α5)抗原及其表达、纯化与在制备日本血吸虫病免疫预防疫苗中的应用。本发明提供了一种日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基(SjPSM Α5)重组抗原。 所述日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基(SjPSM Α5)重组抗原编码核苷酸片断具有如 下核酸序列和相应的氨基酸序列SjPSMA5 核酸序列ATGTTTCTCACTAGGACAGAATATGATCGTGGAGTTAACACGTTTTCTCCAGAGGGACG
ACTTTTCCAAGTGGAATATGCCATAGAGGCTACAAAGCTGGGTTCGACAGGTATCGGTATCAAGACGAATGAAGGTGTTGTTATGGCCGTAGAAAAACGTGTGAACTCAACTCTAATCATACCGTCCAGCATTGAAAAGATTTTTGAAGTCGACAAGCACATTGCGTGCGCTGTCAGTGGGCTGGTCGCAGATGCAAGAACTCTAATAGAACGTGCACGTACAGAAGCAGCTCATCATTGGTTCGTATACAATGAAAAAATGGCTATTGAAGACGTAACTAAAGCTGTTAGTAACTTGGCACTAGCACTTGGTGATGATGATATGGAGTCTGGAGCAATGAGTCGGCCATTCGGTGTTGCCTTGTTATTTGCTGGAGTAGATGAACGAGGTCCACAGCTATATCATATGGATCCAAGTGGAACATATATTCGATATGAAGCTAAAGCAATTGGTTCCGGTTCTGAAGGTGCACAGCAAGCTTTACAAGAAATCTATCATAAGAATATGACATTACACGAAGGTTGTAAACATGCTTTGTCAATTTTGAAACAAGTTATGGAAGAAAAGCTTGATTCAACCAATGTAGAAATGGCAACTGTCAGTGTGAAAAATAATTATCACATATTCAATAAAGATGAAGTCCAGGCTATCATTGAAGAAATTAACCAGTCTCCATCATCCTCTTAASJPSMA5氨基酸序列MFLTRTEYDRGVNTFSPEGRLFQVEYAIEATKLGSTGIGIKTNEGVVMAVEKRVNSTLIIPSSIEKIFEVDKHIACAVSGLVADARTLIERARTEAAHHWFVYNEKMAIEDVTKAVSNLALALGDDDMESGAMSRPFGVALLFAGVDERGPQLYHMDPSGTYIRYEAKAIGSGSEGAQQALQEIYHK匪TLHEGCKHALSILKQVMEEKLDSTNVEMATVSVKNNYHIFNKDEVQAIIEEINQSPSSS本发明另一目的提供了日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基(SjPSM Α5)重组抗原的表 达和纯化方法。本发明在双向电泳技术和质谱技术基础上对获得的19d血吸虫童虫表达蛋 白进行生物信息学分析，应用PCR技术扩增获得编码日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基 (SjPSM Α5)肽段所对应的编码核苷酸片段，运用基因工程重组技术将核苷酸片段重组到 载体pET28a(+)中，构建了 pET28a(+)-SjPSM A5原核表达质粒。将重组原核表达质粒 pET28a(+)-SjPSM A5转化大肠杆菌BL21后进行了诱导表达并且纯化到重组蛋白。本发明提供的日本血吸虫重组抗原的表达和纯化方法包括以下步骤(1)利用生物信息学进行在线分析，找出肽段所对应的编码核苷酸片段；(2)根据上述核酸序列设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点， PCR扩增核酸片断；(3)利用特异限制性内切酶EcoR I, Xho I将编码SjPSM A5抗原的核酸 片段定向克隆至原核表达载体pET28a⑴的多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pET28a(+)-SjPSM A5，并转化到大肠杆菌BL21中；(4)用IPTG诱导表达，并用亲和层析纯化His融合蛋白的方法纯化到日本血吸虫 重组蛋白，得到日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基(SjPSM Α5)重组抗原。本发明的又一目的是提供了日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基(SjPSM Α5)重组抗原 在制备日本 血吸虫病免疫预防疫苗中的应用。本发明提供的日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基(SjPSM Α5)重组抗原，经抗原性检测 与免疫预防实验，结果显示与PBS对照组相比，重组蛋白PSM Α5在BALB/c小鼠中诱导了 23. 29%的减虫率，35. 24%的肝组织减卵率，差异都显著(P < 0. 05)。
图1 重组原核表达质粒pET28a (+) -SjPSM A5的构建图2 重组原核表达质粒的酶切鉴定Ml :DL15000Manker ；1 =EcoR I and Xho I 酶切后的空质粒 pET28a (+)；2 =EcoR I and Xho I 酶切后的 pET28a (+)-SjPSM A5 ；M2 :DL2000 ；3 SjPSM A5 片段图3 实时定量PCR检测SjPSM A5基因在日本血吸虫不同期别和性别虫体中的表 达7d 7天童虫；13d 13天童虫；18d 18天童虫；23d 23天童虫；32d 32天虫体； 42d(m) 42 天雄虫；42d(f) 42 天雌虫图4 融合蛋白pET28a(+)-SjPSM A5时相表达的电泳分析M:低分子量蛋白标准；1-8 :IPTG 分别诱导了 Oh、lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h 的 pET28a(+)-SjPSM A5图 5 SDS-PAGE 分析 IPTG 诱导 pET28a (+) -SjPSM A5 的表达M 低分子量蛋白标准；1 :IPTG诱导了 6小时的pET28a(+)_SjPSMA5 ；2 未诱导的 pET28a(+) -SjPSM A5 ；3 :IPTG 诱导了 6 小时的 pET28a(+) ；4 未诱导的 pET28a(+) ；5 =IPTG 诱导了 6小时的空宿主菌BL21图 6 SDS-PAGE 分析纯化的 pET28a (+) -SjPSM A5M 低分子量蛋白标准；1 纯化的pET28a(+)-SjPSM A5图 7 =Western blotting 分析 SjPSM A5 的抗原性M 预染蛋白标准；1 IPTG 诱导了 6 小时的 pET28a(+) -SJPSMA5 ；2 IPTG 诱导了 6 小时的 pET28a(+)；图8 :BALB/c小鼠血清抗SjPSM A5抗原特异性IgG抗体水平检测结果。横坐标为 采血时间，取了免疫前、一免、二免、三免及剖杀时5个时间点；纵坐标为OD45tl值；+代表 免疫组；代表佐剂对照组；+代表空白对照组。
具体实施例方式实施例日本血吸虫重组抗原的表达、纯化、抗原性检测与免疫预防实验1、材料试剂和酶
Trizol、逆转录酶、RNA 酶抑制剂购自 Invitrogen 公司；Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoR I,Xho I,SYBR Green I、EASYDiIution购自 TaKaRa 生物工程(大连)有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、B型质粒小量快速提取试剂盒购 自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；可溶型、沉淀型四甲基联苯胺(TMB)购自天 根生化科技(北京)有限公司；硝酸纤维素膜购自Whatman公司；山羊抗兔IgG-HRP、山羊 抗小鼠IgG-HRP购自上海鼎国生物工程公司；日本血吸虫中国大陆株尾蚴由本所钉螺室提 供；日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清由本实验室制备。菌种、质粒及实验动物pET28a(+)菌液/大肠杆菌DH5 α、BL21由本所保存菌种是公开的。新西兰白兔 (雄性，2.5kg-3kg)购自上海罗泾飞达实验动物养殖场。日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中 国农科院上海兽医研究所钉螺室提供。2、方法(1)重组表达质粒的构建在双向电泳结合肽质量指纹图谱分析基础上获得的一个在童虫期呈现高表达的 PSM A5蛋白的一段序列，以此肽序列为询问序列，在日本血吸虫EST库中搜索到1个日本血 吸虫的相应EST片段(GenBank Acession No. FJ595238)。根据该EST序列设计特异引物， 应用PCR技术进行ORF片断的扩增。上游引物SjPSM A5FP 5’ -GCGCGAATTCATGTTTCTCA-3’, (下划线处为 EcoR I 酶切位点)；下游引物 SjPSM A5RP :5，-GCGCCTCGAGTTAAGAGGAT-3，, (下划线处为Xho I酶切位点)。取1 μ 1反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反 应条件为94°C预变性lOmin，然后94°C、30s，55°C >30s, 72°C、lmin,共30个循环，循环结束 后72°C延伸lOmin。最后将PCR产物保存于4°C，进行琼脂糖水平电泳观察PCR产物。按博 大泰克生物有限公司DNA Agarose Gel Purification Kit纯化回收试剂盒的操作手册进 行PCR产物回收纯化。最后将DNA溶解于30 μ 1 TE或水。用EcoR I,Xho I 将 SjPSM Α5 的 DNA片断和 pET28a(+)载体酶切，用 T4DNA Iigase 重组连接，构建pET28a(+)-SjPSMA5重组质粒。将质粒转入大肠杆菌BL21。然后将重组质 粒用酶切、PCR鉴定，并将阳性克隆送上海英骏生物公司测序。(2)荧光实时定量PCR选择血吸虫持家基因18sRNA为内参。分别提取7d、13d、18d、23d、32d、42d虫 体及42d雄虫、雌虫总RNA，去除基因组DNA后利用随机引物合成cDNA第一链。SjPSM A5 荧光定量 PCR 引物SjPSM A5FP :5，-CGTACAGAAGCAGCTCATCATTGG-3，，SjPSM A5RP 5，-CAAATAACAAGGCAACACCGAATGG-3，，扩增 SjPSM A5 基因片段长度为 154bp ； 18sRNA 荧光 定量 PCR 引物 Sl :5，-GCAAACTGTTTCATCACCG-3，，S2 :5，-CAATCCAACGACCTCACTAA-3，，片段 扩增长度172bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。采用荧光染料法进行实时定量 PCR，反应体系包括2XSYBR Premix Ex TaqTM 10 μ 1,10 μ mol/L ForwardPrimer 0. 4μ 1, 10ymol/L Reverse Primer 0. 4μ 1, ddH20 8. 2 μcDNA 1.0卩1，共20卩1。反应参 数95°C 10s, (95°C 5s, 55°C 10s，72°C 15s) 40个循环，其中72°C 15s结束时间为荧光信号 检测点。每个反应均做3孔重复。采用CorbettResearch公司Rotor-Gene软件进行计算 分析，以ISsRNA为内参标化反应结果，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量。(3)重组质粒pET28a (+) -SjPSM A5在大肠杆菌中的表达
将鉴定好的pET28a(+)-SjPSM A5/BL21按1 %接种于一定量的含50 μ g/ml卡纳霉 素的LB培养基中，37°C振荡培养，OD600为0. 6时加入终浓度为lmmol/LIPTG诱导表达。在 1卩丁6诱导后他、111、211、311、411、511、611、711，各取出100 μ 1细菌培养物，加入2X上样缓冲液 IOOy 1，在混勻器上混勻后于沸水中煮3到5分钟后，进行SDS-PAGE电泳，用考马氏亮蓝对 SDS-PAGE电泳胶进行染色，室温摇动染色4小时以上。脱色后，对凝胶进行扫描，分析其分 子量和表达状况。(4)重组抗原 pET28a(+)-SjPSM A5 的纯化 将前述鉴定的菌株过夜培养，第二天按的量加入200ml液体LB培养基中扩大 培养3h后，加入IPTG诱导6h。4°C，lOOOr/min离心收集菌体。将收集的菌体在_70°C冰箱 和室温反复冻融5次。超声裂解破碎细胞10次(IOsec/次)，4°C 5000g离心15min，分别 取离心后的沉淀和上清样品，以SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的溶解性。根据novagen蛋白重折叠试剂盒预处理包涵体蛋白，进行复性处理，并进一步按 novagen公司提供的His亲和层析方法进行pET28a (+)-SjPSM A5重组蛋白的纯化。纯化后 的重组蛋白用PBS透析去除小分子，经SDA-PAGE分析和蛋白含量测定后，用PBS稀释至一 定浓度，于_20°C保存备用。(5) Western blotting 检测将高表达时相菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移到硝酸纤维素膜上，用经 pET28a(+)/BL21大肠杆菌蛋白吸附的日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作一抗，辣根过氧化 物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗，TMB作为底物进行显色。(6)动物免疫试验①免疫将30只BALB/c小鼠随机分为SjPSM A5+206佐剂组、206佐剂组、PBS 组，每组10只，重组蛋白SjPSM A5的注射剂量为每次每鼠20 μ g/100 μ 1，共免疫3次，每 次间隔20天。各免疫组小鼠分别在免疫前1周，每次免疫后2周采血，按照间接ELISA方 法操作，以10μ g/ml纯化SjPSM A5重组蛋白4°C包被过夜，次日以1. 5%小牛血清白蛋白 (PBST稀释)于37°C封闭lh，小鼠血清作1 100稀释，于37°C温育lh，以HRP-兔抗小鼠 IgG(l 2500)做二抗，于37°C温育lh，各步骤间用PBST洗涤3次，每次5min，最后以可溶 性TMB溶液进行显色，2mol/L硫酸终止反应，在450nm波长处读取OD45tl值。②攻击感染末次免疫2周后，每只小鼠用腹部盖玻片法感染尾蚴30士2条。攻击 尾蚴后6周解剖小鼠，肝门静脉冲洗法收集成虫记数，同时收集每只小鼠的肝脏。称取肝组 织0. 5g，剪碎后加5% NaOH 10ml，组织勻浆器勻浆，放56°C水浴消化lh，混勻，吸取20 μ 1 的悬液3份，镜检计数肝组织虫卵。按以下公式计算减虫率、肝脏减卵率(EPG为平均每克 肝组织中所负荷虫卵数)。减虫率=(1-免疫组平均虫荷数/对照组平均虫荷数)X 100%减卵率=(1-免疫组EPG/对照组EPG) X 100%3、结果(1)重组表达质粒构建利用PCR和限制性内切酶位点EcoR I、XhoI将SjPSM Α5目的核苷酸片段亚克隆 入载体pET28a(+)中，PGR、酶切鉴定重组的原核表达质粒均出现了与预期大小一致的DNA 片段(图2)。对阳性克隆的菌落小量液体培养后，将菌液样本送上海英俊生物公司测序，结果证实含多表位的核苷酸序列编码阅读框正确。(2) SjPSM A5基因的期别、性别表达分析实验结果表明，SjPSM A5在日本血吸虫在7d童虫、13d童虫、18d童虫、23d虫体、32d虫体和42d成虫中都有表达，32d虫体表大量最高，7d童虫和42d成虫表达量较低，其中 42d雄虫的表达量高于雌虫(图3)。(3)融合蛋白pET28a (+) -SjPSM A5诱导表达结果将含重组质粒pET28a (+) -SjPSM A5的BL21大肠杆菌于含50 μ g/ml卡那霉素的 LB培养液中振摇培养，加入IPTG诱导表达0、1、2、3、4、5、6、7小时，分别取细菌培养物进行 SDS-PAGE电泳分析。结果表明，pET28a(+)-SJPSMA5/BL21经IPTG诱导后不同时相的菌液 均有预期大小的特异目的蛋白(约31KDa)条带出现，在诱导6小时后其表达量达到最高水 平(见图4、5)。(4)融合蛋白纯化结果分别大量培养菌株BL21/pET28a(+)-SjPSM A5，IPTG诱导后，离心收集菌体，反复 冻融、超声裂解破碎细菌，SDS-PAGE电泳分析发现pET28a(+)-SjPSM A5重组蛋白以包涵体 表达。按novagen蛋白重折叠试剂盒预进行复性处理，并进一步用亲和层析方法纯化。经 过纯化得到了纯度较高的重组蛋白(图6)(5)融合蛋白抗原性鉴定以重组表达产物进行SDS-PAGE电泳，经电转移至NC膜上，用经pET28a(+)/BL21 大肠杆菌蛋白吸附的日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作一抗进行Western blot分析，结果 在31kD处有一明显的识别条带(图7)，表明重组表达产物蛋白具有良好的抗原性。a)动物免疫试验结果用间接ELISA方法检测各组小鼠血清中抗SjPSM A5特异性抗体IgG变化，试验结 果表明，SjPSM A5免疫组小鼠在第1次免疫后就检测到特异性抗SjPSM A5蛋白的IgG抗 体，在第2次免疫后特异性IgG抗体滴度进一步升高，第3次免疫后达到最高。佐剂对照组 及空白对照组在整个实验过程中抗SjPSM A5的特异性IgG抗体滴度均未出现明显的变化。 (图8)试验小鼠于攻击感染42天后剖杀、冲虫计数。与PBS对照组相比，重组蛋白PSM A5在BALB/c小鼠中诱导了 23. 29%的减虫率，35. 24 %的肝组织减卵率，差异都显著(P < 0. 05)。(见表 1)。表IBALB/c小鼠保护实验结果Table 1.Worm and egg counting reduction rate induced by SjPSM A5 in BALB/c mice 序列表所述日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基(SjPSM Α5)重组抗原编码核苷酸片断具有如 下核酸序列和相应的氨基酸序列<110>中国农业科学院上海兽医研究所<120>日本血吸虫蛋白酶体α 5亚基重组抗原及其表达、纯化与应用<130><160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>747<212>DNA<213> 日本分体吸虫(Schistosoma japonicum)<400>1atgtttctca ctaggacaga atatgatcgt ggagttaaca cgttttctcc agagggacga 60cttttccaag tggaatatgc catagaggct acaaagctgg gttcgacagg tatcggtatc 120aagacgaatg aaggtgttgt tatggccgta gaaaaacgtg tgaactcaac tctaatcata 180ccgtccagca ttgaaaagat ttttgaagtc gacaagcaca ttgcgtgcgc tgtcagtggg 240ctggtcgcag atgcaagaac tctaatagaa cgtgcacgta cagaagcagc tcatcattgg 300ttcgtataca atgaaaaaat ggctattgaa gacgtaacta aagctgttag taacttggca 360ctagcacttg gtgatgatga tatggagtct ggagcaatga gtcggccatt cggtgttgcc 420ttgttatttg ctggagtaga tgaacgaggt ccacagctat atcatatgga tccaagtgga 480acatatattc gatatgaagc taaagcaatt ggttccggtt ctgaaggtgc acagcaagct 540ttacaagaaa tctatcataa gaatatgaca ttacacgaag gttgtaaaca tgctttgtca 600attttgaaac aagttatgga agaaaagctt gattcaacca atgtagaaat ggcaactgtc 660agtgtgaaaa ataattatca catattcaat aaagatgaag tccaggctat cattgaagaa 720attaaccagt ctccatcatc ctcttaa747<210>2<211>248<212>PRT
<213> 日本分体吸虫(Schistosoma japonicum)<400>2 Met Phe Leu Thr Arg Thr Glu Tyr Asp Arg Gly Val Asn Thr Phe Ser151015Pro Glu Gly Arg Leu Phe Gln Val Glu Tyr Ala lie Glu Ala Thr Lys202530Leu Gly Ser Thr Gly lie Gly lie Lys Thr Asn Glu Gly Val Val Met354045Ala Val Glu Lys Arg Val Asn Ser Thr Leu lie lie Pro Ser Ser lie505560Glu Lys lie Phe Glu Val Asp Lys His lie Ala Cys Ala Val Ser Gly65707580Leu Val Ala Asp Ala Arg Thr Leu lie Glu Arg Ala Arg Thr Glu Ala859095Ala His His Trp Phe Val Tyr Asn Glu Lys Met Ala lie Glu Asp Val100105110Thr Lys Ala Val Ser Asn Leu Ala Leu Ala Leu Gly Asp Asp Asp Met115120125Glu Ser Gly Ala Met Ser Arg Pro Phe Gly Val Ala Leu Leu Phe Ala130135140Gly Val Asp Glu Arg Gly Pro Gln Leu Tyr His Met Asp Pro Ser Gly145150155160Thr Tyr lie Arg Tyr Glu Ala Lys Ala lie Gly Ser Gly Ser Glu Gly165170175Ala Gln Gln Ala Leu Gln Glu lie Tyr His Lys Asn Met Thr Leu His180185190Glu Gly Cys Lys His Ala Leu Ser lie Leu Lys Gln Val Met Glu Glu195200205Lys Leu Asp Ser Thr Asn Val Glu Met Ala Thr Val Ser Val Lys Asn210215220Asn Tyr His lie Phe Asn Lys Asp Glu Val Gln Ala lie lie Glu Glu225230235240lie Asn Gln Ser Pro Ser Ser Ser24权利要求
日本血吸虫蛋白酶体α5亚基重组抗原，其特征在于所述重组抗原的编码核苷酸片断具有如下核酸序列和相应的氨基酸序列SjPSMA5核酸序列atgtttctca ctaggacaga atatgatcgt ggagttaaca cgttttctcc agagggacga 60cttttccaag tggaatatgc catagaggct acaaagctgg gttcgacagg tatcggtatc120aagacgaatg aaggtgttgt tatggccgta gaaaaacgtg tgaactcaac tctaatcata180ccgtccagca ttgaaaagat ttttgaagtc gacaagcaca ttgcgtgcgc tgtcagtggg240ctggtcgcag atgcaagaac tctaatagaa cgtgcacgta cagaagcagc tcatcattgg300ttcgtataca atgaaaaaat ggctattgaa gacgtaacta aagctgttag taacttggca360ctagcacttg gtgatgatga tatggagtct ggagcaatga gtcggccatt cggtgttgcc420ttgttatttg ctggagtaga tgaacgaggt ccacagctat atcatatgga tccaagtgga480acatatattc gatatgaagc taaagcaatt ggttccggtt ctgaaggtgc acagcaagct540ttacaagaaa tctatcataa gaatatgaca ttacacgaag gttgtaaaca tgctttgtca600attttgaaac aagttatgga agaaaagctt gattcaacca atgtagaaat ggcaactgtc660agtgtgaaaa ataattatca catattcaat aaagatgaag tccaggctat cattgaagaa720attaaccagt ctccatcatc ctcttaa747SjPSM A5氨基酸序列Met Phe Leu Thr Arg Thr Glu Tyr Asp Arg Gly Val Asn Thr Phe Ser 1 5 10 15Pro Glu Gly Arg Leu Phe Gln Val Glu Tyr Ala Ile Glu Ala Thr Lys20 25 30Leu Gly Ser Thr Gly Ile Gly Ile Lys Thr Asn Glu Gly Val Val Met 35 40 45Ala Val Glu Lys Arg Val Asn Ser Thr Leu Ile Ile Pro Ser Ser Ile 50 55 60Glu Lys Ile Phe Glu Val Asp Lys His Ile Ala Cys Ala Val Ser Gly65 70 75 80Leu Val Ala Asp Ala Arg Thr Leu Ile Glu Arg Ala Arg Thr Glu Ala85 90 95Ala His His Trp Phe Val Tyr Asn Glu Lys Met Ala Ile Glu Asp Val100 105 110Thr Lys Ala Val Ser Asn Leu Ala Leu Ala Leu Gly Asp Asp Asp Met115 120 125Glu Ser Gly Ala Met Ser Arg Pro Phe Gly Val Ala Leu Leu Phe Ala 130 135 140Gly Val Asp Glu Arg Gly Pro Gln Leu Tyr His Met Asp Pro Ser Gly145 150 155 160Thr Tyr Ile Arg Tyr Glu Ala Lys Ala Ile Gly Ser Gly Ser Glu Gly165 170 175Ala Gln Gln Ala Leu Gln Glu Ile Tyr His Lys Asn Met Thr Leu His180 185 190Glu Gly Cys Lys His Ala Leu Ser Ile Leu Lys Gln Val Met Glu Glu195 200 205Lys Leu Asp Ser Thr Asn Val Glu Met Ala Thr Val Ser Val Lys Asn 210 215 220Asn Tyr His Ile Phe Asn Lys Asp Glu Val Gln Ala Ile Ile Glu Glu225 230 235 240Ile Asn Gln Ser Pro Ser Ser Ser245
2.如权利要求1所述的日本血吸虫蛋白酶体a5亚基重组抗原的表达和纯化方法其特 征在于该方法包括以下步骤(1)利用生物信息学进行在线分析，找出肽段所对应的编码核苷酸片段；(2)根据上述核酸序列设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点，PCR 扩增核酸片断；(3)利用特异限制性内切酶EcoRI、Xho I将编码SjPSM A5抗原的核酸片段定向克 隆至原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pET28a(+)-SjPSM A5，并转化到大肠杆菌BL21中；(4)用IPTG诱导表达，并用亲和层析纯化His融合蛋白的方法纯化到日本血吸虫重组 蛋白，得到日本血吸虫蛋白酶体a 5亚基SjPSM A5重组抗原。
3.如权利要求1所述的日本血吸虫蛋白酶体a5亚基重组抗原在制备日本血吸虫病免 疫预防疫苗中的应用。
全文摘要
本发明提供了日本血吸虫蛋白酶体α5亚基(SjPSM A5)重组抗原及其表达、纯化。本发明提供的日本血吸虫蛋白酶体α5亚基(SjPSM A5)重组抗原，经抗原性检测与免疫预防实验，结果显示与PBS对照组相比，重组蛋白PSM A5在BALB/c小鼠中诱导了23.29％的减虫率，35.24％的肝组织减卵率，差异都显著(P＜0.05)，可用于制备日本血吸虫病免疫预防疫苗。
文档编号C12N9/64GK101838639SQ20091004789
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者傅志强, 刘金明, 孙安国, 孙帅, 彭金彪, 李晔, 林矫矫, 洪炀, 王欣之, 石耀军, 韩宏晓 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所