一种灰霉病菌拮抗菌株及其筛选方法和应用与流程

本发明属于微生物技术及生物防治领域，具体涉及一种解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-KA4及其筛选方法和应用。

背景技术：

灰霉病是一种世界性的植物病害，该病害由半知菌亚门真菌—灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引发，侵染包括黄瓜、西红柿、葡萄等多种作物，对农业生产构成极大威胁，严重影响蔬菜和水果的产量和质量。目前主要采用嘧霉胺、嘧菌酯、多菌灵、乙霉威、速克灵等化学农药进行防治，化学农药的大量使用，不仅造成了环境污染，而且引起了灰葡萄孢菌对嘧霉胺、多菌灵、乙霉威等药剂的抗药性，王美琴等研究表明，山西晋中地区黄瓜灰霉病菌对乙霉威和速克灵的抗性达到中抗，对多菌灵的抗性为高抗。李兴红等研究发现，北京地区番茄灰霉病对嘧霉胺的抗药性非常普遍，且以高抗菌株为主，生产上应替换新型杀菌剂防治番茄灰霉病。所以，开发安全、高效、不引起抗性的生物防治途径是降低灰霉病危害、减少环境污染、保证农业稳产高产的重要途径，越来越成为灰霉病防治的研究热点。

目前，已经筛选出多株对灰葡萄孢菌有拮抗作用的菌株。Elad将哈茨木霉T39菌株制成哈茨木霉可湿性粉剂用于控制温室作物和葡萄灰霉病等病害的发生。Dik等比较了哈茨木霉T39和出芽短梗霉、浅白隐球酵母对黄瓜和番茄灰霉病的防治效果，发现哈茨木霉和出芽短梗霉处理能使茎部病斑与植株的死亡率降低40%~100%，其防效优于杀菌剂对甲抑菌灵和扑海因。魏艳敏等测定了 26 株放线菌菌对5种病原真菌的抑菌作用，其中5株对灰霉病病菌抑菌作用较强，抑菌活性明显高于50%多菌灵等对照化学药剂。韩斯琴等从长白山土壤中分离到了一株放线菌D2-4，经平板抑菌试验、离体叶片试验和盆栽试验发现该菌的发酵液对番茄灰霉病病菌具有很强的抑制和防治效果。迄今为止，用于灰霉病防治研究和应用的细菌有10多种，主要有芽胞杆菌、假单胞菌等，可控制番茄、辣椒、草莓、苹果和葡萄等植物灰霉病的发生和危害。童蕴慧等分离获得的拮抗性强、抗菌谱广的地衣芽胞杆菌W l0、W 3 、Y 2-11-1菌株，对番茄灰霉病叶片和果实的防效为70%~80%，优于50%速克灵2000倍液。王伟等研究发现拮抗细菌x-75对番茄灰霉病具有较好的抑制效果。总体来说，我国利用拮抗细菌防治灰霉病的研究还相对很少，王英国等人中分离到1株解淀粉芽胞杆菌，其对于尖孢镰刀菌、草莓蛇眼病菌等植物病原真菌均有很强的抑制作用。王奕文等人首次从甜瓜果实表面分离到1株解淀粉芽胞杆菌，对灰葡萄孢、链格孢、尖孢镰刀菌、黑曲霉和粉红单端孢等果蔬采后病原真菌具有显著且广谱的拮抗作用。

本研究利用单一靶标初筛、多靶标复筛的筛选体系，从土壤样品中筛选出了对灰霉病拮抗效果良好、且抑菌谱较广的解淀粉芽胞杆菌BA-KA4，以期为灰霉病的生物防治提供材料支撑。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种编号为BA-KA4的解淀粉芽胞杆菌，其具有可抑制作物灰霉病病原菌的生长的作用，且抑菌谱较广，尤其具有可明显抑制黄瓜灰霉病病原菌的生长的作用。另一方面本发明还提供了上述菌株的筛选方法和用途。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：

一种灰霉病菌拮抗菌株，该菌株为解淀粉芽胞杆菌BA-KA4，于2016年3月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 12190。

进一步地，所述的灰霉病菌拮抗菌株，具有抑制辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌生长的活性。

一种上述解淀粉芽胞杆菌BA-KA4的筛选方法，包括以下步骤：

（1）对来自不同地区的土壤试样中的细菌进行分离纯化与保藏；

（2）初筛：采用平板对峙法进行拮抗菌的筛选，用直径5mm的打孔器在黄瓜灰霉病菌边缘打孔，将菌块接种于PDA平板中央，挑取4个不同的单菌落均匀接在距离指示菌3cm的位置，22℃ 黑暗培养5d 后，观察抑菌效果，选出具有抑菌圈的菌株进入复筛；

（3）复筛：以黄瓜灰霉病菌为指示菌，采用十字交叉法将进入复筛的菌株点接在距平板中央3cm处的4 个角上，平板中央同时移入直径5mm的长有灰霉病菌的琼脂块，22℃ 黑暗培养5d 后，观察抑菌结果，测定抑菌圈直径，计算抑菌率，筛选出抑菌率60%以上的菌株；进行继代培养，测定遗传稳定性，筛选培养10代后抑菌率60%以上的菌株；选择辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌作为指示菌,采用平板对峙法对选出的菌株进行抑菌谱的测定，观察抑菌效果，测定抑菌圈直径，计算抑菌率，筛选出对这8种真菌抑菌效果都较好的菌株，即为解淀粉芽胞杆菌BA-KA4。

进一步地，步骤（1）的具体操作为：从云南、黑龙江、新疆、河北地区采来的120个土壤，采用PB培养基，利用稀释涂平板方法进行土壤分离，于28℃培养箱中培养3d后，挑取菌落形态不同的细菌进行5次划线纯化、编号，并采用15%的甘油在-80℃冰箱保存。

进一步地，所述PB培养基为 ：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15 g，pH 7.4，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min。

一种上述解淀粉芽胞杆菌BA-KA4在防治作物灰霉病害中的应用。

进一步地，其防治方法为用无菌水将解淀粉芽胞杆菌BA-KA4稀释成浓度为1×10⁸CFU/mL的菌悬液，121℃灭菌20min后，叶面喷施于作物。

本发明所述的解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens CGMCC No. 12190的形态学特征为：在PB培养基上生长不产生色素，菌落扁平或圆形、乳白色不透明、菌落边缘整齐，表面有褶皱。革兰氏阳性，显微镜观察为杆状、产生芽孢，芽孢椭圆或柱形。参见图3。

参照《柏杰明细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》进行菌株的生理生化鉴定，结果如表1所示，初步鉴定拮抗菌BA-KA4为解淀粉芽胞杆菌。

表1拮抗菌生理生化鉴定结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

本发明的解淀粉芽胞杆菌BA-KA4对辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌等多种病原真菌均具有明显的抑制作用；并且尤其适用于制作为农用制剂用于防治作物灰霉病菌感染而引起的病害。

生物样品保藏信息

解淀粉芽胞杆菌BA-KA4，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens，已于2016年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC No. 12190。

附图说明

图1拮抗菌BA-KA4对黄瓜灰霉病菌的拮抗效果

图2拮抗菌BA-KA4抑菌谱

图3拮抗菌BA-KA4菌落形态

图4拮抗菌BA-KA4 依据16S rDNA基因序列的系统发育树

图5拮抗菌BA-KA4 依据gyrB基因序列的系统发育树。

具体实施方式

本发明中所用供试土壤为从云南、黑龙江、新疆、河北等地采集的土样。

供试病原菌为辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌，由本实验室分离保存。

供试黄瓜种子购于河北省农科院。

供试培养基为：PDA 培养基( 1 L) ：去皮马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至1L，115℃灭菌20min；PB培养基( 1 L) ：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15 g，pH 7.4，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min。

实施例1 土壤中细菌的分离纯化与保藏

（1）从云南、黑龙江、新疆、河北等地采来的120个土壤，采用PB培养基，利用稀释涂平板方法进行土壤分离，于28℃培养箱中培养3d后，挑取菌落形态不同的细菌进行5次划线纯化、编号，并采用15%的甘油在-80℃冰箱保存。

（2）采用平板对峙法进行拮抗菌的初筛，用直径5mm的打孔器在黄瓜灰霉病菌边缘打孔，将菌块接种于PDA平板中央，挑取4个不同的单菌落均匀接在距离指示菌3cm的位置，22℃ 黑暗培养5d 后，观察抑菌效果，选出具有抑菌圈的菌株进入复筛。从129个土样中分离到的细菌菌株4200株，分别与黄瓜灰霉病菌做平板对峙试验，初筛得到对黄瓜灰霉病菌具有拮抗作用的细菌191株。

（3）以黄瓜灰霉病菌为指示菌，采用十字交叉法将进入初筛的菌株点接在距平板中央3cm处的4 个角上，平板中央同时移入直径5mm的长有灰霉病菌的琼脂块，22℃ 黑暗培养5d 后，测量、记录抑菌圈直径的大小并计算抑制率，筛选出抑菌率60%以上的菌株10株。抑制率（%）=（对照组病原菌菌落直径-处理组病原菌菌落直径）/对照组病原菌菌落直径×100%。进行继代培养，测定遗传稳定性，筛选培养10代后抑菌率60%以上的菌株，以上10株菌株培养10代后抑菌率均在60%以上；选择辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、大蒜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌等8种真菌作为指示菌进行多靶标复筛，观察抑菌效果，测定抑菌圈直径，计算抑菌率，筛选出对这8种病原真菌具有最好抑菌效果菌株，即为解淀粉芽胞杆菌BA-KA4。结果如图1和图2所示，BA-KA4的抑菌率最高，为65%，且稳定遗传。拮抗菌BA-KA4对8种病原真菌均具有明显的抑制作用，具有广泛的抑菌谱，且对不同病原真菌的拮抗能力有所不同。其中对5种病原真菌的抑制率都达到60%以上，分别是：对梨黑斑病菌抑制率为75.9%，对大蒜菌核病菌抑制率为65.9%，对番茄早疫病菌抑制率为62.9%，番茄灰霉病菌抑制率为61.8%，对辣椒疫霉病菌的抑制率为60.6%。

实施例2 拮抗菌BA-KA4的鉴定

（1）拮抗菌的培养特征和形态特征

该菌株BA-KA4，如图3所示，在PB培养基上生长不产生色素，菌落扁平或圆形、乳白色不透明、菌落边缘不整齐、表面有褶皱。革兰氏阳性，显微镜观察为杆状、产生芽孢，芽孢椭圆或柱形。

（2）拮抗菌的生理生化特征

参照《柏杰明细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行：V-P试验阳性、甲基红试验阴性、吲哚试验阳性、明胶液化试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、淀粉水解试验阳性、脂肪酶阴性、H₂S产生试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、丙二酸盐的利用阴性、酪氨酸水解阴性、纤维素分解阳性。

（3） PCR扩增及序列测定

（1）16S rDNA序列分析鉴定

采用天根公司的试剂盒进行细菌基因组DNA的提取，以此DNA为模版，以27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，序列SEQ ID No.1和1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，序列SEQ ID No.2为引物，进行菌株16S rDNA的扩增。PCR扩增条件为: 95℃ 5min；94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 2min，35个循环；72℃10min。将16S rDNA扩增产物在金唯智生物科技有限公司进行测序，测序所得序列通过NCBI数据库进行BLAST比对，通过MEGA5.2软件与已知序列进行系统发育分析。以拮抗菌BA-KA4基因组DNA为模板，用引物27F和1492R进行PCR扩增，测得该菌株的16S rDNA核苷酸序列长度为1394bp，如序列SEQ ID No.3所示，与NCBI中已知的16S rDNA序列进行比对分析，发现拮抗菌BA-KA4菌株与Bacillus methylotrophicus strain F29、Bacillus amyloloquefaciens strain CSM11、Bacillus subtilis strain MB8，相似性均为100%，构建 16S rDNA序列的系统发育树（图4），可以看出，拮抗菌BA-KA4被鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloloquefaciens。

（2）gyrB基因序列分析鉴定

采用天根公司的试剂盒进行细菌基因组DNA的提取，以此DNA为模版，正向引物为UP1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)，序列SEQ ID No.4，反向引物为UP2r（5′-AGCAGGGTACGGAT GTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′），序列SEQ ID No.5，扩增gyrB基因序列。PCR扩增条件为： 95℃ 4min；98℃ 10s，62℃ 1min，72℃ 2min，30 个循环；72℃ 8min。将gyrB 基因扩增产物在金唯智生物科技有限公司进行测序，测序所得序列通过NCBI数据库进行BLAST比对，通过MEGA5.2软件与已知序列进行系统发育分析。以拮抗菌BA-KA4基因组DNA为模板扩增gyrB基因，序列长度约为1010bp，如序列SEQ ID No.6所示，与NCBI中模式菌株的16S rDNA序列进行比对分析，发现拮抗菌BA-KA4菌株与解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloloquefaciens 的同源性最近，相似性为98%，依据gyrB基因序列构建系统发育树（图5），可以看出，拮抗菌BA-KA4与解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloloquefaciens FZB42亲缘关系最接近。

综合菌株的培养特征、形态和生理生化特征及16S rDNA 序列和gyrB基因序列分析结果，可得出拮抗菌BA-KA4菌株为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloloquefaciens。

实施例3解淀粉芽胞杆菌BA-KA4对黄瓜灰霉病的盆栽防效试验

制备种子瓶，挑取BA-KA4单菌落接种于装有20mL PB液体培养基的100 mL三角瓶中，28℃、180rpm摇床震荡培养24h。从种子瓶中吸取10 mL菌液接种于装有200mL PB液体培养基的500mL三角瓶中，28℃、180rpm摇床震荡培养48h后，用无菌水稀释成1×10⁸CFU/ mL,即为菌悬液。取相同浓度的菌悬液121℃灭菌20min，即为无菌发酵液。嘧菌酯用无菌水稀释1000倍。用打孔器在生长3d 的灰霉病菌边缘打孔，将菌块放入0.9%的生理盐水中，22℃、180rpm摇床震荡摇匀30min，用无菌水稀释成浓度为1×10⁶个/mL的孢子悬液。盆栽黄瓜叶面喷施菌悬液、无菌发酵液、嘧菌酯6h后，接种灰霉病菌孢子悬液，无菌水为阴性对照。黑暗保湿48h，22℃恒温培养，观察5d、7d、14d发病情况，计算病情指数。

实验结果如表2所示，解淀粉芽胞杆菌BA-KA4的无菌发酵液和嘧菌酯对黄瓜灰霉病的防治效果在5d和7d都可以达到100%，但是在14d时嘧菌酯的防效下降，而无菌发酵液防效依然可以达到97.5%。对比嘧菌酯和菌悬液的处理组，无菌发酵液处理后的叶片更加浓绿。对比常用药剂嘧菌酯，短期内防治效果相当，但该菌株的代谢产物持效期更长。

表2解淀粉芽胞杆菌BA-KA4对黄瓜灰霉病的室内防效试验

在黄瓜灰霉病比较发生普遍的地区，使用拮抗微生物进行防治，可以减少化学农药的使用，解决农药残留问题，延缓病菌抗药性产生。

解淀粉芽胞杆菌是一种与枯草芽胞杆菌亲缘性很高的细菌，在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，这些代谢产物使得解淀粉芽胞杆菌能够具有广泛地抑制真菌和细菌的活性。本研究的盆栽防效试验表明解淀粉芽胞杆菌BA-KA4的代谢产物对黄瓜灰霉病的防治效果在5d和7d时可达到100%，14d后仍可达到97.5%。对比常用药剂嘧菌酯，短期内防治效果相当，但该菌株的代谢产物持效期更长。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省科学院生物研究所

<120> 一种灰霉病菌拮抗菌株及其筛选方法和应用

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggytaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1394

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 3

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 60

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accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 180

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ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 300

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gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 540

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 600

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 660

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 720

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 780

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 840

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 900

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 960

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1080

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1140

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1200

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1260

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1320

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gaggtaacct ttag 1394

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<212> DNA

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<213> 人工序列

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<211> 1010

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 6

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aacgccttgt cgaccactct tgacgttacg gttcatcgtg acggaaaaat ccactatcag 120

gcgtacgagc gcggtgtacc tgtggccgat cttgaagtga tcggtgatac tgataagacc 180

ggaacgatta cgcacttcgt tccggatccg gaaattttca aagaaacaac cgaatacgac 240

tatgacctgc tttcaaaccg tgtccgggaa ttggccttcc tgacaaaagg tgtaaacatc 300

acgattgaag acaaacgtga aggacaagaa cggaaaaacg agtaccacta cgaaggcgga 360

atcaaaagct atgttgagta cttaaaccgt tccaaagaag tcgttcatga agagccgatt 420

tatatcgaag gcgagaaaga cggcataacg gttgaagttg cattgcaata caacgacagc 480

tatacaagca atatttattc tttcacaaat aatatcaaca catacgaagg cggcacgcac 540

gaagccggat ttaaaaccgg tctgacccgt gttataaacg actatgcaag aagaaaaggg 600

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