组织再生促进剂的制作方法

本发明涉及含有RGD肽的用于细胞增殖促进和/或组织再生促进的组合物、使用了RGD肽的用于细胞增殖促进和/或组织再生促进的方法、使用了RGD肽的细胞培养物的制造方法等。

背景技术：

生物体的组织如果受到损伤，则会进行再生以补偿损伤部分，并恢复其功能。例如，已知肝脏即使切除一半以上，也会在短时间内再生，恢复大致原本的大小和功能。关于组织再生的研究，以往重点对肝脏进行，且报告了各种见解，但关于组织再生的详细机制仍有很多不明之处。认为组织的再生中有多种细胞的复杂参与，但关于这些细胞中的哪些承担主要作用，并未得出决定性的见解。

组织的再生中，构成组织的细胞或分化成该细胞的干细胞的增殖不可或缺，HGF等细胞生长因子已知介由其细胞增殖能力等参与组织的再生(非专利文献1)。但是，由于近年对再生医疗的需求高涨，要求探究有助于组织再生或细胞增殖的促进的进一步的物质

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Nakamura and Mizuno，Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci.2010；86(6)：588-610

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供新型的用于细胞增殖促进和/或组织再生促进的组合物及方法等。

用于解决课题的方法

本发明者们为了解决上述课题进行了深入研究，其中发现RGD肽促进细胞的增殖，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下技术方案。

(1)一种用于促进细胞增殖的组合物，其含有RGD肽。

(2)根据(1)所述的组合物，其中，细胞为组织实质细胞。

(3)一种用于促进组织再生的组合物，其含有RGD肽。

(4)根据(3)所述的组合物，其中，组织再生伴随有组织实质细胞的增殖。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的组合物，其还含有细胞增殖因子。

(6)一种促进细胞增殖的方法，其包含使RGD肽与细胞接触的工序。

(7)根据(6)所述的方法，其中，使RGD肽与细胞接触的工序是在血清和/或细胞增殖因子的存在下进行的。

(8)一种细胞培养物的制造方法，其包含使RGD肽与细胞接触的工序及培养细胞的工序。

(9)根据(8)所述的方法，其中，使RGD肽与细胞接触的工序、和/或培养细胞的工序是在血清和/或细胞增殖因子的存在下进行的。

发明效果

通过本发明，促进细胞增殖成为可能，可期待在生物学、细胞工学、医学、医疗(特别是再生医疗)等领域做出大的贡献。

附图说明

图1为表示将肝细胞在RGD肽的存在下培养时的BrdU阳性细胞的显微镜图像。

图2为表示将肝细胞在RGD肽的存在下培养时的BrdU阳性细胞的比例的图。

具体实施方式

本说明书中只要没有另外定义，则本说明书中使用的全部技术用语及科学用语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。本说明书中所参照的全部专利、申请及其他出版物(包括在线信息)其全部内容通过参照引入本说明书中。

本发明涉及：一种用于促进组织再生的组合物，其含有RGD肽作为有效成分；一种制造用于促进组织再生的组合物的方法，其包含将RGD肽作为有效成分进行配合；RGD肽在制造用于促进组织再生的组合物中的用途；一种组合物，其含有用于促进组织再生的有效量的RGD肽；以及，一种用于组织再生促进的RGD肽。

本说明书中，RGD肽是指RGD基序、即含有由Arg-Gly-Asp构成的氨基酸序列的肽。RGD肽可以仅由Arg-Gly-Asp构成，也可以在N末端、C末端或两末端含有进一步的氨基酸残基。RGD肽，没有限定，可以为例如3～100个氨基酸长、3～50个氨基酸长、3～25个氨基酸长、3～20个氨基酸长、3～15个氨基酸长、3～10个氨基酸长、3～8个氨基酸长、3～5个氨基酸长等。因此，RGD肽，没有限定，可以是例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸长等。

RGD肽可以是直链状、可以是环状、也可以是分枝状。为环状时，可以是肽的两末端结合而成的类型(head-to-tail型，头对尾型)，也可以是至少1个末端自由的环状。为环状肽时，RGD基序可以位于环的顶点部分。氨基酸残基可以无修饰也可以经过修饰。为6个氨基酸长以上的RGD肽时，可以含有1个或2个以上的RGD基序。RGD肽可以设计为采取在至迟与细胞接触前，至少1个RGD基序被细胞识别那样的拓扑结构。例如，RGD肽可以采取在生物体外至少1个RGD基序已被细胞识别那样的拓扑结构，也可以采取虽然在生物体外RGD基序不被细胞识别的拓扑结构，但是在生物体内在pH等环境的变化或代谢等作用下成为至少1个RGD基序被细胞识别那样的拓扑结构。这里，作为被细胞识别那样的拓扑结构，没有限定，可列举出例如RGD肽采取3维结构时，RGD基序未被其他氨基酸残基隐蔽那样的拓扑结构等。在一个方式中，RGD肽具有由无修饰的氨基酸残基构成的至少1个RGD基序。

RGD肽可以利用已知的肽，也可以新设计。作为已知的RGD肽的非限定例子，可列举出例如Arg-Gly-Asp(例如Sigma-Aldrich，Cat.No.A8052)、Arg-Gly-Asp-Ser(序列编号1、例如Sigma-Aldrich，Cat.No.A9041、肽研究所、Cat.No.4171)、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser(序列编号2、例如Sigma-Aldrich，Cat.No.G4391)、Cyclo(Ala-Arg-Gly-Asp-3-Aminomethylbenzoyl)(序列编号3、例如Sigma-Aldrich，Cat.No.C9357)、Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro(序列编号4、例如Sigma-Aldrich，Cat.No.G5646)、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro(序列编号5、例如Sigma-Aldrich，Cat.No.SCP0157)、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys(序列编号6、例如Sigma-Aldrich，Cat.No.G1269)、Echistatin(例如Sigma-Aldrich，Cat.No.SCP0157)、GRGDS(序列编号7、例如肽研究所、Cat.No.4189-v)、Cilengitide、RGD4C(ACDCRGDCFCG、序列编号8)、RGD10(DGARYCRGDCFDG、序列编号9)、Cyclo(Cys-Arg-Gly-Asp-Cys)(序列编号10)、SKF107260、G-4120、CYGGRGDTP(序列编号11)、Cyclo(RGDfK)等。

另外，本发明中的RGD肽包括模拟了RGD肽的功能的RGD肽模拟物(例如，Dugganetal.，JMedChem.2000；43(20)：3736-45)、及具有与RGD肽类似功能的RLD(Arg-Leu-Asp)基序或KGD(Lys-Gly-Asp)基序的肽。作为RGD肽的功能，可列举出如本说明书的例1中记载的那样的细胞增殖促进作用、对整合素分子(例如整合素αvβ1、αvβ3等)的结合性等。

在本发明的组合物的作用下促进再生的组织没有特别限定，包括全身的各种组织。所述组织，没有限定，可列举出例如星状细胞存在的组织、发生纤维化的组织、干细胞存在的组织等。作为促进再生的组织的非限定例子，可列举出例如肝脏、胰腺、肾脏、肠道、肺、脾脏、心脏、骨髓、声带、皮肤、腹膜、眼、脉管、神经组织、软骨、骨、肌肉、乳房、毛囊等。

本发明的组合物对于损害组织或在移植组织中发生的组织再生是有用的。损害组织包括受到组织破坏、炎症、坏死、纤维化、手术侵袭、器官衰竭等的组织。

本发明的组合物引起的组织再生可以伴随有干细胞的分化和/或增殖。另外，本发明的组合物引起的组织再生还可以伴随有组织实质细胞的增殖。干细胞的分化可以通过例如分化细胞特异性的细胞标记物的检测、分化细胞所显示功能的检测等来评价。细胞的增殖可以通过各种已知方法、例如经时的活细胞数的计数、组织的尺寸、体积或重量的测定、DNA合成量的测定、细胞增殖标记物的检测、WST-1法、BrdU(溴脱氧尿苷)法、³H胸苷导入法等来评价。

本发明的组合物可以对具有组织再生受到抑制的状态的对象使用。作为组织再生受到抑制的状态，没有限定，例如包括炎症、坏死、纤维化、器官衰竭、血小板数量减少、基因异常、去甲肾上腺素减少等。

本发明的组合物中的RGD肽的配合量是在给予了组合物时可促进组织再生的量。另外，优选不会产生超过因给予引起的益处的不良影响的量。所述量是公知的，或者是可以通过使用了培养细胞等的体外试验、或小鼠、大鼠、狗或猪等动物模型的试验来适当确定，这样的试验方法是本领域技术人员所熟知的。组织再生的促进可以通过使用了生化学检查、X光、超声波、MRI、CT、内窥镜等的图像诊断等对组织的功能、重量、大小等的恢复进行评价。RGD肽的配合量可以根据组合物的投药方式而变化。例如在1次给予中使用几个单位的组合物时，1个单位组合物中所配合的RGD肽的量的量可以设为1次给予所需的RGD肽的量的几分之一。本领域技术人员可以适当进行这样的配合量调整。

本发明还涉及一种促进对象的组织再生的方法，其包括将RGD肽给予至需要其的对象的工序。本方法中的对象可以是组织受到损害，也可以是受到组织移植。损害并无限定，例如包括组织破坏、炎症、坏死、纤维化、手术侵袭、器官衰竭等。另外，本方法中的对象可以患有通过组织再生能够改善的疾病。所述疾病在下文中详述。

本发明还涉及一种用于促进细胞增殖的组合物，其含有RGD肽作为有效成分；一种制造用于促进细胞增殖的组合物的方法，其包含将RGD肽作为有效成分进行配合；RGD肽在制造用于促进细胞增殖的组合物中的用途；一种组合物，其含有用于促进细胞增殖的有效量的RGD肽；以及，一种RGD肽，其用于细胞增殖的促进。

作为促进增殖的细胞，没有限定，可列举出例如肝脏、胰腺、肾脏、肠道、肺、脾脏、心脏、骨髓、声带、皮肤、腹膜、眼、脉管、神经组织、软骨、骨、肌肉、乳房、毛囊等组织的细胞。细胞可以是体细胞(即分化了的细胞)也可以是干细胞。体细胞包括实质细胞及非实质细胞。干细胞没有特殊限定，包括例如组织干细胞(成体干细胞)、胚性干细胞、iPS细胞等。干细胞可以是全能性、万能性、多能性或单能性的。作为组织干细胞，没有限定，可列举出例如神经干细胞、造血干细胞、间充质系干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、皮肤干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、心脏干细胞等。细胞可以是自体来源的细胞，也可以是同种的其他个体或异种的个体的细胞。可以将经增殖的细胞移植给需要其的对象。另外，促进增殖的细胞可以存在于生物体内、也可以存在于生物体外。存在于生物体外时，细胞可以存在于从生物体分离的组织中，也可以以从组织分离的状态存在。

细胞可以具有识别RGD基序的细胞表面分子。作为所述细胞表面分子，可列举出例如整合素。整合素是由α链和β链这2个亚单位构成的蛋白。在一个方式中，细胞表达具有β1链的整合素。在一个方式中，细胞表达具有αv链的整合素。在特定的方式中，细胞表达选自由整合素α5β1、α8β1、αIIBβ3、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8组成的组中的整合素。

细胞的增殖可以通过各种已知的方法、例如经时的活细胞数的计数、组织的大小、体积或重量的测定、DNA合成量的测定、细胞增殖标记物的检测、WST-1法、BrdU(溴脱氧尿苷)法、³H胸苷导入法等来评价。本发明中，促进细胞增殖是指，在RGD肽的存在下细胞增殖(例如培养规定期间后的细胞数、从某个时点的细胞数(例如播种时的细胞数)的增加率等)与没有RGD肽的存在下的细胞增殖相比增大。细胞增殖的增大程度没有限定，例如可以为没有RGD肽存在下的细胞增殖的5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、150％以上、200％以上、250％以上、300％以上等。

本发明的组合物中的RGD肽的配合量或有效量是在给予了组合物时可促进细胞增殖的量。另外，优选不会产生超过因给予引起的益处的不良影响的量。所述量是公知的，或者是可以通过使用了培养细胞等的体外试验、或小鼠、大鼠、狗或猪等动物模型的试验来适当确定，这样的试验方法是本领域技术人员所熟知的。细胞增殖的促进可以通过上述的各种方法来评价。RGD肽的配合量可以根据组合物的给药方式而变化。例如在1次给予中使用几个单位的组合物时，1个单位组合物中所配合的RGD肽的量可以设为1次给予所需的RGD肽的量的几分之一。本领域技术人员可以适当进行所述配合量调整。本发明的组合物可以在体外(invitro)、体内(invivo)或离体(exvivo)中使用。本发明的组合物还可以用于后述的本发明的细胞培养物制造方法。

本发明还涉及一种促进对象的细胞增殖的方法，其包括将RGD肽的有效量给予至需要其的对象的工序。本方法中的对象可以是组织受到损害，也可以是受到组织移植。损害并无限定，例如包括组织破坏、炎症、坏死、纤维化、手术侵袭、器官衰竭等。另外，本方法中的对象可以患有通过组织再生能够改善的疾病。所述疾病在下文中详述。

本发明还涉及一种用于通过组织再生和/或细胞增殖能够改善的疾病的处置的组合物，其含有RGD肽作为有效成分；一种制造用于处置所述疾病的组合物的方法，其包含将RGD肽作为有效成分进行配合；RGD肽在制造用于处置所述疾病的组合物中的用途；一种所述疾病的处置中使用的RGD肽；一种组合物，其含有处置所述疾病的有效量的RGD肽；以及一种用于处置所述疾病的方法，其包含将RGD肽的有效量给予需要其的对象。

作为通过组织再生和/或细胞增殖能够改善的疾病，没有限定，可列举出例如伴随着组织中的细胞或细胞基质的消失的疾病、需要细胞或组织移植的疾病等。细胞或细胞基质的消失没有限定，例如可由于坏死或细胞凋亡等导致的细胞死亡、外伤等导致的组织损伤、手术等导致的组织摘出等而产生。通过组织再生和/或细胞增殖能够改善的疾病，例如由肝脏、胰腺、肾脏、肠道、肺、脾脏、心脏、骨髓、声带、皮肤、腹膜、眼、脉管、神经组织、软骨、骨、肌肉、乳房、毛囊等的组织产生。作为通过组织再生和/或细胞增殖能够改善的疾病的非限定例子，可列举出例如组织纤维化(例如肝纤维化(包括肝硬化)、肺纤维化、肾纤维化、胰腺纤维化、肠道纤维化、骨髄纤维化、腹膜纤维化等)、梗塞性疾病(例如心肌梗塞、脑梗塞等)、坏死性疾病(例如坏疽(包括糖尿病性坏疽)、褥疮、溃疡等)、神经变性疾病、外伤、需要细胞或组织移植的器官衰竭、需要再建术的肿瘤性疾病(例如乳腺癌、头颈部癌、舌癌、口腔癌、食道癌等)等。

本发明的各种组合物可以在RGD肽之外还进一步含有细胞生长因子作为有效成分，还可以与细胞生长因子并用。同样地，本发明的各种方法中，也可以将RGD肽与细胞生长因子并用。作为细胞生长因子，没有限定，可列举出例如HGF、EGF、VEGF、FGF、TGF-α、PDGF、HB-EGF、神经营养素、GDNF等。细胞生长因子可以是天然存在的因子，也可以是人工制作的因子。因此，细胞生长因子包括重组细胞生长因子。与细胞生长因子的氨基酸及对其进行编码的碱基序列有关的信息可从已有的数据库(例如GenBank等)获得。

本发明中的细胞生长因子还包括其功能性突变体。细胞生长因子为蛋白时，其功能性突变体并无限定，可列举出例如：(i)该蛋白的氨基酸序列中具有1个或2个以上、典型的是1个或几个突变、但具有与该蛋白同等功能的突变体；(ii)由具有编码该蛋白的基因的碱基序列的核酸、或在编码与该核酸相同的多肽的核酸的碱基序列中具有1个或2个以上、典型的是1个或几个突变的核酸编码、且具有与该蛋白同等功能的突变体；(iii)由具有编码该蛋白的基因的碱基序列的核酸、编码与该核酸相同的多肽的核酸或编码(ii)的突变体的核酸的互补链、或者其片段中在严格条件下杂交的核酸编码、且具有与该蛋白同等功能的突变体；(iv)与该蛋白的氨基酸序列具有60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上、尤其优选95％以上的同源性的氨基酸序列、且具有与该蛋白同等功能的突变体；(v)由与编码该蛋白的基因的碱基序列具有60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上、尤其优选95％以上的同源性的核酸编码、且具有与该蛋白同等功能的突变体等。

本领域技术人员可以根据细胞生长因子的序列信息、通过已知的任意方法、例如化学合成、利用限制性酶的核酸的切断或插入、部位特异性突变导入、放射线或紫外线的照射等来适当制作上述功能性突变体。

某突变体是否具有与细胞生长因子同等的功能可以通过下述方法评价：利用已知的任意方法对该突变体就细胞生长因子的已知功能、没有限定、例如细胞增殖诱导能力等进行分析，与适当的阴性对照、或作为阳性对照的细胞生长因子进行比较，由此进行评价。例如对于某突变体，在所述功能比阴性对照优异时，例如优异10％以上、25％以上、50％以上、75％以上、甚至100％以上时，和/或该功能为阳性对照的1/100以上、1/50以上、1/25以上、1/10以上、1/5以上、甚至1/2以上时，该突变体包括在细胞生长因子的功能性突变体中。

本说明书中所用的“严格条件”的用语是本技术领域众所周知的参数，记载于标准实验指南集、例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3d ed.，Cold Spring Harbor Press(2001)、或Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)等。

本发明中的严格条件例如是指利用65℃下的由3.5×SSC(0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠、pH为7)、葡聚糖0.02％、聚乙烯吡咯烷酮0.02％、牛血清白蛋白0.02％、NaH₂PO₄25mM(pH为7)、SDS 0.05％、EDTA 2mM构成的杂交缓冲液进行的杂交。杂交后，移入了DNA的膜用2×SSC在室温下洗涤，接着用0.1～0.5×SSC/0.1×SDS在最高68℃的温度下洗涤。或者，严格的杂交也可以使用ExpressHyb^(R)Hybridization Solution(Clontech公司)等的市售的杂交缓冲液、在由制造者记载的杂交和洗涤条件下进行。

虽然存在达到产生同等程度的严格的结果的可使用的其他条件、试剂等，但认为本领域技术人员是知晓这样的条件的，因此对此，本说明书中并不特别记载。然而，为了可以明确地鉴定出对蛋白的突变体进行编码的核酸，可以对条件进行操作。

本发明中的细胞生长因子除了该蛋白自身或其功能性突变体外，也包括对该蛋白或其功能性突变体进行编码的核酸分子。

本说明书中记载的本发明的各种组合物、方法等中的有效成分含有核酸分子(例如编码细胞生长因子的核酸分子等)时，这些成分也可以单独的核酸形式直接利用，但也可以载持在各种载体上。作为载体，可以利用质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、病毒载体等公知的任意载体。载体优选至少包含使所载持的核酸的表达增强的启动子，此时，该核酸优选以可动作的方式与该启动子连接。所谓核酸以可动作的方式与启动子连接是指通过启动子的作用、按照适当地产生该核酸所编码的蛋白的方式配置该核酸与启动子。载体可以在宿主细胞内复制，也可以不在宿主细胞内复制，而且，基因的转录可以在宿主细胞的核外进行，也可以在核内进行。在后者的情况下，核酸可以并入宿主细胞的基因组中。

另外，有效成分也可以载持在各种非病毒性脂质或蛋白载体上。作为这样的载体，并无限定，可列举出例如胆固醇、脂质体、抗体原体、环糊精纳米粒子、融合肽、适体、生物降解性聚乳酸共聚物、聚合物等，可以提高在细胞内的导入效率(例如参照Pirollo and Chang，Cancer Res.2008；68(5)：1247-50等)。尤其阳离子性脂质体或聚合物(例如聚乙烯亚胺等)是有用的。作为可用作该载体的聚合物的进一步的例子，可列举出例如US2008/0207553、US2008/0312174等中记载的聚合物等。

本说明书中所记载的本发明的各种组合物可以用于生物体内的组织再生、疾病的处置等医疗用途。因此，本发明的各种组合物可以制成医药组合物。在医药组合物中，只要不妨碍有效成分的效果，则可以将有效成分与其他任意成分组合。作为这样的任意成分，可列举出例如其他化学治疗剂、药理学上可允许的载体、赋形剂、稀释剂等。而且，根据给予途径或药物释放模式等，用适当的材料、例如肠溶性包衣或定时崩解性材料将上述组合物被覆，还可组装到适当的药物释放系统中。

本说明书中所记载的本发明的各种组合物(包括各种医药组合物)可以通过包含经口和非经口这两者在内的各种途径给予，例如可以，并非限定，通过经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、肿瘤内、直肠、动脉内、门静脉内、心室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内、肺内和子宫内等途径进行给予，还可制成适于各给予途径的剂型。这样的剂型和制剂方法可以适当采用任意的公知的剂型和制剂方法(例如参照標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、2003年等)。

例如作为适于经口给予的剂型，并无限定，可列举出散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、糖浆剂等，另外作为适于非经口给予的剂型，可列举出溶液性注射剂、混悬性注射剂、乳浊性注射剂、用时制备型注射剂等注射剂。非经口给予用制剂可以是移植片、水性或非水性的等渗性无菌溶液或混悬液的形态。

本说明书中所记载的本发明的各种组合物(包括各种医药组合物)可以以任意形态供给，但从保存稳定性的观点出发，可以以能够用时制备的形态、例如在医疗现场或其附近可由医师和/或药剂师、护士或其他的辅助医务人员等制备的形态来提供。该形态在本发明的组合物包含脂质或蛋白、核酸等难以稳定保存的成分时尤其有用。此时，本发明的组合物以在其中含有至少1个必需构成要素的1个或2个以上的容器的形式提供，在使用前、例如24小时前以内、优选3小时前以内、更优选在马上要使用前进行制备。在制备时，可适当使用在进行制备的场所通常可获得的试剂、溶剂、调剂器具等。

因此，本发明还涉及组合物的制备试剂盒或包，其包含单独或组合地含有本发明的各种组合物中可含有的活性成分的1个或2个以上的容器；以及以这样的试剂盒或包形式提供的各种组合物的必要构成要素。本发明的试剂盒或包除了上述外，还可以包含本发明的各种组合物的制备方法、使用方法(例如给予方法等)等的指示，例如使用说明书、记录有指示内容的介质、例如软盘、CD、DVD、蓝光光盘、存储卡、USB存储器等电子记录介质等。另外，本发明的试剂盒或包可以包含用于完成本发明的各种组合物的全部构成要素，但也可以不一定要含有全部构成要素。因此，本发明的试剂盒或包可以不含有在医疗现场、实验室等中通常可获得的试剂、溶剂，例如无菌水、生理盐水、葡萄糖溶液等。本发明的试剂盒或包可以用于上述有关本发明的组合物的各种用途、例如细胞增殖的促进、组织再生的促进、细胞培养物的制造等。

本说明书中所记载的本发明的各种方法中的有效量是指，例如对于组织的再生，可以为促进组织的再生、或消除组织再生的延缓的量；对于细胞增殖，可以是促进细胞增殖或消除细胞增殖的延缓的量；对于疾病的处置，可以为减轻疾病的症状、或者延缓或停止疾病的发展的量，优选为抑制疾病、或治愈疾病的量。而且，优选不产生超越因给予带来的益处的不良影响的量。这样的量可以通过使用了培养细胞等的体外试验、或小鼠、大鼠、狗或猪等动物模型中的试验来适当确定，这样的试验方法是本领域技术人员所熟知的。而且，本发明的处置方法中所用的药物的用量是本领域技术人员所公知的、或者可以通过上述的试验等适当确定。RGD肽的1日总给予量，没有限定，例如可以为约1μg/kg～约1000mg/体重kg、约10μg/kg～约100mg/体重kg、约100μg/kg～约10mg/体重kg等。

本说明书中所记载的本发明的处置方法中所给予的有效成分的具体的用量可以考虑关于需要处置的对象的各种条件、例如抑制组织再生或细胞增殖的状态的有无、症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、给予的时期和频率、并用的医药、对治疗的反应性、剂型及对治疗的依从性等来确定。

作为给予途径，包括包含经口和非经口这两者的各种途径、例如经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、肿瘤内、直肠、动脉内、门静脉内、心室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内、肺内及子宫内等途径。

给予频率根据所用组合物的性状或包括上述的对象条件的不同而不同，例如可以为1日多次(即1日2、3、4次或5次以上)、1日1次、数日1次(即每2、3、4、5、6、7日1次等)、每周1次、每数周1次(即每2、3、4周1次等)。

本说明书中使用时，用语“对象”是指任意的生物个体，优选动物、更优选哺乳动物、进一步优选人的个体。本发明中，对象可以健康，也可以患有任一疾病，在想要实施特定疾病的处置时，典型地是指患有此种疾病、或存在患病风险的对象。

另外，本说明书中使用时，用语“处置”包括以疾病的治愈、暂时缓解或预防等目的、在医学上可允许的所有种类的预防性和/或治疗性的介入。例如，“处置”这一用语包括包含疾病发展的延缓或停止、病变的消退或消失、发病的预防或复发的防止等各种目的的医学上可允许的介入。

本发明还涉及促进细胞增殖的方法，其包含使RGD肽与细胞接触的工序。该方法可以在体外、体内或离体下进行。使RGD肽与细胞接触的工序可以在血清和/或细胞增殖因子的存在下进行。关于RGD肽、细胞、细胞增殖的促进及细胞增殖因子，如上文有关用于促进细胞增殖的组合物所记载的。

血清包括异种血清及同种血清。异种血清是指和与RGD肽接触的细胞为不同种的生物来源的血清。例如，该细胞为人细胞时，牛或马来源的血清、例如胎牛血清(FBS、FCS)、小牛血清(CS)、马血清(HS)等属于异种血清。另外，“同种血清”是指与该细胞为同一种的生物来源的血清。例如，该细胞为人细胞时，人血清属于同种血清。同种血清包括自体血清、即该细胞来源的个体的血清、及同一个体以外的同种个体来源的同种别人的血清。需要说明的是，本说明书中，也将除自体血清以外的血清、即异种血清和同种别人的血清总称为非自体血清。血清的浓度，没有限定，例如可以为0.1～50v/v％、0.5～40v/v％、1～30v/v％、2～20v/v％等的范围。

RGD肽与细胞的接触只要是RGD肽能够促进该细胞的增殖的方式，则没有特殊限定，例如，可以通过将RGD肽添加到含有该细胞的介质(例如培养基或生理缓冲液等)中，也可以通过将RGD肽给予含有该细胞的对象或组织来进行。与细胞接触时的RGD肽的浓度，没有限定，例如可以为0.1μg/mL～100mg/mL、1μg/mL～10mg/mL、10μg/mL～1mg/mL、20μg/mL～500μg/mL、25μg/mL～400μg/mL、50μg/mL～100μg/mL等的范围。

本发明还涉及一种细胞培养物的制造方法，其包含使RGD肽与细胞接触的工序、及培养细胞的工序。使RGD肽与细胞接触的工序、和/或培养细胞的工序可以在血清和/或细胞增殖因子的存在下进行。关于RGD肽、细胞、细胞增殖的促进、使RGD肽与细胞接触的工序、血清及细胞增殖因子等，如上文中有关用于促进细胞增殖的组合物或促进细胞增殖的方法中所记载的。

本发明中的细胞的培养可以在适于该细胞的生存、增殖的条件下进行。所述条件是本领域技术人员已知的，或者是本领域技术人员可适当调整的。作为所述条件的非限定例子，可列举出细胞培养培养基中的37℃、5％CO₂下的培养等。作为细胞培养培养基，没有限定，可列举出例如DMEM、MEM、F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7、DMEM/F12等。培养基也可以不含有血清。

通过本发明的制造方法制造的细胞培养物可用于各种移植疗法等。因此，通过本发明的制造方法制造的细胞培养物还可以是用于移植疗法中使用的细胞培养物。本发明的制造方法能够快速制造具有所期望细胞数的细胞培养物，因此对于移植疗法等中的细胞培养物的制造而言是有用的。

实施例

通过以下的例子对本发明进一步详细地进行说明，但这些例子不过是示例，并不是对本发明进行限定。

例1RGD肽对肝细胞的增殖的影响

通过将胶原酶溶液从门静脉灌流而从GFP基因导入大鼠(Slc Japan)的肝脏采集大鼠肝实质细胞(Seglen，Methods Cell.Biol.(1976)13：29-83)，将该大鼠肝实质细胞在含有10％胎牛血清的DME/F12培养基中以2×10⁵个/mL的浓度播种到以10μg/cm²的浓度涂覆有大鼠尾来源的Native collagen I(Sigma-Aldrich)的60mm平皿中，加入不同浓度的肽(RGD肽(Sigma-Aldrich，Cat.No.A8052)：50μg/ml、100μg/ml、GRGES肽(肽研究所、Cat.No.PFA-3907-PI)：100μg/ml、GRGDS肽(肽研究所、Cat.No.4189-v)：5089-ml、100μg/ml)，在37g、5％CO₂下培养48小时。培养第48小时时，将培养基替换成含有10μM BrdU及10％FBS的DME/F12培养基，在37℃、5％CO₂下进一步培养24小时。在培养第24小时时，将培养基除去，用PBS洗涤后，加入4％PFA，在室温下固定30分钟。固定后，用PBS洗涤，加入含有2N HCl及0.1％Triton X-100的PBS，进行透过处理。

在用PBS洗涤后，用5％山羊血清中进行封闭，加入小鼠单克隆抗BrdU抗体(MBL)及兔多克隆抗GFP抗体(Life Technologies)，在37℃下进行一次抗体反应60分钟。一次抗体反应后，用PBS洗涤，加入Alexa Fluor^(R)488标记山羊抗兔IgG(Life Technologies)及Alexa Fluor^(R)555标记山羊抗小鼠IgG(Life Technologies)，在37℃下进行二次抗体反应60分钟。二次抗体反应后，用PBS洗涤，使用含有DAPI的封闭剂将细胞封闭。将荧光显微镜图像示于图1。图中，箭头表示BrdU阳性细胞。另外，为了算出BrdU阳性细胞的比例，对BrdU阳性细胞数和GFP阳性细胞数进行计数。图2中示出了BrdU阳性细胞(增殖肝细胞)相对于GFP阳性细胞(总肝细胞)的比例。

从图1及2所示的结果可知，通过RGD肽，肝细胞的增殖得到促进。

序 列 表

<110> 日东电工株式会社

<120> 组织再生促进剂

<130> PCT2729ND

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD peptide

<400> 1

Arg Gly Asp Ser

1

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD peptide

<400> 2

Gly Arg Gly Asp Ser

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD peptide

<400> 3

Ala Arg Gly Asp

1

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD pepdide

<400> 4

Gly Arg Gly Asp Thr Pro

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD pepdide

<400> 5

Gly Arg Gly Asp Ser Pro

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD peptide

<400> 6

Gly Arg Gly Asp Ser Pro Lys

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD peptide

<400> 7

Gly Arg Gly Asp Ser

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD peptide

<400> 8

Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly

1 5 10

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD peptide

<400> 9

Asp Gly Ala Arg Tyr Cys Arg Gly Asp Cys Phe Asp Gly

1 5 10

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD peptide

<400> 10

Cys Arg Gly Asp Cys

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> RGD peptide

<400> 11

Cys Tyr Gly Gly Arg Gly Asp Thr Pro

1 5