一种铁皮石斛内生真菌菌株及其产生的胞外多糖以及该胞外多糖的提取方法与应用与流程

本发明涉及内生真菌菌株提取多糖领域，具体涉及一种铁皮石斛内生真菌菌株及其产生的胞外多糖以及该胞外多糖的提取方法与应用。

背景技术：

植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌，与菌根真菌只存在于植物根系不同，内生真菌在植株的地下和地上部分的任何组织器官都能存在。研究发现：植物内生真菌不仅包括了互惠共利的和中性的内共生真菌，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原菌；有的内生真菌能促进宿主植物的生长、增强宿主的抗逆性、促进宿主植物活性成分的合成和积累，在提高植物产量和质量中可以起到积极作用。因此，利用植物内生真菌这一尚未深入挖掘的宝库，同时植物内生真菌在筛选活性物质方面，表现出的巨大潜力，合成的次生代谢产物不但化学成分丰富，而且也具有多种多样的生物活性的特点，选取传统药用植物铁皮石斛(dendrobiumofficinale)作为宿主植物分离内生真菌及真菌活性研究具有重要的意义。

铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)属兰科附生草本植物，是我国传统名贵中药，具有滋阴清热、益胃生津、润肺明目、抗癌防老等功效，位列“中华九大仙草”之首，广泛运用于慢性咽炎、闭塞性周围血管病、白内障、青光眼等疾病的治疗药方及各种保健品中，市场需求量很大，长期无制的采挖造成其资源枯竭，已无野生资源可用。至1987年，被列为国家重点保护野生植物，在《中国植物红皮书》中被列为濒危种，现己成为国家二级保护植物。2010年版《中华人民共和国药典》将铁皮石斛从石斛类药材中划出，单独收录。

近二十年来，由于相关研究包括膜的化学功能、免疫物质的研究以及对新药物资源的寻找等，人们发现多糖在生物体中不仅作为能量资源或结构材料，更重要的是它参与生命科学中细胞的各种活动，体现多种多样的生物学及活性功能，如降血糖、血脂作用，心脑血管作用，抗肿瘤、抗菌、抗病毒作用，免疫增强或调节作用，肝、肠、胃保护作用，抗炎、抗氧化、抗衰老作用等。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种铁皮石斛内生真菌菌株，该菌株属于腐皮镰刀霉菌(fusariumsolani)，是采用内生真菌分离纯化技术从铁皮石斛植物活体中分离、纯化得到。

本发明的目的还在于提供所述的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖，该胞外多糖具有良好的抑制病原菌的效果。

本发明的目的还在于提供一种提取所述的铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖的方法，该方法包括如下流程：菌株活化-种子液培养-发酵培养-发酵液真空抽滤-抽滤液真空浓缩-浓缩液醇沉-沉淀离心-沉淀水溶后透析-透析液真空冷冻干燥-获得冻干粉，即为所述胞外多糖。

本发明的目的还在于提供所述的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖在抑制病原菌中的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种铁皮石斛内生真菌菌株，属于腐皮镰刀霉菌，命名为fusariumsolanid07，于2017年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌路珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为cctccno.m2017145。

一种由上述所述的铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖的提取方法，包括如下步骤：

(1)将所述铁皮石斛内生真菌菌株活化培养后，进行种子液培养，再将得到的种子液进行发酵培养；

(2)将步骤(1)发酵培养后得到的发酵液真空抽滤，得到的抽滤液进行真空浓缩、醇沉、离心，将离心得到的沉淀脱水处理、干燥后，溶于去离子水中进行透析，对透析液进行真空冷冻干燥，得到所述铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖。

进一步地，步骤(1)中，所述活化培养是采用试管斜面培养方法，于28±1℃活化培养72小时，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(固体pda)。

进一步地，步骤(1)中，所述种子液培养是采用马铃薯葡萄糖水培养基(pdb)，于28±1℃、120rpm摇床培养48～72小时。

进一步地，步骤(1)中，所述发酵培养是按5v％～15v％的接种量将种子液接种于马铃薯葡萄糖水培养基中，于28±1℃、120rpm摇床发酵培养7～14天。

进一步地，步骤(2)中，所述真空浓缩是采用旋转蒸发仪于45℃将抽滤液浓缩为原液的1/10体积。

进一步地，步骤(2)中，所述醇沉是采用浓缩液：95vol％乙醇＝1：4的体积比混合均匀，4℃静置12～24小时。

进一步地，步骤(2)中，所述离心是在8000rpm离心15分钟。

进一步地，步骤(2)中，所述脱水处理是依次采用无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤进行脱水处理。

进一步地，步骤(2)中，所述干燥是在温度50～55℃下进行干燥。

进一步地，步骤(2)中，经脱水处理、干燥后的沉淀在溶于去离子水后的浓度为0.05～0.2g/ml。

进一步地，步骤(2)中，所述透析是采用截留分子量3500da透析袋蒸馏水透析24～72小时。

由上述任一项所述的提取方法提取得到的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖。

提取得到的胞外多糖具有良好的抑菌活性，对包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的病原菌具有明显的抑制作用，将所述的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖应用于抑制病原菌中。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖对包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的病原菌具有明显的抑制活性作用，能很好地应用于抑制病原菌中；

(2)本发明的提取方法工艺简单易行，条件温和、易于控制，为大规模提取铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖提供了新路径，同时为通过改进内生真菌与宿主植物的相互作用提高胞外多糖产量提供新的思路。

附图说明

图1为实施例1中的铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsolanid07于pda培养基上培养5天于100倍显微镜下观察到的菌丝形态图。

图2a和图2b为实施例1中的铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsolanid07于pda培养基上培养5天于不同倍率下扫描电镜下观察到的菌丝形态图。

图3a和图3b为实施例1中的铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsolanid07于pda培养基上培养5天于不同倍率下扫描电镜下观察到的孢子形态图。

具体实施方式

以下结合具体实施例以及附图对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明不限于此。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明具体实施例的一种铁皮石斛内生真菌菌株，属于腐皮镰刀霉菌，命名为fusariumsolanid07，于2017年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌路珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为cctccno.m2017145；

铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsolanid07的核糖体内转录间隔区(its)和5.8s核糖体rna编码基因如seqidno.1所示。

本发明具体实施例的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖，通过如下方法流程提取得到：

菌株活化-种子液培养-发酵培养-将发酵液真空抽滤-将抽滤液真空浓缩-将浓缩液醇沉-沉淀离心-沉淀水溶后透析-透析液真空冷冻干燥-冻干粉，即为所述胞外多糖；

将得到的胞外多糖用蒸馏水溶解后，胞外多糖含量参照《2010版中国药典一部》中的苯酚—硫酸比色法测定。

本发明具体实施例的一种铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖对包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的病原菌具有明显的抑制作用，抑菌活性评价包括如下方法流程：

病原菌菌株活化-种子液培养-平板涂布-含所述菌株胞外多糖滤纸片接种-培养-抗菌结果观察；

具体抑菌活性评价，包括如下步骤：

(1)病原菌菌株采用试管斜面培养方法，培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(固态lb培养基)，于37±1℃活化培养24小时；

(2)活化培养后的菌种转移至牛肉膏蛋白胨液体培养基(液态lb培养基)中，于37±1℃摇床160rpm种子液培养24小时，得到种子液；

(3)将得到的种子液接种于涂布平板培养基(以牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或牛肉膏蛋白胨液体培养基为涂布平板培养基)中，凝结后于37±1℃培养24小时；

(4)滤纸片采用6mm直径打孔器获取，滤纸片灭菌后浸泡在浓度0.05g/l的胞外多糖溶液中，风干后，置于培养好测试菌株的培养皿中，平板37℃倒置培养24～48小时。

实施例1

铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsolanid07的固体培养特征为：

在马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基上于28±1℃培养4～7天，最初其生菌丝为无色，渐变为红色；菌落呈浅白绒毛状，边缘不整齐；菌丝体白色，发达，背面最初白色，渐变为红色。

铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsolanid07的液体培养特征为：

(1)培养基pdb，摇瓶培养7天，培养温度为28±1℃；

(2)发酵培养特征：培养第1-2天，未见明显生长现象；培养第三天，有深红色菌丝出现；

培养第4-5天，菌丝增多，培养5天于100倍显微镜下观察到的菌丝形态图如图1所示，培养5天于不同倍率下扫描电镜下观察到的菌丝形态图如图2a和图2b所示，而培养5天于不同倍率下扫描电镜下观察到的孢子形态图如图3a和图3b所示；

培养第6天，培养瓶瓶壁黏附有深红色菌丝，培养液中有1-2mm深红色菌丝球；

培养地7天，菌丝球增大到2-4mm。

铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsolanid07的形态特征为：

(1)无性繁殖，菌丝体密集，成树枝状，侧生大量带梗孢子囊，孢子囊中最多可含22个孢子；

(2)有性世代，未发现。

实施例2

铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖的提取，包括如下方法流程：

菌株活化-种子液培养-发酵培养-将发酵液真空抽滤-将抽滤液真空浓缩-将浓缩液醇沉-沉淀离心-沉淀水溶后透析-透析液真空冷冻干燥-冻干粉，即为所述胞外多糖；

具体提取过程包括如下步骤：

(1)取铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsolanid07菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体pda培养基试管，于28±1℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体pdb种子培养基中，于28±1℃、120rpm摇床培养72小时，得种子液；

(3)在无菌条件下，将种子液按10v％(体积百分比)接种量接入500ml液体培养基中，于28±1℃、120rpm摇床培养7天；

(4)将发酵液真空抽滤，抽滤液于45℃下旋蒸浓缩至1/10体积，然后添加4倍体积于浓缩液的95vol％乙醇，剧烈震荡后，4℃静置24小时，得到醇沉液；

(5)将醇沉液8000rpm离心15分钟，弃去上清液，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤脱水，50℃烘干后，采用去离子水溶解，溶解后的浓度为0.2g/ml；

(6)溶解于去离子水后的沉淀采用3500da截留分子量透析袋蒸馏水透析24小时，得到透析液；

(7)对得到的透析液进行冷冻干燥，得到冻干粉，即为铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsolanid07产生的胞外多糖。

获取的胞外多糖产量为1.77g/l。

实施例3

铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖的抑菌效果测试

(1)取选用的4种常见病原菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量病原菌菌落，接入已灭菌的固体lb培养基试管，于37±1℃活化24小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体lb种子培养基中，于37±1℃、160rpm摇床培养24小时，得种子液；

(3)在无菌条件下，按2v％(体积百分比)接种量接入10ml液体lb平板培养基中，晃动平板，使种子液和lb液体培养基混合均匀，超净工作台中待其凝固后于37±1℃培养24小时；

(4)将实施例2获取的铁皮石斛内生真菌胞外多糖冻干粉采用去离子水配成0.05g/l的胞外多糖溶液；

(5)实验组吸取0.05g/l的胞外多糖溶液20ul于滤纸片(φ＝0.6cm，已灭菌)上，而空白对照组则于无菌滤纸片上添加20ul无菌水，略微风干后，置于含有测试菌的培养皿中，一种测试菌的培养皿中放3个滤纸片；

(6)将制好后的测试菌培养皿置于37℃的培养箱中恒温培养24h后观察，测其抑菌圈的大小。

抑菌圈的观察结果如表1所示。

表1实施例2提取得到的菌株产生的胞外多糖的抗菌活性结果

由表1结果可见，铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖对包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的四种病原的抑菌圈半径均大于空白对照组，说明铁皮石斛内生真菌菌株产生的胞外多糖具有明显的抑制常见致病菌的作用。

应当理解，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不用于限制本发明的范围。此外，应当理解，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些各种改动或修改的等价形式同样落于本申请所附权利要求所限定的范围。

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