本发明涉及食用菌技术领域，尤其涉及一种黑木耳液体菌种及其制备方法。
背景技术：
黑木耳是一种营养丰富的食用菌，又是我国传统的保健食品和出口商品。目前，大多数黑木耳栽培仍然采用传统的母种、原种、栽培种的固体培养模式，这种方式存在周期长，污染率高，菌龄不一致等缺点。
基于上述周期长的缺点，越来越多的人们采用液体菌种来栽培黑木耳，这种液体菌种栽培方式的周期短，通常液体菌种是通过发酵罐一次发酵获得，这种方式获得的液体菌种存在发酵不均匀，成活率低，菌种萌发期长等缺点。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种黑木耳液体菌种及其制备方法，提高菌种成活率。
本发明是通过如下技术方案实现的，提供一种黑木耳液体菌种的制备方法，所述方法包括如下步骤：
s01：购买黑木耳菌种，并保存于pda斜面培养基上；
s02：将150ml液体培养基加入至500ml的三角瓶中，灭菌并冷却后接入所述步骤s01中的菌种，旋转式摇床，转速160～200r/min，在温度24～28℃条件下培养5～8天；
s03：将所述步骤s02获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐一次发酵培养基上，在发酵罐内保持恒温24～28℃，通入无菌空气培养4～6天；
s04：将所述步骤s03获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐二次发酵培养基上，在发酵罐内保持温度24～28℃，通入无菌空气培养2～3天，获得黑木耳液体菌种。
本发明的方法中采用两次发酵制备黑木耳液体菌种，相比一次发酵，二次发酵在等量原种的情况下增大接种量三到四倍，节约生产成本；且二次发酵使液体发酵液中的营养成分维持在适宜的水平，既利于菌丝在液体环境中生长，又能让菌丝在接入菌棒后的萌发阶段更快适应；最主要的是二次发酵使菌种发酵的更均匀，更充分，提高了菌种的成活率。
作为优选，所述步骤s02中，所述液体培养基包括如下质量分数的组分：
麸皮：10%，玉米粉：5%．葡萄糖：1%，kh2p04：0.1%，mgs04：0.1%，蛋白胨：0.1%，余量为水。
蛋白胨作为速效氮源，满足菌种快速萌发的需要。磷酸二氢钾提供微量元素，并且起到缓冲ph值的作用。
作为优选，所述步骤s02中，所述液体培养基的灭菌方法为：将所述液体培养基加热至121～125℃保持1～3小时。
作为优选，所述步骤s03中，所述发酵罐一次发酵培养基包括如下质量分数的组分：
麸皮：5%，玉米粉：10%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水。
玉米粉既是氮源，又是碳源，为培养基提供较为全面的营养。硫酸镁能激发酶活性，提高菌丝活力。
作为优选，所述步骤s03中，所述发酵罐一次发酵培养基的灭菌方法为：将所述发酵罐一次发酵培养基在发酵罐中加热至118～125℃保持1～3小时。
作为优选，所述步骤s04中，所述发酵罐二次发酵培养基包括如下质量分数的组分：
土豆汁：15%，玉米粉：5%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水。
土豆汁作为碳源。
作为优选，所述步骤s04中，所述发酵罐二次发酵培养基的灭菌方法为：将所述发酵罐二次发酵培养基在发酵罐中加热至118～125℃保持1～3小时。
本发明还提供一种采用上述方法制备得到的黑木耳液体菌种。
本发明实施例提供的技术方案可以包含以下有益效果：
本发明提供一种黑木耳液体菌种的制备方法，所述方法包括母种制备、液体摇瓶制备、发酵罐一次发酵、发酵罐二次发酵等步骤，在发酵罐进行一次发酵之后继续进行二次发酵，相比一次发酵制备的液体菌种，本发明的二次发酵方法在等量原种的情况下增大接种量三到四倍，节约生产成本；且二次发酵使液体发酵液中的营养成分维持在适宜的水平，既利于菌丝在液体环境中生长，又能让菌丝在接入菌棒后的萌发阶段更快适应；最主要的是二次发酵使菌种发酵的更均匀，更充分，提高了菌种的成活率。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种黑木耳液体菌种的制备方法，所述方法包括如下步骤：
s01：购买黑木耳菌种，并保存于pda斜面培养基上；所述pda斜面培养基包括马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，余量为水。
s02：将150ml液体培养基加入至500ml的三角瓶中，灭菌并冷却后接入所述步骤s01中的菌种，旋转式摇床，转速160r/min，在温度24℃条件下培养5天；其中，液体培养基包括：麸皮：10%，玉米粉：5%．葡萄糖：1%，kh2p04：0.1%，mgs04：0.1%，蛋白胨：0.1%，余量为水，所述液体培养基的灭菌方法为：将所述液体培养基加热至121℃保持1小时。
s03：将所述步骤s02获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐一次发酵培养基上，在发酵罐内保持恒温24℃，通入无菌空气培养4天；其中，所述发酵罐一次发酵培养基包括：麸皮：5%，玉米粉：10%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐一次发酵培养基灭菌方法为：将所述发酵罐一次发酵培养基在发酵罐中加热至118℃保持1小时。
s04：将所述步骤s03获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐二次发酵培养基上，在发酵罐内保持温度24℃，通入无菌空气培养2天，获得黑木耳液体菌种；其中，所述发酵罐二次发酵培养基包括：土豆汁：15%，玉米粉：5%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐二次发酵培养基的灭菌方法为：将所述发酵罐二次发酵培养基在发酵罐中加热至118℃保持1小时。
实施例2
本实施例提供一种黑木耳液体菌种的制备方法，所述方法包括如下步骤：
s01：购买黑木耳菌种，并保存于pda斜面培养基上；所述pda斜面培养基包括马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，余量为水；
s02：将150ml液体培养基加入至500ml的三角瓶中，灭菌并冷却后接入所述步骤s01中的菌种，旋转式摇床，转速200r/min，在温度28℃条件下培养8天；其中，液体培养基包括：麸皮：10%，玉米粉：5%．葡萄糖：1%，kh2p04：0.1%，mgs04：0.1%，蛋白胨：0.1%，余量为水，所述液体培养基的灭菌方法为：将所述液体培养基加热至125℃保持3小时。
s03：将所述步骤s02获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐一次发酵培养基上，在发酵罐内保持恒温24℃，通入无菌空气培养4天；其中，所述发酵罐一次发酵培养基包括：麸皮：5%，玉米粉：10%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐一次发酵培养基灭菌方法为：将所述发酵罐一次发酵培养基在发酵罐中加热至125℃保持3小时。
s04：将所述步骤s03获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐二次发酵培养基上，在发酵罐内保持温度24℃，通入无菌空气培养3天，获得黑木耳液体菌种；其中，所述发酵罐二次发酵培养基包括：土豆汁：15%，玉米粉：5%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐二次发酵培养基的灭菌方法为：将所述发酵罐二次发酵培养基在发酵罐中加热至125℃保持3小时。
实施例3
本实施例提供一种黑木耳液体菌种的制备方法，所述方法包括如下步骤：
s01：购买黑木耳菌种，并保存于pda斜面培养基上；所述pda斜面培养基包括马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，余量为水；
s02：将150ml液体培养基加入至500ml的三角瓶中，灭菌并冷却后接入所述步骤s01中的菌种，旋转式摇床，转速180r/min，在温度26℃条件下培养5～8天；其中，液体培养基包括：麸皮：10%，玉米粉：5%．葡萄糖：1%，kh2p04：0.1%，mgs04：0.1%，蛋白胨：0.1%，余量为水，所述液体培养基的灭菌方法为：将所述液体培养基加热至123℃保持2小时。
s03：将所述步骤s02获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐一次发酵培养基上，在发酵罐内保持恒温24℃，通入无菌空气培养4天；其中，所述发酵罐一次发酵培养基包括：麸皮：5%，玉米粉：10%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐一次发酵培养基灭菌方法为：将所述发酵罐一次发酵培养基在发酵罐中加热至120℃保持2小时。
s04：将所述步骤s03获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐二次发酵培养基上，在发酵罐内保持温度24℃，通入无菌空气培养3天，获得黑木耳液体菌种；其中，所述发酵罐二次发酵培养基包括：土豆汁：15%，玉米粉：5%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐二次发酵培养基的灭菌方法为：将所述发酵罐二次发酵培养基在发酵罐中加热至120℃保持2小时。
实施例4
本实施例提供一种黑木耳液体菌种的制备方法，所述方法包括如下步骤：
s01：购买黑木耳菌种，并保存于pda斜面培养基上；所述pda斜面培养基包括马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，余量为水；
s02：将150ml液体培养基加入至500ml的三角瓶中，灭菌并冷却后接入所述步骤s01中的菌种，旋转式摇床，转速180r/min，在温度24℃条件下培养5～8天；其中，液体培养基包括：麸皮：10%，玉米粉：5%．葡萄糖：1%，kh2p04：0.1%，mgs04：0.1%，蛋白胨：0.1%，余量为水，所述液体培养基的灭菌方法为：将所述液体培养基加热至121℃保持1小时。
s03：将所述步骤s02获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐一次发酵培养基上，在发酵罐内保持恒温24℃，通入无菌空气培养4天；其中，所述发酵罐一次发酵培养基包括：麸皮：5%，玉米粉：10%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐一次发酵培养基灭菌方法为：将所述发酵罐一次发酵培养基在发酵罐中加热至118℃保持3小时。
s04：将所述步骤s03获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐二次发酵培养基上，在发酵罐内保持温度24℃，通入无菌空气培养2天，获得黑木耳液体菌种；其中，所述发酵罐二次发酵培养基包括：土豆汁：15%，玉米粉：5%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐二次发酵培养基的灭菌方法为：将所述发酵罐二次发酵培养基在发酵罐中加热至125℃保持1小时。
实施例5
本实施例提供一种黑木耳液体菌种的制备方法，所述方法包括如下步骤：
s01：购买黑木耳菌种，并保存于pda斜面培养基上；所述pda斜面培养基包括马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，余量为水；
s02：将150ml液体培养基加入至500ml的三角瓶中，灭菌并冷却后接入所述步骤s01中的菌种，旋转式摇床，转速160r/min，在温度28℃条件下培养5天；其中，液体培养基包括：麸皮：10%，玉米粉：5%．葡萄糖：1%，kh2p04：0.1%，mgs04：0.1%，蛋白胨：0.1%，余量为水，所述液体培养基的灭菌方法为：将所述液体培养基加热至125℃保持3小时。
s03：将所述步骤s02获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐一次发酵培养基上，在发酵罐内保持恒温28℃，通入无菌空气培养6天；其中，所述发酵罐一次发酵培养基包括：麸皮：5%，玉米粉：10%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐一次发酵培养基灭菌方法为：将所述发酵罐一次发酵培养基在发酵罐中加热至125℃保持1小时。
s04：将所述步骤s03获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐二次发酵培养基上，在发酵罐内保持温度24℃，通入无菌空气培养2天，获得黑木耳液体菌种；其中，所述发酵罐二次发酵培养基包括：土豆汁：15%，玉米粉：5%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐二次发酵培养基的灭菌方法为：将所述发酵罐二次发酵培养基在发酵罐中加热至118℃保持2小时。
对比例1
本实施例提供一种黑木耳液体菌种的制备方法，所述方法包括如下步骤：
s01：购买黑木耳菌种，并保存于pda斜面培养基上；所述pda斜面培养基包括马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，余量为水；
s02：将150ml液体培养基加入至500ml的三角瓶中，灭菌并冷却后接入所述步骤s01中的菌种，旋转式摇床，转速160r/min，在温度28℃条件下培养5天；其中，液体培养基包括：麸皮：10%，玉米粉：5%．葡萄糖：1%，kh2p04：0.1%，mgs04：0.1%，蛋白胨：0.1%，余量为水，所述液体培养基的灭菌方法为：将所述液体培养基加热至125℃保持3小时。
s03：将所述步骤s02获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐一次发酵培养基上，在发酵罐内保持恒温28℃，通入无菌空气培养6天；其中，所述发酵罐一次发酵培养基包括：麸皮：5%，玉米粉：10%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐一次发酵培养基灭菌方法为：将所述发酵罐一次发酵培养基在发酵罐中加热至125℃保持1小时。
对比例2
本实施例提供一种黑木耳液体菌种的制备方法，所述方法包括如下步骤：
s01：购买黑木耳菌种，并保存于pda斜面培养基上；所述pda斜面培养基包括马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，余量为水；
s02：将150ml液体培养基加入至500ml的三角瓶中，灭菌并冷却后接入所述步骤s01中的菌种，旋转式摇床，转速180r/min，在温度24℃条件下培养5～8天；其中，液体培养基包括：麸皮：10%，玉米粉：5%．葡萄糖：1%，kh2p04：0.1%，mgs04：0.1%，蛋白胨：0.1%，余量为水，所述液体培养基的灭菌方法为：将所述液体培养基加热至121℃保持1小时。
s03：将所述步骤s02获得的菌种接入灭菌并冷却后的发酵罐一次发酵培养基上，在发酵罐内保持恒温24℃，通入无菌空气培养4天；其中，所述发酵罐一次发酵培养基包括：麸皮：5%，玉米粉：10%．葡萄糖：2%，kh2p04：0.2%，mgs04：0.1%，余量为水；所述发酵罐一次发酵培养基灭菌方法为：将所述发酵罐一次发酵培养基在发酵罐中加热至118℃保持3小时。
将上述液体菌种与固体菌种相比：
液体菌种8d即可达到接种要求，而固体菌种需30d以上菌丝才能长满瓶。固体菌种原种、栽培种培养共需50d，而液体菌种原种、栽培种培养共需25d，采用摇瓶发酵结合固体料制种可缩短制种时间25d，可见在时间上液体菌种比固体菌种有更大的优越性。
液体菌种与固体菌种在栽培过程的差异，液体菌种袋比固体菌种袋提前25d长满，始菇期提前8d，终菇期延后20d，生物学效率提高15%。
将上述实施例1至实施例5与对比例1和对比例2进行对比，即二次发酵获得的菌种相比一次发酵获得的菌种，二次发酵在等量原种的情况下增大接种量三到四倍，节约生产成本；且二次发酵使液体发酵液中的营养成分维持在适宜的水平，既利于菌丝在液体环境中生长，又能让菌丝在接入菌棒后的萌发阶段更快适应；最主要的是二次发酵使菌种发酵的更均匀，更充分，提高了菌种的成活率。
当然，上述说明也并不仅限于上述举例，本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述；以上实施例仅用于说明本发明的技术方案并非是对本发明的限制，参照优选的实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换都不脱离本发明的宗旨，也应属于本发明的权利要求保护范围。