一种高抗性产海藻糖酿酒酵母菌株的筛选及应用的制作方法

技术领域：

本发明涉及一种高抗性产海藻糖酿酒酵母菌株筛选及应用，属于生物工程领域。

技术背景：

海藻糖是一种非还原性二糖，广泛存在于海藻、酵母、霉菌和食用菌等生物体内，是一种贮藏性碳水化合物。具有保护细胞核等生物活动性物质在脱水、干燥、高温、冷冻及高渗透压等不良环境条件下活性免遭破坏的功能，是国际上最近开发的主要低聚糖之一。

海藻糖在微生物细胞中的合成非常强烈。它的积累一般和生长速度的降低有关，特别是在分化过程和营养不足时。它的合成主要由二种酶催化，其反应分两步进行：第一步，尿苷二磷酸葡萄糖或鸟苷二磷酸葡萄糖经6-磷酸海藻糖合成酶的催化转移给6-磷酸葡萄糖，形成6-磷酸海藻糖；第二步，6-磷酸海藻糖经6-磷酸海藻糖磷酸酯酶催化水解，形成海藻糖。

若将酵母细胞置于饥饿条件下产海藻糖的量会大大提高，当海藻糖含量越高时，酵母细胞对干燥的抵抗力也明显增强。在生命周期期间，海藻糖在再生阶段积累，在出芽期间流动。对于仅在含糖培养基中的芽孢出芽，海藻糖的重要性是不明显的，因为海藻糖分解产生的葡萄糖量与从培养基中吸收的葡萄糖相比是很少的。真菌芽孢中内部海藻糖的储存，对于处在不良环境条件下芽孢的出芽更为重要。生物体能在无水状态下忍受许多年，当它们重新吸收水分后，很快复活并恢复代谢活力。

生长速度降低伴随着海藻糖的积累，而生长的促进，特别在休眠阶段，生长的诱导导致海藻糖的流动。在真菌芽孢出芽时，出芽的条件和海藻糖分解的程度密切相关。糖源与氮源的加入是出芽所必须的，但是单独糖源的加入引起部分海藻糖流动的同时也伴随海藻糖的再合成，而糖源与氮源同时加入则引起非常强烈的海藻糖分解而没有海藻糖的合成。海藻糖在休眠条件下也许是作为能量的补充物和中间物，atp被认为是休眠期间海藻糖流动的控制因子。

本发明以野生柑橘-皱皮柑citrusverrucosahort.为原料，以高抗性下菌株的生长状态和代谢产物的形成模式作为指标，筛选出了一株高抗性产海藻糖的酿酒酵母菌株。

技术实现要素：
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本发明的目的是提出一种一株高抗性产海藻糖的酿酒酵母菌株，利用其特性发酵制备海藻糖。

本发明是这样实现的。从江汉平原广泛分布的一种野生资源-皱皮柑的汁液中，采用微生物分离纯化的方法，筛选出一株高抗性产海藻糖的酿酒酵母菌株。该酵母菌具有良好的应用前景。

具体筛选步骤为：

1、将野生皱皮柑剥皮，榨汁，装入瓶中，在夏季高温下，皱皮柑汁液可进行自行发酵，酒体散发淡淡的果香味，但品质不稳定，酒液呈酸味。证实野生皱皮柑中存在酿造果酒及耐高温的酵母菌。

2、收集自行发酵带果香的皱皮柑汁液，吸取0.2ml均匀涂布于装有已灭菌豆芽汁琼脂培养基的培养皿上，28℃恒温箱培养2d后，观察菌落特征，其菌落生长良好，具有明显酵母菌菌落特征。经进一步培养、分离后，发现有2种酵母菌。第一种菌呈浓郁酒香的菌体，菌落大，纯白色，经鉴定为酿造果酒所用的专属菌株(已申请专利,专利号:zl201210561882.x)。第二种菌呈不太明显的果香，菌落形成较小，乳白色。在无菌操作台上划线接种于新鲜斜面培养基上，培养3d，将培养温度设置为夏季常温36℃。待长出菌落后进一步采用分区划线进行纯化，重复以上步骤3～5次，直至分离出纯单菌株。该菌株在高温条件下，斜面培养基上生长的菌落呈乳白色，酵母菌长势良好。

将该分离纯化培养的高抗性、产海藻糖的酿酒酵母菌株于2012年11月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2012473，名称为酿酒酵母zgj-4(saccharomycescerevisiaezgj-4)。保藏地址：中国.武汉.武汉大学。以下简称zgj-4。

zgj-4菌株的菌学特性：

形态特征：在豆芽汁琼脂培养基上，菌落大小为6-8mm，正面圆形，侧面为低凸面，边缘整齐，乳白色，湿润，较光滑，粘稠，易用接种环挑取，有微弱的果香味、酸味产生，其菌落形态描述如附图1。在豆芽汁液体培养基中静止培养时，有菌环，沉淀，菌液混浊，产气明显。在普通光学显微镜下观察，细胞个体呈球形或椭圆形，直径约为(5.2-12.7)μm。单个或成双，芽殖。

生理生化特征：zgj-4与genbank上其他酵母菌的18srrna和26srrna核苷酸序列的一致性分别为99％和97％，该菌株属于酿酒酵母saccharomycescerevisiae。在碳源的氧化测定中，当以d-海藻糖为唯一碳源时，gzj-4具有强氧化能力，测定结果呈阳性，菌株生长能力好，代谢产物积累显著；当以蔗糖、α-d-葡萄糖、麦芽糖、d-棉子糖、龙胆二糖等为唯一碳源时，gzj-4氧化能力呈弱阳性，菌株生长能力较弱，代谢产物积累不显著。在碳源利用上，zgj-4可以有效利用d-海藻糖，其次利用龙胆二糖、麦芽糖、蔗糖、α-d-葡萄糖，不能利用d-蜜二糖、纤维二糖、d-半乳糖和糊精等。

本发明的优点及应用前景：

本发明是从江汉平原广泛分布的一种野生柑橘-皱皮柑的汁液中分离得到了一株高抗性产海藻糖的优良酿酒酵母菌株。皱皮柑生长于干涸环境中，汁液偏酸(ph＝4.5)、偏苦。因此，从其果汁中分离纯化出的酿酒酵母菌株具备耐干旱、耐酸等特性。经鉴定该菌株为酿酒(产海藻糖)酵母菌类型。

酵母菌zgj-4的发酵能力强，通过诱变等方法选育出的高产海藻糖菌株，采用高浓度培养基发酵，发酵结束后，让菌体饥饿处理3h可得到含海藻糖高的产物，经hplc检测每100克干重细胞含有35克海藻糖，海藻糖得率＞80％。由于zgj-4具备抗干旱、耐酸、抗高温等特性，所产海藻糖制备率高，可在食品、食品保鲜、医药等领域应用，具有良好的开发利用潜力。

海藻糖的存在不仅可以用于工业开发，对于菌种的保存有重要意义，它能大大提高储藏时菌种的存活率。

附图说明

图1酿酒酵母菌株zgj-4的菌落形态

图2酿酒酵母菌株zgj-4的细胞形态(400×)

具体实施方式：

实施例1：高抗性产海藻糖酿酒酵母菌株zgj-4的分离、纯化及培养

1、将野生皱皮柑剥皮，榨汁，装入瓶中。在夏季高温下，皱皮柑汁液可进行自行发酵，酒体散发果香味，但品质不稳定，酒液呈淡淡的酸味。证实野生皱皮柑中存在酿造果酒及耐高温的酵母菌。

2、收集自行发酵带果香的皱皮柑汁液，吸取0.2ml均匀涂布于装有已灭菌豆芽汁琼脂培养基的培养皿上，28℃恒温箱培养2d后，观察菌落特征，其菌落生长良好，具有明显酵母菌菌落特征，经进一步培养、分离后，发现有2种酵母菌。第一种菌呈浓郁酒香的菌体，菌落大，纯白色，经鉴定为酿造果酒所用的专属菌株(已申请专利,专利号:zl201210561882.x)。第二种菌呈不太明显的果香，菌落形成较小，乳白色。在无菌操作台上划线接种于新鲜斜面培养基上，培养3d，将培养温度设置为夏季常温36℃。待长出菌落后进一步采用分区划线进行纯化，重复以上步骤3～5次，直至分离出纯单菌株。该菌株在高温条件下，斜面培养基上生长的菌落呈乳白色，酵母菌长势良好。

根据菌落特征(见图1)，确定为酿酒酵母saccharomycescerevisiae系列。挑取酵母菌单菌体做装片，在显微镜下可以观察到酵母菌的形态(见图2)。细胞为圆形或椭圆形，直径为5.2μm-12.7μm。将该菌株进一步划线培养后送鉴定，命名为酵母菌zgj-4(saccharomycescerevisiaezgj-4)，保藏号为cctccno：m2012473。

实例2：产海藻糖酵母菌zgj-4的抗性研究

1、不同培养温度对菌株生长状态的影响

将zgj-4接种于豆芽汁液体培养基中，分别在20℃、24℃、28℃、32℃、36℃和40℃条件下培养菌体，菌体的生长状态见表1。一般酵母菌的最适生长温度为26℃-28℃，耐受温度为38℃，高于40℃几乎全部死亡。而酵母菌zgj-4在28℃-32℃下生长良好，且在40℃高温条件下，该菌仍能生长，其形态结构、生理特征等未发生变化。表明酵母菌zgj-4具有一定的抗高温能力。

表1酵母菌zgj-4的抗高温测试

注：“++”表示生长良好，“+”表示生长较差，“±”表示生长很少，“-”表示无生长。

2、酒精浓度对菌株生长状态的影响

培养基采用平板培养基，接种量为2％，分别于发酵培养基中加入2.0ml、2.4ml、2.8ml、3.2ml、3.6ml和4.0ml无水乙醇，于28℃恒温培养一周时间，考察不同无水乙醇浓度对酵母生长状态的影响。结果见表2。

表2酵母菌zgj-4的抗酒精测试

注：“++”表示生长良好，“+”表示生长较差，“±”表示生长很少，“-”表示无生长。

3、不同渗透压对菌株生长状态的影响

采用50ml/250ml锥形瓶，接种量为2％，加入不同量的kcl使其在培养基中的浓度分别为1.0mol/l、1.5mol/l、2.0mol/l、2.5mol/l和3.0mol/l，于28℃、160r/min条件培养2d，考察不同渗透压下酵母的生长状况(表3)。

表3酵母菌zgj-4的抗渗透压测试

注：“++”表示生长良好，“+”表示生长较差，“±”表示生长很少，“-”表示无生长。

4、不同饥饿时间对菌株状态影响

采用50ml/250ml锥形瓶，接种量为2％，接种菌株经过3d、5d、7d、9d和11d的饥饿处理。于28℃、160r/min条件培养2d，考察不同饥饿时间对酵母生长状况的影响(表4)。

对照各环境条件下酵母菌的生长特征，酵母菌zgj-4在高温、高酒精浓度、强渗透压和饥饿条件下均能正常生长(表1-表4)，未发生菌株形态变异、菌株性能退化等现象。同时，因为酵母菌zgj-4来自汁液偏酸(ph＝4.5)的皱皮柑，对高酸性环境也有很强的忍耐力，因而应用于果汁尤其是高酸性果汁如山葡萄汁、猕猴桃汁和山楂汁等的发酵有很大的开发前景。

综述所述，酵母菌zgj-4具备抗高温、高酒精浓度、强渗透压和饥饿等特征，适于酸性果汁(特别是野生型可食用性水果)发酵使用。

表4酵母菌zgj-4的抗饥饿测试

注：“++”表示生长良好，“+”表示生长较差，“±”表示生长很少，“-”表示无生长。

实例3：用酵母菌zgj-4发酵制备海藻糖

1、工艺过程如下

2、操作过程

1)接种。将含有酵母菌zgj-4的斜面菌苔，刮取2环菌体接种到盛有10ml豆芽汁培养基的150ml三角瓶中，温度32℃，220rpm，培养时间2天。

2)菌种扩培。豆芽汁培养基中长势良好的酵母菌zgj-4菌液，接种到盛有100ml种子培养基的1l摇瓶中，发酵温度32℃，220rpm，培养时间2天。

3)发酵培养。将扩培好的酵母菌zgj-4菌液，按8％的比例接种到盛有3l发酵培养基的10l发酵罐中，发酵温度35℃，发酵4天。

4)收集菌体，用离心机脱水并烘干，用粉碎机粉碎，

5)用去离子水溶解，均匀搅拌一小时，再用超滤膜过滤，

6)浓缩结晶，得海藻糖产品。

本实施例经hplc检测每100克干重细胞含有35克海藻糖，海藻糖得率＞80％。