与多能细胞有关的方法与流程

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年3月19日提交的美国临时申请号61/955,362、于2014年3月19日提交的美国临时申请号61/955,358和于2014年8月28日提交的美国临时申请号62/043,042的权益，这些申请的全部内容通过引用被并入本文中。
技术领域：
：本文所描述的技术涉及多能细胞的生产。
背景技术：
：：获得多能细胞的现行方法主要取决于可获得途径有限的组织(例如胚胎组织或脐带血)或涉及外源性核酸引入的重编程因子的加入(Hanna,J.等人，Cell2008133,250-264；Hockemeyer,D.等人，Cellstemcell20083,346-353；Kim,D.等人，Cellstemcell20094,472-476；Kim,J.B.Nature2009461,649-643；Okabe,M.等人，Blood2009114,1764-1767)。容易生产干细胞(特别是自体干细胞)而不会有由外源性重编程因子的加入所引入的并发症的方法加速了对细胞分化的研究和基于干细胞的疗法的发展。虽然推测由于暴露于刺激(诸如烧伤、化学损伤、创伤和辐射)对细胞的损害可能改变正常体细胞而变成癌细胞，但还不存在健康成年体细胞可被转变为其他状态，而无需对重编程因子的特异性操控的直接证据。之前，研究员已经报道了在成体组织中发现“成体干细胞”(Reynolds,B.A.&Weiss,S.Science1992255,1707-1710；Megeney,L.A.等人，Genes&development199610,1173-1183；Caplan,A.I.Journaloforthopaedicresearch19919,641-650；Lavker,R.M.&Sun,T.T.TheJournalofinvestigativedermatology198381,121s-127s)。这些报告仍然存在争议。例如，正在寻找表达干细胞标志物Oct4的细胞的研究员未能在正常体内平衡的成体骨髓中发现Oct4表达细胞(Lengner,C.J.等人，CellCycle20087,725-728；Berg,J.S.&Goodell,M.A.Cellstemcell20071,359-360)，而其他研究员报道了从不同的成体组织分离Oct4表达细胞的能力(Jiang,Y.等人，Nature2010418,41-49；D'Ippolito,G.等人，Journalofcellscience2004117,2971-2981；Johnson,J.等人，Cell2005122,303-315；Kucia,M.等人，Leukemia200620,857-869；Kuroda,Y.等人，PNAS2011107,8639-8643；Obokata,H.等人，Tissueengineering.2011PartA17,607-615；Rahnemai-Azar,A.等人，Cytotherapy201113,179-192；Huang,Y.等人，Transplantation201089,677-685；Zuba-Surma,E.K.等人，Journalofcellularandmolecularmedicine201115,1319-1328；Paczkowska,E.等人，Annalsoftransplantation201116,59-71)。已推测这些细胞代表成体干细胞群，或者仅是所使用技术的人工制品。在任何一种情况下，它们仍然是罕见的，并且不代表用于研究和治疗目的多能细胞的足够来源。技术实现要素：本文描述了用于生成多能细胞(例如STAP细胞)的改进方法，与各自通过引入并入本文中的国际专利公开WO2013/163296和Obokata等人的Nature(自然)2014505:641-647中所描述的方法相比，该改进方法提供了提高的效率、产量和/或质量。本文中还描述了与通过本方法生成的细胞有关的方法和用途。附图说明图1A-1D描绘了从CD45阳性体细胞生成的Oct4表达细胞。图1A描绘了应激(应力，stress)处理的细胞的Oct4-GFP表达。应激处理的细胞表达Oct4-GFP，而未处理的对照没有表达Oct4-GFP。在应激处理组中的右上方示出了Oct4表达集落的放大图。比例尺指示了100μm。图1B描绘了应激处理的细胞和未应激处理的对照的群分析。在第5天，仅在应激处理组中观察到了GFP表达细胞群。图1C描绘了在第7天，在应激处理之前和之后的CD45阳性细胞的细胞尺寸分析。图1D描绘了应激处理之后CD45阳性细胞随时间顺序的变化。图2A-2B描绘了动物愈伤组织(callus)细胞(ACC)的特征。图2A描绘了多能标志物基因随时间顺序的基因表达变化。信使RNA水平被归一化为GAPDH(n＝3，平均值+S.D.)。图2B描绘了Oct4和Nanog启动子基因的甲基化分析。图3A-3D描绘了应激处理之后的细胞修饰。图3A描绘了在ACC生成阶段期间的应激防御基因的相关基因表达。在第3天和第7天收集样品，并与CD45阳性细胞进行比较(n＝3，平均值+S.D.)。图3B描绘了总细胞ATP测量(n＝3，平均值+S.D.)。图3C描绘了ROS测量。误差棒指示了SD。图3D描绘了mtDNA复制因子的相关基因表达(n＝3，平均值+S.D.)。图4A-4B描绘了自ACC的嵌合体小鼠生成。图4A描绘了嵌合体小鼠生成的图示。组图(panel)(i)表明了用胰蛋白酶将AC解离成单细胞或(组图ii)将AC切成小块然后注入胚泡。图4B描绘了嵌合体贡献分析(contributionanalysis)。通过FACS分析来自9只小狗的组织。图5A-5C在ACC生成条件下实验。图5A表明了将CD45阳性细胞暴露于各种应激并通过FACS分析Oct4-GFP表达。应激处理之后在存活细胞中Oct4-GFP表达细胞的百分比(n＝3，平均值+S.D.)。图5B描绘了pH值条件的确定。将CD45阳性细胞暴露于不同的pH溶液。应激处理后第3天，通过FACS分析Oct4-GFP表达。图5C描绘了培养条件的确定。在各种培养基中培养应激处理的细胞。在第14天对GFP表达AC的数量进行计数(n＝3，平均值±S.D.)。图6A-6B描绘了由来源于ICR小鼠的CD45阳性细胞的ACC生成。图6A描绘了应激处理之后CD45阳性细胞随时间顺序的变化。通过FACS分析E-钙粘蛋白和SSEA-1的表达。图6B表明通过RT-PCR证实了E-钙粘附蛋白/SSEA1双阳性细胞的Oct4基因表达(n＝3，平均值+S.D.)。图7A-7B描绘了由来源于GOF小鼠的多种组织的ACC生成。图7A描述了应激处理之后Oct4-GFP表达细胞的比例。从多种组织分离体细胞，并暴露于多种应激。通过FACS分析Oct4-GFP表达。图7B描绘了来源于多种组织的ACC的胚胎基因表达。通过GAPDH将基因表达归一化(n＝3，平均值+S.D.)。图8描绘了在前7天期间应激防御基因的相关基因表达。应激处理之后，在第1、3和7天收集细胞，并与天然CD45阳性细胞进行基因表达比较。蓝色图表指示了热休克蛋白的基因表达。绿色图表指示了DNA修复基因表达。红色图表指示了氧化还原基因的基因表达。Y轴指示了表达的相对倍数。图9描绘了ACC的分化。该图表描绘了嵌合体贡献分析。通过FACS分析用来源于多种体细胞的ACC生成的嵌合体胚胎。图中示出了处于E13.5至15.5的5个嵌合体胚胎的平均值。图10表明应激处理引起了通过间充质-上皮转化(MET)对体细胞重编程。在天然细胞中和在应激处理开始后的第3天和第7天的细胞中示出了MET相关基因的表达。该y轴示出了表达％，其被归一化至对于那个基因具有表达水平的样品中的水平。图11描绘了在应激之前和在应激之后细胞群的FACS分析。在来自各检验的组织类型的应激后细胞群中GFP表达是明显的，表明生成多能细胞。图12A-12E表明定向体细胞中的低pH处理诱导的命运转变。图12A描绘了该实验方案的示意图。图12B描绘了流式细胞术分析(顶排：oct3/4::GFP+/CD45-；底排：未处理的CD45+细胞)。y轴是Oct3/4:GFP细胞的数量，且X轴是CD45+细胞的数量。这两个轴都以0、100、1000和10000的主要单位进行标记。图12C描绘了在培养物中有活力的oct3/4::GFP+和oct3/4::GFP-细胞随时间变化的图。图12D描绘了Oct3/4::GFP+细胞(左峰)和CD45+细胞(右峰)的细胞尺寸的图。图12E描绘了通过基因组PCR在已分离的oct3/4::GFP+球体中tcrβ的基因组重排的分析结果。图13A-13B表明了低pH诱导的Oct3/4+细胞具有多能性。图13A描绘了与CD45+细胞相比，在第7天的低pH诱导的oct3/4::GFP+细胞中通过qPCR的基因表达分析的图(系列从左至右表示oct3/4、nanog、sox2、ecatl、esgl、daxl和klf4表达)。在第3天和第7天收集样品，并与CD45阳性细胞进行比较(n＝3，平均值+S.D.)。图13B描绘了亚硫酸氢盐测序(硫化测序)的结果是具有oct3/4和nanog启动子区域。在有或没有另外培养的情况下，CD45+细胞在这两个启动子处显示了严重的甲基化模式。图14A-14B表明STAP细胞可以从其他组织来源获得。图14A描绘了在许多组织的第7天培养时oct3/4::GFP+细胞的产率的图表(从左至右的系列表示，CD45+细胞、骨髓、脑、肺、肌肉、脂肪、成纤维细胞、肝和软骨细胞)。图14B描绘了oct3/4::GFP+细胞簇中的基因表达分析的图(系列从左至右表示Oct3/4、Nanog、Sox2、Klf4和Rexl的表达)。图15A-15B描绘了作为多能细胞的STAP细胞的特征。图15A描绘了STAP细胞中ES细胞标志物的基因表达的图(系列从左至右表示ES、EpiSC、STAP和CD45)。图15B描绘了STAP细胞中X-染色体失活％的图。图16A描绘了在暴露于多种应激的CD45阳性细胞中通过FACS所分析的Oct4-GFP表达的图。在应激处理后，在存活细胞中Oct4-GFP表达细胞的百分比(n＝3，平均值+S.D.)。图16B描绘了确定pH条件的图。将CD45阳性细胞暴露于不同的pH溶液。在应激处理后第3天，通过FACS对Oct4-GFP表达进行分析(n＝3，平均值+S.D.)。图16C描绘了确定培养条件的图。在多种培养基中培养应激处理的细胞。在第14天，对表达GFP的应激改变的细胞团的数量进行计数(n＝3，平均值+S.D.)。图17A-17B描绘了由来源于ICR小鼠的CD45阳性细胞的SAC生成。图17A描绘了在应激处理后CD45阳性细胞按时间顺序的变化。通过FACS对E-钙粘蛋白和SSEA-1的表达进行分析。图17B描绘了通过RT-PCR证实的E-钙粘蛋白/SSEA1双阳性细胞的Oct4基因表达的图(n＝3，平均值+S.D.)。图18A-18B描绘了由来源于GOF小鼠的多种组织的SAC生成。图18A描绘了在应激处理后Oct4-GFP表达细胞的比例的图。从多种组织中分离体细胞，并暴露于多种应激。通过FACS对Oct4-GFP表达进行分析。从左至右的系列表示BM、脑、肺、肌肉、脂肪、成纤维细胞和肝。图18B描绘了来源于多种组织的SAC的胚胎基因表达的图。通过GAPDH将基因表达归一化(n＝3，平均值+S.D.)。从左至右的系列表示Oct4、Nanog、Sox2、Klf4和Ecatl。图19描绘了在前7天中应激防御基因的相关基因表达的图。在应激处理后，在第1天、第3天和第7天收集细胞，并与天然的CD45阳性细胞进行基因表达比较。Y轴表示表达的相对倍数。图20描绘了对SAC和来源于来自CD45+细胞的SAC的嵌合体小鼠的TCRβ链重排分析。2N嵌合体小鼠#1、#2、#3、#5、#6、#7、#8和#9表达重排的DNA。图21描绘了4N嵌合体小鼠的基因型分型分析。进行基因型分型，以证明利用由来源于129/Sv×B6GFPF1的SAC和来源于ICR表达的SAC(129/Sv×B6GFP)特异性基因的4N囊泡生成的4N嵌合体小鼠。图22表明了STAP细胞有助于体内胚胎组织和胎盘组织。该图描绘了在其中所注射的细胞仅有助于胚胎部分以及还有助于胎盘和卵黄囊组织的细胞的胎鼠(胚胎)的比例。图23A-23C表明FGF4处理诱导了STAP细胞中的一些滋养层谱系特征。图23A描绘了FGF4处理以从STAP细胞诱导TS样(F4I)细胞的示意图。图23B描绘了标志物表达的qPCR分析的图。图23C描绘了通过FACS分析对胎盘贡献进行定量的图。与F4I细胞不同，ES细胞并不在可检测的水平时有助于胎盘组织。图24A-24D表明，ES细胞样干细胞可以来源于STAP细胞。图24A描绘了从STAP细胞诱导干细胞系的示意图。图24B描绘了表明在120天内在维持培养中STAP-S细胞的稳健生长的图。用16个独立的细胞系获得了相似的结果。相反，亲代STAP细胞的数量迅速降低。图24C描绘了标志物基因表达的qPCR分析的图。ES细胞和STAP-S细胞表达在CD45+细胞中不表达的多能性相关基因。图24D描绘了通过亚硫酸氢盐测序进行的DNA甲基化研究的示意图。图25A-25B表明STAP干细胞是多能性的，并与种系传递和四倍体互补相容。图25A描绘了在胚泡注射测定法(2N)中，STAPS细胞对嵌合体小鼠中的多种组织的贡献的图。图25B描绘了对胎盘组织贡献的图。与亲代STAP细胞和TS细胞不同，STAPS细胞不再保留胎盘贡献的能力。对三个独立的细胞系进行检测，都表现出对胚胎部分的重大贡献。图26表明了通过酸洗液所诱导的多能性。图27描绘了，顶部：用鞘内(囊内的，intrathecal)SSP-SAP处理的大鼠中的由辣椒素注射后缩足阈值下降所指示的机械性痛觉过敏降低。随后的图示出了当最大差异出现时在辣椒素后10分钟时的反应。底部：在脊髓干细胞植入五周后，辣椒素诱导的痛觉过敏恢复。图28描绘了在首先鞘内(i.t.)注射大大降低了痛觉过敏状态(参照图27)的SSP-SAP，然后用干细胞处理(腰部鞘内注射)的大鼠中在辣椒素注射到爪后触觉(顶部)反应和热(底部)反应。“原始的反应”显示出了在任何操作之前，对辣椒素的痛觉过敏反应。“BL1”是在2周前已用SSP-SAP或无活性的Blank-SAP处理的大鼠中进行辣椒素注射前的基线反应。“BL2”是干细胞递送1-2天后在没有辣椒素注射情况下时的基础线反应。注意到干细胞移植以恢复使SSP-SAP-处理的大鼠的痛觉过敏反应回到原始大鼠和Blank-SAP处理的对照的痛觉过敏反应的能力。图29表明在通过干细胞移植而恢复了辣椒素敏感性的大鼠中NK1-R的特异性拮抗剂的效力增加。对于原始大鼠中痛觉过敏的这两种方式(○，□；左图；以及在接受Blank-SAP，然后接受干细胞的那些大鼠中，未示出)L-733,060的IC50为约0.3mM(30μL鞘内注射)，而在干细胞恢复的大鼠(右图)中，IC50对于触觉痛觉过敏(■)为约30μM以及对于热痛觉过敏(●)为约5μM。具体实施方式本文所描述的技术方面涉及从细胞产生或生成多能细胞。本文所描述的技术的方面是基于本发明人的如下发现：应激可以诱导从细胞产生多能干细胞，而无需将外源基因、转录物、蛋白、核组分或细胞质引入到细胞中，或者无需细胞融合。在一些实施方式中，应激诱导细胞中细胞质和/或线粒体的量的减少；触发了去分化过程并产生多能细胞。在一些实施方式中，应激引起例如暴露于该应激的细胞中的至少10％的细胞膜破坏。这些多能细胞的特征在于如下中的一种或多种：(在体外和/或在体内)分化成三种胚层中每种胚层的能力、在体内畸胎瘤样细胞团的生成以及生成有活力的胚胎和/或嵌合体小鼠的能力。本文描述了这样的实验，该实验表明用某些环境应激(包括但不限于，减少细胞中的细胞质和/或线粒体的量的应激)对细胞进行处理，能够降低线粒体活性，使与去分化相关的基因组区域去甲基化，使细胞显示出已知去分化途径的标志物。因此，在一些实施方式中，本文提供了由细胞生成多能细胞的方法，该方法包括将至少约40％的细胞质和/或线粒体从细胞中移除，并选择多能性或表现出多能性标志物的细胞，其中，该细胞并不存在于组织中。本文还描述了能够由细胞生成多能细胞的其他应激处理。为了方便起见，将本文在说明书、实施例和所附的权利要求书中使用的特定术语收集于此。除非另有说明或在上下文中有所暗示，否则下列术语和短语包括下文提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中可明显看出，否则下面的术语和短语并不排除在其所属领域已具有的含义。因为发明的范围仅由权利要求限定，所以提供该定义以辅助描述具体实施方式，而并不旨在限制所请求保护的发明。除非另有限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
：中的普通技术人员之一通常所理解的相同的含义。如本文所使用的，术语“包括”或“包含”用来指组合物、方法及其各自的对该方法或组合物而言是必要的一种或多种组分，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素开放。如本文所使用的，术语“基本上由…组成”是指给定的实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响那个实施方式的基础和新颖性或一个或多个功能性特征的要素。术语“由…组成”涉及如本文所描述的组合物、方法及其各自的组分，排除了没有在实施方式描述中列出的任何要素。除非上下文中明确地另有所指，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”涵盖复数的所指物。因此，例如，“该方法”指包括一种或多种本文所描述的类型的方法和/或步骤和/或本领域技术人员阅读本公开内容等后将变得显而易见的类型的方法和/或步骤。类似地，除非上下文中明确地另有所指，否则单词“或”旨在包括“和”。虽然与本文所描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本公开内容的实施或检测，但是在下文中还描述了合适的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”来源于拉丁文exempligratia，并在本文中用于指代非限制性实例。因此，该缩写“例如(e.g.)”与术语“例如”是同义的。细胞生物学和分子生物学中常用术语的定义可在“TheMerckManualofDiagnosisandTherapy”，第19版，MerckResearchLaboratories出版，2006(ISBN0-911910-19-0)和RobertS.Porter等人(编辑)，TheEncyclopediaofMolecularBiology，BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)中发现。分子生物学中常用术语的定义也可在BenjaminLewin,GenesX,Jones&BartlettPublishing出版，2009(ISBN-10:0763766321)；Kendrew等人(编辑)，MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)；以及CurrentProtocolsinProteinSciences2009，WileyIntersciences，Coligan等人编辑中发现。除非另有说明，否则本发明使用在以下中所描述的标准程序来进行，例如：Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual(第3版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，USA(2001)；Davis等人，BasicMethodsinMolecularBiology，ElsevierSciencePublishing，Inc.，NewYork，USA(1995)；CurrentProtocolsinCellBiology(CPCB)(JuanS.Bonifacino等人编辑，JohnWileyandSons,Inc.)，以及CultureofAnimalCells：AManualofBasicTechnique，以R.IanFreshney的名义，出版商：Wiley-Liss；第5版(2005)，AnimalCellCultureMethods(MethodsinCellBiology，第57卷，JennieP.Mather和DavidBarnes编辑，AcademicPress，第1版，1998)；它们的全部内容都通过引用并入本文中。所有本文所使用的术语“降低”、“减少”、“减少的”和“减少”通常都意味着相对于参考物统计学上显著量的降低。然而，为避免疑义，“减少”、“减少”或“降低”一般表示与没有给定处理的相比，降低至少10％，并可以包括例如降低至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、高达且包括，例如，与没给定处理的相比，完全没有给定实体或参数，或与没有给定处理的相比在10％-99％之间的任何降低。本文所使用的术语“增加的”、“增加”或“增强”通常都意味着统计学上显著量的增加；为避免任何疑义，该术语“增加的”、“增加”或“增强”表示与参考水平相比，增加至少10％，例如，与参考水平相比，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包括增加100％或在10％-100％之间的任何增加，或与参考水平相比，增加至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍或2倍和10倍或更高之间的任何增加。如本文所使用的，当使用涉及疾病、紊乱或病情时，术语“治疗”、“处理”、“治疗的”或“改善”是指对病症的治疗处理，其中，目的是逆转、缓和、改善、抑制、减缓或停止症状或病症的进展或严重程度。该术语“治疗”包括减轻或缓和病症的至少一种不良影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。可替换地，如果病症的进展减轻或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括使在不进行治疗的情况下所预期到的症状进展或恶化中止或至少减慢。有利的或所期望的临床结果包括但不限于，一种或多种症状的缓和、缺陷程度的减小、健康的状态稳定(即，不恶化)、疾病进展的延缓或减慢以及症状的改善或缓解。治疗还可以包括受试者的存活超出统计学上预计的死亡时间。如本文所使用的，术语“给予/施用”是指将根据本文所描述的方法所产生的多能细胞和/或这样的多能细胞的至少部分分化的后代通过使细胞至少部分定位于所期望的位点的方法或途径而置于受试者中。可以通过在受试者中引起有效治疗的任何适合的途径给予包含根据本文所描述的方法所产生的多能细胞和/或这样的多能细胞的至少部分分化的后代的药物组合物。如本文所使用的，“受试者”指人或动物。通常地，该动物为脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物例如包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(例如，恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养和狩猎动物包括母牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(例如，家猫)、犬科物种(例如，狗、狐狸、狼)、鸟类物种(例如，鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼类(例如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。患者或受试者包括前面提及的任何子集，例如上述所有。在某些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如，灵长类动物(例如，人类)。优选地，受试者是哺乳动物。该哺乳动物可以是人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或母牛，但并不仅限于这些实例。除人类以外的哺乳动物可有利地用作代表具有与给定细胞或组织的缺陷、功能失常和/或不足、或与干细胞区室的缺陷、功能失常或不足相关的疾病的动物模型的受试者。此外，本文所描述的方法可用于治疗家养动物和/或宠物。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是先前诊断患有或识别为经受或具有细胞类型、组织或干细胞区室的缺陷、功能失常和/或不足，或者与这样的病症相关的一种或多种疾病或病症，以及可选地但需要未经历过对这样的病症的治疗的受试者。受试者还可以是诊断患有或识别为经受包括细胞类型或组织或干细胞区室的缺陷、功能失常和/或不足的病症，但由于接受对于这样的病症的一种或多种治疗而在已知的风险因素方面显示出改善的受试者。可替换地，受试者还可以是先前未被诊断为患有这样的病症的受试者。例如，受试者可以是显现出这样的病症的一种或多种风险因素的受试者，或者未显现出这样的病症的风险因素的受试者。如本文所使用的，当使用涉及细胞或细胞群时，术语“选择”是指挑选、分离、分开和/或选择性地增殖具有所期望特征的一种或多种细胞。如本文所使用的术语“选择”并不一定指没有所期望特征的细胞不能在所提供的条件下增殖。如本文使用的，“维持”是指继续细胞或细胞群的活力。被维持的群体将具有大量的新陈代谢活跃的细胞。这些细胞的数量在至少1天的时间内可以是大体稳定的或者可以增长。如本文使用的，“可检测水平”是指允许该物质的量或活性与参考水平(例如，未暴露于应激的细胞中的物质或活性的水平)相区别的样品中物质或活性的水平。在一些实施方式中，可检测水平可以是比参考水平大至少10％的水平，例如大10％、大20％、大50％、大100％、大200％或300％或更大。术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且通常意味着高于或低于参考(例如标志物(例如干细胞标志物或分化标志物)的浓度或数量(丰度))的两个标准差(2SD)的差异。该术语是指存在差异的统计学证据。将其定义为当零假设事实上为真时，作出拒绝零假设的决定的可能性。通常使用p值作出该决定。除了在操作实施例中或在另有所指处，本文所使用的表达成分的数量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。当与百分比连同使用时，该术语“约”可指±1％。本文中在本文所描述的技术的多种方面的描述内限定了其他术语。本文所描述的技术方面涉及从细胞生成多能细胞的方法以及使用那些多能细胞的用途和方法。与依赖于增加重编程因子的表达而生成多能细胞(即所诱导的多能干细胞或iPS细胞)的现有方法(例如，通过引入编码一个或多个重编程因子(例如Oct4)的核酸构建体)相比，本文所描述的方法使细胞经受应激，而无需引入外源重编程作用物。在一些实施方式中，该应激减小了细胞的细胞质的体积和/或该细胞的线粒体的数量。该细胞的细胞质的体积或该细胞的线粒体的数量的减少在该细胞获得至少多能性的能力的期间诱导了应激应答。在一个方面，本文所描述的是生成多能细胞的方法，包括从细胞中移除至少约40％的细胞质，并选择显现出多能性的细胞，其中，该细胞并不存在于组织中。在一方面中，如本文所描述的发明涉及生成多能细胞的方法，包括从细胞中移除至少约40％的线粒体，并选择显现出多能性的细胞，其中，该细胞并不存在于组织中。在本文所描述的方法、测定(测定法，分析，assay)和组合物中所使用的细胞可以是任何类型的细胞，例如成体细胞、胚胎细胞、分化细胞、干细胞、祖细胞和/或体细胞。可以通过上文所描述的术语的组合来描述细胞，例如细胞可以是胚胎干细胞或分化的体细胞。可以由受试者获得在本文所描述的方法、测定和组合物中所使用的细胞。在一些实施方式中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，该细胞是人类细胞。在一些实施方式中，该细胞是成体细胞。在一些实施方式中，该细胞是新生细胞。在一些实施方式中，该细胞是胚胎细胞。在一些实施方式中，该细胞是羊水细胞。在一些实施方式中，该细胞是脐带血细胞。“成体”是指来源于或在出生后任何时间的动物受试者中的组织和细胞。“胚胎”是指来源于或在出生前任何时间的动物受试者中的组织和细胞。如本文所使用的，术语“体细胞”是指除了生殖细胞、存在于或从植入前胚胎获得的细胞或由这样的细胞在体外繁殖所得的细胞以外的任何细胞。换言之，体细胞是指相对于生殖系细胞而言的形成生物体的躯体的任何细胞。在哺乳动物中，生殖系细胞(也称为“配子”)是在受精期间融合以产生会发育成整个哺乳动物胚胎的细胞(称为合子(受精卵))的精子和卵子。在哺乳动物躯体中除了精子和卵子、制造它们的细胞(配子细胞)和未分化的干细胞以外的每种其他细胞类型均为体细胞：内脏、皮肤、骨、血液和结缔组织均由体细胞构成。在一些实施方式中，该体细胞是“非胚胎体细胞”，其指的是不存在于胚胎或并非从胚胎获得且并非从这样的细胞的体外增殖所得到的体细胞。在一些实施方式中，该体细胞是“成体体细胞”，其指的是存在于或从除了由这样的细胞的体外增殖所得到的胚胎或胎儿以外的生物体所获得的细胞。需要注意的是，可以通过结构差异(例如表观遗传组织(诸如甲基化模式))来区分成体细胞和新生细胞或胚胎细胞。在一些实施方式中，该体细胞是哺乳动物体细胞。在一些实施方式中，该体细胞是人类体细胞。在一些实施方式中，该体细胞是成体体细胞。在一些实施方式中，该体细胞是新生体细胞。如本文使用的，“分化细胞”是指与其命运或功能方面比在其发育中的之前时间点时的更特化的细胞，并且包括终末分化的细胞以及尽管未终末分化但比与在它们发育中的之前时间点时的更特化的细胞。来自未定向细胞(例如，干细胞)的细胞向定向为特定分化的细胞类型的程度渐增的细胞，并最终向终末分化的细胞的发育被称为进行性分化或进行性定向。在细胞个体发育(个体发生)的背景下，形容词“已分化的”或“正分化的”是相对的术语。“分化的细胞”是比与其进行比较的细胞在发育通路上进展更远的细胞。因此，干细胞可分化为谱系受限的前体细胞(诸如中胚层干细胞)，其可依次沿进一步的途径分化为其他类型的前体细胞(诸如心肌细胞前体)，并然后分化成在特定组织类型中起到特征性作用并可能会或可能不会保留进一步增殖的能力的末期分化的细胞。如本文所使用的，术语“干细胞”是指处于未分化的或部分分化的状态、具有自我更新的特性并具有自然地分化为更分化细胞类型的发育潜能的细胞，而并非关于发育潜能(即，全能、多能、专能等)的特定含义。自我更新是指干细胞能够增殖，并产生更多这样的干细胞，同时维持其发育潜能。因此，术语“干细胞”是指在特定环境下具有分化为更特化的或更分化的表型的发育潜能，并在某些环境下保持增殖而基本没有分化的能力的任何子集的细胞。术语“躯体干细胞”在本文是用来指来源于非胚胎组织(包括胎儿组织、青少年年轻的组织和成体组织)的任何干细胞。已从很多种成体组织(包括血液、骨髓、脑、嗅上皮、皮肤、胰腺、骨骼肌和心肌)分离出天然的躯体干细胞。示例性的天然存在的躯体干细胞包括但不限于间充质干细胞和造血干细胞。在一些实施方式中，干细胞或祖细胞可以是胚胎干细胞。如本文所使用的，“胚胎干细胞”是指来源于在受精后但在妊娠结束前所形成的组织(包括在妊娠期间任何时间(通常但并不一定是在大约10-12周妊娠之前)取得的胚胎前期组织(诸如，例如，胚泡)、胚胎组织或胎儿组织)的干细胞。最常见的是，胚胎干细胞是来源于早期胚胎或胚泡的全能细胞。胚胎干细胞可直接从适合的组织(包括但不限于人类组织)或从已建立的胚胎细胞系中来获得。在一个实施方式中，按Thomson等人(美国专利号5,843,780和6,200,806；Science282:1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:7844，1995，它们的全部内容以引用的方式并入本文中)所描述的来获得胚胎干细胞。示例性的干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、多能干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉干细胞、肌肉前体干细胞、内皮祖细胞、骨髓干细胞、软骨形成干细胞、淋巴干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、中枢神经系统干细胞、外周神经系统干细胞等。可在如下以及其他地方找到对干细胞的描述(包括分离和培养它们的方法)：EmbryonicStemCells，MethodsandProtocols，Turksen编辑，HumanaPress，2002；Weisman等人，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.，17:387403；Pittinger等人，Science，284:14347，1999；AnimalCellCulture，Masters编辑，OxfordUniversityPress，2000；Jackson等人，PNAS96(25):1448286，1999；Zuk等人，TissueEngineering，7:211228,2001(“Zuk等人”)；Atala等人，particularlyChapters3341；以及美国专利号5,559,022、5,672,346和5,827,735。可在如下以及其他地方发现对基质细胞(stromalcell)的描述(包括分离和培养它们的方法)：Prockop，Science，276:7174，1997；Theise等人，Hepatology，31:23540，2000；CurrentProtocolsinCellBiology，Bonifacino等人编辑，JohnWiley&Sons，2000(包括直至2002年3月的更新)；以及美国专利号4,963,489。如本文所使用的，“祖细胞”是指处于未分化的或部分分化的状态并具有分化为至少一种更分化表型的发育潜能的细胞，并非关于发育潜能(即，全能、多能、专能等)的特定含义，并且不具有自我更新的特性。因此，术语“祖细胞”是指在特定环境下具有分化为更特化的或更分化的表型的发育潜能的任何子集的细胞。在一些实施方式中，该干细胞或祖细胞为多能干细胞。在一些实施方式中，该干细胞或祖细胞为全能干细胞。该术语“全能”是指能够产生躯体中的任何组织或细胞类型的干细胞。“多能”干细胞能够产生躯体中的除生殖系细胞外的任何类型的细胞。能够产生更少的或有限数量的不同细胞类型的干细胞通常被称为“专能”。因此，全能细胞分化为能够产生胎儿发育所必需的大部分的而不是全部的组织的多能细胞。多能细胞进一步分化为被定向产生具有特定功能的细胞的专能细胞。例如，专能造血干细胞产生了血液中的红血胞、白血胞和血小板。本文所使用的术语“多能”是指具有在不同的条件下分化为具有全部三种胚细胞层(即，内胚层(例如肠道组织)、中胚层(例如血液、肌肉和血管)和外胚层(例如皮肤和神经))的特征的细胞类型的能力的细胞。使用例如裸鼠畸胎瘤形成测定法(测定，分析)，多能细胞的特点主要是它们分化为全部三种胚层的能力。还通过胚胎干(ES)细胞标志物的表达证明了多能性，尽管多能性的优选的检测是证明分化为具有三种胚层中每种胚层的细胞的能力。本文实施例中所描述的“ACC”和“STAP”细胞为多能细胞的非限制性实例。该“STAP干细胞”为多能干细胞的非限制性实例。由于这两种细胞均可适合地用于本发明的目的，因此术语多能细胞和术语多能干细胞可在本文互换地使用。本文所使用的术语“多能性”或“多能状态”是指具有分化为全部三种胚胎胚层(内胚层(肠道组织)、中胚层(包括血液、肌肉和血管)以及外胚层(诸如皮肤和神经))的能力的细胞。当使用涉及“专能细胞”时该术语“专能”是指能够分化成一些但并非源自全部三种胚层的全部细胞的细胞。因此，专能细胞是部分分化的细胞。专能细胞在本领域是公知的，并且专能细胞的非限制性实例可以包括成体干细胞，诸如例如造血干细胞和神经干细胞。专能指干细胞可形成给定谱系中的许多类型的细胞，但不形成其他谱系的细胞。例如，专能血液干细胞可形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但它不能形成神经元。该术语“专能性”是指具有低于全能和多能的发育变通性的程度的细胞。术语“全能性”是指具有如下分化程度的细胞，该分化程度描述了制造成体内以及包括胎盘的胚外组织中的全部细胞的能力。受精卵(合子)作为早期核裂细胞(卵裂球)是全能的。本文所描述的方法中所使用的细胞可以是不存在于组织中的细胞。如本文所使用的，“组织”是指至少一种特定功能的表现一致的相似特化细胞的有序生物材料(例如，组、层或聚集体)。当将细胞从有序超结构中移除或者从体内存在的有序超结构中分离出来时，它们不再存在于组织中。例如，当将血样分离成两个或更多个不同部分或将脾脏切碎并用巴斯德吸管进行机械解离时，该细胞不再存在于组织中。在一些实施方式中，不存在于组织中的细胞为已分离的细胞。当涉及细胞时，如本文所使用的术语“分离的”是指将细胞与体内通常相关的另一组细胞机械地或物理地相分离。将一种或多种细胞与另一组细胞相隔离的方法在本领域中是公知的。参见例如，CultureofAnimalCells:amanualofbasictechniques(第3版)，1994，R.I.Freshney(编辑)，Wiley-Liss，Inc.；Cells:alaboratorymanual(第1卷)，1998，D.L.Spector，R.D.Goldman，L.A.Leinwand(编辑)，ColdSpringHarborLaboratoryPress；AnimalCells:cultureandmedia，1994，D.C.Darling，S.J.Morgan，JohnWileyandSons,Ltd.。可选地，已例如在其他细胞的存在下在体外培养已分离的细胞。在一些实施方式中，细胞虽然不存在于组织中，但是存在于细胞群中。在一些实施方式中，该细胞群是细胞的群体。如本文所使用的，“细胞群”是指至少2个细胞(例如2个细胞、3个细胞、4个细胞、10个细胞、100个细胞、1000个细胞、10000个细胞、100000个细胞或在它们之间的任何值或更多个细胞)的群组。可选地，细胞群可以是具有共同起源的细胞，例如，这些细胞可起源于相同亲代细胞，这些细胞可以是克隆的，这些细胞可分离自或起源于从相同组织中分离的细胞，或者这些细胞可分离自或起源于从相同组织样品中分离的细胞。细胞群可包含1种或多种细胞类型，例如1种细胞类型、2种细胞类型、3种细胞类型、4种细胞类型或更多种细胞类型。细胞群可以是异源的或同源的。如果细胞群包含至少90％的相同细胞类型，例如群中90％、92％、95％、98％、99％或更多的细胞是相同的细胞类型)，则细胞群可以是基本上同源的。如果群中存在的少于90％的细胞具有相同的细胞类型，则细胞群可以是异源的。在一些实施方式中，本文所描述的方法可涉及使非多能细胞(例如，已分化的细胞)呈现出多能表型。在一些实施方式中，生成多能细胞可以包括生成具有更多能表型，即使细胞呈现出具有更广泛的分化潜能的表型的细胞。通过非限制性实例的方式，非常小的胚胎样(VSEL)细胞可以是单能的而非多能的，和/或在它们分化为某些已分化细胞类型的能力方面受到限制(可能是由于VSEL的表观遗传状态比胚胎干细胞更类似于已分化的细胞)。根据本文所描述的方法，单能细胞和/或具有有限的分化能力的细胞可被引起呈现出更多多能表型。更多多能表型可以是能够分化为更多数量的已分化的细胞类型(例如，更多数量的两种单能细胞)的表型，能够分化为具有更多多能的谱系和/或比单能细胞更多多能的多能细胞的大量的已分化的细胞类型的多能表型。生成本文所描述的多能细胞(或更多能的细胞)的方法可以包括，例如从细胞中移除部分细胞质和/或从细胞中移除线粒体。在一些实施方式中，从细胞中移除部分细胞质或线粒体去除了细胞的部分表观遗传控制。在一些实施方式中，将至少约40％的细胞质移除，例如将至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的细胞的细胞质移除。在一些实施方式中，将60％至80％之间的细胞的细胞质移除。在一些实施方式中，将至少约40％的线粒体移除，例如将至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的细胞的线粒体移除。在一些实施方式中，将50％至90％之间的细胞的线粒体移除。使细胞经受应激和/或从细胞中移除部分细胞质或线粒体的方法可以是会引起低于致死性阈值的细胞膜穿孔和/或细胞膜破裂的任何环境刺激。该应激可以包括在组织或细胞培养物中的非生理性应激。适合的环境刺激的非限制性实例包括创伤、机械刺激、化学暴露、超声刺激、氧剥夺、营养剥夺、辐射、暴露至极端温度、解离、研磨、物理应激、高渗透压、低渗透压、膜损害、毒素、极端离子浓度、活性氧、UV暴露、强可见光、必需营养的剥夺或非生理性酸性环境。在一些实施方式中，可对细胞施加一种环境刺激。在一些实施方式中，可对细胞施加多种环境刺激，例如可施加2种刺激、3种刺激、4种刺激或更多种刺激。可同时地或分别地施加多种环境刺激。在一些实施方式中，该应激可以是会引起暴露至该应激的至少10％的细胞发生膜破裂的应激。如本文所使用的，“膜破裂”是指使膜受到危害、破坏或破裂，从而形成足以将可检测量的细胞器和/或细胞物质(包括但不限于线粒体和DNA)释放进入胞外环境的孔或间隙。检测细胞物质(例如线粒体)的释放的方法在本领域中是公知的并在本文其他部分有描述。该释放的细胞物质可以是游离的、封装的或由膜包裹的。该应激可引起暴露至该应激的至少10％的细胞的细胞膜破裂，例如10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或者90％或更多。在一些实施方式中，暴露至该应激的细胞可以是具有与如本文所描述的待制备的更多能的细胞相同的类型和特征的细胞，例如，适合于一种类型细胞的应激可能不适合于另一种类型的细胞。细胞暴露至应激的时长可根据所使用的刺激变化。例如，当根据本文所描述的方法使用低营养条件来应激细胞时，可在低营养条件下培养该细胞1周或更长，例如1周、2周或3周或更长。在一些实施方式中，在低营养条件下培养该细胞约3周。在另一非限制性实例中，根据本文所描述的方法暴露于低pH或缺氧条件的细胞可暴露数分钟或更长，例如包括数小时，例如至少2分钟、至少5分钟、至少20分钟、至少1小时、至少2小时、至少6小时或更长。诱导多能细胞生成的机械刺激可以包括物质或表面与细胞膜的任何形式的接触，这将机械性地破坏膜的完整性。机械刺激可以包括将细胞暴露于剪切应激和/或高压。机械刺激的示例性形式为研磨。研磨是通过摩擦对颗粒表面进行碾磨和/或打磨的过程。细胞研磨过程的非限制性实例为使细胞穿过一种设备，其中该设备具有小于细胞尺寸的孔。例如，通过真空压力和/或流体流动，可使细胞穿过吸管，其中该吸管的至少部分的内部空间的直径小于细胞的直径。在一些实施方式中，使细胞穿过具有小于细胞尺寸的孔的至少一个设备。在一些实施方式中，使细胞穿过具有逐渐变小的孔的若干设备。在一些实施方式中，可将细胞研磨5或更多分钟，例如5分钟、10分钟、20分钟、30分钟或60分钟。在一些实施方式中，可以通过使细胞穿过内径为50μm的巴斯德吸管来研磨细胞。在一些实施方式中，通过使细胞穿过内径为50μm的巴斯德吸管20分钟来研磨细胞。施加诱导细胞生成多能细胞所必需的应激的其他方法包括，例如暴露于某些化学或物理化学条件(例如，高或低的pH、渗透压休克、温度极值、氧剥夺等)。下文中将进一步讨论诱导多能细胞生成的此类和其他处理。化学暴露可以包括，例如破坏或危害细胞膜完整性的pH、渗透压和/或孔形成化合物的任何组合。通过非限制性实例的方式，可将细胞暴露于非生理性酸性环境或低pH、链球菌溶血素O或蒸馏水(即，渗透压休克)。低pH可以包括低于6.8(例如6.7、6.5、6.3、6.0、5.8、5.4、5.0、4.5、4.0或更低)的pH。在一些实施方式中，该低pH为约3.0至约6.0。在一些实施方式中，该低pH为约4.5至约6.0。在一些实施方式中，该低pH为5.4至5.8。在一些实施方式中，该低pH为5.4至5.6。在一些实施方式中，该低pH为约5.6。在一些实施方式中，该低pH为约5.7。在一些实施方式中，该低pH为约5.5。在一些实施方式中，可将细胞暴露于低pH条件多达数天，例如6天或更少、4天或更少、3天或更少、2天或更少、1天或更少、12小时或更少、6小时或更少、3小时或更少、2小时或更少、1小时或更少、30分钟或更少、20分钟或更少或少于10分钟。在一些实施方式中，可将细胞暴露于5.4至5.6的pH3天或更少。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约5.6至6.8的pH持续3天或更少。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约5.6至6.8的pH持续1小时或更少。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约5.6至6.8的pH约30分钟。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约5.6至6.8的pH约20分钟。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约5.6至5.8的pH持续3天或更少。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约5.6至5.8的pH持续1小时或更少。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约5.6至5.8的pH约30分钟。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约5.6至5.8的pH约20分钟。在一些实施方式中，可将细胞暴露至ATP以诱导生成多能细胞。在一些实施方式中，可将细胞暴露至浓度为约20μM至约200mM的ATP。在一些实施方式中，可将细胞暴露至浓度为约200μM至约20mM的ATP。在一些实施方式中，可将细胞暴露至约2.4mM浓度的ATP。在一些实施方式中，可将细胞暴露至稀释于HBSS中的ATP。在一些实施方式中，可将细胞暴露于ATP1分钟或更长，例如至少1分钟、至少2分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时或更长。在一些实施方式中，可将细胞暴露于ATP约5分钟至约30分钟。在一些实施方式中，可将细胞暴露于ATP约15分钟。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约2.4mM的ATP约15分钟。在一些实施方式中，可将细胞暴露于CaCl2以诱导生成多能细胞。在一些实施方式中，可将细胞暴露于浓度为约20μM至约200mM的CaCl2。在一些实施方式中，可将细胞暴露于浓度为约200μM至约20mM的CaCl2。在一些实施方式中，可将细胞暴露于浓度为约2mM的CaCl2。在一些实施方式中，可将细胞暴露于稀释在HBSS中的CaCl2。在一些实施方式中，可将细胞暴露于CaCl2持续1天或更长，例如至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少3周或更长。在一些实施方式中，可将细胞暴露于CaCl2约1周至3周。在一些实施方式中，可将细胞暴露于CaCl2约2周。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约2mM的CaCl2约2周。在一些实施方式中，可将细胞暴露于约2mM的CaCl2约1周。孔形成化合物的实例包括链球菌溶血素O(SLO)、皂苷、毛地黄皂苷、菲律宾菌素、AeI、海葵的溶细胞素、气单胞菌溶素、鹅膏毒素、变形虫穿孔肽、来自迪斯帕内阿米巴的变形虫穿孔肽同系物、抗菌肽-lE(brevinin-lE)、抗菌肽-2E(brevinin-2E)、菌素(barbatolysin)、粪肠球菌的溶细胞素、δ溶血素、白喉毒素、霍乱弧菌的ElTor溶细胞素、马痘毒素(equinatoxin)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)的肠毒素、尖槐藤种苷(esculentin)、颗粒溶素、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)溶血素、中间链球菌(Streptococcusintermedins)的中间链球菌溶素(intermedilysin)、慢病毒裂解肽、伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)白细胞毒素、爪蟾抗菌肽(magainin)、蜂毒肽、膜相关淋巴毒素、Met-脑啡肽、新京都肽(neokyotorphin)、新京都肽片段1、新京都肽片段2、新京都肽片段3、新京都肽片段4、NK溶素、摩西鱼毒肽、金黄色葡萄球菌的α溶细胞素、败毒梭状芽孢杆菌的α溶细胞素、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒素、大肠杆菌素、补体、防卫素、溶组织素、李斯特菌溶血素、爪蟾抗菌肽、蜂毒肽、肺炎球菌溶血素、酵母杀手毒素、缬氨霉素、彼得森冠醚(Peterson'scrownether)、穿孔素、产气荚膜梭菌溶素O(perfringolysinO)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的θ毒素、鬼笔溶血素(phallolysin)、鬼笔毒素(phallotoxin)和其他分子，诸如在其全部内容通过引入并入本文中的Regen等人，BiochemBiophysResCommun1989159：566-571中所描述的那些分子。纯化或合成孔形成化合物的方法对本领域中的普通技术人员来说是公知的。此外，孔形成化合物可商购，例如链球菌溶血素O(产品编号S5265；Sigma-Aldrich公司；圣路易斯，密苏里州)。通过非限制性实例的方式，可将细胞暴露至SLO约5分钟或更长，例如至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时或更长。在一些实施方式中，将细胞暴露于SLO约30分钟至2小时。在一些实施方式中，将细胞暴露于SLO约50分钟。通过非限制性实例的方式，可将细胞暴露于浓度为约10ng/mL至1mg/mL的SLO。在一些实施方式中，可将细胞暴露于浓度为约1μg/mL至100μg/mL的SLO。在一些实施方式中，可将细胞暴露于浓度为约10μg/mL的SLO。在一些实施方式中，可将细胞暴露于浓度为约10μg/mL的SLO约50分钟。诱导多能细胞生成的氧剥夺条件可以包括在降低的氧条件下培养细胞，例如，在10％或更少的氧气中培养细胞。在一些实施方式中，在5％或更少的氧气下培养细胞。在降低的氧条件下的培养时长可以是1小时或更长，例如1小时、12小时、1天、2天、1周、2周、3周、1个月、2个月或更长。在一些实施方式中，可在降低的氧条件下将细胞培养1周至1个月。在一些实施方式中，可在降低的氧条件下将细胞培养约3周。诱导多能细胞生成的营养剥夺条件可以包括对细胞生长有益的任何因子或营养的缺乏。在一些实施方式中，营养剥夺条件包括在基础培养基(例如无另外的补充物(诸如FBS或生长因子)的F12或DMEM)中培养细胞。在营养剥夺条件下的培养时长为1小时或更长，例如1小时、12小时、1天、2天、1周、2周、3周、1个月、2个月或更长。在一些实施方式中，可在营养剥夺条件下将细胞培养1周至1个月。在一些实施方式中，可在营养剥夺条件下将细胞培养约2周。在一些实施方式中，可在营养剥夺条件下将细胞培养约3周。在一些实施方式中，营养剥夺条件可以包括无生长因子的条件或者具有低于对给定细胞类型而言的一种或多种生长因子的标准浓度的50％的条件。暴露于诱导多能细胞生成的极端温度可以包括暴露于低温或高温。对哺乳动物细胞来说，极端低温可以是低于35℃(例如34℃、33℃、32℃、31℃或更低)的温度。在一些实施方式中，极端低温可以是低于结冰的温度。细胞的结冰可导致膜被冰晶穿孔，并提供了减少细胞质的途径。对哺乳动物细胞来说，极端高温可以是高于42℃(例如43℃、44℃、45℃、46℃或更高)的温度。在一些实施方式中，该极端高温可以是约85℃或更高的温度。在极端温度下的培养时长可以是20分钟或更长，例如20分钟、30分钟、1小时、12小时、1天、2天、1周、2周、3周、1个月、2个月或更长。显然地，温度越高，通常将所能容忍的允许多能细胞生成的暴露越短。可用于本文所描述方法的应激的其他实例可以包括但不限于超声刺激和辐射处理。在一些实施方式中，在暴露于应激后，可根据本文下面所描述的方法在选择之前培养细胞。可在选择之前将细胞培养至少1小时，例如在本文所描述的选择之前，移除应激性刺激并将细胞培养至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少1天、至少2天、至少7天或更长。通过非限制性实例的方式，可将细胞暴露于SLO约50分钟，然后在选择之前，在无SLO的培养基中培养约7天。在一些实施方式中，用于在选择之前培养细胞的培养基不含分化因子或者不会促进分化。在一些实施方式中，该培养基为一种适于干细胞和/或多能细胞培养的培养基。本文下面描述了这样的培养基的实例。在一些实施方式中，减少细胞中的细胞质的量。可以通过监测细胞的大小来确定细胞中的细胞质减少。确定细胞尺寸的方法为本领域中普通技术人员之一所公知的，并且通过非限制性实例的方式，包括细胞荧光分析(cytofluorimetricanalysis)。简言之，单细胞用碘化丙啶染色、过滤和例如，使用FLOMAXTM软件在DAKOGALAXYTM(DAKO)分析仪上测量。然后可进行细胞荧光分析以确定细胞尺寸。将预定大小的微珠重悬在等渗磷酸盐生理盐水(pH7.2)中，并用作使用细胞荧光分析对球体中所含细胞的大小进行比较的标准。使用相同的仪器设置对细胞和珠进行分析(前向散射，表示细胞和珠大小，以及侧向散射，表示细胞的粒度)。可依据使用x轴为珠大小和y轴为前向散射值的曲线来计算细胞尺寸。在一些实施方式中，减少了细胞中线粒体的量。确定细胞中线粒体的数量的方法为本领域中普通技术人员之一所公知的，并且包括用线粒体特异性染料进行染色，以及当在显微镜下观测时，对每个细胞可见的线粒体的数量计数。线粒体特异性染料可商购，例如MITOTRACKERTM(产品编号M7512Invitrogen公司；格兰德岛，纽约)。在一些实施方式中，在用本文上面所描述的方法处理后，线粒体的数量或来自线粒体特异性染料的信号强度可减少至少40％。在一些实施方式中，选择用本文上面所描述的方法处理后，线粒体的数量或来自线粒体特异性染料的信号强度减少至少40％的细胞。还可以通过测量胞外环境中的氧化还原活性来检测线粒体和/或膜破坏的量。由于通过本文所描述的应激使线粒体释放到胞外环境中，所以胞外环境中的ROS水平可增高并可用于测量给定应激的有效性。在本文所描述的任何方面的一些实施方式中，在LIF(白血病抑制因子)的存在下，可使细胞经受应激。在一些方面中，在移除了细胞的部分细胞质和/或线粒体之后，该方法还包括选择表现出多能性的细胞。可以通过选择显示出多能细胞的标志物、表型或功能的细胞来选择多能细胞。选择细胞可以包括分离和增殖显示出所期望特征的细胞，或者在使具有一个或多个所期望特征的细胞存活和/或以比没有该一个或多个所期望特征的细胞高的速率增殖的条件下，培养具有未知特征的细胞群。本文下面描述了多能细胞的标志物和特征的非限制性实例。在一些实施方式中，选择多能性细胞包括至少部分地选择表达Oct4的细胞。在一些实施方式中，选择多能性细胞包括至少部分地选择表达Nanog的细胞。在一些实施方式中，选择多能性细胞包括至少部分地选择表达Oct4、Nanog、E-钙粘蛋白和/或SSEA的细胞。在一些实施方式中，可以通过使用对那些标志物特异性的抗体和FACS选择表达SSEA-1和E-钙粘蛋白的细胞，来选择多能细胞。在一些实施方式中，可利用FACS或本领域已知的和/或本文所描述的其他细胞挑选设备，基于大小来选择细胞。还可以通过它们粘附至培养皿的能力来选择细胞。还可以基于经受应激后更小的大小来选择细胞。即，向着多能性发展的应激细胞比其非多能性体细胞前体小。在一些实施方式中，选择直径小于8μm的细胞，例如直径为8μm或更小、7μm或更小、6μm或更小、5μm或更小或者更小的细胞。可基于在短期培养(例如若干分钟至若干天)后或被允许在应激处理后静置后的大小来选择细胞。在一些实施方式中，可基于紧接在应激处理后的大小来选择细胞。可以通过本领域已知的任何方法(例如，使用过滤器或通过FACS)基于大小来选择细胞。在本文所描述的方法的一些实施方式中，可培养根据本文所描述的方法生成的多能细胞以允许该多能细胞的增殖(即干细胞的增殖)。在一些实施方式中，可在体外维持根据本文所描述的方法生成的多能细胞。在一方面中，本文所描述的技术涉及包含多能细胞和/或其至少部分分化的后代的组合物。在一些实施方式中，该多能细胞和/或其至少部分分化的后代可例如作为细胞系维持在体外。如本文下面所描述的，细胞系可用来筛选和/或检测用于给定疾病的候选试剂(例如治疗剂)和/或调节干细胞的试剂。在一些实施方式中，该多能细胞和/或其至少部分分化的后代可来源于从患有疾病(例如与天然存在的细胞或组织类型、或天然存在的多能和/或专能细胞(如本文下面所描述的)的不足相关的疾病，和/或涉及有遗传突变的细胞的疾病(例如癌症))的受试者所获得的细胞。本文所描述的组合物可用于例如疾病建模、药物发现、诊断和个性化疗法。适合于干细胞和/或多能细胞的增殖和/或维持的条件是本领域中公知的。干细胞的增殖允许细胞数量的扩大，而基本不会诱导或允许分化。通过非限制性实例的方式，适合于多能细胞的增殖的条件包括以1×106个细胞/cm2将细胞铺板于补充有2％的B27、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和10ng/mL上皮生长因子的F12/DMEM(1:1，v/v)中。可在培养持续期间，每2-3天更换约50％的培养基。在一些实施方式中，适于干细胞和/或多能细胞的增殖的条件包括在B27-LIF(即含有LIF(1×103单位/mL，Chemicon试剂盒；产品编号：ESG1107EMDMillipore公司，比勒利卡(Billerica)，马萨诸塞州)和B27补充物(产品编号：0080085-SA；Invitrogen公司；格兰德岛，纽约)的无血清培养基)中培养细胞，如在Hitoshi，S.等人，Genes&development200418，1806-1811中所描述的，其全部内容通过引用并入本文中。在本文的实施例中描述了适于培养本文所描述的细胞的其他培养基，例如ES建立培养基(ESestablishculturemedium)、2i、3i和ACTH、ES培养条件、ES-LIF、胚胎神经干细胞培养条件以及EpiSC培养条件。在一些实施方式中，用于多能细胞的增殖或维持的条件可以包括在LIF(白血病抑制因子)存在下培养细胞。在增殖期间，根据本文所描述的方法生成的多能细胞将继续表达一个或多个相同的多能干细胞标志物。多能干细胞标志物的非限制性实例包括SSEA-1、SSEA-2、SSEA-3、SSEA-4(本文中统称为SSEA)、AP、E-钙粘蛋白抗原、Oct4、Nanog、Ecat1、Rex1、Zfp296、GDF3、Dppa3、Dppa4、Dppa5、Sox2、Esrrb、Dnmt3b、Dnmt3l、Utf1、Tcl1、Bat1、Fgf4、Neo、Cripto、Cdx2和Slc2a3。确定细胞是否表达了多能干细胞标志物的方法为本领域中普通技术人员之一所公知的，包括例如RT-PCR、报告基因构建物的使用(例如，结合FACS或荧光显微术的本文所描述的Oct4-GFP构建体的表达)以及使用对感兴趣的细胞表面标志物特异性的抗体的FACS或荧光显微术。与细胞相比，多能细胞标志物还包括延长的端粒。可例如通过分离基因组DNA、用限制性内切酶(诸如Hinf1和Rsa1)消化该gDNA以及利用端粒长度测定试剂检测端粒来确定端粒长度。这样的试剂是本领域中已知的且可商购，例如TELOTAGGGTMTELOMERELENGTHASSAY试剂盒(产品编号12209136001Roche；Indianapolis，IN)。在一些实施方式中，可将根据本文所描述的方法所处理的细胞改变为比在根据所公开方法处理前的细胞更接近地类似于胚胎干细胞的表观遗传状态。细胞的表观遗传状态是指与基因组的核苷酸序列中的变化不同的基因组化学标志。表观遗传标志可以包括DNA甲基化(印迹)以及与DNA相关的蛋白(诸如组蛋白)的甲基化和乙酰化。该术语“DNA甲基化”是指向DNA中的特定碱基中添加甲基(CH3)基团。在哺乳动物中，甲基化几乎全部出现在其后面是鸟嘌呤(CpG)的胞嘧啶的5位。在一些实施方式中，该表观遗传状态可以包括表观遗传甲基化模式，例如DNA甲基化模式。用于确定表观遗传标志的存在和定位的测定法是本领域中公知的，可以包括亚硫酸氢盐测序(例如，如本文实施例2中所描述的)。简言之，用CpGenomeTMDNA修饰试剂盒(Chemicon，特曼库拉，加利福尼亚)处理DNA，并对感兴趣的区域(例如，Nanog和Oct4基因)进行扩增和测序。本文所描述的技术的一些方面涉及使用由本文所描述的方法所产生的多能干细胞的测定法。例如，可将由本文所描述的方法所产生的多能干细胞用于筛选和/或识别调节多能干细胞的存活力、分化或增殖的试剂。此类测定法可以包括将根据本文所描述的方法所产生的多能细胞与候选试剂接触，并且确定与候选试剂接触的多能细胞的存活力、分化和/或增殖是否不同于未与候选试剂接触的多能细胞的存活力、分化和/或增殖。在一些实施方式中，试剂可提高该多能干细胞的存活力、分化和/或增殖。在一些实施方式中，试剂可降低多能干细胞的存活力、分化和/或增殖。在一些实施方式中，可将该多能干细胞与多种候选试剂接触，以例如确定协同作用或拮抗作用，或者以集中筛选候选试剂。如果在候选试剂的存在下，与不存在候选试剂相比，有活力的多能细胞(即活细胞)的数量更多或更少，则认为候选试剂是调节所产生的多能细胞的存活力的试剂。确定细胞存活力的方法是本领域中公知的，并且通过非限制性实例的方式，该方法包括通过检测来自活细胞标志物的信号强度或由活细胞标志物所染色的细胞的数量或比例来确定在至少两个时间点的有存活力的细胞的数量。活细胞标志物可商购，例如PRESTOBLUETM(产品编号A-13261；LifeTechnologies公司；格兰德岛，纽约)。如果在候选试剂的存在下，该多能细胞的增值率发生改变，即在给定时间内所产生的后代细胞的数量更高或更低，则认为候选试剂是调节所产生的多能细胞的增殖的试剂。确定细胞增殖率的方法是本领域中公知的，并且通过非限制性实例的方式，该方法包括确定活细胞数量随时间的增加。如果在候选试剂的存在下，该多能细胞的分化率或分化特征更高或更低，则认为候选试剂是调节多能细胞的分化的试剂。确定细胞的分化率或分化特征的方法是本领域中公知的，并且通过非限制性实例的方式，该方法包括检测特定细胞系的标志物或形态，并将与候选试剂接触的群体中具有此类标志物或形态的细胞的数量和/或细胞的出现率与未和候选试剂接触的群体的进行比较。多种细胞命运谱系和成熟细胞类型的标志物和形态特征是本领域中公知的。通过非限制性实例的方式，中胚层细胞通过肌动蛋白、肌球蛋白和结蛋白的表达而区别于多能细胞。通过用番红O和/或FASTGREENTM染料(Fisher公司；匹兹堡，宾夕法尼亚州；F99)进行染色可将软骨细胞与它们的前体细胞类型区分开。通过用茜素红S(Sigma公司；圣路易斯，密苏里州：产品编号A5533)进行染色可将骨细胞与它们的前体细胞类型区分开。在一些实施方式中，候选试剂可以是肿瘤干细胞的潜在抑制剂，例如可将本文所描述的方法用于从成熟肿瘤细胞生成多能细胞，和用于筛选抑制肿瘤细胞生成和/或存活力的试剂。还可将本文所描述的方法用于筛选杀死成熟肿瘤细胞而不会促进肿瘤干细胞的发育和/或存活的试剂。在一些实施方式中，将该多能细胞与一种或多种候选试剂接触，并在促进分化为特定细胞谱系或成熟细胞类型的条件下培养。适合分化的条件是本领域中公知的。通过非限制性实例的方式，适合分化为中胚层谱系的条件包括补充有20％的胎牛血清(FCS)的DMEM，同时每3天更换该培养基。通过另外的非限制性实例的方式，适合分化为神经谱系的条件包括将细胞铺板于处于补充有2％的B27、10％的FCS、10ng/mL的bFGF和20ng/mL的LEGF的F12/DMEM(1:1，v/v)中的包被鸟氨酸(ornithine)的腔室玻片上。可每3天更换该培养基。如本文所使用的，“候选试剂”是指通常不存在或不会以施用于细胞、组织或受试者的水平存在的任何实体。候选试剂可选自包含如下的组：化学品；小的有机或无机分子；核酸序列；核酸类似物；蛋白质；肽；适体；拟肽、肽衍生物、肽类似物、抗体；胞内抗体；生物大分子、从生物材料(诸如细菌、植物、真菌或者动物细胞或组织)制备的提取物；天然存在的组合物或合成的组合物或它们的功能片段。在一些实施方式中，该候选试剂是任何化学实体或部分(moiety)，包括但不限于合成的和天然存在的非蛋白质实体。在某些实施方式中，该候选试剂是具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基部分、芳香部分或杂环部分，包括大环内酯、来普霉素和相关的天然产物或其类似物。候选试剂可已知具有所期望的活性和/或特性，或可以选自多种化合物的库。可针对候选试剂调节多能细胞的存活力、增殖和/或分化的能力来筛选候选试剂。在一个实施方式中，使用本文上面和实施例中所描述的用于存活力、分化和/或增殖的测定法来筛选候选试剂。通常，可以在合适的时间段内相对于对照以能调节细胞功能、基因表达或蛋白活性的任何浓度来检测化合物。在一些实施方式中，以约0.1nM至约1000mM的范围的浓度来检测化合物。在一个实施方式中，以约0.1μM至约20μM、约0.1μM至约10μM或约0.1μM至约5μM的范围来检测化合物。根据被实施的特定实施方式，该候选试剂或检测试剂可以以溶液中的游离形式提供，或者可粘附至载体或固体支持物(例如，珠子)。大量的合适的固体支持物可用于该检测试剂的固定。合适的固体支持物的实例包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖(可商购，例如，交联葡聚糖(Sephadex)、琼脂糖)、羧甲基纤维素、聚苯乙烯、聚乙二醇(PEG)、滤纸、硝化纤维素、离子交换树脂、塑料膜、聚胺甲基乙烯基醚、马来酸共聚物、玻璃珠、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、丝等。此外，对于本文所描述的方法，检测试剂可单独地筛选、成组筛选或集中筛选。在预期有效检测试剂的命中率低使得对于给定组不预期会有多于一个的阳性结果的情况下，成组筛选是特别有用的。在例如Ding等人，JAm.Chem.Soc.124:1594-1596(2002)和Lynn等人，J.Am.Chem.Soc.123:8155-8156(2001)中描述了开发基于小分子、聚合物和基因组的库的方法。可商购的化合物库可从例如ArQule公司(沃本，麻萨诸塞州)、Invitrogen公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚)、RyanScientific公司(Mt.Pleasant，SC)以及EnzoLifeSciences公司(法明代尔，纽约)来获得。可针对这些库中的成员的调节多能干细胞的存活力、增殖和/或分化的能力来筛选这些库。该候选试剂可以是天然存在的蛋白质或其片段。可从天然来源(例如细胞或组织裂解物)来获得这样的候选试剂。可由例如从可商购的或用常规方法生成的cDNA库制备多肽试剂库。该候选试剂还可以是肽，例如约5个至约30个氨基酸的肽、优选具有约5个至约20个氨基酸以及特别优选约7个至约15个氨基酸。该肽可以是天然存在的蛋白质、随机肽或“偏性”随机肽的消化物。在一些实施方式中，该候选试剂可以是多肽或蛋白质。在无序列优选性或在任何位置恒定性的情况下，肽库(例如肽或其他化合物的组合库)可完全随机化。可替换地，可将库偏性化，即，序列中的一些位置保持不变或选自有限数目的可能性。例如，在一些情况下，在例如疏水氨基酸、亲水残基、空间位阻偏性(小或大)残基的限定类别内将该核苷酸或氨基酸残基随机化为用于交联的半胱氨酸的生成、用于SH-3结构域的脯氨酸、用于磷酸化位点的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或组氨酸，或者随机化为嘌呤。该候选试剂还可以是核酸。核酸候选试剂可以是天然存在的核酸、随机核酸或“偏性”随机核酸。例如，原核或真核基因组的消化物可类似地按如上用于蛋白质。在一些实施方式中，与未处理的对照相比，根据本文所描述的方法筛选并识别出的调节多能细胞的存活力、增殖和/或分化的候选试剂能够将多能细胞的存活力、增殖和/或分化提高至少5％，优选地至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多。在一些实施方式中，与未处理的对照相比，根据本文所描述的方法筛选并识别出的调节多能细胞的存活力、增殖和/或分化的候选试剂能够将多能细胞的存活力、增殖和/或分化降低至少5％，优选地至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多，达到并包括完全减少(即，零存活力、零生长、零增殖或零分化)。在一些实施方式中，该候选试剂直接以其被施用的形式起作用。可替换地，可胞内修饰或利用该候选试剂以产生调节所期望活性的形式，例如将核酸序列引入细胞中并且其转录使得在细胞内产生基因表达或蛋白质活性的抑制子或激活子。预计本文所描述的方法和组合物可用于例如癌症疫苗的开发。生成按本文所描述的(例如通过根据本文所描述的方法来处理成熟肿瘤细胞)获得的多能肿瘤细胞的至少部分分化的后代能够提供能够允许更有力的基于APC(抗原呈递细胞)的癌症疫苗的多样的且变化的抗原特性(图谱)。在一些实施方式中，本文所描述的方法涉及提高细胞的转化效率。应激细胞(例如，如本文所描述的诱导多能性)能够使细胞更易接受遗传修饰的方法，包括但并不限于转基因插入、病毒载体和/或锌指蛋白核酸内切酶。预计本文所描述的方法能够允许细胞被修饰为遗传学上接受状态，从而裸DNA能够被用于转化所得到的多能细胞。本文所描述的技术的一些方面涉及细胞治疗的方法，包括给予需要细胞治疗的受试者通过本文所描述的方法所产生的多能细胞或者这样的细胞的至少部分分化的后代。在一些实施方式中，提供了治疗有效量的多能细胞或该多能细胞的至少部分分化的后代。在一些实施方式中，该多能细胞和/或其后代为自体的。在一些实施方式中，该多能细胞和/或其后代为同种异体的。在一些实施方式中，该多能细胞和/或其后代为自体的。在一些实施方式中，该多能细胞和/或其后代为HLA匹配的同种异体的。在一些实施方式中，该多能细胞和/或其后代为同基因的(syngeneic)。在一些实施方式中，该多能细胞和/或其后代为异基因的(xenogenic)。在一些实施方式中，该细胞治疗可以是自体治疗，例如根据本文所描述的方法可将来自受试者的细胞用于生成多能细胞，并且可向受试者施用该多能细胞和/或该多能细胞的至少部分分化的后代。如本文所使用的，“需要细胞治疗的受试者”是指诊断为患有与天然存在细胞或组织类型或者天然存在多能细胞和/或专能细胞(例如干细胞)的不足相关的疾病或者处在患有或发展上述疾病的风险中的受试者。在一些实施方式中，可将本文所描述的方法用于例如通过给予按本文所描述的获得的同种异体多能细胞和/或其后代来治疗遗传紊乱，例如Tay-Sachs或血友病。一方面，本文所描述的是制备与待给予受试者的细胞治疗相容的细胞或组织的方法，包括：根据本文所描述的方法从细胞生成多能细胞(或更多能细胞)，其中，该细胞是自体细胞或HLA匹配的同种异体细胞。在一些实施方式中，在给予受试者细胞或组织之前，多能细胞(或更多能细胞)可沿预定细胞谱系分化。可将根据本文所描述的方法所生成的多能细胞(例如多能干细胞)用于癌症治疗。例如，使用如本文所描述的所生成的多能细胞可有利于通过高剂量化疗结合造血干细胞移植以使骨髓造血系统再生。与天然存在的细胞或组织类型或者天然存在的多能细胞和/或专能细胞的不足相关的疾病的非限制性实例包括再生障碍性贫血、范科尼贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。其他实例包括例如：急性白血病，包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性双表型白血病和急性未分化白血病；慢性白血病，包括慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、青少年慢性骨髓性白血病(JCML)和青少年骨髓单核细胞性白血病(JMML)；骨髓增生紊乱，包括急性骨髓纤维化、血管生成髓样化生(骨髓纤维化)、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症；溶酶体贮积病，包括粘多醣累积病(MPS)、赫尔勒氏综合征(MPS-IH)、沙伊综合征(MPS-IS)、亨特氏综合征(MPS-II)、圣菲利柏氏综合征(MPS-III)、莫尔基奥综合征(MPS-IV)、马-拉综合症(MPS-VI)、Sly综合征、β-葡萄糖醛酸酶缺乏症(MPS-VII)、脑白质肾上腺萎缩症、粘多糖症II(I-细胞病)、克拉伯病、高歇病、尼-皮二氏病、沃尔曼病和异染性脑白质营养不良；组织细胞紊乱，包括家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症、组织细胞增多症-X和吞噬血细胞；吞噬细胞紊乱，包括切-东二氏综合征、慢性肉芽肿病、嗜中性粒细胞肌动蛋白缺乏症和网状组织发育不全；遗传性血小板异常，包括巨核细胞增多症/先天性血小板减少症；浆细胞紊乱，包括多发性骨髓瘤、浆细胞白血病和华氏巨球蛋白血症。可用干细胞疗法治疗的其他恶性肿瘤包括但不限于乳腺癌、骨尤文肉瘤、神经母细胞瘤和肾细胞癌等等。还可用干细胞疗法治疗的是：肺部病症，包括COPD和支气管哮喘；先天性免疫紊乱，包括共济失调毛细血管扩张症、科斯特曼综合征、白细胞粘附缺陷、迪格奥尔格综合征、裸淋巴细胞综合征、奥姆恩氏综合征、重症联合免疫缺陷症(SCID)、伴随腺苷脱氨酶缺陷的SCID、T细胞和B细胞缺失的SCID、T细胞缺失、正常B细胞的SCID、常见变异型免疫缺陷病和X-连锁淋巴组织增生紊乱；其他遗传性紊乱，包括莱-萘二氏综合征、软骨毛发发育不全症、血小板无力症和骨硬化病；神经病症，包括急性中风和慢性中风、创伤性脑损伤、脑性麻痹、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症和癫痫；心脏病症，包括动脉粥样硬化症、充血性心力衰竭和心肌梗塞；代谢紊乱，包括糖尿病；以及眼部紊乱，包括黄斑变性和视神经萎缩。可以通过如下来治疗这样的疾病或紊乱：施用多能细胞本身，该多能细胞允许在施用或不施用促进所期望的分化的试剂的条件下在体内分化为所期望的细胞类型；和/或施用在体外分化为或至少部分分化为所期望的细胞类型的多能细胞。诊断这样的病症的方法是本领域中普通技术的医师所公知的。在一些实施方式中，该受试者可以是用放射疗法或其他疗法(已切除了细胞群或干细胞)治疗的受试者，例如，该受试者可以是其骨髓已通过放射疗法切除的患有癌症的受试者。在一些实施方式中，对受试者施用多能细胞。在一些实施方式中，对受试者施用至少部分分化的细胞。在一些实施方式中，细胞治疗的方法还可以包括在施用细胞之前沿预限定细胞谱系来分化该多能细胞。沿所期望的细胞谱系分化干细胞的方法是本领域中公知的，并且在本文描述了实例。在一些实施方式中，向受试者施用包含根据本文所描述的方法所获得的多能细胞或为该多能细胞后代的至少部分分化的细胞的组合物。在一些实施方式中，包含根据本文所描述的方法所获得的多能细胞或该多能细胞后代的至少部分分化的细胞的组合物可以可选地进一步包含G-CSF、GM-CSF和/或M-CSF，和/或可以以单独的组合物被给予已经或将要被给予G-CSF、GM-CSF和/或M-CSF的受试者。G-CSF、GM-CSF和/或M-CSF的给药可例如诱导有利于器官再生以及组织碎片、废弃物和构造物移除的炎症状态。在一些实施方式中，在根据本文所描述的方法产生处于培养物中的多能细胞之后的相对短的时间(例如在产生后1小时、2小时、5小时、10小时、24小时或48小时)内，可发生该多能细胞和/或其至少部分地分化的后代的给予。在一些实施方式中，可在根据本文所描述的方法分化处于培养物中的多能细胞之后的相对短的时间内(例如在分化后1小时、2小时、5小时、10小时、24小时或48小时)，发生该至少部分分化的后代的给药。在一些实施方式中，可在给药前低温保存该多能细胞和/或其至少部分分化的后代。在一些方面，本文所描述的技术涉及包含根据本文所描述的方法所生成的多能细胞和/或该多能细胞的至少部分分化的后代的组合物。在一些实施方式中，药物组合物包含根据本文所描述的方法所生成的多能细胞和/或该多能细胞的至少部分分化的后代，和可选地药学上可接受的载体。该组合物可进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。该药物组合物可包含合适的赋形剂或稳定剂，并且可以是例如溶液剂、混悬剂、凝胶剂或乳剂。典型地，该组合物将含有约0.01％至99％、优选5％至95％的细胞，连同该载体。当与药学上或生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂组合时，可以通过肠胃外、皮下、经移植或经注射给予该细胞。对于大部分治疗目的，该细胞可作为溶液剂或混悬剂以液体形式通过注射来给予。该术语“药学上可接受的载体”是指用于给予根据本文所描述的方法所生成的多能细胞和/或该多能细胞的至少部分分化的后代的载体。这样的载体包括但不限于生理盐水、生理盐水缓冲液、葡聚糖、水、甘油及它们的组合。各载体必须是在与该制剂的其他成分相容的意义上为“可接受的”，例如，该载体不会降低试剂对受试者的作用。换言之，载体为药学上惰性的且与活细胞相容的。合适的制剂还包括含水的或非水的无菌注射溶液，该无菌注射溶液可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、杀菌性抗生素以及使制剂与所预期的接受者体液等渗的溶质。含水的和非水的无菌混悬剂可以包括悬浮剂和增稠剂。该制剂可存在于单位剂量或多剂量的容器中。肠胃道外剂型的实例包括但不限于准备用于注射的溶液剂、准备用于注射的混悬剂以及乳剂。该肠胃外剂型可例如使用支撑根据本文所描述的方法所生成的多能细胞和/或该多能细胞的至少部分分化的后代的生物可吸收的支架材料来制备。该术语“表观遗传修饰”是指基因组的化学标志。表观遗传标志可以包括DNA甲基化(印迹)以及DNA相关蛋白质(诸如组蛋白)的甲基化和乙酰化。亲本来源特异性基因(来自母系或父系染色体)的表达常在哺乳动物中观察到，并且归因于表观遗传修饰。在亲本种系中，表观遗传修饰可导致稳定的基因沉默或活化。如本文所使用的，该术语“给予”或“移植”是指通过使细胞至少部分定位于所期望的位点从而产生所期望的效果的方法或途径而将细胞置于受试者中。可以由临床医师认为合适的任何方式给予本文所描述的多能干细胞和/或其至少部分地分化的后代，并且可以包括局部给药，例如通过注射细胞的混悬剂，或例如通过植入沉积在或生长在可植入支架或支持物上或者沉积在可植入支架或支持物内或在其内生长的细胞配制剂。可植入支架可以包括许多可降解的或可吸收的聚合物，或者例如丝支架等中的任一种。给药包含本文所描述的多能干细胞和/或其至少部分分化的后代的药物组合物的合适途径包括但不限于局部给药，例如腹膜内给药、肠胃外给药、腔内给药或皮下给药。如本文所使用的短语“肠胃外给药”和“肠胃外给药的”是指除肠内给药和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，并且非限制性地包括腹膜内注射、皮内注射、皮下注射和灌注。给药可涉及适用于注射或外科植入的针、导管和注射器或者外科植入的使用。递送方式和递送位点的组合的使用预计可实现所期望的临床效果。术语“表观遗传修饰”是指基因组的化学标志。表观遗传标志可以包括DNA甲基化(印迹)以及与DNA相关的蛋白质(诸如组蛋白)的甲基化和乙酰化。在哺乳动物中通常观察到亲本来源特异性基因(来自母系或父系染色体)的表达，并且归因于表观遗传修饰。在亲本种系中，表观遗传修饰可导致稳定的基因沉默或活化。在一个实施方式中，给予受试者治疗有效量的本文所描述的多能干细胞和/或其至少部分分化的后代。“治疗有效量”是足以对所治疗的病症的症状或标志物产生可测量的改善的本文所描述的多能干细胞和/或其至少部分分化的后代的量。治疗组合物中的细胞的实际剂量水平可发生变化，从而给予对特定受试者而言有效地实现所期望的治疗应答的细胞的量。所选剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于，治疗组合物的活性、剂型、给药途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗病症的严重度、受试者的身体状况、所治疗的受试者的在先病史以及施用疗法的临床医师或从业者的经验和判断。通常，所安排的剂量和给药应足以减缓以及优选地抑制病症的进展，并且还优选地引起病症的一种或多种症状或标志物的降低。治疗有效剂量的确定和调整以及评估何时和如何进行此类调整是医学领域中的普通技术人员公知的。可由医师确定根据本文所描述的方法给予的本文所描述的多能干细胞和/或其至少部分分化的后代的剂量，并在必要时将该剂量调整至与所观察到的治疗效果相适应。关于治疗的持续时间和频率，对技术临床医师来说典型的是监测受试者，从而确定治疗在何时提供了治疗益处，并确定是否给药另一剂量的细胞、增加或减少剂量、中断治疗、重新开始治疗或对治疗方案进行其他变更。在期望所给予的细胞移入并存活中等时期至长期的情况下，重复给药可以是必要的。然而，可根据需要和受试者的容忍度来重复给药。剂量不应大到引起实质上有害的副作用。在任何并发症的情况下，还可由个人的医师调整该剂量。然而，典型地，对成人而言，该剂量的范围可以是100至1×109个如本文所描述的多能干细胞和/或其至少部分分化的后代，例如100至10000个细胞、1000至100000个细胞、10000至1000000个细胞或1000000至1×109个细胞。可由来自例如动物模型检测生物测定法或体系的剂量-应答曲线推导出有效剂量。根据本领域公知的方法，可选地在一种或多种合适的体外和/或体内动物疾病模型(诸如，SCID小鼠模型)中检测包含本文所描述的多能干细胞和/或如本文所描述的所制备的该多能干细胞的至少部分分化的后代的治疗组合物以确认功效，评估所移植的细胞在体内的生长，以及估计剂量。具体而言，在相关的测定法中，可以通过与经处理相比未经处理(例如，经处理的和未经处理的动物模型的比较)的活性、稳定性或其他合适的测量结果，初步确定剂量。在确定本文所描述的多能干细胞和/或其至少部分分化的后代的有效量时，医师对所移植的细胞的生长和体积和所治疗病症的进展以及其他标准进行评价。该剂量可随着所使用的剂型以及所用给药途径而变化。关于本文所描述的治疗方法，并不试图将本文所描述的多能干细胞和/或其至少部分分化的后代的给药限定至特定的给药模式、剂量或给药频率。所有的给药模式预计包括肌内、静脉内、腹膜内、囊内、关节内、病灶内、皮下或足以提供适于对所治疗病症进行治疗的剂量的任何其他途径。在一些实施方式中，可将本文所描述的方法用于在体内生成多能细胞，例如可使存在于受试者中的细胞经受本文所描述的应激，从而获得多能表型。在体内对细胞施加本文所描述的应激的方法是显而易见的，例如可以通过注射和/或直接施加将弱酸溶液引入组织，可以通过能够加热或冷却周围组织的探针、或通过使用无创伤性方法(例如聚焦光束辐射)来改变温度。多能性的体内调节可用于例如增加组织再生或伤口愈合。非限制性实例可以包括将弱酸注射入关节炎性膝关节以诱导膝关节细胞(例如滑膜细胞或软骨细胞)，以呈现出多能表型和生成新的组织。进一步的非限制性实例可以包括对患有中风或中枢神经系统损伤(例如脊髓损伤)的受试者进行治疗。在解决炎症后，可用本文所描述的应激来治疗损伤区域附近的细胞，从而生成能够重建该受损组织和/或再生或修复该受损组织的多能细胞。在进一步的非限制性实例中，表观遗传状态的变化(例如通过用去甲基化酶处理)可引起非胰岛素分泌细胞(例如胰腺的α胰高血糖素细胞)转化成胰岛素分泌细胞(例如β细胞)。因此，根据本文所描述的方法对非胰岛素分泌细胞(例如，胰腺的α胰高血糖素细胞)进行处理可在体外或体内使细胞成为胰岛素分泌细胞，例如β样细胞。另外，预计本文所描述的多能细胞可与其他细胞(即“受体细胞”)(例如未经本文所描述的方法处理的细胞、非多能细胞、成熟细胞、恶性细胞和/或受损细胞)融合。与融合前相比，细胞的融合可引起受体细胞中的细胞修复酶表达和/或活性的水平的增高。这可以例如通过增加细胞损害的修复、突变和/或该受体细胞表观遗传状态的修饰而提高该受体细胞的健康和/或功能。在一些实施方式中，通过增加体内细胞的多能性，可调节那些细胞的表观遗传标志物(例如DNA甲基化、去甲基化和/或羟甲基化状态)。表观遗传标志物的调节已涉及例如恶性肿瘤、关节炎、自体免疫疾病、衰老等，并且根据本文所描述的方法的这样的表观遗传相关病症的治疗是预期的。在一些实施方式中，可在体内同时处理多种组织，例如可相继地或同步地在多个器官(例如脑、心脏、肝、肺和/或甲状腺)内诱发弱酸状态以治疗广泛的损害或衰老。还预计本文所描述的细胞的体内处理可与按本文所描述所产生的多能细胞和/或其至少部分分化的后代的给药相结合。本文中预计可将本文所述的方法可以用于治疗例如子宫内的胎儿或胚胎。可例如通过测量如本文所描述的治疗的病症的标志物、指示物、症状或发生率或任何其他合适的可测量参数(例如多能细胞后代的数量)来评价治疗的效力。通过测量这样的参数中的任一种或者参数的任合组合来监测治疗或预防的效力，在本领域技术人员的能力范围之内。当在待治疗的病症的一种或多种标志物、指示物或症状方面具有统计学上显著的改善，或者未如所预期的发生恶化或发展症状时，有效的治疗是明显的。作为一个实例，在病症的可测量参数方面至少约10％，并且优选地至少约20％、约30％、约40％、约50％或更多的有利变化可表示有效的治疗。还可使用本领域已知的用于本文所描述的病症的实验动物模型来评判根据本文所描述的方法所生成的多能细胞和/或该多能细胞的至少部分分化的后代的功效。当使用实验动物模型时，在观察到标志物(例如存在于骨髓切除并用如本文所描述的多能细胞治疗后的小鼠中存在的造血细胞的数量)在统计学上显著的变化时，治疗功效是明显的。在一方面中，本文所描述的是产生能够分化为胎盘细胞的多能细胞的方法，该方法包括在FGF4的存在下培养根据本文所描述的方法所获得的多能细胞。在一些实施方式中，该多能细胞能够分化为胚胎干细胞。在一些实施方式中，FGF4的浓度为约1nM至约1μM。在一些实施方式中，FGF4的浓度为1nM至1μM。在一些实施方式中，FGF4的浓度为约5nM至约500nM。在一些实施方式中，FGF4的浓度为约10nM至约100nM。在一些方面中，本文所描述的技术涉及从细胞生成多能细胞的系统，包括将部分细胞质和/或线粒体从细胞中移除。根据本文所描述的方法，用于从细胞生成多能细胞的系统可以包括使细胞在其中经受应激的容器。例如，当为了根据本文所描述的方法来减少细胞质和/或线粒体的量而在低氧条件下培养细胞数天或更长时，该容器可适于对体细胞和/或多能细胞的培养。可替换地，例如，当在具有窄孔的设备中将细胞研磨有限的时间(例如小于1小时)时，该容器可适于对细胞进行应激而不适于培养细胞。容器可以是例如器皿、管、微流设备、吸管、生物反应器或细胞培养皿。可将容器维持在提供适于体细胞和/或多能细胞培养的条件的环境中(例如处于培养箱中)或在提供在细胞上引起环境应激的条件的环境中(例如处于提供低氧含量环境的培养箱中)。可将容器配置为提供1种或多种本文上面所描述的环境应激，例如1种应激、2种应激、3种应激或更多种应激。适于操作和/或培养体细胞和/或多能细胞的容器是本领域中普通技术人员之一所公知的并可商购(例如产品编号CLS430597Sigma-Aldrich公司；圣路易斯，密苏里州)。在一些实施方式中，该容器是微流设备。在一些实施方式中，该容器是细胞培养皿、瓶或板。在一些实施方式中，该系统可进一步包括用于选择多能细胞的装置(means)，例如该系统可以包括能够选择表达多能性标志物(例如Oct4-GFP)的细胞或通过如本文上面所描述的大小来进行选择的FACS系统。用于选择细胞的方法和设备是本领域中普通技术人员之一所公知的并且可商购，例如由新泽西富兰克林湖BDBiosciences公司所生产的配合有BDLSRIITM和BDFACSDIVATM软件的BDFACSARIASORPTM(产品编号643629)。在一些实施方式中，将不存在于组织中的细胞提供至该系统。在一些实施方式中，将组织提供至该系统，并且该系统进一步包括分离一种或多种类型细胞的装置。通过非限制性实例的方式，该系统可以包括组织匀浆器。组织匀浆器和使用组织匀浆器的方法是本领域中公知的并且可商购(例如FASTH21TM，产品编号21-82041OmniInternational公司；肯内索(Kennesaw)，佐治亚州)。可替换地，该系统可以包括离心机以处理血液或流体样品。在一些实施方式中，该系统可以是自动化的。自动化细胞分离、细胞培养和选择装置的方法在本领域中是公知的并且可商购。例如，FASTH21TM组织匀浆器(产品编号21-82041OmniInternational公司；肯内索，佐治亚州)和BDFACSARIASORPTM。在一些实施方式中，该系统可以是无菌的，例如其可在无菌环境中操作，或者可将该系统作为封闭的无菌系统操作。在一方面中，本文所描述的是增强多能细胞的自我更新能力的方法，该方法包括在促肾上腺皮质激素(ACTH)、2i或3i培养基的存在下培养细胞。如本文所使用的，“自我更新能力”是指细胞能够在体外培养和传代的时长，例如细胞及其后代能够经受和继续产生有活力的细胞的传代的数量。根据本文所描述的方法，使得具有增加的自我更新能力的细胞可以是例如全能细胞和/或通过暴露至如本文其他地方所描述的应激而生成的细胞。在一些实施方式中，在ACTH的存在下培养可以包括在包含约0.1μM至约1000μM(例如约0.1μM至约100μM、约0.1μM至约10μM或约10μM)的细胞培养基中培养细胞。在一些实施方式中，在ACTH的存在下培养细胞可以包括在包含ACTH的LIF培养基中培养细胞。LIF、ACTH、2i和3i是可商购的且是本领域中公知的，例如，ACTH可从Sigma-Aldrich公司(产品编号A0673；St.Louis，MO)购买，且LIF培养基可以从Millipore公司(例如，产品编号ESG1107；比勒利卡(Billerica)，马萨诸塞州)购买，以及3i可从StemCellsInc.公司(例如作为“iSTEM干细胞培养基”，产品编号SCS-SF-ES-01；纽瓦克(Newark)，新泽西州)购买。在一些实施方式中，该培养步骤可进行至少3天，例如至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或更长。在培养步骤之后，可将该细胞维持在如本文其他地方所描述的适于维持多能细胞的条件下。在一些实施方式中，在培养步骤之后，该细胞能够表达可检测和/或提高水平的干细胞标志物。在本文其他地方描述了干细胞标志物及其检测方法。在一些实施方式中，该干细胞标志物可选自由Oct3/4、Nanog、Rex1、Klf4、Sox2、Klf2、Esrr-β、Tbx3和Klf5组成的组。在一方面中，本文提供的是相对于先前方法有改进的用于生成多能细胞或STAP细胞的方法，例如提供了提高的效率、质量和/或产量。在一个实施方式中，本文提供的是用于从例如细胞悬浮液和/或组织培养条件生成多能细胞或STAP细胞的方法。作为第一步骤，可将悬浮液中的初始(例如起始物料)细胞沉淀和/或从溶液中除去。但是作为一个实例，可以通过以约800rpm到约1600rpm在离心管中离心约1分钟至约20分钟将该细胞沉淀。但是作为一个实例，通过以约1200rpm在离心管中离心5分钟可将该细胞沉淀。在一些实施方式中，在被沉淀和/或从溶液中除去之前可使悬浮液中的细胞与消化酶(诸如胰蛋白酶)接触。但是作为一个实例，可将约0.01％至约0.5％的胰蛋白酶-EDTA(Gibco：25300-054)加入到含有细胞的组织培养皿约1分钟至20分钟以释放待加入至离心管的贴壁细胞。但是作为一个实例，可将0.05％的胰蛋白酶-EDTA(Gibco：25300-054)加入到含有细胞的组织培养皿约3-5分钟以释放待加入离心管的贴壁细胞。在包括离心的实施方式中，在离心后可将上清液吸出直至该细胞沉淀。在一些实施方式中，第一步骤是对至少1百万个活细胞的群进行的。在一些实施方式中，第一步骤是对至少5百万个活细胞的群进行的。在一些实施方式中，第一步骤是在至少1千万个活细胞的群进行的。作为第二步骤，可以将细胞重悬浮于生理盐水例如HBSS(Hanks平衡盐溶液)(例如，无Ca+Mg+的HBSS：Gibco14170-112)中。在一些实施方式中，可以以约1×103个细胞/mL至约1×109个细胞/mL的浓度将该细胞重悬浮。在一些实施方式中，可以以约1×105个细胞/mL至约1×107个细胞/mL的浓度将该细胞重悬浮。在一些实施方式中，可以以约1×106个细胞/mL的浓度将该细胞重悬浮。在一些实施方式中，可将该细胞重悬浮在50mL管中。在一些实施方式中，可将该细胞重悬浮于在50mL管中的2-3mL的HBSS中。作为第三步骤，可研磨悬浮液/溶液中的细胞，例如穿过足够小以生成例如剪切应激的孔、开口和/或管腔(腔，lumen)。在本文下面所描述的示例性实施方式中，由具有如本文下面所描述的大小的开口的玻璃吸管构成了该孔、开口和/或管腔。该研磨可以通过多种可替换的装置实现。非限制性实例可以包括在微流体设备中的孔、管腔或通道，具有泵和管道的细胞处理设备、使细胞悬浮液穿过固定筛(grate)或过滤器、使细胞悬浮液流过的屏障或颗粒等。本领域中的技术人员可凭经验确定对于基于本发明公开的不同研磨系统的适当压力、流速、剪切应力等。对流体应力和与这样的应力相关的计算的进一步讨论可在例如，Foumier“BasicTransportPhenomenainBiomedicalEngineering”Taylor&Francis，1999中找到，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，该研磨可以持续约10分钟至约2小时，例如约20分钟至约1小时、或约30分钟，在一些实施方式中，该研磨可以持续至少10分钟，例如10分钟或更多、20分钟或更多、30分钟或更多、40分钟或更多、50分钟或更多或60分钟或更多。在一些实施方式中，该研磨可以继续直到可以通过该开口或管腔容易地研磨该悬浮液。在一些实施方式中，在最后的孔或管腔中的研磨可以继续直到该悬浮液容易地穿过该孔或管腔。在一些实施方式中，在每个孔或管腔中的研磨可以继续直到该悬浮液容易地穿过该孔或管腔。在一些实施方式中，该研磨可以包括经一系列开口或管腔(例如一系列逐渐减小的开口或管腔)的研磨。在一些实施方式中，一系列开口或管腔包括至少2个开口或管腔，例如2个、3个、4个、5个、10个、20个、50个或更多个开口或管腔。在一些实施方式中，一个或多个开口或管腔可以例如用HBSS或水预涂覆。但作为示例性实施方式，可以通过多个(例如，三个)开口或管腔研磨细胞。在一些实施方式中，第一开口或管腔可具有约0.5mm至约2.0mm的内径。在一些实施方式中，第一开口或管腔可具有约0.7mm至约1.5mm的内径。在一些实施方式中，第一开口或管腔可具有约1.1mm的内径。在一些实施方式中，通过第一孔或管腔的研磨可进行约1分钟至约10分钟。在一些实施方式中，通过第一孔或管腔的研磨可进行约5分钟。但作为示例性实施方式，由标准9”玻璃吸管(例如，Fisher牌9”一次性巴斯德吸管：13-678-20D)构成了第一开口或管腔，并可用相当量的力在吸管中和吸管外将该细胞悬浮液研磨5分钟，以解离细胞聚集体和任何相关的碎片。在一些实施方式中，系列中的最后两个孔或管腔可具有约90至约200微米和约25微米至约90微米的内径。在一些实施方式中，系列中的最后两个孔或管腔可具有约100至150微米和约50微米至约70微米的内径。在一些实施方式中，该研磨可以包括通过倒数第二个孔或管腔中的约5至约20分钟的研磨和在最后的孔或管腔中的约5至约20分钟的研磨。在一些实施方式中，该研磨可以包括通过倒数第二个孔或管腔的约10分钟的研磨和在最后的孔或管腔中的约15分钟的研磨。但作为示例性实施方式，最后两个开口或管腔可由如下改进的吸管构成：按如下制造具有非常小的口的两个火抛光的吸管：在例如煤气灯(本生灯)上方加热该标准9”玻璃吸管并然后拉伸该吸管的远(熔化的)端直到该管腔合拢(倒塌)以及该尖端脱落，从而留下封闭的尖头玻璃尖端。等待直到该吸管冷却，然后折断该封闭的远端直到现在认为是非常小的管腔。对第二个吸管重复该过程，但更近一点地折断尖端，产生了稍微更大的远端管腔。该更大的管腔的直径应为约100-150微米，而另一吸管应具有约50-70微米的更小的管腔。通过具有更大的管腔的吸管可将该细胞悬浮液研磨10分钟。这之后可以是通过具有更小的管腔(50-70微米)的吸管研磨额外15分钟。继续研磨该悬浮液直到其容易地向上和向下经过更小口径的火抛光吸管。每个吸管可用培养基预涂覆。而且，在研磨过程中，要避免在该细胞悬浮液中吸入空气以及产生气泡或泡沫。在一些实施方式中，研磨可以以每分钟约1至约200个循环的速率进行，例如每分钟将全部悬浮液穿过孔、管腔或开口1至100次。在一些实施方式中，研磨可以以每分钟约10至约60个循环的速率进行。在一些实施方式中研磨可以以每分钟约40个循环的速率进行。在一些实施方式中，其中将吸管用于研磨，每分钟可使该悬浮液经过该吸管的外部并返回到该吸管中约20次。在接下来的步骤中，可将该已研磨的细胞从悬浮液中分离出来。在一些实施方式中，可将约0至50体积的HBSS加入到已研磨的悬浮液中，并以约800-1600rpm将该悬浮液离心约1分钟至约30分钟，然后吸出上清液。在一些实施方式中，可将约9体积的HBSS加入到已研磨的悬浮液中，并以约1200rpm将该悬浮液离心约5分钟，然后吸出该上清液。在接下来的步骤中，可将细胞重悬浮在HBSS中，同时所得悬浮液具有约5.0至约6.0的pH。在一些实施方式中，所得悬浮液可具有约5.4至约5.8的pH。在一些实施方式中，所得悬浮液可具有约5.6至约5.7的pH。在一些实施方式中，所得悬浮液可具有约5.6的pH。在一些实施方式中，该HBSS溶液在与细胞混合之前可具有约5.0至约5.7的pH。在一些实施方式中，该HBSS溶液在与细胞混合之前可具有约5.3至约5.6的pH。在一些实施方式中，该HBSS溶液在与细胞混合之前可具有约5.4的pH。在一些实施方式中，可以以约2×104个细胞/mL至约2×108个细胞/mL的浓度重悬浮该细胞。在一些实施方式中，可以以约2×106的浓度重悬浮该细胞。但作为示例性实例，可如下进行前述段落的重悬浮步骤：当使该溶液呈酸性时，在将该酸加入Hanks溶液之后立即使用5ml吸管温和地吹打10秒。HBSS具有非常弱的缓冲能力，所以从之前的悬浮液的上清液所转移的任何溶液将严重影响该HBSS的pH值。下面的说明将显示出如何产生用于根据该实验实施方式的STAP细胞生成的具有5.6-5.7的最佳pH的HBSS。首先，用12N的HCl滴定预冷的HBSS(在4摄氏度)的pH值至5.6的pH。这通过向50mlHBSS中缓慢加入11.6μl的12N的HCl来完成。确认该pH后，通过经0.2微米针筒过滤器或瓶顶过滤器过滤而使该溶液无菌化，进入用于存储的新无菌容器中。例如，用适当数量的细胞经最初检测实验确定最终pH值为5.6-5.7。因为该HBSS的pH是如此重要，所以在每次使用前应检查该溶液的pH值、重滴定和重灭菌。在下一步骤中，HBSS悬浮液中的细胞可在大约它们的体内温度下培养。例如，哺乳动物细胞可以在大约37℃下培养。在一些实施方式中，该培养可以为约5分钟至约3小时。在一些实施方式中，该培养可以为约10分钟至约1小时。在一些实施方式中，该培养可以为约15分钟至约40分钟。在一些实施方式中，该培养可以为约25分钟。在下一步骤中，将该细胞从该酸性HBSS溶液中分离出来。但作为一个实例，可以通过在离心管中以约800rpm至约1600rpm离心约1分钟至约20分钟来沉淀细胞。但作为一个实例，可以通过在离心管中以约1200rpm离心约5分钟来沉淀细胞。在一些实施方式中，然后可将上清液吸出。在下一步骤中，可将该细胞重悬浮于适于维持和/或选择多能细胞的培养基中。在一些实施方式中，该培养基是球体培养基(球形培养基，球培养基，spheremedia)。如本文所使用的，“球体培养基”是指具有1％的抗生素和2％的B27Gibco12587-010的DMEM/F12。在一些实施方式中，该培养基可进一步包含生长因子，例如，b-FGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、肝素(0.2％，StemCellTechnologies(干细胞技术)07980)。根据所使用的细胞类型来调整这些因子。例如，在一些实施方式中，如果该细胞是鼠科的，则可加入LIF(1000U)。在一些实施方式中，补充剂(诸如bFGF、EGF和肝素)可能不是必要的。在一些实施方式中，可以以105个细胞/cc的浓度将该细胞重悬浮于培养基中。在下一步骤中，可培养和/或维持该细胞，例如在37℃、5％的CO2下培养。在一些实施方式中，可在培养/维持期间搅拌该细胞以防止粘附于细胞培养容器。在一些实施方式中，可使用例如5ml吸管温和地吹打该细胞，对于第一周两次/天，2分钟，以阻止该细胞附着于该皿的底部。在一些实施方式中，这可以促进良好的球体形成。在一些实施方式中，可每隔一天添加可选地含有补充剂的球体培养基。例如，加入1ml/天至10cm的培养皿或0.5ml/天至6cm的培养皿。在第二种实施方式中，本文所提供的是用于从例如可包含红细胞(RBC)的软组织生成多能细胞或STAP细胞的方法。这样的组织可以包括但不限于肝、脾和肺。在第一步骤中，机械地切片、切碎、刮和/或浸渍该软组织(例如已切除的、已清洗的、无菌的器官组织)。在一些实施方式中，此步骤可在消化酶和/或降解ECM的酶的存在下进行。在一些实施方式中，该酶可以是胶原酶。本文中预计基于该组织的ECM和结蹄组织的组分，对于不同器官组织的消化，不同类型的胶原酶或酶是更好的。本领域中的技术人员之一可容易地确定对于各组织类型的适当的酶。在一些实施方式中，该组织是脾脏，并且没有酶是必要的。如作为示例性实例，可使用解剖刀和/或剪刀将组织切碎和刮约1分钟至约30分钟，以增加暴露于胶原酶的表面积，直到该组织似乎变为一致性凝胶状。但作为示例性实例，可使用解剖刀和/或剪刀将组织切碎和刮约10分钟。在一些实施方式中，可加入其他酶并且可选地在搅拌下用酶培养组织。但作为一个实例，可在37℃下以90RPM在培养箱/摇床中将该组织维持30分钟。在一些实施方式中，在酶暴露和/或机械破坏后可将该组织稀释在HBSS中。在下一步骤中，可以研磨(例如穿过足够小以生成例如剪切应激的开口或管腔)悬浮液中的细胞。在一些实施方式中，该研磨可持续约10分钟至约2小时，例如约20分钟至约1小时或约30分钟。在一些实施方式中，该研磨可持续至少10分钟，例如10分钟或更多、20分钟或更多、30分钟或更多、40分钟或更多、50分钟或更多或60分钟或更多。在一些实施方式中，该研磨可以继续，直到可容易地通过该开口或管腔研磨该悬浮液。在一些实施方式中，在最后的孔或管腔中的研磨可继续，直到该悬浮液容易地穿过该孔或管腔。在一些实施方式中，在每个孔或管腔中的研磨可继续，直到该悬浮液容易地穿过该孔或管腔。在一些实施方式中，该研磨可以包括通过一系列开口或管腔(例如一系列的逐渐更小的开口或管腔)的研磨。在一些实施方式中，一系列开口或管腔包括至少2个开口或管腔，例如2个、3个、4个、5个、10个、20个、50个或更多个开口或管腔。在一些实施方式中，一个或多个开口或管腔可预涂覆有例如HBSS或水。但作为示例性实施方式，可以通过三个开口或管腔研磨细胞。在一些实施方式中，该第一开口或管腔可具有约0.5mm至约2.0mm的内径。在一些实施方式中，该第一开口或管腔可具有约0.7mm至约1.5mm的内径。在一些实施方式中，该第一开口或管腔可具有约1.1mm的内径。在一些实施方式中，通过该第一孔或管腔的研磨可进行约1分钟至约10分钟。在一些实施方式中，通过该第一孔或管腔的研磨可进行约5分钟。但作为示例性实施方式，由标准9”玻璃吸管(例如，Fisher牌9”一次性巴斯德吸管：13-678-20D)构成了该第一开口或管腔，并可用相当量的力在吸管中和吸管外将该细胞悬浮液研磨5分钟，以解离细胞聚集体和任何相关的碎片。在一些实施方式中，系列中的最后两个孔或管腔可具有约90至约200微米和约25微米至约90微米的内径。在一些实施方式中，系列中的最后两个孔或管腔可具有约100至150微米和约50微米至约70微米的内径。在一些实施方式中，该研磨可以包括通过倒数第二个孔或管腔的约5至约20分钟的研磨和在最后的孔或管腔中的约5至约20分钟的研磨。在一些实施方式中，该研磨可以包括通过倒数第二个孔或管腔的约10分钟的研磨和在最后的孔或管腔中的约15分钟的研磨。但作为示例性实施方式，最后两个开口或管腔可由如下改进的吸管构成：按如下制造两个具有非常小的口的火抛光吸管：在煤气灯上方加热该标准9”玻璃吸管，然后拉伸该吸管的远(熔化)末端直到该管腔合拢以及该尖端脱落，留下封闭的尖头玻璃尖端。等待直到该吸管冷却，并然后折断该封闭的远尖端直到现在认为是非常小的管腔。对第二吸管重复此过程，但更近一点地折断该前端，产生了稍微更大的远端管腔。该更大的管腔的直径应为约100-150微米，而另一吸管应具有约50-70微米的更小的管腔。通过具有更大的管腔的吸管可将该细胞悬浮液研磨10分钟。这之后可以是通过具有更小的管腔(50-70微米)的吸管研磨额外15分钟。继续研磨该悬浮液直到其容易地向上和向下经过更小口径的火抛光吸管。可用培养基预涂覆每个吸管。而且，研磨过程中，要避免在该细胞悬浮液中吸入空气以及产生气泡或泡沫。在一些实施方式中，研磨可以以每分钟约1至约200个循环的速率进行，例如将全部悬浮液以每分钟1至100次穿过孔、管腔或开口。在一些实施方式中，研磨可以以每分钟约10至约60个循环的速率进行。在一些实施方式中研磨可以以每分钟约40个循环的速率进行。在一些实施方式中，其中将吸管用于研磨，该悬浮液可以每分钟约20次经过该吸管的外部并返回进入该吸管。在下一步骤中，可将非RBC的已研磨细胞从红色血液中分离出来。在一些实施方式中，可将约0至50体积的HBSS加入到已研磨的悬浮液，然后加入0.1至20体积的RBC分离溶液。本领域中的技术人员之一知道用于分离RBC的溶液，例如具有RBC特异性抗体的淋巴溶解素或珠子。但作为示例性实施方式，研磨完成后可向细胞加入HBSS，然后可将1体积的淋巴溶解素加入到该管的底部以产生良好的双层。在一些实施方式中，应避免两种溶液的混合。可将此混合物以1000g离心10分钟。将管旋转180°并以1000g离心额外的10分钟。这将导致红细胞在该管的底部形成沉淀。使用标准9”玻璃吸管吸出HBSS和淋巴溶解素之间的细胞悬浮液层，移入并放置于新的50ml管中。可将HSBB加入到该悬浮液至总体积20ml的HBSS，并然后通过经5ml吸管吹打1分钟来混合该悬浮液。在下一步骤中，将该细胞从HBSS溶液中分离出来。但作为一个实例，可以通过在离心管中以约800rpm至约1600rpm离心约1分钟至约20分钟将该细胞沉淀。但作为一个实例，可以通过在离心管中以约1200rpm离心约5分钟将该细胞沉淀。在一些实施方式中，在下一步骤中，可将细胞重悬浮在HBSS中，其中所得的悬浮液具有约5.0至约6.0的pH。在一些实施方式中，所得悬浮液可具有约5.4至约5.8的pH。在一些实施方式中，所得悬浮液可具有约5.6至约5.7的pH。在一些实施方式中，所得悬浮液可具有约5.6的pH。在一些实施方式中，该HBSS溶液在与细胞混合之前可具有约5.0至约5.7的pH。在一些实施方式中，该HBSS溶液在与细胞混合之前可具有约5.3至约5.6的pH。在一些实施方式中，该HBSS溶液在与细胞混合之前可具有约5.4的pH。在一些实施方式中，可以以约2×104个细胞/mL至约2×108个细胞/mL的浓度重悬浮该细胞。在一些实施方式中，可以以约2×106的浓度重悬浮该细胞。但作为一个示例性实例，可如下进行前面段落的重悬浮步骤：当使该溶液呈酸性时，在将该酸加入到Hanks溶液中之后立即使用5ml吸管温和地吹打10秒。HBSS具有非常弱的缓冲能力，所以从之前的悬浮液的上清液所转移的任何溶液将严重影响该HBSS的pH值。下面的说明将示出如何产生具有根据该实验实施方式对于STAP细胞生成的5.6-5.7的最适pH的HBSS。首先，用12N的HCl滴定预冷的HBSS(在4摄氏度)的pH值至5.6的pH。这是通过将11.6μl12NHCl加入到50ml的HBSS中来完成的。在确认该pH后，通过经0.2微米针筒过滤器或瓶顶过滤器过滤使该溶液无菌化，进入用于存储的新无菌容器中。用适当数量的细胞经最初检测实验确定最终pH值为5.6-5.7。因为该HBSS的pH是如此重要的，所以在每次使用前应检查该溶液的pH值、重滴定和重灭菌。在下一步骤中，HBSS悬浮液中的细胞可在大约它们的体内温度下培养。例如，哺乳动物细胞可以在大约37℃下培养。在一些实施方式中，该培养可以为约5分钟至约3小时。在一些实施方式中，该培养可以为约10分钟至约1小时。在一些实施方式中，该培养可以为约15分钟至约40分钟。在一些实施方式中，该培养可以为约25分钟。在下一步骤中，将该细胞从该酸性HBSS溶液中分离出来。但作为一个实例，可以通过在离心管中以约800rpm至约1600rpm离心约1分钟至约20分钟来沉淀细胞。但作为一个实例，可以通过在离心管中以约1200rpm离心约5分钟来沉淀细胞。在一些实施方式中，然后可将上清液吸出。在下一步骤中，可将该细胞重悬浮在适于维持和/或选择多能细胞的培养基中。在一些实施方式中，该培养基是球体培养基。如本文所使用的，“球体培养基”是指具有1％的抗生素和2％的B27Gibco12587-010的DMEM/F12。在一些实施方式中，该培养基可进一步包含生长因子，例如，b-FGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、肝素(0.2％，StemCellTechnologies07980)。在一些实施方式中，如果该细胞是鼠科的，则可加入LIF(1000U)。在一些实施方式中，补充剂(诸如bFGF、EGF和肝素)可能不是必要的。在一些实施方式中，可以以105个细胞/cc的浓度将该细胞重悬浮于培养基中。在下一步骤中，可例如在37℃、5％CO2下培养和/或维持该细胞。在一些实施方式中，在培养/维持期间可搅拌该细胞，以防止粘附于细胞培养容器。在一些实施方式中，可使用5ml吸管温和地吹打该细胞，第一周两次/天，2分钟，以阻止该细胞附着于该皿的底部。在一些实施方式中，这可以促进良好的球体形成。在一些实施方式中，可每隔一天添加可选地含有补充剂的球体培养基。例如，加入1ml/天至10cm的培养皿或0.5ml/天至6cm的培养皿。在一方面中，本文所描述的是治疗脊椎动物中神经损伤的方法，该方法包括对需要神经损伤治疗的脊椎动物施用如本文所描的脊椎动物多能(包括如本文所描述的“更多能的”细胞)细胞或STAP细胞。在一些实施方式中所施用的细胞是由本文所描述的改进方法(例如两个上紧近地前述两个方面和/或实施例5的方法)生成的细胞。在一些实施方式中，可以以支架、水凝胶或延时释放制剂来施用该细胞。在一些实施方式中，该细胞可以是对于脊椎动物自体的。在一些实施方式中，该细胞由神经组织生成。在一些实施方式中，脊椎动物需要治疗神经毒素暴露、急性神经损伤、慢性神经损伤和/或退化性神经疾病。在一些实施方式中，该神经损伤可以包括对脊髓、神经和/或脑的损伤。在一些实施方式中，该脊椎动物可以是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在一些实施方式中，该脊椎动物可以是犬、猫科动物、狗、猫、家养动物、马或灵长类动物(例如人类)。在一些实施方式中，该方法可以包括重复给药，例如2次或更多次、3次或更多次、4次或更多次给药。在一些实施方式中，可将该细胞给予受损害位点(例如外科移植的和/或注射的)。在一方面中，本文所提供是这样的试剂盒，其包含具有直径为约90至约200微米的开口的吸管和/或具有直径为约25微米至约90微米的开口的吸管。在一些实施方式中，第一吸管具有直径为约100至约150微米的开口，以及第二吸管具有直径为约50微米至约70微米的开口。在一些实施方式中，该试剂盒还可包含具有直径为约0.5mm至约2.0mm的开口的附加吸管。在一些实施方式中，该吸管可具有直径为约0.7mm至约1.5mm的开口。在一些实施方式中，该吸管可具有直径为约1.1mm的开口。在一些实施方式中，可替换地，试剂盒可设置有具有上文所描述的直径的孔和/或管腔的装置，例如具有有所描述的内径的孔或管腔的通道的微流体装置。在一些实施方式中，该试剂盒还可包含HBSS。在一些实施方式中，该HBSS可具有约5.0至约5.7的pH。在一些实施方式中，该HBSS可具有约5.3至约5.6的pH。在一些实施方式中，该HBSS可具有约5.4的pH。在一些实施方式中，该试剂盒还可包含用于滴定该HBSS的pH的酸。在一些实施方式中，该酸是盐酸。在一些实施方式中，该试剂盒还可包含球体培养基以及可选地生长因子。试剂盒是包括根据本文各种实施方式的至少一种多电极阵列的任何制造品(例如，包装或容器)，该制造品作为用于进行本文所描述的方法或测定法的单元而被推广、分布或出售。本文中所描述的试剂盒包括允许生成、培养和/或选择多能细胞的试剂和/或组分。本文所描述的试剂盒可以可选地包含有利于进行本文描述的方法和测定法的其他组分。这样的试剂可以包括，例如细胞培养基、生长因子、分化因子、缓冲溶液、标记(label)、成像试剂等等。这样的成分是本领域中技术人员公知的，并可根据具体的细胞和待进行的方法或测定法而变化。此外，该试剂盒可以包括散页说明书，和/或可提供与所得到的结果相关的信息。对本公开内容的实施方式的描述并不是全面的或将本公开内容限制在所公开的精确形式。尽管出于说明目的本文描述了本公开内容的具体实施方式和实施例，但是在相关领域中的那些技术人员将会认识到，各种等同修改均有可能落入本公开内容的范围内。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序存在，但是可替换的实施方式可以以不同的顺序来实施功能或可基本上同时地实施功能。本文所提供的公开内容的教导视情况可适用于其他程序或方法。可将本文所描述的各种实施方式结合以提供进一步的实施方式。如有需要的话，可对修改本公开内容的方面进行修改，以利用上述参考和应用的组合、功能和概念来提供本公开内容甚至更多的更进一步的实施方式。根据所详述的说明，可对本公开内容进行这些以及其他变化。可将任何前述实施方式的具体要素结合或用其他实施方式中的要素替代。此外，尽管已在这些实施方式的上下文中描述了与本公开内容的某些实施方式相关的优点，但是其他实施方式也可表现出这样的优点，但不是所有的实施方式都必须表现出这样的优点才落入本公开内容的范围内。出于描述和公开的目的，将有关联的所有专利和其他出版物通过引用明确地并入本文中，例如，这样的出版物中所描述的可与本发明一起使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这点上不应当解释为承认本发明人无权由于先前的发明或因为任何其他原因而在此公开内容之前。所有关于这些文件的日期的声明或内容的表述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。通过以下实施例来进一步说明本发明，这些实施例不应视为是限制性的。根据以下编号的段落中的任何一段可限定本文所描述的技术的一些实施方式。1.一种生成多能细胞的方法，包括使细胞经受应激。2.根据段落1所述的方法，其中所述多能细胞在没有引入外源基因、转录物、蛋白质、核组分或细胞质或者没有细胞融合的情况下生成。3.根据段落1-2中任一段所述的方法，还包括选择表现出多能性的细胞。4.根据段落1-3中任一段所述的方法，其中所述细胞不作为组织的部分而存在。5.根据段落1-4中任一段所述的方法，其中所述细胞是体细胞、干细胞、祖细胞或胚胎细胞。6.根据段落1-5中任一段所述的方法，其中所述细胞是已分离的细胞。7.根据段落1-6中任一段所述的方法，其中所述细胞存在于细胞的异源群中。8.根据段落1-7中任一段所述的方法，其中所述细胞存在于细胞的同源群中。9.根据段落1-8中任一段所述的方法，其中选择表现出多能性的细胞包括选择表达干细胞标志物的细胞。10.根据段落9中任一段所述的方法，其中所述干细胞标志物选自由Oct4、Nanog、E-钙粘蛋白和SSEA4组成的组。11.根据段落1-10中任一段所述的方法，其中选择表现出多能性的细胞包括选择不粘附的细胞。12.根据段落1-11中任一段所述的方法，其中所述应激包括组织或细胞培养物中的非生理性应激。13.根据段落1-12中任一段所述的方法，其中所述应激包括将所述细胞暴露于选自如下的至少一种环境刺激：创伤、机械刺激、化学暴露、超声刺激、氧剥夺、辐射、暴露至极端温度、解离、研磨、物理应激、高渗透压、低渗透压、膜损害、毒素、极端离子浓度、活性氧、UV暴露、强可见光、必需营养的剥夺或非生理性酸性环境。14.根据段落1-13中任一段所述的方法，其中所述应激包括将所述细胞暴露于约3.0至约6.8的pH。15.根据段落1-14中任一段所述的方法，其中所述应激包括将所述细胞暴露于约4.5至约6.0的pH。16.根据段落15所述的方法，其中所述应激包括将所述细胞暴露于约5.4至约5.8的pH。17.根据段落12-16中任一段所述的方法，其中将所述细胞暴露2-3天。18.根据段落12-17中任一段所述的方法，其中将所述细胞暴露1天或更少。19.根据段落12-18中任一段所述的方法，其中将所述细胞暴露1小时或更少。20.根据段落12-19中任一段所述的方法，其中将所述细胞暴露约30分钟。21.根据段落13所述的方法，其中暴露于极端温度包括将所述细胞暴露于低于35℃或高于42℃的温度。22.根据段落21所述的方法，其中暴露于极端温度包括将所述细胞暴露于处于或低于冰冻的温度或将所述细胞暴露于至少约85℃的温度。23.根据段落13所述的方法，其中所述机械刺激包括将所述细胞暴露于剪切应激和/或高压。24.根据段落23所述的方法，其中所述机械刺激包括使所述细胞穿过具有比所述细胞的大小小的孔的至少一个装置。25.根据段落23所述的方法，其中所述机械刺激包括使所述细胞穿过具有逐渐变小的孔的多个装置。26.根据段落1-25中任一段所述的方法，还包括培养所述多能细胞以允许该多能细胞的增殖。27.根据段落1-26中任一段所述的方法，其中所述多能细胞表达干细胞标志物。28.根据段落27所述的方法，其中所述干细胞标志物选自由Oct4、Nanog、E-钙粘蛋白和SSEA4组成的组。29.根据段落1-28中任一段所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。30.根据段落1-29中任一段所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。31.根据段落1-30中任一段所述的方法，其中所述细胞是成体细胞、新生儿细胞、胎儿细胞、羊膜细胞或脐带血细胞。32.根据段落1-31中任一段所述的方法，还包括在体外维持所述多能细胞。33.根据段落1-32中任一段所述的方法，其中所述细胞的表观遗传状态变为更加极为类似于胚胎干细胞的表观遗传状态。34.根据段落33所述的方法，其中所述表观遗传状态包括甲基化模式。35.根据段落1-34中任一段所述的方法，其中所述应激包括将至少约40％的细胞质从该细胞中移除。36.根据段落35所述的方法，其中将至少约50％的细胞质从所述细胞中移除。37.根据段落36所述的方法，其中将至少约60％的细胞质从所述细胞中移除。38.根据段落37所述的方法，其中将60％-80％的细胞质从所述细胞中移除。39.根据段落37所述的方法，其中将至少约80％的细胞质从所述细胞中移除。40.根据段落39所述的方法，其中将至少约90％的细胞质从所述细胞中移除。41.根据段落1-40中任一段所述的方法，其中所述应激包括将至少约40％的线粒体从所述细胞中移除。42.根据段落41所述的方法，其中移除部分细胞质从所述细胞质中移除了至少约50％的线粒体。43.根据段落42所述的方法，其中移除细胞质或线粒体从所述细胞质中移除了约50％-90％的线粒体。44.根据段落42所述的方法，其中移除细胞质或线粒体从所述细胞质中移除了多于90％的线粒体。45.根据段落1-44中任一段所述的方法，其中所述应激足以破坏暴露于所述应激的至少10％的细胞的细胞膜。46.一种测定法，包括，将由根据段落1至45中任一段所述的方法所产生的多能细胞与候选药剂接触。47.根据段落46所述的测定法，用于识别影响所述多能细胞的存活力、分化和增殖中的一种或多种的药剂。48.由根据根据段落1至45中任一段所述的方法所产生的多能细胞在用于受试者的细胞治疗的方法中的用途。49.一种制备与待给予受试者的细胞治疗相容的细胞或组织的方法，包括：根据段落1至45中任一段所述的从细胞生成多能细胞；其中所述细胞是自体细胞或HLA匹配的同种异体细胞。50.根据段落49所述的方法，还包括在向该受试者给予所述细胞或组织之前，使所述多能细胞沿预定的细胞谱系分化。51.一种包含多能细胞的组合物，其中通过根据段落1至45中任一段所述的方法由细胞生成所述多能细胞。52.一种产生多能干细胞的方法，所述方法包括在促肾上腺皮质激素(ACTH)、2i或3i培养基的存在下培养细胞。53.根据段落52所述的方法，其中所述细胞在包含ACTH的LIF培养基中培养。54.根据段落52或53所述的方法，其中所述ACTH以约0.1μM至约100μM的浓度存在。55.根据段落52-54中任一段所述的方法，其中所述细胞是通过根据段落1-45中任一段所述的方法所生成的细胞。56.根据段落52-55中任一段所述的方法，其所述该细胞为全能细胞。57.根据段落52-56中任一段所述的方法，其中所述细胞在ACTH、2i或3i培养基的存在下培养至少3天。58.根据段落52-57中任一段所述的方法，其中所述细胞在ACTH、2i或3i培养基的存在下培养至少5天。59.根据段落52-58中任一段所述的方法，其中所述细胞在ACTH、2i或3i培养基的存在下培养至少7天。60.根据段落52-59中任一段所述的方法，其中在所述培养步骤后，该细胞表达可检测水平的干细胞标志物，所述干细胞标志物选自由Oct3/4、Nanog、Rex1、Klf4、Sox2、Klf2、Esrr-β、Tbx3和Klf5组成的组。61.一种增强多能细胞的自我更新能力的方法，所述方法包括在促肾上腺皮质激素(ACTH)、2i或3i培养基的存在下培养所述细胞。62.根据段落61所述的方法，其中所述细胞在包含ACTH的LIF培养基中培养。63.根据段落61-62中任一段所述的方法，其中所述ACTH以约0.1μM至约100μM的浓度存在。64.根据段落61-63中任一段所述的方法，其中所述细胞是通过根据段落1-45中任一段所述的方法所生成的细胞。65.根据段落61-64中任一段所述的方法，其中所述细胞为全能细胞。66.根据段落61-65中任一段所述的方法，其中所述细胞在ACTH、2i或3i培养基的存在下培养至少3天。67.根据段落61-66中任一段所述的方法，其中所述细胞在ACTH、2i或3i培养基的存在下培养至少5天。68.根据段落61-67中任一段所述的方法，其中所述细胞在ACTH、2i或3i培养基的存在下培养至少7天。69.根据段落61-68中任一段所述的方法，其中在所述培养步骤后，所述细胞表达可检测水平的干细胞标志物所述，该干细胞标志物选自由Oct3/4、Nanog、Rex1、Klf4、Sox2、Klf2、Esrr-β、Tbx3和Klf5组成的组。70.一种在需要细胞治疗的受试者中的自体细胞治疗的方法，包括：a.根据段落1至45中任一段所述的由细胞生成多能细胞，其中所述细胞从所述受试者获得，以及b.向所述受试者给予包含所述多能细胞或其分化后代的组合物。71.根据段落70所述的方法，还包括在向所述受试者给予所述组合物之前，使所述多能细胞沿预定的细胞谱系分化。72.一种产生能够分化为胎盘细胞的多能细胞的方法，所述方法包括在FGF4的存在下培养通过根据段落1-45中任一段所述的方法所生成的多能细胞。73.根据段落72所述的方法，其中FGF4的浓度为1nM至1μM。74.根据段落72或73所述的方法，其中所述多能细胞能分化为胚胎干细胞。根据以下编号段落中的任一段可以限定本文所描述的技术的一些实施方式：1.一种生成多能细胞的方法，包括：a.从溶液中分离初始细胞；b.将从步骤a所得的细胞重悬浮在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中；c.研磨从步骤b所得的细胞悬浮液；d.向所述细胞悬浮液中加入约2至约20体积的HBSS；e.从由步骤d所得的悬浮液中分离细胞；f.将从步骤e所得的细胞重悬浮在具有约5.0至约6.0的pH的HBSS中；g.在所述细胞的自然体内温度下培养所述细胞；h.从由步骤g所得的悬浮液中分离细胞；以及i.将从步骤h所得的细胞沉淀重悬浮在培养基中。2.根据段落1所述的方法，其中分离包括离心。3.根据段落1-2中任一段所述的方法，还包括在步骤a之前使所述初始细胞与胰蛋白酶接触约1分钟至约10分钟。4.根据段落3所述的方法，还包括在步骤a之前使所述初始细胞与胰蛋白酶接触约5分钟。5.根据段落3-4中任一段所述的方法，其中通过使所述细胞沉淀与包含10％的热灭活胎牛血清(FBS)的达尔伯克必需基本培养基(DMEM)/F-12接触来将所述胰蛋白酶灭活。6.根据段落1-5中任一段所述的方法，其中步骤c的研磨包括通过一系列直径逐渐减小的孔或管腔来研磨所述细胞。7.根据段落6所述的方法，其中所述系列包括至少3个孔或管腔。8.根据段落6-7中任一段所述的方法，其中至少第一孔或管腔预涂覆有HBSS或水。9.根据段落6-8中任一段所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约0.5mm至约2.0mm的内径。10.根据段落9所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约0.7mm至约1.5mm的内径。11.根据段落10所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约1.1mm的内径。12.根据段落6-11中任一段所述的方法，其中通过所述第一孔或管腔的研磨进行了约1分钟至约10分钟。13.根据段落12所述的方法，其中通过所述第一孔或管腔的研磨进行了约5分钟。14.根据段落6-13中任一段所述的方法，其中所述系列中的最后两个孔或管腔具有约90至约200微米和约25微米至约90微米的内径。15.根据段落14所述的方法，其中所述系列中的最后两个孔或管腔具有约100至约150微米和约50微米至约70微米的内径。16.根据段落1-15中任一段所述的方法，其中所述研磨包括通过倒数第二个孔或管腔的约5至约20分钟的研磨和在所述最后的孔或管腔中约5至约20分钟的研磨。17.根据段落16所述的方法，其中所述研磨包括通过所述倒数第二个孔或管腔的约10分钟的研磨和在所述最后的孔或管腔中约15分钟的研磨。18.根据段落6-17中任一段所述的方法，其中继续在所述最后的孔或管腔中的研磨，直到所述悬浮液容易地穿过所述孔或管腔。19.根据段落6-18中任一段所述的方法，其中继续在每个孔或管腔中的研磨，直到所述悬浮液容易地穿过那个孔或管腔。20.根据段落1-19中任一段所述的方法，其中研磨的总时间为约30分钟。21.根据段落1-20中任一段所述的方法，其中在步骤d中加入约5至约15体积的HBSS。22.根据段落1-21中任一段所述的方法，其中在步骤d中加入约10体积的HBSS。23.根据段落1-22中任一段所述的方法，其中步骤f的HBSS的pH为约5.1至约5.7。24.根据段落1-23中任一段所述的方法，其中步骤f的HBSS的pH为约5.4。25.根据段落1-24中任一段所述的方法，其中从步骤f所得的HBSS中的细胞悬浮液的pH为约5.0至约6.0。26.根据段落1-25中任一段所述的方法，其中从步骤f所得的HBSS中的细胞悬浮液的pH为约5.6至约5.7。27.根据段落1-26中任一段所述的方法，其中步骤f包括将所述细胞重悬浮至约50万个细胞/mL至约4百万个细胞/mL的浓度。28.根据段落1-27中任一段所述的方法，其中步骤f包括将所述细胞重悬浮至约2百万个细胞/mL的浓度。29.根据段落1-28中任一段所述的方法，其中步骤g包括将所述细胞在约37℃下培养约25分钟。30.根据段落1-29中任一段所述的方法，其中组合的步骤g和h持续约10分钟至约1小时。31.根据段落1-30中任一段所述的方法，其中组合的步骤g和h持续约30分钟。32.根据段落1-31中任一段所述的方法，其中步骤i的培养基是包含DMEM/F12、约1％的抗生素、约2％的B27和可选地一种或多种生长因子的球体培养基。33.根据段落32所述的方法，其中所述生长因子包括bFGF、EGF和肝素。34.一种生成多能细胞的方法，其中初始细胞存在于包含红细胞的组织中，所述方法包括：a.在一种或多种ECM降解酶的存在下将所述组织机械地切片；b.在大约所述组织的自然体内温度下培养从步骤a所得的样品，同时搅拌所述组织；c.在HBSS中稀释从步骤b所得的细胞悬浮液；d.从步骤c所得的悬浮液中分离细胞；e.将从步骤d所得的细胞重悬浮在HBSS中；f.研磨从步骤e所得的细胞悬浮液；g.向从步骤f所得的细胞悬浮液中加入约0.1至约10体积的RBC分离溶液，以产生双层；h.将从步骤g所得的HBSS层与该RBC分离溶液层分开；i.从由步骤h所得的HBSS悬浮液中分离细胞；j.将从步骤i所得的细胞重悬浮在具有约5.0至约6.0的pH的HBSS中；k.在该组织的自然体内温度下培养所述细胞；l.从由步骤k所得的悬浮液中分离细胞；以及m.将从步骤l所得的细胞重悬浮在培养基中。35.根据段落34所述的方法，其中包含红细胞的组织选自由肺、脾和肝组成的组。36.根据段落34-35中任一段所述的方法，其中所述组织是肺，并且所述ECM降解酶是胶原酶P。37.根据段落34-36中任一段所述的方法，其中步骤a的切片继续约10分钟。38.根据段落34-37中任一段所述的方法，其中步骤f的研磨包括通过一系列直径逐渐减小的孔或管腔来研磨所述细胞。39.根据段落38所述的方法，其中所述系列包括至少3个孔或管腔。40.根据段落38-39中任一段所述的方法，其中至少第一孔或管腔预涂覆有HBSS或水。41.根据段落38-40中任一段所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约0.5mm至约2.0mm的内径。42.根据段落41所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约0.7mm至约1.5mm的内径。43.根据段落42所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约1.1mm的内径。44.根据段落38-43中任一段所述的方法，其中通过所述第一孔或管腔的研磨进行了约1分钟至约10分钟。45.根据段落44所述的方法，其中通过所述第一孔或管腔的研磨进行了约5分钟。46.根据段落38-45中任一段所述的方法，其中所述系列中的最后两个孔或管腔具有约90至约200微米和约25微米至约90微米的内径。47.根据段落46所述的方法，其中所述系列中的最后两个孔或管腔具有约100至约150微米和约50微米至约70微米的内径。48.根据段落38-47中任一段所述的方法，其中所述研磨包括通过倒数第二个孔或管腔的约5至约20分钟的研磨和在该最后的孔或管腔中约5至约20分钟的研磨。49.根据段落48所述的方法，其中所述研磨包括通过所述倒数第二个孔或管腔的约10分钟的研磨和在所述最后的孔或管腔中约15分钟的研磨。50.根据段落34-49中任一段所述的方法，其中继续在所述最后的孔或管腔中的研磨直到所述悬浮液容易地穿过所述孔或管腔。51.根据段落34-50中任一段所述的方法，其中继续在每个孔或管腔中的研磨直到所述悬浮液容易地穿过那个孔或管腔。52.根据段落34-51中任一段所述的方法，其中研磨的总时间为约30分钟。53.根据段落34-52中任一段所述的方法，其中步骤j的HBSS的pH为约5.1至约5.7。54.根据段落53所述的方法，其中步骤j的HBSS的pH为约5.4。55.根据段落34-54中任一段所述的方法，其中从步骤j所得的HBSS中的细胞悬浮液的pH为约5.0至约6.0。56.根据段落55所述的方法，其中从步骤j所得的HBSS中的细胞悬浮液的pH为约5.6至约5.7。57.根据段落34-56中任一段所述的方法，其中步骤k包括将所述细胞在约37℃下培养约25分钟。58.根据段落34-57中任一段所述的方法，其中组合的步骤k和l持续约10分钟至约1小时。59.根据段落34-58中任一段所述的方法，其中步骤m的培养基是包含DMEM/F12、约1％的抗生素、约1％的B27和可选地一种或多种生长因子的球体培养基。60.根据段落59所述的方法，其中所述生长因子包括bFGF、EGF和肝素。61.根据段落1-60中任一段所述的方法，其中所述初始细胞是鼠科的细胞，以及所述球体培养基包含LIF。62.根据段落1-61中任一段所述的方法，还包括将所得的细胞培养至少一周的步骤，所述培养包括：a.加入可选地包含生长因子的球体培养基；b.搅拌所述细胞以防止粘附于皿的底部。63.根据段落62所述的方法，其中每1-4天添加所述球体培养基。64.根据段落63所述的方法，其中每2天添加所述球体培养基。65.根据段落62-64中任一段所述的方法，其中所述搅拌包括用吸管吹打所述细胞。66.根据段落65所述的方法，其中所述吸管具有直径为约1.1mm的开口。67.根据段落65-66中任一段所述的方法，其中所述吹打每天进行至少一次。68.根据段落67所述的方法，其中所述吹打每天进行至少两次。69.根据段落1-68中任一段所述的方法，还包括选择具有多能性的细胞，其中所述选择包括选自由以下组成的组的方法：选择具有低粘附性的细胞；选择作为球体的组分的细胞；以及选择具有小的相对大小的细胞。70.根据段落1-69中任一段所述的方法，还包括选择表现出多能性的细胞的最后一步。71.根据段落1-70中任一段所述的方法，其中所述初始细胞不作为组织的部分存在。72.根据段落1-71中任一段所述的方法，其中所述初始细胞是体细胞、干细胞、祖细胞或胚胎细胞。73.根据段落1-72中任一段所述的方法，其中所述初始细胞是已分离的细胞。74.根据段落1-73中任一段所述的方法，其中所述初始细胞存在于细胞的异源群中。75.根据段落1-74中任一段所述的方法，其中所述初始细胞存在于细胞的同源群中。76.根据段落1-75中任一段所述的方法，其中选择表现出多能性的细胞包括选择表达干细胞标志物的细胞。77.根据段落76所述的方法，其中所述干细胞标志物选自由Oct4、Nanog、E-钙粘蛋白和SSEA4组成的组。78.根据段落1-77中任一段所述的方法，其中选择表现出多能性的细胞包括选择不粘附的细胞。79.根据段落1-78中任一段所述的方法，还包括培养所述多能细胞以允许所述多能细胞的增殖。80.根据段落1-79中任一段所述的方法，其中所述多能细胞表达干细胞标志物。81.根据段落80所述的方法，其中所述干细胞标志物选自由Oct4、Nanog、E-钙粘蛋白和SSEA4组成的组。82.根据段落1-81中任一段所述的方法，其中所述初始细胞是哺乳动物细胞。83.根据段落1-82中任一段所述的方法，其中所述初始细胞是人类细胞。84.根据段落1-83中任一段所述的方法，其中所述初始细胞是成体细胞、新生儿细胞、胎儿细胞、羊膜细胞或脐带血细胞。85.根据段落1-84中任一段所述的方法，还包括在体外维持所述多能细胞。86.一种测定法，包括，将根据段落1至85中任一段所述的方法所产生的多能细胞与候选药剂接触。87.根据段落86所述的测定法，用于识别影响所述多能细胞的存活力、分化和增殖中的一种或多种的药剂。88.由根据段落1至85中任一段所述的方法所产生的多能细胞在用于受试者的细胞治疗的方法中的用途。89.一种制备与待给予受试者的细胞治疗相容的细胞或组织的方法，包括：根据段落1至85中任一段所述的从细胞生成多能细胞；其中所述细胞是自体细胞或HLA匹配的同种异体细胞。90.根据段落89所述的方法，还包括在向该受试者给予所述细胞或组织之前，使所述多能细胞沿预定的细胞谱系分化。91.一种包含多能细胞的组合物，其中根据段落1至85中任一段所述的方法从细胞生成所述多能细胞。92.一种需要细胞治疗的受试者中的自体细胞治疗的方法，包括：a.根据段落1至85中任一段所述的从细胞生成多能细胞，其中所述细胞从所述受试者获得，以及b.向所述受试者施用包含所述多能细胞或其分化后代的组合物。93.根据段落92所述的方法，还包括在向所述受试者施用所述组合物之前，使所述多能细胞沿预定的细胞谱系分化。94.一种试剂盒，包含两个吸管，第一吸管具有直径约90至约200微米的开口，以及第二吸管具有直径约25微米至约90微米的开口。95.根据段落94所述的试剂盒，其中所述第一吸管具有直径约100至约150微米的开口，以及所述第二吸管具有直径约50微米至约70微米的开口。96.根据段落94-95中任一段所述的试剂盒，还包含HBSS。97.根据段落94-96中任一段所述的试剂盒，其中所述HBSS具有约5.4的pH。98.根据段落96-97中任一段所述的试剂盒，还包含用于滴定所述HBSS的pH的酸。99.根据段落98所述的试剂盒，其中所述酸是HCl。100.根据段落94-99中任一段所述的试剂盒，还包含球体培养基以及可选地生长因子。根据以下编号段落中的任何一段可限定本文所描述的技术的一些实施方式。1.一种生成多能细胞的方法，包括：a.从溶液中分离初始细胞；b.将从步骤a所得的细胞重悬浮在pH为约4.0至约6.5的Hanks平衡盐溶液(HBSS)和ATP的溶液中；c.研磨从步骤b所得的细胞悬浮液；d.将从步骤c所得的细胞重悬浮在HBSS中；e.从由步骤d所得的悬浮液中分离细胞；以及f.将从步骤g所得的细胞沉淀重悬浮在培养基中。2.一种生成多能细胞的方法，包括：a.从溶液中分离初始细胞；b.将从步骤a所得的细胞重悬浮在pH为约4.0至约6.5的Hanks平衡盐溶液(HBSS)和ATP的溶液中；c.从由步骤b所得的悬浮液中分离细胞；d.将从步骤c所得的细胞重悬浮在pH为约4.0至约6.5的HBSS和ATP的溶液中；e.研磨从步骤d所得的细胞悬浮液；f.将中从步骤e所得的细胞重悬浮在HBSS；g.从由步骤f所得的悬浮液分离细胞；以及h.将从步骤g所得的细胞沉淀重悬浮在培养基中。3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述ATP以约1.5至约5mg/cc的浓度存在于HBSS和ATP的溶液中。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述ATP以约2.7mM至约9mM的浓度存在于HBSS和ATP的溶液中。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中通过用ATP的溶液滴定HBSS溶液直到达到所期望的pH来制备pH为约4.0至约6.5的HBSS和ATP的溶液。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述ATP的溶液具有约50mM至约500mM的浓度。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述ATP的溶液具有约200mM的浓度。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述HBSS和ATP的溶液的pH为约5.0至约5.7。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述HBSS和ATP的溶液的pH为约5.0。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中权利要求62的步骤f和权利要求61的步骤d的HBSS不包含ATP。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中分离包括离心。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，还包括在步骤a之前使所述初始细胞与胰蛋白酶接触约1分钟至约10分钟。13.根据权利要求12所述的方法，还包括在步骤a之前使所述初始细胞与胰蛋白酶接触约3分钟至约5分钟。14.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中通过使所述细胞沉淀与包含10％的热灭活胎牛血清(FBS)的达尔伯克必需基本培养基(DMEM)/F-12接触来将所述胰蛋白酶灭活。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述研磨包括通过一系列直径逐渐减小的孔或管腔来研磨所述细胞。16.根据权利要求15的方法，其中所述系列包括至少3个孔或管腔。17.根据权利要求15-16中任一项所述的方法，其中至少第一孔或管腔预涂覆有HBSS或水。18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约0.5mm至约2.0mm的内径。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约0.7mm至约1.5mm的内径。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约1.1mm的内径。21.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中通过所述第一孔或管腔的研磨进行了约1分钟至约10分钟。22.根据权利要求21所述的方法，其中通过所述第一孔或管腔的研磨进行了约5分钟。23.根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中所述系列中的最后两个孔或管腔具有约90至约200微米和约25微米至约90微米的内径。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述系列中的最后两个孔或管腔具有约100至约150微米和约50微米至约70微米的内径。25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述研磨包括通过所述第二和最后的孔或管腔的约5至约20分钟的研磨和在所述最后的孔或管腔中约5至约20分钟的研磨。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述研磨包括通过所述第二和最后的孔或管腔的约10分钟的研磨和在所述最后的孔或管腔中约15分钟的研磨。27.根据权利要求15-26中任一项所述的方法，其中继续在所述最后的孔或管腔中的研磨，直到所述悬浮液容易地穿过所述孔或管腔。28.根据权利要求15-27中任一项所述的方法，其中继续在每个孔或管腔中的研磨，直到所述悬浮液容易地穿过那个孔或管腔。29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中研磨的总时间为约30分钟。30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中研磨后加入约5至约15体积的HBSS。31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中研磨后加入约10体积的HBSS。32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中研磨后加入的HBSS的pH为约5.1至约5.7。33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中研磨后加入的HBSS的pH为约5.4。34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中从权利要求62的步骤f或权利要求61的步骤d所得的HBSS中的细胞悬浮液的pH为约5.0至约6.0。35.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中从权利要求62的步骤f或权利要求61的步骤d所得的HBSS中的细胞悬浮液的pH为约5.6至约5.7。36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中研磨后加入HBSS之后，所述细胞以约50万个细胞/mL至约4百万个细胞/mL的浓度存在。37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中研磨后加入HBSS之后，所述细胞以约2百万个细胞/mL的浓度存在。38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述培养基是包含DMEM/F12、约1％的抗生素、约2％的B27和可选地一种或多种生长因子的球体培养基。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述生长因子包括bFGF、EGF和肝素。40.一种生成多能细胞的方法，其中初始细胞存在于包含红细胞的组织中，所述方法包括：a.在一种或多种ECM降解酶的存在下将所述组织机械地切片；b.在约所述组织的自然体内温度下培养从步骤a所得的样品，同时搅拌所述组织；c.在pH为约4.0至约6.5的Hanks平衡盐溶液(HBSS)和ATP的溶液中稀释从步骤b所得的细胞悬浮液；d.研磨从由步骤c所得的细胞悬浮液；e.将从步骤d所得的细胞重悬浮在HBSS中；f.从由步骤e所得的悬浮液分离细胞；以及g.将从步骤g所得的细胞沉淀重悬浮在培养基中。41.一种生成多能细胞的方法，其中初始细胞存在于包含红细胞的组织中，所述方法包括：a.在一种或多种ECM降解酶的存在下将所述组织机械地切片；b.在约所述组织的自然体内温度下培养从步骤a所得的样品，同时搅拌所述组织；c.在pH为约4.0至约6.5的Hanks平衡盐溶液(HBSS)和ATP的溶液中稀释从步骤b所得的细胞悬浮液；d.从由步骤b所得的悬浮液分离细胞；e.将从步骤c所得的细胞重悬浮在pH为约4.0至约6.5的HBSS和ATP的溶液中；f.研磨从步骤d所得的细胞悬浮液；g.将从步骤e所得的细胞重悬浮在HBSS中；h.从由步骤f所得的悬浮液分离细胞；以及i.将从步骤g所得的细胞沉淀重悬浮在培养基中。42.根据权利要求40-41中任一项所述的方法，其中包含红细胞的组织选自由肺、脾和肝组成的组。43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述组织是肺，并且所述ECM降解酶是胶原酶P。44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中步骤a的切片继续约10分钟。45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述ATP以约1.5至约5mg/cc的浓度存在于HBSS和ATP的溶液中。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述ATP约2.7mM至约9mM的以浓度存在于HBSS和ATP的溶液中。47.根据权利要求40-46中任一项所述的方法，其中通过用ATP的溶液滴定HBSS溶液直到达到所期望的pH来制备pH为约4.0至约6.5的HBSS和ATP的溶液。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述ATP的溶液具有约50mM至约500mM的浓度。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述ATP的溶液具有约200mM的浓度。50.根据权利要求40-49中任一项所述的方法，其中所述HBSS和ATP的溶液的pH为约5.0至约5.7。51.根据权利要求40-50中任一项所述的方法，其中所述HBSS和ATP的溶液的pH为约5.0。52.根据权利要求40-50中任一项所述的方法，其中权利要求101的步骤g和权利要求100的步骤e的HBSS不包含ATP。53.根据权利要求40-50中任一项所述的方法，其中分离包括离心。54.根据权利要求40-53中任一项所述的方法，还包括在步骤c之前使所述初始细胞与胰蛋白酶接触约1分钟至约10分钟。55.根据权利要求54所述的方法，还包括在步骤c之前使所述初始细胞与胰蛋白酶接触约3分钟至约5分钟。56.根据权利要求54-55中任一项所述的方法，其中通过使所述细胞沉淀与包含10％的热灭活胎牛血清(FBS)的达尔伯克必需基本培养基(DMEM)/F-12接触来减将述胰蛋白酶灭活。57.根据权利要求40-57中任一项所述的方法，其中所述研磨包括通过一系列直径逐渐减小的孔或管腔来研磨所述细胞。58.根据权利要求57所述的方法，其中所述系列包括至少3个孔或管腔。59.根据权利要求40-58中任一项所述的方法，其中至少第一孔或管腔预涂覆有HBSS或水。60.根据权利要求40-59中任一项所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约0.5mm至约2.0mm的内径。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约0.7mm至约1.5mm的内径。62.根据权利要求61所述的方法，其中所述第一孔或管腔具有约1.1mm的内径。63.根据权利要求40-62中任一项所述的方法，其中通过所述第一孔或管腔的研磨进行了约1分钟至约10分钟。64.根据权利要求40-63中任一项所述的方法，其中通过所述第一孔或管腔的研磨进行了约5分钟。65.根据权利要求40-64中任一项所述的方法，其中所述系列中的最后两个孔或管腔具有约90至约200微米和约25微米至约90微米的内径。66.根据权利要求65所述的方法，其中所述系列中的最后两个孔或管腔具有约100至约150微米和约50微米至约70微米的内径。67.根据权利要求40-66所述的方法，其中所述研磨包括通过所述第二和最后的孔或管腔的约5至约20分钟的研磨和在所述最后的孔或管腔中约5至约20分钟的研磨。68.根据权利要求67所述的方法，其中所述研磨包括通过所述第二和最后的孔或管腔的约10分钟的研磨和在所述最后的孔或管腔中约15分钟的研磨。69.根据权利要求40-68中任一项所述的方法，其中继续在所述最后的孔或管腔中的研磨，直到所述悬浮液容易地穿过所述孔或管腔。70.根据权利要求40-69中任一项所述的方法，其中继续在每个孔或管腔中的研磨，直到所述悬浮液容易地穿过那个孔或管腔。71.根据权利要求40-70中任一项所述的方法，其中研磨的总时间为约30分钟。72.根据权利要求40-71中任一项所述的方法，其中研磨后加入约5至约15体积的HBSS。73.根据权利要求40-72中任一项所述的方法，其中研磨后加入约10体积的HBSS。74.根据权利要求40-73中任一项所述的方法，其中研磨后加入的HBSS的pH为约5.1至约5.7。75.根据权利要求40-74中任一项所述的方法，其中研磨后加入的HBSS的pH为约5.4。76.根据权利要求40-75中任一项所述的方法，其中从权利要求101的步骤g或权利要求100的步骤e所得的HBSS中的细胞悬浮液的pH为约5.0至约6.0。77.根据权利要求40-76中任一项所述的方法，其中从权利要求101的步骤g或权利要求100的步骤e所得的HBSS中的细胞悬浮液的pH为约5.6至约5.7。78.根据权利要求40-77中任一项所述的方法，其中研磨后加入HBSS之后，所述细胞以约50万个细胞/mL至约4百万个细胞/mL的浓度存在。79.根据权利要求40-78中任一项所述的方法，其中研磨后加入HBSS之后，所述细胞以约2百万个细胞/mL的浓度存在。80.根据权利要求40-79中任一项所述的方法，其中所述培养基是包含DMEM/F12、约1％的抗生素、约2％的B27和可选地一种或多种生长因子的球体培养基。81.根据权利要求80所述的方法，其中所述生长因子包括bFGF、EGF和肝素。82.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述初始细胞是鼠科的细胞，以及所述球体培养基包含LIF。83.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，还包括将所得的细胞培养至少一周的步骤，所述培养包括：j.加入可选地包含生长因子的球体培养基；k.搅拌所述细胞以防止粘附于所述皿的底部。84.根据权利要求83所述的方法，其中每1-4天添加所述球体培养基。85.根据权利要求83所述的方法，其中每2天添加所述球体培养基。86.根据权利要求82-85中任一项所述的方法，其中所述搅拌包括用吸管吹打所述细胞。87.根据权利要求86所述的方法，其中所述吸管具有直径为约1.1mm的开口。88.根据权利要求86-87中任一项所述的方法，其中所述吹打每天进行至少一次。89.根据权利要求88所述的方法，其中所述吹打每天进行至少两次。90.根据权利要求1-89中任一项所述的方法，还包括选择具有多能性的细胞，其中所述选择包括选自由以下组成的组的方法：选择具有低粘附性的细胞；选择为球体的组分的细胞；以及选择具有小的相对大小的细胞。91.根据权利要求1-90中任一项所述的方法，进一步包括选择表现出多能性的细胞的最后一步。92.根据权利要求1-91中任一项所述的方法，其中所述初始细胞不作为组织的部分存在。93.根据权利要求1-92中任一项所述的方法，其中所述初始细胞是体细胞、干细胞、祖细胞或胚胎细胞。94.根据权利要求1-93中任一项所述的方法，其中所述初始细胞是已分离的细胞。95.根据权利要求1-94中任一项所述的方法，其中所述初始细胞存在于细胞的异源群中。96.根据权利要求1-95中任一项所述的方法，其中所述初始细胞存在于细胞的同源群中。97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法，其中选择表现出多能性的细胞包括选择表达干细胞标志物的细胞。98.根据权利要求97所述的方法，其中所述干细胞标志物选自由Oct4、Nanog、E-钙粘蛋白和SSEA4组成的组。99.根据权利要求1-98中任一项所述的方法，其中选择表现出多能性的细胞包括选择不粘附的细胞。100.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，还包括培养所述多能细胞，以允许所述多能细胞的增殖。101.根据权利要求1-100中任一项所述的方法，其中所述多能细胞表达干细胞标志物。102.根据权利要求101所述的方法，其中所述干细胞标志物选自由Oct4、Nanog、E-钙粘蛋白和SSEA4组成的组。103.根据权利要求1-102中任一项所述的方法，其中所述初始细胞是哺乳动物细胞。104.根据权利要求1-103中任一项所述的方法，其中所述初始细胞是人类细胞。105.根据权利要求1-104中任一项所述的方法，其中所述初始细胞是成体细胞、新生儿细胞、胎儿细胞、羊膜细胞或脐带血细胞。106.根据权利要求1-105中任一项所述的方法，还包括在体外维持所述多能细胞。107.一种测定法，其包括，将根据权利要求1至106中任一项所述的方法所产生的多能细胞与候选试剂接触。108.根据权利要求107所述的测定法，用于识别影响所述多能细胞的存活力、分化和增殖中的一种或多种的试剂。109.由根据权利要求1至106中任一项所述的方法产生的多能细胞在用于受试者的细胞治疗的方法中的用途。110.一种制备与待施用于受试者的细胞治疗相容的细胞或组织的方法，包括：根据权利要求1至106中任一项所述的方法从细胞生成多能细胞；其中所述细胞是自体细胞或HLA匹配同种异体细胞。111.根据权利要求110所述的方法，还包括在向所述受试者施用所述细胞或组织之前，使所述多能细胞沿预定的细胞谱系分化。112.一种包含多能细胞的组合物，其中，根据权利要求1至106中任一项所述的方法从细胞生成所述多能细胞。113.一种需要细胞治疗的受试者中的自体细胞治疗的方法，包括：c.根据权利要求1至106中任一项所述的方法从细胞生成多能细胞，其中所述细胞从所述受试者获得，以及d.向所述受试者施用包含所述多能细胞或其分化后代的组合物。114.根据权利要求113所述的方法，还包括在向所述受试者给予所述组合物之前，使所述多能细胞沿预定的细胞谱系分化。根据以下编号段落中的任何一段可以限定本文所描述的技术的一些实施方式：1.一种治疗神经损伤的方法，所述方法包括对需要神经损伤治疗的受试者施用多能细胞或STAP细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过本文中例如段落[0157]至[0190]、编号段落的[00202]-[00204]段落、实施例5或实施例7描述的方法生成所述多能细胞或STAP细胞。3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述细胞对于所述受试者是自体的。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述神经损伤选自由急性神经损伤、慢性神经损伤、退行性神经系统疾病、神经损伤或脊髓损伤组成的组。实施例实施例1所有的生物体拥有原始的存活本能。当植物经受显著的外部应激时，它们激活了引起细胞去分化以及使损伤区域或整个生物体再生的存活机制。虽然这样的机制似乎对于低等生物体在极端环境变化下的存活是必要的，但在哺乳动物中尚未有该机制的记载。本发明人推测与在植物和低等生物体中看到的相似，物理应激可引起成熟哺乳动物细胞逆转至干细胞状态。为了检验该推测，研究了从7个成体体细胞组织所获得的成熟细胞。为了首先关注何种物理应激可能在使成熟细胞逆转至成熟度较低的状态方面最有效，研究了从Oct4-GFP小鼠收集的CD45阳性淋巴细胞。当干细胞特异性Oct4启动子激活时，来自这些小鼠的细胞提供了逆转至干细胞表型的结果输出(readout)。将成熟的完全分化的细胞暴露至多种显著的外部刺激。例如，将CD45阳性淋巴细胞暴露于低pH溶液以提供强的化学应激。在暴露的3天内，观察到GFP表达细胞，并在5天内，观察到由GFP表达细胞组成的球形集落。在本实施例中，将以这种方式生成的细胞称为应激改变的干细胞(StressAlteredStemcell，SASC或SAC)。SAC还可指恢复活力的干细胞(RSC)或动物愈伤组织细胞(ACC)。SAC表达了通常与胚胎干细胞相关的多种标志物。SAC表现出与ES细胞等同的分化潜能，其有助于嵌合体小鼠的生成，并且在注射入4N囊泡中时能够生成整个胎儿。以这种方式生成的细胞最初显示出低的线粒体活性和通常与基于细胞的损伤防御机制的诱导相关的其他状态。然后，它们表现出Oct4和Nanog基因启动子的去甲基化。似乎通过间充质-上皮转化诱导了应激所改变的细胞的重编程。这些发现与对植物愈伤组织中含有的细胞在应答损伤(外部刺激)时的描述一致。由应激所诱导的细胞至能够形成克隆体的多能植物干细胞的转化而形成了植物愈伤组织。本文将由成熟的完全分化的哺乳动物体细胞在应答显著的外部刺激而生成的此类球形集落称为动物愈伤组织，并将在这样的集落或愈伤组织中含有的应激所改变的细胞称为“动物愈伤组织细胞”(ACC)或SAC。因此，显著的物理和化学应激引起了正常的成熟成体细胞重编程为能够进行胚胎发生的多能干细胞。虽然不希望受理论的束缚，但该重编程的机制似乎包括诱导通常在损伤应答中所见的细胞存活和修复处理。本文证实了，哺乳动物细胞具有非常类似于植物的存活机制，从而在对显著的应激性外部刺激应答时逆转至重编程状态。已报道多种类型的细胞通过对特定基因进行诱导或强制表达而重编程为多能干细胞状态1-5。还认为，由于暴露于刺激(诸如烧伤、化学损伤、创伤和辐射)损害细胞可能将正常细胞变为癌细胞。介绍所有的生物体似乎具有通过使它们自身适应于环境并使它们的机体再生而从与应激刺激相关损伤存活的本能。在植物中，不仅在合子中，而且还在完全分化的细胞和不成熟的花粉中观察到了个体发生。在脊椎动物中，蝾螈能够再生多种解剖结构和器官，包括它们的四肢1。特别注意的是，植物和蝾螈都显示出的显著再生能力是通过引起先前完全分化的体细胞的细胞去分化的外部刺激诱导的。虽然从最早的生命形式起已经过了数十亿年，并且不同的生物体已以其独特的方式进化，但这种存活本能可能从共同的祖先遗传至现代生物体。尽管通常认为终末分化的哺乳动物细胞不能逆转该分化过程，但哺乳动物可保留此前未认识到的在对强烈的环境变化进行应答时逃避死亡的程序。植物愈伤组织，即对外部刺激(诸如伤害)进行应答所形成的增殖细胞团块，可在培养中通过植物激素的刺激而形成2。该愈伤组织含有重编程的体细胞(称为愈伤组织细胞)，各愈伤组织细胞能够克隆再生为全部躯体。在植物中，愈伤组织细胞并非是固有的，而是在对外部刺激进行应答中由体细胞生成。尽管最近的研究证实了可以通过外源处理(诸如基因诱导3-7)对哺乳动物体细胞进行重编程，但以类似于植物的方式，应答外部物理和/或化学刺激时对哺乳动物体细胞进行重编程未有被报道。有趣的是，据认为，极端的外部刺激，诸如暴露至刺激(包括烧伤、化学损伤、创伤和辐射)可将正常体细胞变为癌细胞。这样的经验看起来表明外部刺激将导致哺乳动物细胞变化。在该研究中，推测哺乳动物细胞保留了以与植物相同的方式在暴露于显著的外部应激时存活的机制。该报道给出了如下证据：施加显著的物理和化学刺激可引起从多种组织中所获得的成熟的完全分化的哺乳动物体细胞的重编程，并且这样的应激所改变的细胞能够形成含有“动物愈伤组织细胞”的动物愈伤组织，该动物愈伤组织可再生为克隆体。结果施加于成熟体细胞的显著的物理和化学刺激。由于认为胚胎转录因子Oct4对细胞多能状态的调控很关键，因此初步的策略为识别何种外部刺激最有效地将成熟细胞变为重编程来表达Oct4。为了避免被未分化的细胞污染，首先研究了CD45阳性造血谱系细胞。将从Oct4-GFP(GOF)小鼠8获得的脾中收集的CD45阳性细胞暴露于多种显著的物理和化学刺激。该暴露包括：渗透压处理、利用显著的机械研磨的处理、暴露于低pH、使用链球菌溶血素O(SLO)施加细胞膜损伤、暴露于营养不足以及暴露于缺氧和高Ca2+浓度。接下来，使用FACS来识别、挑选和收集GFP表达细胞。通过RT-PCR来确定Oct4的基因表达。暴露于所施加的各刺激引起成熟细胞的重编程从而在一定程度上表达GFP(图5A)。将该成熟细胞暴露于低pH的化学应激和显著机械研磨的物理应激似乎是使成熟细胞变为表达Oct4的最有效的处理。为了确定诱导转变为Oct4表达细胞的最佳pH，将CD45阳性细胞暴露于酸度在pH4.0至pH6.8变化的溶液。在暴露于酸性溶液3天后，使用FACS分析细胞的GFP表达。具有pH5.4-5.6的酸性溶液最有效地将细胞变为表达GFP(图5B)。因此，作为对本研究剩余部分的应激处理的选择集中于暴露至低pH。随后确定用于维持应激改变的Oct4表达细胞的最佳培养条件。研究了前述的多种培养基，包括：ES建立培养基、3i9和ACTH10、ES培养条件、ES-LIF11、胚胎神经干细胞培养条件、B27-LIF12以及EpiSCs培养条件13。将细胞铺板于各培养基中，并对表达GFP的集落进行计数(图5C)。在生成GFP表达球形集落方面，培养基B27-LIF似乎最有效。因此，将B27-LIF培养基用于已处理细胞的培养。在B27-LIF培养基中培养经应激处理的CD45阳性细胞，并且在5天内观察到了GFP表达球形集落，而在未经处理的对照中没有观察到GFP表达集落(图1A)。在最初的7天，球形集落生长至直径约70μm，并且在该培养条件下该球形集落可再维持另外的7天。该集落的外形有些复杂，其看起来更类似于植物中所见的愈伤组织的形状，而非球形。因此，将通过应激处理所生成的细胞集落称为动物愈伤组织(AC)。解离所培养的细胞，并然后使用FACS进行群体分析。该分析表明，施加某些显著刺激导致生成之前并不存在于CD45阳性细胞群中的应激所改变的细胞，该应激所改变的细胞现在称为动物愈伤组织细胞(ACC)(图1B)。在单细胞水平观察到了作为应激处理结果的CD45阳性细胞的表型变化。尽管CD45阳性细胞不表达GFP，但是ACC表达与CD45的减弱表达相关的GFP(数据未示出)。单细胞的检查表明，经处理的细胞的细胞尺寸看起来比未经处理的细胞更小。因此，通过FACS来分析ACC群的细胞尺寸。ACC的细胞尺寸非常小，其中80％的细胞的直径小于8μm(图1C)。为了检查与CD45减少和Oct4表达相关的随时间发生的表型变化，在第1天、第3天和第7天分析了经应激处理的CD45阳性细胞。在第1天，大部分的细胞仍然表达CD45，但不表达Oct4。在第3天，标志物表达转变成显示为CD45阴性细胞或CD45阴性/Oct4阳性(微弱)细胞。在第7天，CD45表达消失，并观察到了Oct4表达细胞(图1D)。值得注意的是，在培养的最初7天里，PI阳性细胞(死细胞)的数量逐渐增多(数据未示出)，这表明应激处理和培养条件逐渐改变了细胞的特性，并选择了成功改变的表达Oct4的细胞。ACC的表征。为了证实由于暴露于外部刺激导致的体细胞重编程，对ACC的早期胚胎发生标志物基因的表达进行了研究。作为早期胚胎发生的阳性对照，将ES细胞用于下面的实验中。标志物表达和DNA甲基化的特点如下：在第7天的免疫荧光染色显示出，含有ACC的球形集落一致地表达了多能细胞标志物、E-钙粘蛋白抗原、Nanog、SSEA-1、PCAM-1和AP，并且对于Oct4-GFP是阳性的(数据未示出)。基因表达分析显示出，ACC和ES细胞，而非原代CD45阳性细胞，表达出可比水平的Oct4、Nanog、Sox2、Ecat1、Esg1、Dax1、Fgf5、Klf4和Rex1基因(图2A)。在第7天，ACC中的ES特异性基因的基因表达达到峰值(图2A)。进行亚硫酸氢盐测序以确定ACC中的Oct4和Nanog基因启动子的甲基化状态。天然淋巴细胞和培养的淋巴细胞对照样品在两个启动子处均呈现出了广泛的甲基化，而ACC类似于ES细胞中所见的，显示出了这些区域的广泛去甲基化(图2B)。因此，证明了哺乳动物体细胞通过外部应激而重编程。为了证实不仅在GOF小鼠中而且在野生型小鼠中，Oct4基因表达由对成熟细胞进行应激处理所引起，从ICR小鼠获得的脾中收集CD45阳性淋巴细胞。然后，将淋巴细胞暴露于应激处理，并使用FACS按时间顺序进行分析直至第7天。在应激处理组中，看到SSEA-1阳性/E-钙粘蛋白阳性细胞群，而在未经应激处理的对照组中未观察到SSEA-1/E-钙粘蛋白表达(图6A)。通过RT-PCR证实了那些双阳性细胞表达了Oct4基因表达(图6B)。这些结果表明，由于应激处理的结果，由CD45阳性细胞生成了ACC、Oct4阳性细胞和多能标志物表达细胞，而与小鼠的品系无关。这些结果暗示，由于应激处理，成熟的完全分化的成体体细胞逆转为“干细胞性”。为了评价ACC的干细胞性，检查它们的自我更新潜能和它们的分化潜能。为了研究它们的自我更新潜能，将来源于之前成熟CD45阳性淋巴细胞的ACC集落解离为单个细胞，并努力以每孔一个细胞铺于96孔板中，以生成无性系衍生群体。在铺板后10天，在96个孔的4个孔中看到了球形集落。孔与孔中的ACC分裂时间不同。一些在12-16h内分裂，其他的在30-34h内分裂。将ACC传代至少5次，同时观察到Oct4的连续表达。因此，ACC证明了自我更新的潜能以及在体外分化为全部三种胚层的细胞的潜能。再次将来源于成熟GOF淋巴细胞的AC解离为单个细胞，挑选为仅含有表达GFP的细胞群，然后在分化培养基中培养。在铺板后第14-21天，细胞表达外胚层标志物(βIII-微管蛋白和GFAP)、中胚层标志物(α-平滑肌肌动蛋白)和内胚层标志物(α-甲胎蛋白和细胞角蛋白7)(数据未示出)。因此，ACC在体外分化为代表三种胚层的细胞。从多种成体组织获得的成熟体细胞的应激改变。为了检查ACC是否不仅能够从成熟的淋巴细胞而且还能够从其他类型的体细胞生成，从Oct4-GFP(GOF)小鼠收集脑、皮肤、肌肉、脂肪、骨髓、肺和肝8。从该组织样品分离细胞，解离为单个细胞，并用不同的物理和/或化学应激条件进行处理。改变细胞的处理的效果根据细胞来源和该细胞所暴露至的一种或多种应激条件两者而变化(图7A)。应激将成熟细胞改变为表达Oct4的能力随细胞的根源而变化，但在来源于全部三种胚层的成熟细胞中，应激能够在一定程度上将细胞改变为表达Oct4(图7A)。来源于任何成熟组织的ACC集落表达了多能标志物、E-钙粘蛋白、Nanog、PCAM-1和AP(数据未示出)，以及ES特异性标志物基因(图7B)。显著的物理和化学应激改变了成熟体细胞以逆转至干细胞状态，而与组织的来源和胚层的根源无关。ACC生成的初始阶段中的细胞修饰。这些结果证明了强的物理和化学刺激引起了体细胞的重编程。观察到了经应激处理的淋巴细胞在5天内形成AC。推测由于应激暴露，发生了分子事件的剧烈变化。因此，研究关注于该重编程的初始阶段，即暴露于刺激后的最初7天期间。因为ACC在显著的应激暴露后存活，所以推断在ACC生成期间，诱导了正常开启以修复细胞损伤的存活机制。首先，在第1天、第3天和第7天，对天然CD45阳性细胞和经应激处理的CD45阳性细胞中涉及对应激和DNA修复14的细胞应答的大量候选基因的表达进行比较。当分析ACC生成细胞和其他细胞的混合物时，在第1天已观察到细胞应答基因表达，并且那些基因在7天内上调(图8)。因为细胞应答基因的上调与ACC生成相关，所以挑选了在第3天和第7天的ACC，并分析了基因表达。在ACC生成期间，除Hif3a外，所有的候选基因均上调了不同程度(图3A)。在ACC生成期间，发现了四种热休克基因和一种DNA修复基因上调。此外，已知上调基因中的7个直接参与细胞氧化还原状态的调控。这些结果表明，在ACC生成期间诱导了自我更新潜能或自我防御潜能。由于ACC表现出细胞氧化还原相关的基因的上调，所以接着检查了ACC的线粒体功能。线粒体是在真核细胞内负责通过利用氧气进行氧化还原反应从而产生绝大部分ATP的细胞器。当对集落进行培养而不传代时，在7天后，ACC球形集落的GFP表达从位于周边的细胞逐渐降低。在第10天，所包含的ACC含有GFP表达中心细胞和非GFP分化的周边细胞(数据未示出)。通过用线粒体特异性染料MitoTracker红染色来评价ACC和分化的细胞中线粒体形态。观察到了ACC线粒体为表现为点状和球形的核周团簇，而分化的细胞含有呈细丝状并在细胞质中广泛分布的许多线粒体。ACC的ATP产生少于天然CD45阳性细胞中的(图3B)。而且，ACC的活性氧种类(ROS)产生少于天然CD45阳性细胞中的(图3C)。最后，评估了参与mtDNA复制的关键因子，该关键因子为线粒体转录因子A(Tfam)、线粒体特异性DNA聚合酶γ(Polg)及其辅助单元(Polg2)。ACC中的Tfam、Polg和Polg2的基因表达低于分化细胞中的那些(图3D)。因此，ACC含有少量的线粒体，并且ACC的线粒体活性低于分化的细胞。这些结果表明，ACC获得了不同于分化的细胞的代谢系统以在剧烈的应激应答后存活。ACC的发育潜能。最后，评估了ACC是否具有类似于植物愈伤组织细胞的发育潜能。作为对发育潜能的初步检测，研究了免疫缺陷(SCID)小鼠中的经皮下植入的ACC。移植六周后，ACC生成了表现出全部三种胚层的组织(数据未示出)。在体内和体外，ACC分化为表现出全部三种胚层的细胞。因此，评估了ACC的嵌合体贡献潜能。使用来源于F1GFP(C57BL/6GFP×DBA/2或129/SvGFP×C57BL/6GFP)或GOF的CD45阳性细胞制备用于嵌合体生成研究的ACC。因为基因表达分析已表明在第7天时ACC表达最高水平的多能标志物基因，因此将第7天的ACC用于嵌合体小鼠生成研究。首先，利用了用于嵌合体生成的传统方法。通过用胰蛋白酶处理将AC解离为单个细胞。然后，将ACC注射入胚泡中(图4A)。使用该方法，解离的ACC的嵌合体贡献非常低(表1)。因此，将没有在先的胰蛋白酶处理(该胰蛋白酶处理经常导致细胞损伤15)的ACC注射入胚泡中。在显微镜下使用显微刀将AC切为小团簇。然后，将AC的小团簇注射入胚泡中(图4A)。使用该方法，ACC的嵌合体贡献显著地增强(数据未示出)。用ACC生成的嵌合体小鼠健康成长(数据未示出)，并观察到种系传递。通过FACS来分析各组织的嵌合体贡献率。结果示出，来源于淋巴细胞的ACC有助于所有的组织的生成(图4B)。如上文所证明的，可由来源于全部三种胚层的多种细胞生成ACC(图7A-7B)。为了检查来源于多种组织的ACC是否具有不同的分化倾向，由来源于F1GFP小鼠的多种组织生成ACC，并注射入ICR胚泡中。然后，使用FACS来分析所生成的嵌合体小鼠中的各组织的贡献率。发现来源于任何组织的ACC均有助于嵌合体小鼠的生成(图9)。另外，分析了使用来源于多种组织的ACC所生成的嵌合体小鼠中对皮肤、脑、肌肉、脂肪、肝和肺的贡献率。来源于任何组织的ACC均有助于生成表现出全部三种胚层的组织，并且未观察到分化倾向(图9)。通过四倍体互补生成小鼠涉及将多能细胞注射入4N宿主胚泡中，由于所得到的胚胎仅来源于所注射的供体细胞，所以通过四倍体互补生成小鼠代表了对发育潜能的最严格检测16。由来源于DBA×B6GFPF1小鼠或129/SvGFP×B6GFPF1的淋巴细胞生成了ACC。在注射入4N胚泡后，ACC引起了(中)晚期妊娠“全ACC胚胎”的生成(数据未示出)。基因分型分析证明了，“所有的ACC胚胎”具有用于生成ACC的菌株的特异性基因。因此，ACC正像植物愈伤组织细胞一样具有生成克隆体的潜能。讨论哺乳动物体细胞以非常类似于植物的方式表现出由于暴露于显著的外部刺激而形成动物愈伤组织(AC)的能力。包含在这些愈伤组织中的细胞(动物愈伤组织细胞，ACC)具有生成嵌合体小鼠和生成完全仅由ACC生成的细胞构成的新胚胎的能力。本文所描述的结果证明，通过外部刺激，哺乳动物体细胞重新获得分化为三种胚层中的任一种的能力。这表明，体细胞具有比先前认为的更大的可塑性。此外，这种研究证明了无基因诱导或外源蛋白引入时的体细胞重编程的潜能，并提供了对成体干细胞的潜能的新见解；从而代表了干细胞生物学的阐释中的重要的里程碑。材料和方法组织收集和细胞培养。对于成熟淋巴细胞的分离，用剪刀将来源于GOF小鼠或ICR小鼠的脾剪碎，并用巴斯德吸管进行机械解离。将已解离的脾通过细胞滤过器(cellstrainer)(BDBiosciences公司，圣约瑟(SanJose))进行过滤。将所收集的细胞重悬浮在DMEM培养基中，并加入相同体积的淋巴细胞(安大略(Ontario)，加拿大)，然后以1000g离心15min。将淋巴细胞层取出，并用CD45抗体(ab25603，abcam，坎布里奇(Cambridge)，马萨诸塞州)加以获取。通过FACSAria(BDBiosciences公司)对CD45阳性细胞进行挑选。然后，用应激处理(pH5.5溶液，进行15min)来处理CD45阳性细胞，并铺板于补充有1000U的LIF(Sigma公司)和10ng/ml的FGF2(Sigma公司)的B27培养基中。暴露于外部刺激-应激处理。为了向成熟细胞提供机械应激，将巴斯德吸管加热并然后拉伸，以生成直径约50微米的管腔，然后打断。然后，通过这些吸管将成熟的体细胞研磨20min，并培养7天。为了向成熟细胞提供低氧刺激，在5％氧气培养箱中将细胞培养3周。通过在基础培养基中将细胞培养3周来向成熟细胞提供营养不足刺激。为了将成熟细胞暴露于生理应激，将该成熟细胞用低pH(pH5.5)溶液处理，并培养7天。而且，使细胞受到更严重的损伤。为了在成熟细胞膜中产生孔，用SLO(链球菌溶血素O)来处理细胞。在37℃下在含有10μg/mL的SLO的HBSS中将经SLO处理的细胞培养50min，然后在无SLO的培养基中培养7天。在基础培养基中将暴露于营养不足应激的细胞培养2至3周。在37℃下在含有2.4mM的ATP的HBSS中将暴露于“ATP”应激的细胞培养15min，然后在培养基中培养7天。在含有2mM的CaCl2的培养基中将暴露于“Ca”应激的细胞培养2周。亚硫酸氢盐测序。将从GOF小鼠获得的细胞解离为单个细胞。使用FACSAria收集GFP阳性细胞。从ACC提取基因组DNA并进行研究。按照制造商的说明，使用CpGenomeDNA修饰试剂盒(Chemicon，特曼库拉，加利福尼亚，http://www.chemicon.com)来进行DNA的亚硫酸氢盐处理。使用两条正向引物(F)和一条反向引物(R)通过巢式聚合酶链式反应PCR来扩增所得的经修饰的DNA：Oct4(F1，GTTGTTTTGTTTTGGTTTTGGATAT(SEQIDNO：1)；F2，ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA(SEQIDNO：2)；R，CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC(SEQIDNO：3))。以及Nanog(F1，GAGGATGTTTTTTAAGTTTTTTTT(SEQIDNO：4)；F2，AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT(SEQIDNO：5)；R，CCCACACTCATATCAATATAATAAC(SEQIDNO：6))。使用TaKaRaExTaqHotStartVersion(RR030A)进行PCR。使用M13引物并借助GRAS(TheGenomeResourceandAnalysisUnit(基因组资源和分析单元))来进行DNA测序。免疫组化。用4％的多聚甲醛来固定所培养的细胞，并在用1％的BSA溶液(LifeTechnology公司，东京，日本)封闭前，用0.1％的TritonX-100/PBS透化。二抗为偶联至Alexa-488或Alexa-594的山羊抗小鼠抗体或抗兔抗体(Invitrogen公司)。用DAPI(Sigma公司)将细胞核可视化。载玻片贴有SlowFadeGold抗淬灭试剂(Invitrogen公司)。荧光活化的细胞挑选和流式细胞术。根据标准方案准备细胞，并在FACS之前将细胞悬浮于冰上的0.1％的BSA/PBS中。使用PI(BDBiosciences公司)排除死细胞。在BDFACSAriaSORP上挑选细胞，并在具有BDFACSDiva软件的BDLSRII(BDBiosciences公司)上进行分析。RNA制备和RT-PCR分析。用RNeasyMicro试剂盒(QIAGEN公司)来分离RNA。用SupeSACriptIII第一链合成试剂盒(Invitrogen公司)进行逆转录。将SYBRGreenMixI(RocheDiagnostics公司)用于扩增，并将样品在Lightcycler-II仪器(RocheDiagnostics)上运行。动物研究。为了研究致瘤性，将悬浮于100ml的PBS中的细胞经皮下注射入年龄匹配的免疫缺陷SCID小鼠的侧腹(flank)。在6周后处死小鼠并进行尸体解剖。ATP和ROS测定法。根据供应商的方案，通过ATP生物发光测定试剂盒HSII(Roche)来测量细胞间ATP水平。通过使用Gelomax96微孔板发光检测仪(MicroplateLuminometer)(Promega公司，麦迪逊(Madison)，威斯康辛州)来测量发光强度，并通过细胞计数将发光读数归一化。为了测量ROS水平，在37℃下在含有2μM的二氢乙锭(MolecularProbes公司)的培养基中将细胞避光培养15分钟。然后，用PBS洗涤细胞，并悬浮于含0.5％的BSA的PBS中。借助于BDBiosciencesLSRII(BDBioscience公司，Spark，MD)记录30000个细胞的荧光强度。嵌合体小鼠的生成和分析。二倍体嵌合体和四倍体嵌合体的生产。由与ICR雄性交配的ICR品系雌性获得二倍体胚胎，并由与BDF1雄性交配的BDF1品系雌性获得四倍体胚胎。通过2-细胞胚胎的电融合来产生四倍体胚胎17。在该研究中，因为胰蛋白酶处理引起低的嵌合性，在显微镜下使用微刀将ACC球形集落切成小块，然后通过大的吸管将ACC的小团簇注射入4.5天的胚泡中。次日，将嵌合胚泡转移入2.5天的假孕的雌性中。参考文献1.Brockes,J.P.&Kumar,A.Plasticityandreprogrammingofdifferentiatedcellsinamphibianregeneration.Naturereviews.Molecularcellbiology3,566-574,doi:10.1038/nrm881(2002).2.Sinnott,J.J.&Burklund,C.W.Thetreatmentofcarotidinsufficiency.TheNebraskastatemedicaljournal45,357-359(1960).3.Hanna,J.etal.DirectreprogrammingofterminallydifferentiatedmatureBlymphocytestopluripotency.Cell133,250-264,doi:10.1016/j.cell.2008.03.028(2008).4.Hockemeyer,D.etal.Adrug-induciblesystemfordirectreprogrammingofhumansomaticcellstopluripotency.Cellstemcell3,346-353,doi:10.1016/j.stem.2008.08.014(2008).5.Kim,D.etal.Generationofhumaninducedpluripotentstemcellsbydirectdeliveryofreprogrammingproteins.Cellstemcell4,472-476,doi:10.1016/j.stem.2009.05.005(2009).6.Kim,J.B.etal.DirectreprogrammingofhumanneuralstemcellsbyOCT4.Nature461,649-643,doi:10.1038/nature08436(2009).7.Okabe,M.etal.Definitiveprooffordirectreprogrammingofhematopoieticcellstopluripotency.Blood114,1764-1767,doi:10.1182/blood-2009-02-203695(2009).8.Ohbo,K.etal.Identificationandcharacterizationofstemcellsinprepubertalspermatogenesisinmicesmallstar,filled.Developmentalbiology258,209-225(2003).9.Ying,Q.L.etal.Thegroundstateofembryonicstemcellself-renewal.Nature453,519-523,doi:10.1038/nature06968(2008).10.Ogawa,K.,Matsui,FL,Ohtsuka,S.&Niwa,H.AnovelmechanismforregulatingclonalpropagationofmouseEScells.Genestocells:devotedtomolecular&cellularmechanisms9,471-477,doi:10.1111/j.l356-9597.2004.00736.x(2004).11.Gough,N.M.etal.LIF:amoleculewithdivergentactionsonmyeloidleukaemiccellsandembryonicstemcells.Reproduction,fertility,anddevelopment1,281-288(1989).12.Hitoshi,S.etal.PrimitiveneuralstemcellsfromthemammalianepiblastdifferentiatetodefinitiveneuralstemcellsunderthecontrolofNotchsignaling.Genes&development18,1806-1811,doi:10.110l/gad.1208404(2004).13.Tesar,P.J.etal.Newcelllinesfrommouseepiblastsharedefiningfeatureswithhumanembryonicstemcells.Nature448,196-199,doi:10.1038/nature05972(2007).14.Saretzki,G.,Armstrong,L.,Leake,A,Lako,M.&vonZglinicki,T.Stressdefenseinmurineembryonicstemcellsissuperiortothatofvariousdifferentiatedmurinecells.StemCells22,962-971,doi:10.1634/stemcells.22-6-962(2004).15.Mitalipova,M.M.etal.Preservingthegeneticintegrityofhumanembryonicstemcells.Naturebiotechnology23,19-20,doi:10.1038/nbt0105-19(2005).16.Nagy,A,Rossant,J.,Nagy,R.,Abramow-Newerly,W.&Roder,J.C.Derivationofcompletelycellculture-derivedmicefromearly-passageembryonicstemcells.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica90,8424-8428(1993).17.Nagy,A.etal.Embryonicstemcellsaloneareabletosupportfetaldevelopmentinthemouse.Development110,815-821(1990).表1：从ACC生成嵌合体小鼠*全部胎儿均在13.5dpc(交配后天数)至15.5dpc时收集，并通过FACS检查ACC在各器官中的贡献率。**SAC在各嵌合体中的贡献打分同样高(＞50％的具有GFP表达的毛色)。表2：引物序列。中间列从上至下含有SEQIDNO：7-39，以及右列从上至下含有SEQIDNO：40-72。基因5’引物3’引物TxnigtcatccttgatctgcccctgagacgacctgctacacctgBmi1ggtacttacgatgcccagcatccctacctgactgcttacgPrdx2ccctgaatatccctctgcttatgtctgctcgtaccccttHspb1agatggctacatctctcggttcagacctcggttcatcttcHif3acactctggacttggagatgccttggaccttcgaaggacgaHspa1bcttgtcgttggtgatggtgatcaaagcgcagaccacctcgHspa9agttgaagcagttaatatggcgcatgtcgtccgcagtaactErcc4agatgagaccaacctggacctcgacttcgtcttgttcggtHpas1aaggtggagatcatcgccaactctacctgttccgcgtctagGapdhcgttgaatttgccgtgagtgtggtgaaggtcggtgtgaacGpx2attgccaagtcgttctacgagtaggacagaaacggatggaSod2aggtcgcttacagattgctggtgtcgatcgttcttcactTgrgtctctttagaaaagtgtgaattgcagctgcaaatccctgGstatacagctttcttcctggccatacgattcacggaccgtgccPdha2atgtcagccttgtggaaattaacgataactgatccctgggGpx3gtctgacagaccaataccatcagttctacctgtaggacagGpx4aacggctgcgtggtgaagcgcctccttccaggtctccggaPolgggacctcccttagagagggaagcatgccagccagagtcactPol2acagtgccttcaggttagtcactccaatctgagcaagaccTfamgcatacaaagaagctgtgaggttatatgctgaacgaggtcOct4tctttccaccaggcccccggcttgcgggcggacatggggagatccEcat1tgtggggccctgaaaggcgagctgagatatgggccgccatacgacgacgctcaactEsg1gaagtctggttccttggcaggatgactcgatacactggcctagcNanogcaggtgtttgagggtagctccggttcatcatggtacagtcERasactgcccctcatcagactgctactcactgccttgtactcgggtagctgGdf3gttccaacctgtgcctcgcgtcttagcgaggcatggagagagcggagcagFgf4cgtggtgagcatcttcggagtggccttcttggtccgcccgttcttaRex1acgagtggcagtttcttcttgggatatgactcacttccagggggcactCriptoatggacgcaactgtgaacatgatgttcgcactttgaggtcctggtccatcacgtgaccatDax1tgctgcggtccaggccatcaagaggggcactgttcagttcagcggatcSox2tagagctagactccgggcgatgattgccttaaacaagaccacgaaaKlf4gcgaactcacacaggcgagaaacctcgcttcctcttcctccgacacaFgf5gctgtgtctcaggggattgtcactctcggcctgtcttttc表3：在应激处理1周后，显示多能表型的细胞的百分数。在第一列中示出了处理，并在第二行中示出了体细胞来源的组织。数字为百分比。实施例2：刺激触发的体细胞向多能性的命运转变本文所描述了核初始化现象，“刺激触发性获得多能性”(STAP)，其中强的外部刺激足以将哺乳动物体细胞重编程为多能细胞，而无需利用核转移或引入转录因子。在LIF存在的情况下，瞬时低pH应激引起了CD45+造血细胞去分化为表达多能细胞标志物(诸如Oct3/4)并具有分化为三种胚层的能力的细胞。如同ES细胞，在这些STAP细胞中，与ES细胞一样，看到了在oct3/4和nanog启动子区域中看到了的实质的大体上的去甲基化。来源于造血细胞的STAP细胞携带T细胞受体中的基因重排，表明了已定向的体细胞通过谱系转变生成STAP细胞。胚泡注射示出了，STAP细胞甚至在四倍体互补测定法中有效地促成了嵌合体，并且通过种系传递促成了后代。因此，通过强的环境诱因能够以背景依赖的方式在根本上初始化命运确定的表观遗传状态。在Waddington表观遗传图谱的渠化视图中，随着细胞向下分化，逐渐确定了体细胞的命运。通常认为，已分化的细胞状态的逆转需要对它们的核功能进行人工的、物理的或遗传的操控，诸如核转移1和多个转录因子的引入2。仍然未解答的是，体细胞是否能够无需这些直接的核操控，而简单地在应答外部触发时初始化它们的核编程。已知此类情况在植物中出现；培养环境中的剧烈变化可使成熟体细胞(例如，已解离的胡萝卜细胞)的命运转变为未成熟的胚细胞(blastemacell)，在生长素存在的情况下，从该胚细胞发育为完整的植物结构(包括茎和根)。挑战性的问题是，动物体细胞是否可能具有至少在特定条件下出现的相似潜能。在过去的十年中，对于成体组织中的多能细胞(或紧密相关的细胞类型)的存在是具有争议的事情，多个研究小组对此报告了相互矛盾的结论。然而，他们都没有人证明这样的多能细胞可由已分化的体细胞产生。对CD45(白细胞共同抗原)阳性的造血细胞为典型的谱系定向体细胞，其通常用作重编程研究(诸如iPS细胞的衍生)的起始细胞类型。除非被重编程，该造血细胞从不表达多能性相关的标志物，诸如Oct3/4。具体地，来自脾组织的大部分CD45+细胞被认为是非干白细胞群(成熟细胞或祖细胞)，并且由携带T细胞受体β链(tcrβ)基因的基因组重排的淋巴细胞转变为iPS细胞视为用于从定向体细胞重编程的真正标志。因此，本发明人变得对通过外部环境的剧烈变化(诸如，通过简单的化学扰乱所引起的那些变化)是否能够将脾的CD45+细胞转变为获得多能性的问题感兴趣。结果在定向体细胞中低pH处理所诱导的命运转变。将从oct3/4::gfpB6小鼠15获得的成体脾所收集的CD45-细胞暴露至多种类型的强烈瞬时刺激(包括物理和化学刺激)，并使用含有LIF的B27培养基在悬浮液中培养数天后，对oct3/4启动子的活化进行检查。在各种这些扰乱中，所关注的是低pH扰乱。如下文所示出的，这类扰乱证明是在oct3/4的诱导方面最为有效。无论在含LIF的培养基(该培养基允许被挑选出的细胞存活)中的培养时长如何，在没有暴露于刺激的情况下，用CD45所挑选的细胞中没有一个表达oct3/4::GFP。相比之下，用低pH培养基(pH4.5-6.0；图12A)处理脾的CD45+细胞30分钟引起第7天(d7)的培养物中大量的oct3/4::GFP+细胞出现(图12B；最有效的范围是pH5.4-5.8；图16B)。在不传代的情况下，这些细胞保持表达oct3/4::GFP至少持续另外的7天(总共14天)。在此非粘附培养的第7天，低pH所诱导的oct3/4::GFP+细胞形成了不再表达CD45(图12C)的球形的(或略微复杂的)团簇(数据未示出；由少数几个至数十个细胞构成)。有趣的是，低pH所诱导的oct3/4::GFP+细胞的细胞尺寸基本上小于未经处理的CD45+细胞的大小(参见单个细胞中oct3/4::GFP和CD45的免疫染色；图12C)；前者细胞中的80％的直径小于8μm，而对照CD45+细胞的直径范围为8至10μm(图12D(左峰示出了Oct3/4::GFP+细胞，右峰示出了CD45+细胞)，通过FACS中的前向散射分析来评价)。这些观察表明，oct3/4::GFP+和CD45+群体之间的剧烈变化超出了在两种标志物表达方面的差异。时程分析(图12C)示出了在第1天-第3天中的细胞群的动态变化。在第1天，大部分存活细胞(存活细胞数量对应于第0天群体的约85％)仍然为CD45-和oct3/4::GFP-。在第2天和第3天，总的存活细胞中的大量群体(分别为21％和34％)变为oct3/4::GFP+，并且CD45减弱(图12C；此时损失～50％-60％的所铺板的细胞)。在第7天，相当数量的oct3/4::GFP+/CD45-细胞(总的存活细胞中的54％)构成了不同于oct3/4::GFP-/CD45-细胞的群体(图12B，上部；第7天的总细胞数与第3天的那些相似)。在未经处理的CD45+细胞的培养物中未看到oct3/4::GFP+/CD45-群体的明显生成(图12B，下部)。因此，在低pH处理组中，该oct3/4::GFP+/CD45-群体的数量相当可观，并相当于在第7天时的总的存活细胞的约一半。事实上，当oct3/4::GFP信号在第2天首次出现时，GFP+细胞的数量相当于最初所铺板的CD45+细胞的约8％。因此，非常少的群体(例如，污染CD45-细胞)在低pH处理后的最初两天内快速生长以形成这样大量的oct3/4::GFP+群体似乎不太可能。在实时(现场)成像分析(数据未示出)中，经低pH处理的CD45+细胞而非未经处理的细胞倾向于形成小团簇，并在最初的数天内逐渐开启GFP信号。然后，这些小的oct3/4::GFP+团簇频繁融合，并到第5天形成更大的球体，这表明了该团簇是多克隆的。有趣的是，这些GFP+团簇(而非GFP-细胞)非常易于移动，并通常从细胞突中突出来(数据未示出)。为了检测谱系定向的脾CD45+细胞(特别是T细胞群)是否有助于oct3/4::GFP+细胞，通过基因组PCR来检查分离的oct3/4::GFP+球体中的tcrβ基因组重排，且发现各球体包含具有tcrβ基因重排的细胞(数据未示出)。为了排除检测到污染的oct3/4::GFP-/CD45+细胞中重排的可能性，在第7天通过FACS挑选oct3/4::GFP+/CD45-细胞，并进行tcrβ基因重排测定法。在这种情况下，清楚地观察到了tcrβ基因重排(图12E)。这些发现表明了，脾细胞(至少T细胞)中的定向体细胞群体通过将它们命运由CD45+转变为oct3/4::GFP+而有助于oct3/4::GFP+细胞。低pH诱导的Oct3/4+细胞具有多能性。接下来检查了刺激诱导的细胞中的oct3/4::GFP+表达是否代表了这些细胞的多能性状态或仅是没有获得多能性的情况下的基因表达模式中的特定改变(在这种情况下，oct3/4和cd45)。免疫染色示出了，第7天的oct3/4::GFP+球体表达多能性相关标志物，诸如Oct3/4、SSEA-1、Nanog、E-钙粘蛋白和AP(数据未示出)。通过qPCR进行的基因表达分析示出了，与CD45+细胞不同，低pH所诱导的oct3/4::GFP+细胞在第7天表达与ES细胞中的那些的可比水平的oct3/4、nanog、sox2、ecat1、esg1、dax1和klf4基因(图13A(从左至右的系列表示：oct3/4、nanog、sox2、ecat1、esg1、dax1和klf4的表达)；这些标志物在第3天已经为阳性)，表明了该低pH诱导的oct3/4::GFP+细胞表达出从未在CD45+细胞中表达的表征多能性的真正的标志物基因集合。接下来检测了基因表达模式中的此剧烈改变是否伴随有多能性相关基因的表观遗传修饰的变化。为了此目的，实施了亚硫酸氢盐测序，以检查oct3/4和nanog启动子区域的甲基化状态。在进行了或未进行另外培养的情况下，CD45+细胞在两个启动子处均呈示出了严重的甲基化模式。相比之下，如同ES细胞，低pH所诱导的oct3/4::GFP+细胞在这些区域中示出了广泛的去甲基化(图13B)，表明了在这些对多能性而言的关键基因方面，细胞经历了表观遗传状态的基本上的重编程。接着检查了低pH所诱导的细胞是否具有生成三种胚层衍生物的能力，该能力是多能性质的常见标准。体外分化测定法(数据未示出)和畸胎瘤形成测试(数据未示出)均表明了，这些细胞可产生外胚层(例如，β-微管蛋白III+)细胞、中胚层(例如，平滑肌肌动蛋白+)细胞和内胚层(例如，α-甲胎蛋白+)细胞。总之，这些发现表明了，定向体细胞谱系的分化状态可以通过外部给予的强刺激转变为多能性的细胞状态。下文中，将通过强的外部刺激(诸如低pH)从体细胞到多能细胞的命运转变称为“刺激触发性获得多能性”(STAP)，并将所得的细胞称为STAP细胞。来自其他组织来源的STAP细胞。关于STAP细胞的另一重要问题是，低pH触发的转变的现象是否局限于CD45+白细胞。为了解决此问题，用从oct3/4::gfp小鼠的脑、皮肤、肌肉、脂肪、骨髓、肺和肝组织中收集的体细胞进行了类似的转变实验。将来自组织样品的细胞解离为单个细胞，进行瞬时低pH暴露，并在含LIF的培养基中进行培养。虽然转变效力随它们的来源组织变化，但在第7天的培养物中再现地观察到了oct3/4::GFP+细胞(图14A(从左至右的系列表示：CD45+细胞、骨髓、脑、肺、肌肉、脂肪、成纤维细胞、肝和软骨细胞))。值得注意的是，从CD45+细胞稀少的脂肪组织的间充质细胞以及也可从软骨细胞的原代培养细胞有效地衍生出STAP细胞(数据未示出)，表明非CD45+细胞群能够产生STAP细胞。这些oct3/4::GFP+细胞团簇还表达了多能性相关的标志物(图14B(从左至右的系列表示：Oct3/4、Nanog、Sox2、Klf4和Rex1的表达)和图18B，数据未示出)和ES细胞特异性标志物基因(图14B和图18B)。作为多能细胞的STAP细胞的特性。因此，STAP细胞表达了ES细胞特异性基因，并在oct3/4和nanog基因中显示出了相似的甲基化模式。另外，可在小鼠ES细胞的培养基(诸如含LIF的培养基)中，而非在小鼠EpiSc培养基中建立STAP细胞(数据未示出)。然而，虽然STAP细胞表现出了与小鼠ES细胞的实质的相似性，但是还发现了数个不同的特征。例如，STAP细胞显示出有限的自我更新能力。与小鼠ES细胞(数据未示出)不同，当将STAP细胞球体酶促地解离为单个细胞以用于在96孔板的各孔中的克隆培养时，在粘附或非粘附条件下在含有LIF的培养基(基于G-MEM或B27的)中另外培养10天后没有集落(AP+或oct3/4::GFP+)形成(数据未示出)。然而，不常见到球形集落形成(通常，96个孔中有2-4个孔)，这些集落全是AP-和oct3/4::GFP-。即使当STAP细胞球体在高细胞密度条件下部分地解离并培养(数据未示出；推测更支持自我更新)时，两次传代后细胞数量开始下降，且oct3/4::GFP+细胞不能被维持超过五次传代。这些生长和维持的特性表明了，STAP细胞代表了其特征与小鼠ES和iPS细胞部分不同的多能细胞群。小鼠EpiSC是被认为在分化阶段上略微更加进化的另一类多能干细胞。STAP细胞看起来在多个方面表现出了与EpiSC细胞的不同。在粘附培养方面，如同小鼠ES细胞，oct3/4::GFP+细胞通过堆叠形成与所看到的小鼠EpiSC的单层扁平集落不同的半球形集落。STAP细胞也不能在EpiSC培养基中维持，表明它们与EpiSC不同(数据未示出)。另外，用ROCK抑制剂处理(这改善了EpiSC的单个细胞传代(参考Ohgushi))并不会促进由已解离的STAP细胞形成集落(数据未示出)。免疫染色表明，STAP细胞对EpiSC标志物Claudin7和ZO-1呈阴性，而对Klf2/4呈阳性(数据未示出)。ES细胞、STAP细胞和EpiSC之间的分组可能并不简单，因为ES细胞标志物Esrrβ的表达在STAP细胞和EpiSC中均很低，而elf5表达在STAP细胞中特别低(图15A(从左至右的系列表示：ES、EpiSC、STAP和CD45))。在全基因组转录的团簇分析中，STAP细胞最接近于ES细胞，并且在RNA表达方面具有与胚泡实质的相似性，而STAP细胞与亲代的CD45+细胞相距最远(数据未示出)。STAP细胞中的X染色体失活的情况令人感兴趣；～40％的雌性STAP细胞(第7天)显示出失活的染色体，而取消了在其余(～60％)中的X染色体失活(图15B)。这些发现提出了如下可能性：STAP细胞的分化状态可能表示与ES细胞的亚稳态多能状态密切相关但又不同的新的亚稳态多能状态。小鼠中的嵌合体形成和种系传递。最后，通过胚泡注射测定法来评价STAP细胞的嵌合体形成能力。与ES细胞不同，当STAP细胞(B6背景)解离为单个细胞并注射入ICR胚泡中时，并未生出携带深毛色的嵌合体小鼠(表4)。由于单个STAP细胞难以在体外维持，推断细胞解离以某种方式改变了它们的能力。因此，在显微镜下使用微刀将STAP细胞团簇手动地切为小块，并全部注射入胚泡中(数据未示出)。通过此操作，以可观的比率生出嵌合体小鼠，并且所有的嵌合体小鼠均正常发育(数据未示出)。接着检查了所注射的STAP细胞的组织贡献，该STAP细胞由组成型表达GFP的小鼠(与DBA/2或129/Sv杂交的C57BL/6GFP的F1)的CD45+细胞生成。在用STAP细胞团簇注射的嵌合体胚胎中看到了GFP表达细胞的从高到中等的贡献(数据未示出)。通过FACS在这些嵌合体胚胎中来分析GFP+细胞在各组织中的贡献率。来源于CD45+细胞的STAP细胞有助于所检查的全部组织(数据未示出)。此外，来源于STAP细胞的后代出生为嵌合体小鼠(表5)。由于种系传递被视为是对多能性以及遗传和表观遗传常态的严格标准22，所以STAP细胞的这一潜能很重要，并示出了这些多能细胞的真正的性质。然后通过将细胞注射入4N胚泡中来进行四倍体(4N)互补测定法，由于所得到的胚胎仅来源于这些供体细胞23，因此，认为该测定法是对所注射的细胞的发育潜能而言的最严格的测试(数据未示出)。当注射入4N胚泡中时，来源于CD45+细胞的STAP细胞(来自DBA×B6GFP或129/Sv×B6GFPF1小鼠)在E10.5上生成“全GFP+胚胎”(数据未示出)，表明了单独的STAP细胞足以构建整个胚胎结构。总之，这些发现清楚地显示出，STAP细胞具有在胚胎环境的背景中分化为全部体细胞和种系谱系的发育能力。讨论本文所描述的数据已显示出体细胞潜在具有的出乎预料的灵活的可塑性。当将细胞瞬时暴露于在它们的生活环境中通常不会经历的强刺激时，出现了此动态可塑性，甚至转变为多能细胞。至少用HDAC抑制剂(例如，曲古抑菌素A)或5-氮杂胞嘧啶核苷处理不会实质上影响CD45+细胞向STAP细胞的转变。本文表明了低pH处理实质上减少了培养物中的细胞的数量。然而实际上，在最初24小时内存活细胞的减少是边缘化的，表明此处理不可能对大多数细胞提供急性致死效果。相反，在第2天至第5天期间逐渐出现了延迟的细胞损失。与此一致的是，该数据表明了在第3天，在经历过低pH的oct3/4::GFP+细胞中，参与对应激和DNA修复的细胞应答的大量基因21被强烈地诱导，但是在相同培养基中所培养的对照细胞中并未出现，这表明细胞对作为威胁生命或亚致死性应激的刺激进行应答。有趣的是，它们的基因表达水平在第7天变得甚至更高；因此，有兴趣在将来不仅对应激所诱导的基因对细胞存活的作用进行研究，而且也还对它们参与重编程过程的可能进行研究。另一开放性问题是，细胞重编程是否可专门通过低pH处理开启，或者还通过一些其他类型的亚致死性应激(诸如物理损伤、质膜穿孔、渗透压休克、生长因子剥夺、缺氧和高Ca2+培养基暴露)开启。值得注意的是，至少这些应激中的一些，特别是由严格的研磨的物理损伤和由链球菌溶血素O的膜穿孔，诱导了从CD45+细胞生成oct3/4::GFP+细胞(图18A)。这些发现提出了如下可能性：位于这些相关性远的亚致死性应激的下游的某些常见调控组件充当了将体细胞从分化的紧紧锁定的表观遗传状态释放的关键，引起了表观遗传调控中的全局变化。鉴于在第2天所出现的一些oct3/4::GFP+细胞，此类重编程机制可能在最初的两天内开始发挥作用。参考文献1Wakayama,T.,Perry,A.C,Zuccotti,M.,Johnson,K.R.&Yanagimachi,R.Full-termdevelopmentofmicefromenucleatedoocytesinjectedwithcumuluscellnuclei.Nature394,369-374,doi:10.1038/28615(1998).2Takahashi,K.&Yamanaka,S.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell126,663-676,doi:10.1016/j.cell.2006.07.024(2006).3Jiang,Y.etal.Pluripotencyofmesenchymalstemcellsderivedfromadultmarrow.Nature418,41-49,doi:10.1038/nature00870(2002).4D'Ippolito,G.etal.Marrow-isolatedadultmultilineageinducible(MIAMI)cells,auniquepopulationofpostnatalyoungandoldhumancellswithextensiveexpansionanddifferentiationpotential.Journalof<'>cellscience117,2971-2981doi:10.1242/jcs.01103(2004).5Johnson,J.etal.Oocytegenerationinadultmammalianovariesbyputativegermcellsinbonemarrowandperipheralblood.Cell122,303-315,doi:10.1016/j.cell.2005.06.031(2005).6Kucia,M.etal.Apopulationofverysmallembryonic-like(VSEL)CXCR4(+)SSEA-1(+)Oct-4+stemcellsidentifiedinadultbonemarrow.Leukemia:officialjournaloftheLeukemiaSocietyofAmerica,LeukemiaResearchFund,U.K20,857-869,doi:10.1038/sj.leu.2404171(2006).7Kuroda,Y.etal.Uniquemultipotentcellsinadulthumanmesenchymalcellpopulations.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica107,8639-8643,doi:10.1073/pnas.0911647107(2010).8Obokata,H.etal.Thepotentialofstemcellsinadulttissuesrepresentativeofthethreegermlayers.Tissueengineering.PartA17,607-615,doi:10.1089/ten.TEA2010.0385(2011).9Rahnemai-Azar,A.etal.Humanmarrow-isolatedadultmultilineage-inducible(MIAMI)cellsprotectagainstperipheralvascularischemiainamousemodel.Cytotherapy13,179-192,doi:10.3109/14653249.2010.515579(2011).10Huang,Y.etal.Bonemarrowtransplantationtemporarilyimprovespancreaticfunctioninstreptozotocin-induceddiabetes:potentialinvolvementofverysmallembryonic-likecells.Transplantation89,677-685,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DMEM对所收集的细胞进行培养。每3天更换培养基。在7-14天后，用抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(N1584，DAKO)来染色肌肉细胞。在阴性对照中，用具有相同的同种型的IgG阴性对照替代该一抗以确保特异性。神经谱系分化测定法。在第7天收集应激改变的细胞团块，并解离为单个细胞，然后通过细胞挑选器仅收集Oct4-GFP阳性细胞。将所收集的细胞铺板于处于F12/DMEM(1:1，v/v)中的包被有鸟氨酸的腔室玻片(NalgeNuncInternational公司)上，该F12/DMEM补充有2％的B27(Invitrogen公司)、10％的FCS、10ng/ml的bFGF(R&DSystems公司)和20ng/ml的EGF(R&DSystems公司)。每3天更换培养基。在10-14天后，在4℃下用4％的多聚甲醛固定细胞30分钟，在室温下用含有0.2％的TritonX-100的PBS洗涤15分钟，用含有2％的FCS的PBS培养20分钟以封闭非特异性反应，并用抗βIII-微管蛋白小鼠单克隆抗体(G7121，Promega公司)和抗GFAP小鼠单克隆抗体(AB5804，CHEMICON公司)培养。在阴性对照中，用具有相同的同种型的IgG阴性对照替代该一抗以确保特异性。肝分化测定法。在第7天收集应激改变的细胞团块，并解离为单个细胞，然后通过细胞挑选器仅收集Oct4-GFP阳性细胞。将所收集的细胞铺板于处于补充有10％的FCS、1％的青霉素/链霉素(Sigma公司)的肝细胞培养基中的腔室2孔载玻片(NalgeNuncInternational公司)上，该肝细胞培养基由500mL肝细胞基础培养基(Lonza公司，伍珀塔尔(Wuppertal)，德国)、0.5mL的抗坏血酸、10mL的BSA-FAF(不含脂肪酸)、0.5mL的氢化可的松、0.5mL的铁传递蛋白、0.5mL的胰岛素、0.5mL的EGF和0.5mL的庆大霉素-两性霉素(GA-1000；全部来自Lonza公司)组成。使用如下抗体通过免疫组化来检测已分化的细胞：抗α-甲胎蛋白小鼠单克隆抗体(MAB1368，R&DSystem公司)和抗细胞角蛋白7小鼠单克隆抗体(ab668，abcam公司)。在阴性对照中，用具有相同的同种型的IgG阴性对照替代该一抗以确保特异性。体内分化测定法：在第7天收集应激改变的细胞团块，并解离为单个细胞，然后通过细胞挑选器仅收集Oct4-GFP阳性的细胞。将所收集的细胞重悬浮于50μl具有10％的FBS的DMEM中。将此溶液接种于由直径为200微米的聚乙醇酸纤维的无纺布网状物构成的3×3×1mm的薄片上，并经皮下植入4周龄的NOD/SCID小鼠的背侧部。四周后，收集该植入物，并使用免疫组化技术进行分析。用10％的甲醛固定该植入物，在石蜡中包埋，并常规地加工至4μm厚。用苏木精和伊红来染色切片。用内胚层标志物抗α-甲胎蛋白小鼠单克隆抗体(MAB1368，R&DSystem公司)识别内胚层组织。用抗βIII微管蛋白小鼠单克隆抗体(G7121，Promega公司)识别外胚层组织。用抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(N1584，DAKO公司)识别中胚层组织。在阴性对照中，用具有相同的同种型的IgG阴性对照替代该一抗以确保特异性。TCRβ链重排分析。从SAC以及由来源于CD45阳性细胞的SAC生成的嵌合体小鼠的尾尖提取gDNA。使用如下引物，用50ng的gDNA进行PCR(5'-GCACCTGTGGGGAAGAAACT-3'以及5'-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3')。用1.5％的琼脂糖凝胶对所扩增的DNA进行电泳。嵌合体小鼠的基因分型。从4N嵌合体小鼠的尾尖提取gDNA。使用如下引物进行基因分型。(GFP：F-AGAACTGGGACCACTCCAGTG和R-TTCACCCTCTCCACTGACTGATCT。IL-2：F-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT和R-GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC)。然后确定维持应激改变的Oct4表达细胞的最佳培养条件。检查了多种之前所描述的培养基，该培养基包括：ES建立培养基、3i16和ACTH17、ES培养条件、ES-LIF18、Oct4表达原始神经干细胞培养条件、B27-LIF19以及EpiSC培养条件20。将细胞铺板至各培养基，并计数表达GFP的集落(图16C)。该B27-LIF培养基看起来在生成GFP表达球形集落方面最有效。因此，我们将B27-LIF培养基用于培养经处理的细胞。为了检查由从多种组织中获得的细胞所生成的SAC是否具有不同的分化倾向，从来源于F1GFP小鼠的多种组织生成了SAC，并将它们注射入ICR胚泡中。然后，使用FACS来分析所生成的嵌合体小鼠中的各组织的贡献率。发现，来源于任何组织的SAC有助于嵌合体小鼠生成(数据未示出)。另外，在使用来源于多种组织的SAC所生成的嵌合体小鼠中，分析了对皮肤、脑、肌肉、脂肪、肝和肺的贡献率。来源于任何组织的SAC有助于生成代表全部三种胚层的组织，且未观测到分化倾向(数据未示出)。表4从SAC生成嵌合体小鼠*全部胎儿均在13.5dpc至15.5dpc时收集，并通过FACS检查SAC在各器官中的贡献率。**给SAC在各嵌合体中的贡献打分同样高(>50％的具有GFP表达的毛色)。表5通过嵌合体小鼠的种系传递从SAC生产后代实施例3不希望受理论的束缚，本文所描述的方法预计活化了与凋亡或受控的细胞死亡相关的过程。细胞的轻微损伤可诱导修复基因的活化。细胞的严重损伤可活化之前不明确的存活机制。预计当细胞暴露于显著的应激(诸如本文所描述的应激)时，该细胞组分(例如线粒体、囊泡、核、核糖体、内质网、外泌体、核内体、细胞膜、线粒体、溶酶体、ATP、蛋白质、酶、碳水化合物、脂质等)从受损伤的细胞释放入“cellieu”中。本文所描述的数据表明了，此“cellieu”能够重构和/或促进细胞的存活。还预计，不希望受理论的束缚，线粒体(以及其他细胞器)能够指导细胞的重构。由于小的尺寸、简单性、指导细胞分化的能力以及类似原核的性质，线粒体可在证明对亲代细胞而言致死性的应激下存活。线粒体可从该细胞释放而游离、包裹于膜中和/或结合至其他细胞组分。可替换地，不希望受理论的束缚，该核可保持完整、包裹于细胞膜中，该细胞膜可包含一些线粒体。然后后，这些具有极少的细胞质和极少的细胞器的受损伤的细胞可与已挤出的细胞器相可能融合并互相作用，该受损伤的细胞丧失了对该核的表观遗传的控制。这为细胞提供了生长和复制所必须的亚细胞组分，然而细胞丧失了表观遗传控制，并因此诱导了更原始(例如更加多能)的状态。实施例4：在具有获得多能性的重编程细胞中的胚胎和胎盘谱系的发育潜能一般来说，出生后体细胞的命运被固定且不会发生变化，除非它们经历核转移1,2或者具有关键转录因子的遗传操控3。如本文证明的，本发明的发明人已发现通过亚致死性刺激将体细胞重编程为多能细胞(称为刺激触发性获得多能性(STAP)4)的预料不到的现象。本文还描述了如下证明：重编程的STAP细胞表现出不同于ES细胞的独特的分化能力。如胚泡注射测定法中所看到的，STAP细胞不仅可有助于胚胎组织，而且还可有助于胎盘系统。STAP细胞对于胎盘贡献的效力通过用FGF4进行培养而进一步加强。与此相反，当将STAP细胞在ES细胞维持培养基中培养以进行另外的传代时，STAP细胞(最初显示出受限的自我更新能力)生成了稳健增殖的细胞系，该细胞系表现为ES细胞样的特性而非滋养层样的特性。在四倍体互补测定法5中，这些已改变的STAP细胞(STAP干细胞)生出小鼠，但不再有助于胎盘组织。因此，与iPS细胞不同，STAP细胞可代表与ES细胞的状态不同的新的多能性亚稳状态6。STAP干细胞技术可以是新一代的再生医学提供通用强大的资源。本文所描述的是细胞命运转变的有趣现象：在经历亚致死性刺激(诸如低pH暴露)后，体细胞重新获得多能性4。当脾CD45+细胞(包括定向T细胞)暴露于pH5.730min，并随后在LIF的存在下培养时，在第2天(d2)，大部分存活细胞开始表达多能细胞标志物Oct3/4。到第7天，形成具有真正的多能性标志物谱和三种胚层分化能力的多能细胞团簇(例如，如畸胎瘤形成所示的)。这些STAP细胞还可有效地促成嵌合体小鼠，并在胚泡注射测定法中经历种系传递。虽然这些特征类似于ES细胞，至少在受限的自我更新能力(典型地，最多3-5次传代)和解离培养的脆弱性4方面，STAP细胞看起来与ES细胞不同。在本实施例中，本发明的发明人进一步研究了STAP细胞的独特性质，关注于在胚泡注射测定法后STAP细胞分化为胚泡中的两种主要种类的细胞7-9的潜能：内细胞团类型(或ES细胞样)细胞以及滋养层/胎盘谱系细胞，这显示出预料不到的发现。通常，在嵌合体的胚胎部分中而极少在胎盘部分7(数据未示出)中发现了所注射的ES细胞的后代。出乎预料的是，所注射的STAP细胞不仅有助于胚胎，而且还有助于胎盘和胚外膜(图22)。在约60％的嵌合体胚胎中观察到了此双谱系贡献。该发现推动了对STAP细胞的滋养层分化能力的研究。已知，在FGF4的存在下，可在胚泡的长期粘附培养中得到滋养层细胞系(滋养层干细胞；TS细胞)8,9。当在相同的条件下培养STAP细胞团簇(图23A；在96孔板中每孔一个团簇)时，球形STAP细胞团簇逐渐消失，而不同于STAP细胞的具有扁平外观的细胞长出并在第7天-第10天形成集落(数据未示出)。与具有高水平oct3/4::GFP表达的STAP细胞不同，这些扁平细胞(粘附至板底)在用FGF4进行培养的第7天表现出中等的GFP信号(数据未示出)。免疫染色显示出，除中等水平的oct3/4::GFP外，FGF4所诱导的(F4I)细胞还强烈地表达了该滋养层标志物10-12：整联蛋白α7和脱中胚蛋白(Eomesodermin)(数据未示出)。Nanog的表达可检测到但相当低(数据未示出)。与此一致的是，qPCR分析表明了F4I细胞表达了大量水平的滋养层谱系标志物基因(例如，cdx2)，而它们的oct3/4和nanog的表达低于在亲代STAP细胞中所看到的(图23B)。可以通过每逢第三天用胰蛋白酶消化进行传代而将这些F4I细胞有效地扩增，并且在FGF4的存在下，这些细胞传代超过30次仍然稳定(不存在FGF4时，F4I细胞停止增殖)。虽然在MEF细胞和明胶包被的底部上均可进行该建立和扩增，但在MEF饲养物上培养的那些倾向于显示出更清楚的上皮外观(数据未示出)。在胚泡注射测定法中，经常观察到F4I细胞的胎盘贡献(50％-60％)(数据未示出)。在嵌合体胎盘中，F4I细胞通常有助于总胎盘细胞中的～10％(图23C，第1-3道；注意，对照ES细胞未给出实质的胎盘贡献，第4-6道)。这些发现表明，至少根据滋养层标志物表达和胎盘贡献，STAP细胞具有通过FGF4处理而生成TS样细胞的能力。由于向TS样细胞的这样的衍生对于ES细胞并不常见(除非在遗传上进行操控)11，这样的能力可代表STAP细胞不同于ES细胞的另一特征。在另一方面，来源于STAP细胞的F4I细胞还可具有不同于来源于胚泡的TS细胞的特性。首先，与常规的TS细胞13不同，F4I细胞表达了中等水平的oct3/4(数据未示出)。此外，与TS细胞不同，尽管分布程度通常很低，但是注射入胚泡的F4I细胞还有助于胚胎部分(在涉及嵌合体胎盘的所有情况下)(数据未示出)。总之，这些观察结果表明，关于STAP细胞群的胎盘分化的能力，它们与ES细胞有本质的不同。考虑到这一点，对向胚胎谱系(存在于胚泡中的另一细胞类型)的分化进行了研究。与ES细胞不同，STAP细胞具有受限的自我更新能力，并且不能从单个细胞加以扩增。在传统的含有LIF的培养基(包括用于STAP细胞建立中的B27+LIF培养基)中，STAP细胞不能维持超过5次传代(甚至用团簇的部分解离培养)。然而，含有ACTH并具有LIF的培养基15(ACTH培养基，下文中)对STAP细胞集落的生长速度具有相对良好的支持效果(数据未示出)。当在ACTH培养基中的MEF饲养物或明胶上以此培养基培养时(图24A)，部分STAP细胞团簇(一般在使用96孔板的单个团簇培养中于20％-50％的孔中发现)持续生长(数据未示出)。这些生长的集落与小鼠ES细胞的那些集落类似，并表达了高水平的oct3/4::GFP。与亲代STAP细胞不同，在该培养基中培养7天后，这些扩增的集落中的细胞变得抗解离，并可作为单个细胞进行传代(数据未示出)。与STAP细胞相反，如同ES细胞，这些改变的细胞可在多达至少120天的培养中指数地扩增(图24B)。如多色FISH分析16所示出的，此增强的扩增性并不伴随着染色体异常(数据未示出)。在七天的扩增后，该细胞可在所检测的任何ES细胞培养基中生长和维持，而此最初7天的扩增用ACTH培养基进行最有效(例如，在3i培养基中，集落缓慢地且更不频繁地形成17；数据未示出)。下文中，将来源于STAP细胞的增殖细胞称为STAP干细胞。与STAP细胞不同，在用FGF4的培养中，STAP干细胞不会产生TS样细胞(数据未示出)。通过免疫染色发现，在大部分雌性STAP细胞中发现的X染色体失活18不再在STAP干细胞中观察到(参考文献)(数据未示出)。STAP干细胞表达了ES细胞的多种RNA(图24C)和蛋白质(数据未示出)标志物。在oct3/4和nanog基因座处的DNA甲基化水平(当从CD45+细胞转变为STAP细胞时，变为去甲基化)仍然很低(图24D)。在分化培养中19-21，STAP干细胞生成外胚层、中胚层和内胚层衍生物(数据未示出)。这些发现表明了STAP干细胞表现出与ES细胞的那些不难以区分的特征。与此一致的是，甚至在多次传代后，STAP干细胞能够形成畸胎瘤(数据未示出)，并且通过胚泡注射，有效地促成嵌合体小鼠(数据未示出)。通过在四倍体互补测定法5中这些细胞可生出能够生长成为成体且甚至能够产生后代的事实清楚地显示出了STAP干细胞在其胚胎促成中的显著效力(数据未示出)。考虑到八个独立的STAP干细胞系可重复地显示出此能力(需要注意的是，甚至用常用的ES细胞系时，这样的完全互补通常也是困难的)，我们推断，来自于成体体细胞的STAP细胞能够成为用于衍生多能干细胞系的有吸引力的来源，在此方面相当于(或可能更优于)胚泡本身。重要的是，与STAP和F4I细胞不同，STAP干细胞看起来丧失了其有助于胎盘组织的能力(数据未示出)，而STAP干细胞产生嵌合体中的多种组织(图25A-25B)。因此，STAP细胞和STAP干细胞之间的差别不仅限于自我更新活性，而且还涉及分化为胎盘谱系的能力的丧失。这些发现表明了STAP细胞独特的多能状态。虽然不能从单个细胞克隆STAP细胞(如上文所述)阻碍了在单个细胞水平上的定向分析，值得注意的是，STAP过程可将体细胞转变为具有用于胚胎谱系和胎盘谱系的能力的多能细胞群。深入理解STAP细胞的分化状态是未来研究的重要主题。具体而言，STAP细胞是否如其用于胎盘谱系的能力所表明的，代表了比ES细胞更为成熟的状态(类似于桑椹胚时期的胚胎细胞)，将是令人感兴趣的研究。最近的研究已报告了传统的ES细胞培养物也含有非常少数的具有与非常早期的胚胎22的特征类似的独特性质的Oct3/4-细胞群。STAP细胞可具有容许双重能力的类似亚稳态状态，然而与ES细胞不同，在大多数细胞群中发现了此能力。本文证明了STAP细胞具有转化为ES样多能干细胞系的能力。值得注意的是，STAP细胞(来自雌性小鼠)在X染色体失活方面在一定程度上嵌合；在～40％的STAP细胞中，该失活消失4，而剩余的细胞中保留了该失活。相反地，在ES细胞中，两条X染色体均再现地被活化。有趣的是，在衍生后，如同ES细胞，STAP“干”细胞未显示出X染色体失活，这表明了，在这种意义上，亲代STAP细胞中的表观遗传控制也与小鼠ES细胞相似但不相同。当前的结果表明，在暴露于亚致死性刺激时，定向体细胞对它们自身命运重编程以变为初始细胞的预料不到的“自发转变能力”。这提出了许多有趣且深奥的生物问题(包括上文所描述的问题)。最重要的是，此新发现的STAP现象可对干细胞医学方面的方法学带来革命。预计可以通过控制对在没有基因转移的情况下(基因转移可增高癌症转型的风险)来源于体细胞的STAP细胞或STAP干细胞的分化容许生成多种类型的组织。此外，与iPS细胞转变不同，STAP转变以显著高的频率发生，并通过强刺激(诸如低pH暴露)触发的某些内源程序而进行。如同ES细胞，由于STAP干细胞易于扩增和克隆，所以它们比STAP细胞更适于在严格的质量控制下大规模地生成医疗上有用的组织。在我们的初步研究中，本发明的发明人成功地证明了STAP干细胞有效地分化为视网膜祖细胞23、皮层祖细胞24和跳动的心肌细胞25(数据未示出)。方法细胞培养。通过瞬时暴露于低pH溶液，由CD45+细胞生成STAP细胞，随后在B27+LIF培养基中进行培养(Obokata等人，2013，共同提交)。对于F4I细胞系的建立，将STAP细胞团簇转移至96孔板中的MEF饲养细胞上的含有FGF4的TS培养基。使用传统的胰蛋白酶方法在第7天-第10天期间对这些细胞进行第一次传代。对于STAP干(STAPS)细胞系的建立，将STAP球体转移至MEF饲养物或明胶包被的培养皿上的含有ACTH的培养基。四至七天后，使用传统的胰蛋白酶方法使该细胞经受第一次传代，并将所悬浮的细胞铺板至含有5％的FCS和1％的KSR的ES维持培养基中。嵌合体小鼠生成和分析。对于STAP干细胞、F4I细胞和ES细胞的注射，使用了传统的胚泡注射方法。对于STAP细胞的注射，由于胰蛋白酶处理引起了低的嵌合状态，将STAP细胞团簇全部注射。在显微镜下使用微刀将STAP球形集落切成小块，然后通过大的吸管将STAP集落的小团簇注射入4.5天的胚泡中。次日，将嵌合胚泡转移入2.5天的假孕的雌性中。通过2细胞胚胎的电融合产生了四倍体胚胎。体外和体内的分化测定法：通过将1×105个细胞的STAPS细胞经皮下注射入4周龄NOD/SCID小鼠的背侧部来检查畸胎瘤形成。通过SDIA和SFEBq方法24,26诱导了体外神经分化。通过用生长因子(活化素)或10％的FCS对STAPS细胞聚集体进行培养，诱导了体外的内中胚层分化25。核型分析。通过秋水仙酰胺使分汇合的STAPS细胞停滞在分裂中期，并进行多色FISH分析(M-FISH)。将小鼠染色体特异性涂染探针使用七种不同的荧光染料进行组合标记，并如之前所描述进行杂交(Jentsch等人，2003)。细胞培养。如同所描述的(Obokata等人，2013；共同提交)，从CD45+细胞生成STAP细胞，随后在B27+LIF培养基中培养7天。对于F4I细胞系建立，将STAP细胞团簇转移至96孔板中的MEF饲养细胞上的含有FGF4的TS培养基。使用传统的胰蛋白酶方法，在第7天-第10天期间对细胞进行第一次传代。每逢第三天进行后续的传代。对于STAP干(STAPS)细胞系的建立，将STAP球体转移至MEF饲养细胞上的含有ACTH的培养基。四至七天后，使用传统的胰蛋白酶方法对细胞进行第一次传代，并将所悬浮的细胞铺板至含有5％的FCS和1％的KSR的ES维持培养基中。每逢第二天进行后续的传代。嵌合体小鼠生成和分析。对于二倍体嵌合体和四倍体嵌合体的产生，由与ICR雄性交配的ICR品系雌性获得二倍体胚胎，且由与BDF1雄性交配的BDF1品系雌性产生四倍体胚胎。通过2-细胞胚胎的电融合产生四倍体胚胎。对于STAP干细胞、F4I细胞和ES细胞的注射，使用了传统的胚泡注射方法。对于STAP干细胞、F4I细胞和ES细胞的注射，使用传统的囊胚注射方法。对于STAP细胞的注射，由于胰蛋白酶处理引起了低的嵌合性，所以将STAP细胞团簇全部注射。在显微镜下使用微刀将STAP球形集落切成小块，然后通过大的吸管将STAP集落的小团簇注射入4.5天的胚泡中。次日，将嵌合胚泡转移入2.5天的假孕的雌性中。体外和体内的分化测定法：将1×105个细胞的STAP-S细胞经皮下注射入4周龄NOD/SCID小鼠的背侧部。在六周后收集植入物，并在组织学上进行分析。用10％的甲醛固定该植入物，在石蜡中包埋，并常规地加工成4μm厚。利用苏木精和伊红对切片进行染色。通过SDIA和SFEBq方法诱导了体外神经分化。通过用生长因子(活化素)或10％的FCS对STAPS细胞聚集体进行培养，诱导了体外的内中胚层分化。免疫染色。用4％的PFA将细胞固定15min，并在用0.5％的TritonX-100透化后，用一抗进行培养，该一抗为：抗H3K27me3抗体(Millipore公司；1:300)、抗Oct3/4抗体(SantaCruzBiotechnology公司；1:300)、抗Nanog抗体(eBioscience公司；1:300)、抗KLF2/4抗体(R&DSystem公司；1:300)以及抗Esrrβ抗体(R&DSystem公司；1:300)。过夜培养后，用缀合有Alexa546(MolecularProbes)的二抗使所结合的抗体可视化。用DAPI(MolecularProbes公司)对核进行染色。RNA制备和RT-PCR分析。用RNeasyTMMini试剂盒(QIAGEN公司)分离RNA。用SupeSACriptIII第一链合成试剂盒(Invitrogen公司)进行逆转录。将PowerSYBRTMGreenMix(RocheDiagnostics公司)用于PCR扩增，并将样品在Lightcycler-IITM仪器(RocheDiagnostics公司)上运行。核型分析。通过多色FISH分析(M-FISH)进行核型分析。在37℃下于5％的CO2中，通过培养基中的秋水仙酰胺(终浓度为0.270μg/ml)，使分汇合的STAPS细胞停滞在分裂中期2.5h。用PBS洗涤细胞，用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)进行处理，重悬浮于细胞培养基中并以1200rpm离心5min。向处于3ml的PBS中的细胞沉淀中加入7ml经预热的低渗的0.0375M的KCl溶液。在37℃下将细胞培养20min。将细胞以1200rpm离心5min，并将该沉淀重悬浮于3-5ml0.0375MKCl溶液中。通过温和地吹打，用甲醇/乙酸(3:1，v/v)固定该细胞。在将细胞延展在载玻片上之前，进行四次固定。对于FISH过程，将小鼠染色体特异性涂染探针用七种不同的荧光染料进行组合标记，并如之前所描述进行杂交(Jentsch等人，2003)。对于各细胞系，通过使用配置有SensysCCD相机(Photometrics公司，图森，亚利桑那州)的LeicaDMRXARF8落射荧光显微镜(LeicaMikrosystemeGmbH公司，本斯海姆(Bensheim)，德国)，获取了9-15个分裂中期的延展。通过LeicaQ-FISH软件(LeicaMicrosystemshangingsolutions公司，剑桥，英国)对相机和显微镜进行控制。将分裂中期的延展基于LeicaMCK软件进行处理，并作为多色核型图示出。亚硫酸氢盐测序。从STAPS细胞提取基因组DNA。按照制造商的说明，使用CpGenomeDNAModification试剂盒(Chemicon公司，特曼库拉，加利福尼亚州0，http://www.chemicon.com)对DNA进行亚硫酸氢盐处理。使用两条正向引物(F)和一条反向引物(R)通过巢式聚合酶链式反应PCR对所得到的经修饰的DNA进行扩增：oct3/4(F1，GTTGTTTTGTTTTGGTTTTGGATAT(SEQIDNO：73)；F2，ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA(SEQIDNO：74)；R，CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC(SEQIDNO：75))。以及nanog(F1，GAGGATGTTTTTTAAGTTTTTTTT(SEQIDNO：76)；F2，AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT(SEQIDNO：77)；R，CCCACACTCATATCAATATAATAAC(SEQIDNO：78))。使用TaKaRaExTaqHotStartVersion(RR030A)进行PCR。使用M13引物在TheGenomeResourceandAnalysisUnit(基因组资源和分析单元)(RIKENCDB)进行DNA测序。参考文献1.Gurdon,JB.Thedevelopmentalcapacityofnucleitakenfromintestinalepitheliumcellsoffeedingtadpoles.JEmbryolExpMorphol.10,622-640(1962)2.Wakayama,T.,Perry,A.C,Zuccotti,M.,Johnson,K.R.&Yanagimachi,R.Full-termdevelopmentofmicefromenucleatedoocytesinjectedwithcumuluscellnuclei.Nature394,369-374(1998).3.Takahashi,K.&Yamanaka,S.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell126,663-676(2006).4.Obokataetal,Stimulus-TriggeredFateConversionofSomaticCellsintoPluripotency.Co-submittedtothismanuscript.5.Nagy,A.,Rossant,J.,Nagy,R.,Abramow-Newerly,W.&Roder,J.C.Derivationofcompletelycellculture-derivedmicefromearly-passageembryonicstemcells.ProcNationAcadSciUSA90,8424-8428(1993).6.Ohgushi,M.andSasai,Y.Lonelydeathdanceofhumanpluripotentstemcells:ROCKingbetweenmetastablecellstates.TrendsinCellBiology21,274-282(2011).7.Niwa,H.Howispluripotencydeterminedandmaintained？Development134,635-646(2007)8.QuinnJ,KunathT,RossantJ.Mousetrophoblaststemcells.MethodsMolMed.121,125-148(2006).9.RossantJ.Stemcellsandlineagedevelopmentinthemammalianblastocyst.ReprodFertilDev.19,111-8(2007)10.TanakaTS,KunathT,KimberWL,JaradatSA,StaggCA,UsudaM,YokotaT,NiwaH,RossantJ,KoMS.Geneexpressionprofilingofembryo-derivedstemcellsrevealscandidategenesassociatedwithpluripotencyandlineagespecificity.GenomeRes.Yl,1921-1928(2002)11.KlaffkyE,WilliamsR,YaoCC,ZioberB,KramerR,SutherlandA.Trophoblast-specificexpressionandfunctionoftheintegrinalpha7subunitintheperi-implantationmouseembryo.DevBiol.239,161-175(2001).12.RussAP,WattlerS,ColledgeWH,AparicioSA,CarltonMB,PearceJJ,BartonSC,SuraniMA,RyanK,NehlsMC,WilsonV,EvansMJ.Eomesoderminisrequiredformousetrophoblastdevelopmentandmesodermformation.Nature404,95-99(2000).13.NiwaH,ToyookaY,ShimosatoD,StrumpfD,TakahashiK,YagiR,RossantJ.InteractionbetweenOct3/4andCdx2determinestrophectodermdifferentiation.Cell123,917-929(2005)14.ToyookaY,ShimosatoD,MurakamiK,TakahashiK,NiwaH.IdentificationandcharacterizationofsubpopulationsinundifferentiatedEScellculture.Development135,909-918(2008).15.Ogawa,K.,Matsui,FL,Ohtsuka,S.&Niwa,H.AnovelmechanismforregulatingclonalpropagationofmouseEScells.Genestocells9,471-477(2004).16.JentschI,GeiglJ,KleinCA,SpeicherMR.Seven-fluorochromemouseM-FISHforhigh-resolutionanalysisofinterchromosomalrearrangements.CytogenetGenomeRes.103,84-88(2003),17.Ying,Q.L.etal.Thegroundstateofembryonicstemcellself-renewal.Nature453,519-523(2008).18.MurakamiK,ArakiK,OhtsukaS,WakayamaT,NiwaH.ChoiceofrandomratherthanimprintedXinactivationinfemaleembryonicstemcell-derivedextra-embryoniccells.Development138,197-202(2011).19.Watanabe,K.,Kamiya,D.,Nishiyama,A.,Katayama,T.,Nozaki,S.,Kawasaki,H.,Mizuseki,K.,Watanabe,Y.,andSasai,Y.(2005)Directeddifferentiationoftelencephalicprecursorsfromembryonicstemcells.NatureNeurosci.8,288-29620.Kawasaki,H.,Mizuseki,K.,Nishikawa,S.,Kaneko,S.,Kuwana,Y.,Nakanishi,S.,Nishikawa,S.-I.andSasai,Y.(2000)InductionofmidbraindopaminergicneuronsfromEScellsbyStromalCell-DerivedInducingActivity.Neuron28,31-40.21.Gouon-EvansV,BoussemartL,GadueP,NierhoffD,KoehlerCI,KuboA,ShafritzDA,KellerG.(2006)BMP-4isrequiredforhepaticspecificationofmouseembryonicstemcell-deriveddefinitiveendoderm.NatBiotechnol.24,1402-1411.22.MacfarlanTS,GiffordWD,DriscollS,LettieriK,RoweHM,BonanomiD,FirthA,SingerO,TronoD,PfaffSL.Embryonicstemcellpotencyfluctuateswithendogenousretrovirusactivity.Nature487,57-63(2012).23.Eiraku,M.,Takata,N.,Ishibashi,H.,Kawada,M.,Sakakura,E.,Okuda,S.,Sekiguchi,K.,Adachi,T.andSasai,Y.(2011)Self-organizingoptic-cupmorphogenesisinthree-dimensionalculture.NatureAll,51-56.24.Eiraku,M,Watanabe,K.,Matsuo-Takasaki,M.,Kawada,M.,Yonemura,S.,Matsumura,M.,Wataya,T.,Nishiyama,A.,Muguruma,K.andSasai,Y.(2008)Self-OrganizedFormationofPolarizedCorticalTissuesfromEScellsanditsActiveManipulationbyExtrinsicSignals.CellStemCell3,519-53225.BohelerKR,CzyzJ,TweedieD,YangHT,AnisimovSV,WobusAM.Differentiationofpluripotentembryonicstemcellsintocardiomyocytes.CircRes.91,189-201(2002).26.Kawasaki,H.,Mizuseki,K.,Nishikawa,S.,Kaneko,S.,Kuwana,Y.,Nakanishi,S.,Nishikawa,S.-I.andSasai,Y.InductionofmidbraindopaminergicneuronsfromEScellsbyStromalCell-DerivedInducingActivity.Neuron28,31-40(2000)表6：从STAP建立多能细胞系*各孔含有1-4块的STAP表7：通过四倍体互补方法从FLS细胞系产生STAPS小鼠*由于缺少足够数量的养母，将后代混在一起并由相同的母亲养育表8：使用二倍体胚胎从FLS细胞系产生嵌合体小鼠表9：细胞特性实施例5：从成熟体细胞生成STAP细胞的方案本文所描述的是生成STAP细胞的改进方案，与正在研究的细胞类型无关。下面的方案是在我们的2014年01月31日的Nature中所出版的文章(Obokata等人,Stimulustriggeredfateconversionofsomaticcellsintopluripotency.Nature505.641-647,2014)中所描述的方法上改进的，并提供了例如提高的效率和产量。该方案是非常简单的，但如果以组织而非细胞悬浮液开始则将略有变化。该方案还将根据用作起始物料的细胞类型或组织而变化。在一些实施方式中，不跳过任何步骤。在一些实施方式中，将细胞悬浮液研磨最少30分钟，直到该悬浮液可容易地在最小洞口的缩径吸管上下被研磨。首先以细胞的悬浮液开始来描述该方案，然后以软组织开始来描述必要的额外步骤。当以成熟的体细胞开始时生成了STAP细胞：A1.应将活的体细胞悬浮于离心管中，并然后以1200rpm离心5分钟。注意：可将0.05％的胰蛋白酶-EDTA(Gibco：25300-054)加入至含有细胞的组织培养皿中持续3-5分钟以释放待加入离心管的贴壁细胞。A2.吸出该上清液至细胞沉淀。A3.在50ml管中以1×106个细胞/ml的浓度在Hanks平衡盐溶液(无Ca+Mg+的HBSS：Gibco14170-112)中重悬浮所得的沉淀。例如，可在50mL管中将该沉淀重悬浮于2-3mL的HBSS中。A4.用培养基预涂覆标准9”玻璃吸管(这样该细胞不粘附于该吸管-示例性吸管是Fisher牌9”一次性巴斯德吸管：13-678-20D)。在吸管中和吸管外将该细胞悬浮液研磨5分钟以解离细胞聚集体和任何相关的碎片。这可以用相当量的力来完成。A5.作为该研磨过程中的最后步骤，按如下制造具有非常小的洞口的两个火抛光的吸管：在煤气灯上方加热该标准9”玻璃吸管，然后拉伸该吸管的(熔化的)远端直到该管腔合拢(倒塌，collapse)以及该尖端脱落，留下封闭的尖头玻璃尖端。等待直到该吸管冷却，并然后折断该封闭的远端直到现在认为是非常小的管腔。对第二个吸管重复此过程，但更近一点地折断该前端，产生了稍微更大的远端管腔。该更大的管腔的直径应为约100-150微米，而另一吸管应具有约50-70微米的更小的管腔。现在通过具有更大的管腔的吸管将该细胞悬浮液研磨10分钟。这之后通过具有更小的管腔(50-70微米)的吸管研磨额外的15分钟。继续研磨该悬浮液直到其容易地向上和向下经过更小口径的火抛光的吸管。用培养基预涂覆每个吸管。另外，在研磨期间，要避免在该细胞悬浮液中吸入空气以及产生气泡或泡沫。A6.向该悬浮液中加入HSBB至总体积20ml，以1200rpm离心5分钟，然后吸出该上清液。A7.以2×106个细胞/ml的细胞浓度将细胞重悬浮在pH为5.4的HBSS中，然后在37℃的培养箱中放置25分钟。HBSS的pH值随着细胞悬浮液的加入增加，因此可使用比5.6的所需最终pH低的HBSS溶液。当使该溶液呈酸性时，在将该酸加入Hanks溶液之后立即使用5ml吸管温和地吹打10秒。HBSS具有非常弱的缓冲能力，所以从之前的悬浮液的上清液所转移的任何溶液将严重影响该HBSS的pH值。下面的说明将显示出如何产生具有用于根据此实验实施方式对于STAP细胞生成的最适pH5.6-5.7的HBSS。首先，用12N的HCl滴定预冷的HBSS(在4摄氏度)的pH值至pH5.6。这是通过将11.6μl12N的HCl加入至50ml的HBSS来完成。确认此pH后，通过经0.2微米针筒过滤器或瓶顶过滤器过滤使该溶液无菌化，进入用于存储的新无菌容器。确定通过具有适当数量的细胞的最初检测实验最终pH值为5.6-5.7。因为该HBSS的pH是如此重要，所以在每次使用前应检查该溶液的pH值、重滴定和重灭菌。A8.在酸浴中25分钟后，该悬浮液以1200rpm离心5分钟。A9.吸出上清液并在5ml的本文称为“球体培养基”(具有1％的抗生素和2％的B27Gibco12587-010的DMEM/F12)中重悬浮该所得的沉淀，并在如下补充剂的存在下以105个细胞/cc的浓度置于非粘附组织培养皿中：b-FGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、肝素(0.2％，StemCellTechnologies(干细胞技术)07980)。如果该细胞是鼠科的，则应加入LIF(1000U)。在一些实施方式中，补充剂(诸如bFGF、EGF和肝素)可能不是必要的。将该细胞置于组织培养皿中之后，使用5ml吸管可温和地吹打细胞，对于第一周两次/天持续2分钟以阻止该细胞附着于该皿的底部。在一些实施方式中，这可以促进良好的球体形成。每隔一天添加含有本文所描述的补充剂的球体培养基。(加入1ml/天至10cm的培养皿或0.5ml/天至6cm的培养皿)B.当以含有许多RBC的软组织开始时生成STAP细胞。B1.将切除的已清洗的无菌器官组织置于含有50μl胶原酶的60mm皮氏培养皿中。(该脾可不需要被暴露于任何消化酶)。本文中预计不同类型的胶原酶或酶对于不同器官组织的消化是更好的。B2.使用解剖刀和/或剪刀将组织切碎和刮约10分钟以增加暴露于胶原酶的表面积，直到该组织似乎变为一致性凝胶状。B3.向该皿中加入额外的450μl的胶原酶，并置于37℃下的培养箱/摇床中以90RPM持续30分钟。B4.向该皿中加入1.5mlHBSS(产生2.0ml的总体积)，然后通过5ml吸管吸出全部内容物，并置于50ml管中。B5.现在当以成熟的体细胞开始时如之前上文所描述(步骤A4-5)的进行研磨。B6.(当使用成熟的体细胞的培养皿时通过步骤A5)完成研磨后，向15ml管中加入3ml的HBSS(得到5ml的体积)，然后缓慢加入5ml的淋巴溶解素至该管的底部以产生良好的双层。在一些实施方式中，应避免这两种溶液的混合。B7.将该管以1000g离心10分钟。将该管旋转180°并以1000g重离心额外的10分钟。这将导致红细胞在该管的底部形成沉淀。B8.使用标准9”玻璃吸管吸出HBSS和淋巴溶解素之间的细胞悬浮液层，并置于新的50ml管中。B9.向悬浮液中加入HSBB至达到总体积20ml的HBSS，然后通过经5ml吸管吹打1分钟来彻底地混合该悬浮液。B10.将该溶液以1200rpm离心5分钟，并吸出该上清液。B11.对于接下来的步骤，参见如本实施例中所描述的A7-9。实施例6：由于大鼠脊髓中NK-1表达神经元的化学切除而减少的标准痛觉过敏反应的通过成体STAP干细胞的修复。脊髓损伤呈现具有经常慢性神经感觉异常(包括麻木、感觉异常和疼痛)的复合体。并通过由这些创伤性损伤引起的广泛的病理变化使得理解基于这些任一项的机制和研发有效的治疗剂复杂化。本文中描述了脊髓中非常特异性的细胞学损伤，以产生有限但明确的感觉缺陷，然后通过植入经应激的成体干细胞(由刺激触发性获得多能性(STAP)所改变的)已逆转该缺陷。为了切除大部分的神经激肽-1受体(NKlR)-表达神经元，将高度特异性的细胞毒素SSP-SAP(20μl，1μM)注射到雄性大鼠脊髓的鞘内(i.t.)空间中。2到3周后，对在足底后爪中辣椒素(10μL，0.1％)的注射的常健壮痛觉过敏反应(由通过冯-弗雷(vonFrey)长丝的刺激的机械性痛觉过敏和作为对辐射热源撤回的延迟性的缩短而出现的热痛觉过敏组成)几乎消失。后续的作为单个细胞的悬浮液或作为细胞的球形聚集体的该STAP干细胞的鞘内(i.t.)注射，导致在接下来的1-2周缓慢恢复由辣椒素所引起的机械痛觉过敏和热痛觉过敏。已修复的反应具有与天然的、预切除的反应相同的幅度和时间进程，并完全通过NK-1R拮抗剂L-733,060(以300μM)的鞘内(i.t.)注射来抑制。来自具有已修复的痛觉过敏功能的大鼠的腰部脊髓的免疫细胞化学显示了整个后角(dorsalhorn)的NK-1R染色。因此看起来，在具体的脊柱的神经元丢失后STAP干细胞可修复正常功能，并呈现用于对脊髓损伤的治疗方法的模式。首先将成年雄性S-D大鼠处理4-5天，以使它们熟悉测试场地，以最小化应激所诱导的痛觉缺失和获得原始的和初始的基本行为数据。通过用15g冯-弗雷长丝(VFH)每3秒10次刺探一个后爪的趾面来测定触觉反应。在无治疗和无辣椒素的情况下，基线敏感性相当于每10次刺探～1-2次爪撤回。通过爪从辐射热源撤回的延迟性来指示热敏度(Hargreaves方法：截止时间设定为18秒)。基线延迟性～16秒。任何鞘内注射之前，测定了原始大鼠对辣椒素注射入后爪的反应为：触觉：6次撤回/10次VFH刺探以及热：6秒延迟。经骶骨方法使用30g针头并递送消除了大部分的NK1-R表达脊髓神经元(Mantyh等人，)的SSP-SAP(经改性的物质P-皂草素缀合物)或其失活的同类物Blank-SAP(空白-SAP)(与皂草素缀合的无意义肽)来进行鞘内注射。数周之后，当急性高反应由于辣椒素已在SSP-SAP所处理的动物(但不是Blank-SAP所处理的动物)中完全被破坏时，将刺激触发性获得多能性(STAP)干细胞(参见图26)注射入已注射SAP缀合物的腰部脊髓的同一区域。辣椒素注射后对触觉和热刺激的反应跟随另外5周，在此期间用戊巴比妥(i.p.(腹腔注射)75mg/kg)将大鼠麻醉并用冷盐水然后用4％的多聚甲醛进行心脏灌注。将脊髓以50μm厚度切片，并用抗NK1-R一抗和抗神经元一抗[在具有1％的NDS和0.3％的TritonX-100的PBS中溶解的兔抗NK-1R(批号011M4819，Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)1:5000(2.3μg/ml)和小鼠抗NeuN(批号LV1825845，MilliporeBillerica公司，MA)1:500(2μg/ml)]染色，然后充分洗涤，并在荧光显微镜中观看前在相关的2种抗体[驴抗兔AlexaFluor555(批号819572)和驴抗小鼠AlexaFluor488(批号1113537)(Invitrogen公司，格兰德岛，纽约，美国)，二者都是1:1000(2μg/ml)并用PBS中的1％的NDS和0.3％的TritonX-100溶解]中培养。对来自各实验组(n＝3/组)的浅(I和II)层和深(III-V)层的每组织切片的NK-1和Neu-N免疫阳性细胞体的总数进行计数。结果表示为在有或没有干细胞治疗的情况下接受SSP-SAP(或载体)的大鼠中在浅层和深层中的存活神经元的平均百分比。在用鞘内SSP-SAP所处理的大鼠中，由辣椒素注射后爪撤回阈值中的下降所指示的机械性痛觉过敏降低(图27)。植入脊髓干细胞五周后，该辣椒素所诱导的痛觉过敏恢复。干细胞植入恢复SSP-SAP处理的大鼠的痛觉过敏反应至原始大鼠的痛觉过敏反应和Blank-SAP处理的对照的痛觉过敏反应(图28)。在其中通过干细胞植入已恢复了辣椒素敏感性的大鼠中，该NK1-R的特异性拮抗剂的效力增加(图29)。SSP-SAP在切除脊髓中NKlR表达神经元方面是高效的，并且正是如此，实际上取消了对所注射入后爪的辣椒素的初期痛觉过敏反应。STAP干细胞的递送恢复了SSP-SAP所处理的大鼠中对辣椒素的“正常”痛觉过敏的触觉反应和热反应。在经历了痛觉过敏反应方面无变化的大鼠中，由于Blank-SAP的注射，STAP干细胞的递送在对辣椒素的反应方面没有影响。通过STAP干细胞将痛觉过敏应答归一化伴随着脊髓中NK1R-IR的恢复。在STAP干细胞所恢复的大鼠中用于抑制辣椒素痛觉过敏的NK1R的拮抗剂的效力相对于其在原始大鼠中或在接受Blank-SAP的大鼠中的效力被加强了10-60倍。不希望受理论的束缚，预计这可能会从在用于由STAP干细胞所诱导的NK1R的拮抗剂的亲和性方面或在已恢复的大鼠中NK1R接入痛觉过敏应答的总体方案的差异方面的变化被发现。实施例7：本文描述了是具有在从成熟体细胞(不取决于细胞的来源)产生多能STAP干细胞方面的改进结果的方案。该方案已被修订以反映已改进的技术。此方案利用了单独的应激和在实现所需的最终结果(即，多能STAP细胞的产生)方面更有效的方法的结合。不希望受到理论的束缚，本文中预计在本文所描述的一些方案中利用ATP作为能源以改善所产生的细胞和球体的生存力。ATP的加入导致了更好的球体形成并与成熟细胞所暴露于的溶液的pH的明显减小相关。在生成STAP细胞中含有ATP的低pH溶液的效用的进一步考察表明，虽然pH独自导致了STAP细胞的生成，但是含有ATP的低pH溶液的使用显著地增加了这种转化的效力。当此溶液与成熟细胞的机械研磨结合使用时，结果甚至更为深刻。因此，本文描述了合并这些发现以增加生成STAP细胞的效力的方案。所描述的方案对于生成STAP细胞是有效的，而与正在研究的细胞类型无关。在一些实施方式中，该成熟细胞悬浮液的研磨在低pH、ATP已增强的溶液中进行最少30分钟，例如，直到该悬浮液可容易地在最小洞口的缩径吸管上下被研磨。首先描述的是当以细胞的悬浮液开始时使用的方案，然后描述了当以软组织开始时的必要额外步骤。A.当以成熟的体细胞开始时生成了STAP细胞：A1.按如下制备含有ACT的低pH的HBSS溶液，然后在步骤A4中预留使用。通过向各1mL的水(MilliQ水)中加入110.22mg的ATP粉(腺苷5'三磷酸二钠盐水合物(Adenosine5'TriphosphateDisodiumSaltHydrate)-Sigma公司A2383)来制备ATP的原液(200nM)，以加入HBSS中。该溶液的pH为约3.0。将5mL的HBSS(具有酚红)[LifeTechnologies公司，14170-161]置于15mL的管中。将干净的pH传感器置于HBSS中。在该ACT原液滴定，一滴一滴滴入HBSS中直到获得所需的pH(例如，5.0)。规律地混合该溶液以确保测量是准确的。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为约0.5mg/cc至约100mg/cc。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为约0.5mg/cc至约20mg/cc。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为约0.5mg/cc至约10mg/cc。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为约1.0mg/cc至约7mg/cc。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为约1.5mg/cc至约5mg/cc。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为约1mM至约150mM。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为约1mM至约50mM。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为约1mM至约15mM。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为约2.0mM至约10mM。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为约2.7mM至约9mM。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为至少约0.5mg/cc。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为至少约1.0mg/cc。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为至少约1.5mg/cc。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为至少约1mM。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为至少约2.0mM。在一些实施方式中，所得的HBSS和ATP的溶液中的ATP的浓度为至少约2.7mM。在一些实施方式中，ATP的较高浓度可以通过缓冲处于和/或约所需pH的溶液来实现。在一些实施方式中，所需pH为至少5.0。在一些实施方式中，所需pH为至少约5.0。在一些实施方式中，所需pH为约5.0。在一些实施方式中，所需pH为约4.0至约6.5。在一些实施方式中，所需pH为约5.0至约5.7。A2.向离心管中加入作为细胞悬浮液的待处理的活体细胞，然后以1200rpm离心5分钟。在一些实施方式中，可向含有细胞的组织培养皿中加入0.05％的((Gibco：25300-054)，持续3-5分钟以释放待加入至离心管的贴壁细胞。A3.吸出该上清液下至该细胞沉淀A4.将所得沉淀以1×106个细胞/ml的浓度重悬浮在50ml管中的具有ATP的低pH的Hanks平衡盐溶液(在上文步骤1A中制备的)中。在一些实施方式中，可使用在50ml管中2-3ml体积的细胞悬浮液。A5.用培养基预涂覆标准9”玻璃吸管(因此细胞不粘附于吸管-例如，Fisher牌9”一次性巴斯德吸管：13-678-20D)。在吸管中和吸管外将细胞悬浮液研磨5分钟，以解离细胞聚集体和任何相关的碎片。这可以用相当量的力来完成。A6.作为该研磨过程中的最后步骤，按如下制造具有非常小的口的两个火抛光的吸管：在煤气灯上方加热该标准9”玻璃吸管并然后拉伸该吸管的(熔化的)远端直到该管腔合拢以及该尖端脱落，留下封闭的尖头玻璃尖端。等待直到该吸管冷却，然后折断该封闭的远端直到现在认为是非常小的管腔。对第二个吸管重复此过程，但更近一点地折断该尖端，产生了稍微更大的远端管腔。该更大的管腔的直径应为约100-150微米，而另一吸管应具有约50-70微米的更小的管腔。现在通过具有更大的管腔的吸管可将该细胞悬浮液研磨10分钟。这之后通过具有更小的管腔(50-70微米)的吸管研磨额外的15分钟。继续研磨该悬浮液直到其容易地向上和向下经过更小口径的火抛光的吸管。再次，记得用培养基预涂覆每个吸管。另外，在研磨期间，要避免在该细胞悬浮液中吸入空气以及产生气泡或泡沫。A7.向该悬浮液中加入标准HBSS(不含有ATP)至20ml的总体积，以1200rpm离心5分钟，然后吸出该上清液。A8.将所得沉淀重悬浮在5ml我们称为“球体培养基”(具有1％的抗生素和2％的B27Gibco12587-010的DMEM/F12)中，并在如下补充剂的存在下以105个细胞/ml的浓度置于非粘附组织培养皿中：b-FGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、肝素(0.2％，StemCellTechnologies(干细胞技术)07980)。如果该细胞是鼠科的，则应加入LIF(1000U)。在一些实施方式中，补充剂(诸如bFGF、EGF和肝素)可能不是必要的。将该细胞置于组织培养皿中之后，应使用5ml吸管温和地吹打细胞，对于第一周两次/天，持续2分钟以阻止该细胞附着于该皿的底部。这对生成良好的球体形成是重要的。每隔一天添加含有该补充剂的球体培养基。(加入1ml/天至10cm的培养皿或0.5ml/天至6cm的培养皿)B.以含有许多RBC的软组织开始时生成STAP细胞。B1.将切除的已清洗的无菌器官组织置于含有50-500μl胶原酶(这取决于该组织的大小)的60mm皮氏培养皿中。加入足够体积的胶原酶以润湿整个组织。不同类型的胶原酶或其他酶对于不同器官组织的消化是更好的。(脾可能不需要被暴露于任何消化酶)。B2.使用解剖刀和/或剪刀将组织切碎和刮约10分钟以增加暴露于胶原酶的表面积，直到该组织似乎变为一致性凝胶状。特别地，本文中预计在该方法的实施方式(或本文所描述的该方法的任何实施方式)中，该组织的刮可用边缘平坦的刀刃和/或表面(例如，11号手术刀)而不是弯曲的外科刀片来进行。可替换地，在本文所描述的任何实施方式中，为了破坏该组织，高频声波的应用可以取代和/或结合(同时地或依次地)刮。高频声波可以例如，破坏细胞膜，在组织和/或膜中穿孔，和/或引起膜泄漏。高频声波还适合按比例增加。本领域中的技术人员之一熟知用于施加高频声波于组织的方法，例如可商购近距离声波定位器(例如QsonicaQ55近距离声波定位器(Sonicator)，产品编号UX-04712-52，可从伊利诺伊州弗农希尔斯(VernonHills)的Cole-Palmer公司得到)。B3.加入额外的胶原酶至该皿以使总体积＝0.5ml，并置于37℃下的培养箱/摇床中以90rpm持续30分钟。B4.向该皿中加入1.5ml低pH的全部内容物，并置于50ml管中。B5.现在当以成熟的体细胞开始时如之前上文所描述(步骤A4-5)的进行研磨。B6.(当使用成熟的体细胞的培养皿时通过步骤A5)完成研磨后，向15ml管中加入3ml的HBSS(得到5ml的体积)，然后缓慢加入5ml的淋巴溶解素至该管的底部以产生良好的双层。应如所描述的加入该溶液以产生双层并避免这两种溶液的混合。B7.将该管以1000g离心10分钟。将该管旋转180°并以1000g重离心额外的10分钟。这将导致红细胞在该管的底部形成沉淀。B8.使用标准9”玻璃吸管吸出HBSS和淋巴溶解素之间的细胞悬浮液层，并置于新的50ml管中。B9.向悬浮液中加入HSBB至达到总体积20ml的HBSS，然后通过经5ml吸管吹打1分钟来彻底地混合该悬浮液。B10.将该溶液以1200rpm离心5分钟，并吸出该上清液。B11.对于接下来的步骤，参见A6-8。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3