本发明涉及一种昆虫细胞培养基，特别是涉及一种无血清昆虫细胞培养基及其制备方法和应用。
背景技术：
昆虫细胞培养是近年来细胞工程中迅速发展的一个领域，其广泛应用于医学、农业及生物学的各个方面。昆虫细胞培养基是昆虫细胞培养的关键，其是昆虫细胞赖以生长、增殖、分化的重要因素。昆虫细胞对营养的要求较高，往往需要多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、激素、生长因子等。
天然培养基主要取自动物体液或从动物组织分离提取，其营养成分丰富，培养效果良好，常见的有水解乳蛋白和新生牛血清。血清虽然对细胞的生长较为有效，但其应用存在诸多缺点：高质量的动物血清来源有限、成本高，从而限制了其大量使用；动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚不清楚，对后期培养产物的分离、提纯以及检测造成一定困难；血清也是支原体和其它病毒污染的重要来源；每批血清的质量不同，影响细胞生长和复制的稳定性，到目前为止还无法采用血清培养基进行大规模的商业化生产和应用。因此，迫切需要一种低成本并且可实现大规模昆虫细胞培养的无血清昆虫细胞培养基。
技术实现要素：
本发明提供一种无血清昆虫细胞培养基及其制备方法和应用，该无血清昆虫细胞培养基成本相对较低，长期贮存稳定性好，在对昆虫细胞进行培养时细胞密度高，易于实现大规模生产和应用。
本发明提供的无血清昆虫细胞培养基，包括基础组分、蛋白组分、脂质组分和助剂，其中所述基础组分包括9～14重量份的无机盐、3.3～5重量份的氨基酸或其盐、0.17～0.26重量份的水溶性维生素、0.0016～0.0024重量份 的激素和0.0024～0.0036重量份的微量元素，所述蛋白组分包括1.6～2.4重量份的动物蛋白水解物、2.4～3.6重量份的植物蛋白水解物和2.4～3.6重量份的酵母提取物，所述脂质组分包括0.14～0.22重量份的脂肪酸、0.028～0.042重量份的脂溶性维生素和0.24～0.36重量份的胆固醇，所述助剂包括7.2～10.8重量份的消泡剂和2.6～4重量份的表面活性剂。
本发明的无血清昆虫细胞培养基中，所述脂肪酸包括如下重量份的成分：
本发明的无血清昆虫细胞培养基中，所述脂溶性维生素包括如下重量份的成分：
维生素A 0.008～0.012重量份
维生素D 0.004～0.006重量份
维生素E 0.016～0.024重量份。
本发明的无血清昆虫细胞培养基中，所述动物蛋白水解物选自胰胨、肉胨和骨胨中的一种或多种；所述植物蛋白水解物选自大豆蛋白水解物、小麦蛋白水解物、土豆蛋白水解物和豌豆蛋白水解物中的一种或多种。
本发明的无血清昆虫细胞培养基中，所述无机盐可以选用本领域常规用于无血清昆虫细胞培养基的无机盐；进一步地，所述无机盐包括如下重量份的成分：
本发明的无血清昆虫细胞培养基中，所述氨基酸可以选用本领域常规用于昆虫细胞培养基的氨基酸，特别是选用L型氨基酸，所述氨基酸盐可以为盐酸盐；进一步地，所述氨基酸或其盐包括如下重量份的成分：
本发明的无血清昆虫细胞培养基中，所述水溶性维生素包括如下重量份的成分：
本发明的无血清昆虫细胞培养基中，所述微量元素包括如下重量份的成分：
在本发明的无血清昆虫细胞培养基中，所述激素可以为本领域常规用于昆虫细胞培养基的激素，例如胰岛素，其可加强糖类物质的吸收；所述消泡剂可以为本领域常规的消泡剂，例如泊洛沙姆188；所述表面活性剂可以为非离子型表面活性剂，例如吐温80。
本发明无血清昆虫细胞培养基中所采用的各成分的纯度均≥98％，进一步≥99％；各成分均可以通过普通市售获得。并且，在不对本发明的无血清昆虫细胞培养基在培养昆虫细胞时造成不利影响的前提条件下，该无血清昆虫细胞培养基还可以包括其它的常规培养基成分，例如转铁蛋白(其可转运铁)、微量元素硒、乙醇胺(其可作为脂质前体)等，这些常规培养基成分的用量可以为本领域的常规用量。可以采用本领域常规方法制备所述无血清昆虫细胞培养基。
特别是，本发明还提供上述无血清昆虫细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：
按照重量份配比将所述脂质组分中的各成分混合后，加入有机溶剂，搅拌至完全溶解，制得第一溶液；
将赋形剂溶于水中，制得第二溶液；
在搅拌状态下将所述第一溶液缓慢加入到所述第二溶液中，形成混合溶 液，对所述混合溶液真空冷冻干燥，制得所述脂质组分；
按照重量份配比将所述脂质组分与所述无血清昆虫细胞培养基中的其它成分混合，制得所述无血清昆虫细胞培养基。
在本发明中，所述重量份配比指各组分中的各个成分之间的重量配比；所述赋形剂可为本领域常规的赋形剂，例如甘露醇、氯化钾、葡萄糖、组氨酸、甘氨酸等，并且可以控制赋形剂在所述脂质组分中的质量含量为85～95％；所述有机溶剂可以为能够溶解所述脂质组分中各成分的溶剂，例如无水乙醇等。该制备方法将脂质成分进行单独制备，其既易于储存，而且不易变质，从而有利于保证培养基产品的质量稳定。
进一步地，可以单独对基础组分中的微量元素进行混合，混合方法可以为：将微量元素中的各成分制成溶液后，按照重量份配比混合形成混合溶液，向所述混合溶液中加入赋形剂后，干燥，制得微量元素。特别是，在制备微量元素时，可按照扩大的重量份进行制备，以使各成分分散更加均匀。
进一步地，可以单独对基础组分中的水溶性维生素进行混合，混合方法可以为：将水溶性维生素中的各成分制成溶液后，按照重量份配比混合形成混合溶液，向所述混合溶液中加入赋形剂后，干燥，制得水溶性维生素。特别是，在制备水溶性维生素时，可按照扩大的重量份进行制备，以使各成分分散更加均匀。
在将各成分制成溶液时，各成分可以单独进行溶解，也可以使溶解性质相同的成分按照重量份同时溶解于水、酸溶液、碱溶液中的一种中，在混合形成的混合溶液中，各成分的重量份应当满足各组分中各成分的重量份配比要求，并且各组分中的各成分在混合溶液的总质量含量可以为5～15％。
具体地，溶解各成分所采用的水可为超纯水；酸溶液的质量浓度可以为5％-30％，并且酸溶液所采用的酸的类型可选自盐酸、硫酸和硝酸中的一种；碱溶液的质量浓度可以为10％-50％，并且碱溶液所采用的碱的类型可选自氢氧化钠和氢氧化钾中的一种。
进一步地，在将所述脂质组分与所述无血清昆虫细胞培养基中的其它成分混合后进行球磨，使制备的无血清昆虫细胞培养基的平均粒度为120目以上；球磨时间可以为2～4小时。
本发明还提供上述任一所述的无血清昆虫细胞培养基在昆虫细胞培养上 的应用。该无血清昆虫细胞培养基在用于昆虫细胞培养时，无需添加血清，并且可使昆虫细胞生长良好且稳定。
本发明还提供一种昆虫细胞培养方法，将上述任一所述的无血清昆虫细胞培养基制成培养液后，对昆虫细胞进行培养，其中，控制所述培养液中无血清昆虫细胞培养基的质量含量为1～3％。并且，在对昆虫细胞进行培养时，昆虫细胞的接种密度可以为常规密度，例如0.1×106～1×106个细胞/ml，进一步可以为0.5×106个细胞/ml。
进一步地，将上述任一所述的无血清昆虫细胞培养基制成培养液，包括：
将上述任一所述的无血清昆虫细胞培养基溶于水后，加入碳酸氢钠，搅拌混匀，制得培养液；其中，可以控制所述培养液中碳酸氢钠的质量含量为2～3％。制得的培养液的pH值为6.8～7.4。
进一步地，所培养的昆虫细胞包括但不限于sf9细胞、sf21细胞、HighFive细胞等，其中优选为sf9细胞。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明的无血清昆虫细胞培养基不含血清，其组成简单，各成分均可通过普通市售而容易地获得，制备成本相对较低，从而有利于在昆虫细胞培养中的大规模应用。
2、本发明的无血清昆虫细胞培养基的制备方法操作简单、易于控制，特别是其对脂质组分进行单独制备，既易于储存，而且不易变质，制得的产品质量稳定，并且长期稳定性良好。
3、本发明的无血清昆虫细胞培养基在应用时适用性强，可用于大部分的昆虫细胞培养，并且培养的细胞生长状态良好且稳定，目标产品产量高，可达到常规含血清培养基的培养水平，应用前景广泛。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
各实施例所采用的原料的质量要求及来源为：
各氨基酸或其盐、D-葡萄糖：药用级，纯度≥99％，购自sigma公司；
各无机盐：注射级，纯度≥99％，购自sigma公司；
各维生素：药用级，纯度≥99％，购自sigma公司；
各微量元素：试剂级，纯度≥98％，购自国药集团药业股份有限公司；
蛋白组分中的各成分：购自Kerry公司；
各脂肪酸：试剂级，纯度≥98％，购自sigma公司；
胆碱、激素：试剂级，纯度≥98％，购自国药集团药业股份有限公司；
各昆虫细胞：来自中国药品生物制品检定所(简称中检所)。
实施例1
本实施例的无血清昆虫细胞培养基，由基础组分、蛋白组分、脂质组分和助剂组成，其中基础组分由无机盐、氨基酸或其盐、水溶性维生素、微量元素和0.002重量份的胰岛素(激素)组成，蛋白组分由2重量份的肉胨、3重量份的大豆蛋白水解物和3重量份的酵母提取物组成，脂质组分由脂肪酸、脂溶性维生素和0.3重量份的胆固醇组成，助剂由9重量份的泊洛沙姆188(消泡剂)和3.3重量份的吐温80组成(表面活性剂)；其中：
无机盐由如下重量份的成分组成：
氨基酸或其盐由如下重量份的成分组成：
水溶性维生素由如下重量份的成分组成：
微量元素由如下重量份的成分组成：
脂肪酸由如下重量份的成分组成：
脂溶性维生素由如下重量份的成分组成：
维生素A 0.01重量份
维生素D 0.005重量份
维生素E 0.02重量份。
该无血清昆虫细胞培养基可通过如下方法制备得到：
1、制备脂质组分
按照上述重量份配比分别称取脂质组分中的各成分，混合均匀后，加入适量无水乙醇，缓慢搅拌至完全溶解，制得第一溶液；将甘露醇溶于超纯水中，制得第二溶液；在搅拌状态下将第一溶液缓慢加入到第二溶液中，形成混合溶液，其中控制脂质组分中各成分在混合溶液中的总质量含量为10％，甘露醇在混合溶液中的质量含量为90％；随后采用冷冻干燥机对混合溶液进行真空冷冻干燥，制得脂质组分，将制得的脂质组分置于-20℃储存备用。
2、制备无血清昆虫细胞培养基
按照上述重量份配比分别将储存0个月、6个月以及12个月的脂质组分与无血清昆虫细胞培养基的其它成分混合均匀后，采用球磨机球磨3小时左右，制得平均粒度为120目以上的无血清昆虫细胞培养基；其中，将采用储存0个月(即刚制备)、6个月、12个月的脂质组成制成的无血清昆虫细胞培养基分别记作培养基1、培养基2、培养基3。
实施例2
本实施例的无血清昆虫细胞培养基，由基础组分、蛋白组分、脂质组分 和助剂组成，其中基础组分由无机盐、氨基酸或其盐、水溶性维生素、微量元素和0.0016重量份的胰岛素组成，蛋白组分由1.6重量份的胰胨、2.4重量份的小麦蛋白水解物和3.6重量份的酵母提取物组成，脂质组分由脂肪酸、脂溶性维生素和0.36重量份的胆固醇组成，助剂由7.2重量份的泊洛沙姆188和4重量份的吐温80组成；其中：
无机盐由如下重量份的成分组成：
氨基酸或其盐由如下重量份的成分组成：
水溶性维生素由如下重量份的成分组成：
微量元素由如下重量份的成分组成：
脂肪酸由如下重量份的成分组成：
脂溶性维生素由如下重量份的成分组成：
维生素A 0.008重量份
维生素D 0.004重量份
维生素E 0.024重量份。
参照实施例1方法制备上述无血清昆虫细胞培养基，其中将采用储存0个月、6个月、12个月的脂质组分制成的无血清昆虫细胞培养基分别记作培养基4、培养基5、培养基6。
实施例3
本实施例的无血清昆虫细胞培养基，由基础组分、蛋白组分、脂质组分和助剂组成，其中基础组分由无机盐、氨基酸或其盐、水溶性维生素、微量元素和0.0024重量份的胰岛素组成，蛋白组分由2.4重量份的骨胨、3.6重量份的土豆蛋白水解物和2.4重量份的酵母提取物组成，脂质组分由脂肪酸、脂溶性维生素和0.24重量份的胆固醇组成，助剂由10.8重量份的泊洛沙姆188和2.6重量份的吐温80组成；其中：
无机盐由如下重量份的成分组成：
氨基酸或其盐由如下重量份的成分组成：
水溶性维生素由如下重量份的成分组成：
微量元素由如下重量份的成分组成：
脂肪酸由如下重量份的成分组成：
脂溶性维生素由如下重量份的成分组成：
维生素A 0.012重量份
维生素D 0.006重量份
维生素E 0.016重量份。
参照实施例1方法制备上述无血清昆虫细胞培养基，其中将采用储存0个月、6个月、12个月的脂质组成制成的无血清昆虫细胞培养基分别记作培养基7、培养基8、培养基9。
实施例4
分别将2g实施例1制备的培养基1至培养基3溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，制得无血清培养液1～无血清培养液3。
同时，将2g的1640细胞培养基溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入10g血清，制得含血清培养液1。
在无菌条件下，用已灭菌移液器分别将50ml的无血清培养液1～无血清培养液3及含血清培养液1转移到250ml细胞培养瓶中，向各细胞培养瓶分别接种sf9细胞悬液，接种密度为0.5×106个细胞/ml，在27±2℃温度条件下以120转/分钟的转速进行悬浮培养。
培养2周后，采用贝克曼细胞计数仪进行细胞计数并测定细胞活力(细胞活力为总细胞中活细胞所占的百分比)，结果见表1。
实施例5
分别将1g实施例2制备的培养基4至培养基6溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，制得无血清培养液4～无血清培养液6。
同时，将1g的MEM细胞培养基溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入10g血清，制得含血清培养液2。
在无菌条件下，用已灭菌移液器分别将50ml的无血清培养液4～无血清培养液6及含血清培养液2转移到250ml细胞培养瓶中，向各细胞培养瓶分别接种sf21细胞悬液，接种密度为0.5×106个细胞/ml，在27±2℃温度条件下以120转/分钟的转速进行悬浮培养。
培养2周后，采用贝克曼细胞计数仪进行细胞计数并测定细胞活力，结果见表1。
表1各培养液培养后的细胞计数及细胞活力结果
由表1可知：
1、本发明制备的无血清昆虫细胞培养基能够较好地培养sf9细胞和sf21细胞，细胞生长状态良好，细胞增殖倍数高，培养后细胞数和细胞活力均高于常规含血清培养基的培养水平。
2、本发明制备的脂质组分质量稳定，不易变质，添加储存12个月后脂质组分的无血清昆虫细胞培养基与刚制备时对昆虫细胞的培养水平相当，说明该脂质组分及无血清昆虫细胞培养基的长期稳定性良好。
实施例6
分别将3g实施例3制备的培养基7至培养基9溶于100ml超纯水中，搅 拌混匀后，加入3g碳酸氢钠，搅拌混匀，制得无血清培养液7～无血清培养液9。
在无菌条件下，用已灭菌移液器分别将50ml的无血清培养液7～无血清培养液9转移到250ml细胞培养瓶中，向装有无血清培养液7的细胞培养瓶接种sf9细胞悬液，向装有无血清培养液8的细胞培养瓶接种sf21细胞悬液，向装有无血清培养液9的细胞培养瓶接种High Five细胞悬液，各细胞的接种密度均为0.5×106个细胞/ml，在27±2℃温度条件下以120转/分钟的转速进行悬浮培养。
培养2周后，采用贝克曼细胞计数仪进行细胞计数并测定细胞活力，结果见表2。
表2各细胞的细胞计数及细胞活力结果
由表2可知：
本发明的无血清昆虫细胞培养基可用于培养多种昆虫细胞，例如sf9细胞、sf2细胞、High Five细胞等，并且培养的各昆虫细胞生长状态良好，说明本发明的无血清昆虫细胞培养基适用性强，应用前景广泛。
对照例1
除不含有实施例1无血清昆虫细胞培养基的脂质组分外，其它与实施例1的无血清昆虫细胞培养基相同，以该无血清昆虫细胞培养基作为对照培养基1。
将2g对照培养基1溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，制得对照培养液1。
在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液1转移到250ml细胞培养瓶中，向细胞培养瓶接种sf9细胞悬液，接种密度为0.5×106个细胞 /ml，在27±2℃温度条件下以120转/分钟的转速进行悬浮培养。培养2周后的细胞计数及细胞活力结果见表3。
对照例2
除脂质组分中不含有胆固醇、花生四烯酸、油酸和维生素D之外，其它成分与实施例1的无血清昆虫细胞培养基相同，以该无血清昆虫细胞培养基作为对照培养基2。
将2g对照培养基2溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，制得对照培养液2。
在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液2转移到250ml细胞培养瓶中，向细胞培养瓶接种sf9细胞悬液，接种密度为0.5×106个细胞/ml，在27±2℃温度条件下以120转/分钟的转速进行悬浮培养。培养2周后的细胞计数及细胞活力结果见表3。
对照例3
除脂质组分中不含有亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸和维生素E之外，其它成分与实施例1的无血清昆虫细胞培养基相同，以该无血清昆虫细胞培养基作为对照培养基3。
将2g对照培养基3溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，制得对照培养液3。
在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液3转移到250ml细胞培养瓶中，向细胞培养瓶接种sf21细胞悬液，接种密度为0.5×106个细胞/ml，在27±2℃温度条件下以120转/分钟的转速进行悬浮培养。培养2周后的细胞计数及细胞活力结果见表3。
对照例4
除脂质组分中不含有亚油酸、肉豆蔻酸、9-十六碳烯酸和维生素A之外，其它成分与实施例1的无血清昆虫细胞培养基相同，以该培养基作为对照培养基4。
分别将2g对照培养基4溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，制得对照培养液4。
在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液4转移到250ml细胞培养瓶中，向细胞培养瓶接种High Five细胞悬液，接种密度为0.5×106个细胞/ml，在27±2℃温度条件下以120转/分钟的转速进行悬浮培养。培养2周后的细胞计数及细胞活力结果见表3。
表3各对照培养液培养后的细胞计数结果
由表3可知：
缺少本发明无血清昆虫细胞培养基中的脂质组分或脂质组分中的几种成分的培养基在用于培养各昆虫细胞时细胞的密度明显下降。由此说明，上述脂质组分中的各成分在本发明的无血清昆虫细胞培养基中均是不可或缺的，其对各种昆虫细胞的培养均具有显著作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。