本发明涉及生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物和使用该微生物生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法。
背景技术：
O-琥珀酰高丝氨酸是通过在生物合成途径中琥珀酰-CoA的琥珀酰基和高丝氨酸的结合产生的。因此，在开发以高产率生产O-琥珀酰高丝氨酸的菌株中，高丝氨酸和琥珀酰CoA的产生是重要的。在它们中，在TCA循环中产生琥珀酰CoA，因此为了生成高浓度的琥珀酰CoA需要增强TCA循环。
戊糖磷酸途径(PPP)作为NADPH的主要来源是众所周知的，并且氨基酸的生物合成途径需要辅因子NADPH。因此，在产生氨基酸的菌株开发中为了增强戊糖磷酸途径，通常增强编码参与途径的第一步的葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶的zwf基因，并且这些菌株公开于韩国专利公开号2008-0036608和2006-0129352。
当zwf基因的表达或由其编码的酶的活性减弱时，戊糖磷酸途径减弱，导致缺乏NADPH供应。在这种情况下，NADPH可以通过TCA循环的异柠檬酸脱氢酶(icd)和苹果酸脱氢酶(mae)的过表达而部分补充(Appl Microbiol Biotechnol.2004 64(1)；91-8，Metab Eng.2004 6(2)；164-74，FEBS Letters 581 2007 3771-6)。
本发明人已经研究开发了能够以高产率和高效率生产O-琥珀酰高丝氨酸的菌株，并且他们开发了菌株，其中zwf基因被减弱和缺失，目的是在具有O-琥珀酰高丝氨酸生产能力的大肠杆菌(E.coli)中产生高浓度的琥珀酰CoA作为O-琥珀酰高丝氨酸的前体。作为培养的结果，本发明人发现O-琥珀酰高丝氨酸浓度增加，从而完成了本发明。
发明详述
技术问题
本发明的目的是提供产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物。
本发明的另一个目的是提供生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，该方法包括培养产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物的步骤。
技术方案
在一个方面中，本发明提供了产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物。
在本发明的一个具体的实施方案中，产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物可以是具有O-琥珀酰高丝氨酸生产能力的微生物，其中葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶活性与其内源活性相比被减弱或去除。
如本文中所用，术语“产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物”是指能够在生物体中产生O-琥珀酰高丝氨酸并积累O-琥珀酰高丝氨酸的原核或真核微生物。例如，产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物可以是属于埃希氏菌属物种(Escherichia sp.)，欧文氏菌属物种(Erwinia sp.)，沙雷氏菌属物种(Serratia sp.)，普罗威登斯菌属物种(Providencia sp.)，棒状杆菌属物种(Corynebacteria sp.)，假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)，钩端螺旋体属物种(Leptospira sp.)，沙门氏菌属物种(Salmonellar sp.)，短杆菌属物种(Brevibacteria sp.)，生丝单胞菌属物种(Hyphomonas sp.)，色杆菌属物种(Chromobacterium sp.)，诺卡氏菌属物种(Norcardia sp.)或真菌或酵母。具体地，产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物可以是属于埃希杆菌属物种的微生物，更具体地，是大肠杆菌。
葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶在戊糖磷酸途径中起作用，所述戊糖磷酸途径是通过维持NADPH水平为细胞提供还原能力的代谢途径。此酶通过在戊糖磷酸途径的第一步骤中将NADP还原成NADPH来催化葡萄糖6-磷酸氧化成6-磷酸葡糖酸内酯(6-phosphogluconolactone)。编码此酶的基因通常称为zwf。此酶的减弱或除去导致通过TCA循环的流动，导致TCA循环的增强。
葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶可以具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。此外，葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶可以具有与SEQ ID NO:23 80％或更高，90％或更高，或95％或更高的同源性。
如本文中关于序列使用的，术语“同源性”是指与给定的氨基酸序列或碱基序列的匹配程度，并且同源性可以表示为百分比。在本发明中，具有与给定的氨基酸序列或碱基序列相同或相似的活性的同源序列表示为“％同源性”。例如，与SEQ ID NO:23具有80％或更高，90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列代表具有葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶活性的序列。
如本文中所用，术语“内源”酶和活性是指天然存在于微生物或细胞中的天然酶及其活性，换言之，指在修饰相应酶及其活性之前的酶及其活性。
在本发明的一个具体实施方案中，微生物可以是具有O-琥珀酰高丝氨酸生产能力的微生物，其中另外，胱硫醚γ合酶和高丝氨酸激酶中的一种或多种的活性与其内源活性相比被减弱或除去。具体地，微生物可以是具有O-琥珀酰高丝氨酸生产能力的微生物，其中胱硫醚γ合酶和高丝氨酸激酶两者的活性与其内源活性相比被减弱或除去。
胱硫醚γ合酶具有将O-琥珀酰高丝氨酸转化为胱硫醚的活性。胱硫醚γ合酶由metB基因编码。当该酶的活性被减弱或除去时，O-琥珀酰高丝氨酸可能被积累而不转化为胱硫醚(cystathionine)。
高丝氨酸激酶催化从高丝氨酸合成O-磷酸高丝氨酸，并由thrB基因编码。当该酶的活性被减弱或除去时，高丝氨酸可以不被转化为O-磷酸高丝氨酸，并且可以用于O-琥珀酰高丝氨酸的生产。
在本发明的一个具体实施方案中，胱硫醚γ合酶可以具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且高丝氨酸激酶可以具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列。此外，胱硫醚γ合酶和高丝氨酸激酶可以具有分别与SEQ ID NO:24和25具有80％或更高，90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。
如本文中所用，酶活性的术语“减弱”或“除去”是指与内源活性相比，编码相应酶或酶活性的基因的表达降低，或根本不存在，并且可以通过缺失，取代或插入或通过其组合修饰编码相应酶的基因的全部或部分碱基序列或基因的表达调节序列的全部或部分而引起。
如本文中所用，术语“表达调节序列”是调节基因表达的碱基序列，并且是指能够增加或减少对象中特定基因表达的区段，并且可以包括启动子，转录因子结合位点等，但不限于此。
在本发明的一个具体实施方案中，微生物可以是具有O-琥珀酰高丝氨酸生产能力的微生物，其中另外，高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性与其内源活性相比被增强。
高丝氨酸O-琥珀酰转移酶是催化从琥珀酰-CoA和高丝氨酸产生O-琥珀酰高丝氨酸的酶，并且参与甲硫氨酸生物合成途径的第一步。编码该酶的基因通常称为metA，并且其表达受甲硫氨酸的反馈调节抑制。因此，可以使用通过除去甲硫氨酸的反馈调节来高水平表达该基因的突变体。
在本发明的一个具体实施方案中，高丝氨酸O-琥珀酰转移酶可以具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列。此外，高丝氨酸O-琥珀酰转移酶可以具有与SEQ ID NO:26具有80％或更高，90％或更高的氨基酸序列，或95％或更高同源性的氨基酸序列。同时，除去由甲硫氨酸进行反馈调节的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶可以具有与SEQ ID NO:27(metA11:韩国专利公开号2009-0106365)具有80％或更高，90％或更高，或95％或更高的同源性的氨基酸序列。
如本文中所用，术语酶促活性的“增强”是指与其修饰前的活性相比，相应酶的活性得到改善。具体地，酶促活性与其内源活性相比，通过编码相应酶的基因的过表达而增加，或通过基因的突变，基因编码的酶的活性与其内源活性相比而增加，并且通过增加编码基因的拷贝数，用比内源启动子更强的启动子取代基因的启动子，或者通过缺失、取代或插入，或者通过其组合修饰染色体上的基因的碱基序列的全部或部分或其表达调节序列的全部或部分引起增强。
在本发明的一个具体实施方案中，高丝氨酸O-琥珀酰转移酶可以由基因编码，其中编码该酶的基因的启动子被比内源启动子更强的启动子取代。例如，启动子包括已知的强启动子Ptac，Ptrc，Ppro，PR，PL，Prmf，PcysK等，但不限于此。
在本发明的一个具体实施方案中，微生物可以是大肠杆菌。微生物可以是大肠杆菌，其中葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶的活性与其内源活性相比被减弱或除去，并且胱硫醚γ合酶和高丝氨酸激酶中的一种或多种的活性分别与其内源活性相比被减弱或除去，并且高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的活性与其内源活性相比被增强。
在本发明的一个具体实施方案中，微生物可以是大肠杆菌，其中大肠杆菌染色体上的metA用作为通过除去甲硫氨酸的反馈调节而制备的突变体的metA11(SEQ ID NO:27)取代，缺失染色体上的thrB和metB，并且减弱或除去zwf。
在本发明的一个具体实施方案中，微生物可以是大肠杆菌CC03-0156，其于2013年11月22日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM11487P。
此外，在本发明的一个具体实施方案中，微生物可以是具有蔗糖同化能力的微生物。蔗糖同化指代谢作为碳源或代谢来源的蔗糖的能力。蔗糖同化能力可以通过引入蔗糖代谢酶，例如果糖激酶，蔗糖PTS通透酶，蔗糖水解酶或转化酶来提供。例如，蔗糖同化能力可以通过用重组载体(pAscrSM，SEQ ID NO:28)转化来提供，所述重组载体包括源自变异链球菌(Streptococcus mutans)的Scr-PTS酶的基因，其公开于韩国专利公开号2010-0099572。
在本发明的一个具体实施方案中，微生物可以是大肠杆菌，其中大肠杆菌染色体上的metA用作为通过除去甲硫氨酸的反馈调节而制备的突变体met11(SEQ ID NO:27)取代，缺失染色体上的thrB和metB，并且除去zwf，并且其利用重组载体转化能够利用粗糖，所述重组载体包括编码源自蔗糖同化变异链球菌的果糖激酶，蔗糖PTS通透酶，蔗糖水解酶和蔗糖转录调节子(regulator)的scrKYABR。
在本发明的一个方面，提供了生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：培养埃希氏菌属物种微生物，其中葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶的活性与其内源活性相比被减弱或去除，并从微生物的培养物获得O-琥珀酰高丝氨酸。
在根据本发明的具体实施方案的生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法中，产生O-琥珀酰高丝氨酸的菌株的培养可以在本领域已知的合适的培养基和条件下进行。培养方法可以由本领域技术人员根据所选择的菌株容易地调整。培养方法的实例包括分批型，连续型和补料分批型方式，但不限于此。各种培养方法公开在例如文献(“Biochemical Engineering”by James M.Lee,Prentice-Hall International Editions，第138-176页)中。
用于培养的培养基必须满足培养特定菌株的要求。在文献(“Manual of Methods for General Bacteriology”，American Society for Bacteriology，Washington D.C.，USA，1981)中描述了用于各种微生物的培养基。这些培养基包括多种碳源，氮源和微量元素。碳源包括糖，如葡萄糖，乳糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，淀粉和纤维素；脂肪，如大豆油，向日葵油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸；醇如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些碳源可以单独使用或组合使用。氮源包括有机氮源，如蛋白胨，酵母提取物，肉汁(gravy)，麦芽提取物，玉米浆(corn steep liquor，CSL)和豆粉(bean flour)，以及无机氮源，如尿素，硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独使用或组合使用。另外，培养基可以包括磷酸二氢钾，磷酸氢二钾和其相应的含钠盐作为磷源。此外，培养基可以包括金属，如硫酸镁或硫酸铁。此外，也可以添加氨基酸，维生素和适当的前体。
此外，为了将培养物维持在需氧条件下，可以将氧气或含氧气体(例如空气)注入培养物中。培养物的温度通常为20℃-45℃，优选为25℃-40℃。可以继续培养，直到L-甲硫氨酸前体的产生达到期望的水平，并且优选的培养时间为10小时至160小时。
本发明的有益效果
本发明的产生O-琥珀酰高丝氨酸的菌株有效地生产O-琥珀酰高丝氨酸，其可用于生产L-甲硫氨酸。由其生产的L-甲硫氨酸可以广泛用于生产动物饲料或动物饲料添加剂，以及人类食品或食品添加剂。
本发明的模式
在下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明性目的，并且本发明的范围不旨在受这些实施例的限制。
参照例1：制备产生O-琥珀酰高丝氨酸的菌株
1-1：metB基因的缺失
为了增加O-琥珀酰高丝氨酸的积累，通过缺失编码涉及O-琥珀酰高丝氨酸降解的胱硫醚γ合酶的metB基因制备菌株。
在野生型大肠杆菌(K12)W3110菌株中，缺失编码胱硫醚γ合酶的metB基因。已知胱硫醚γ合酶与细胞中的各种甲硫氨酸前体结合，从而产生各种副产物。因此，胱硫醚合酶的过表达可以增加副反应以降低细胞内反应的效率。对于metB基因的缺失，进行FRT一步PCR缺失方法(PNAS(2000)，Vol.197，p6640-6645)。首先，使用SEQ ID NO:1和2的引物和pKD3载体(PNAS(2000)Vol.l97,pP6640-6645)作为模板进行PCR，以制备缺失盒。
SEQ ID NO:1:
5’-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
SEQ ID NO:2:
5’-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’
PCR条件为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟的30个循环。将如此获得的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，然后洗脱和纯化1.1kb的条带。将如此获得的DNA片段电穿孔到预先用pKD46载体(PNAS(2000)Vol.97,p6640-6645)转化的大肠杆菌(K12)W3110菌株中。对于电穿孔，用pKD46转化的W3110菌株在含有200μg/L氨苄青霉素和5mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养到OD600达到0.5。然后，用10％甘油洗涤菌株三次。在2500V下进行电穿孔。将回收的菌株在含有30μg/L氯霉素的LB平板培养基上划线，然后在37℃培养1天至2天。然后，选择显示抗性的菌株。
通过在上述条件下使用经选择的菌株为模板和SEQ ID NO:3和4的引物进行PCR。通过在1.0％琼脂糖凝胶上鉴定1.5kb大小的基因来证实metB基因的缺失。
SEQ ID NO:3:5’-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3’
SEQ ID NO:4:5’-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3’
然后用pCP20载体(PNAS(2000)vol.97,p6640-6645)转化确认了metB基因缺失的菌株，并在含有100μg/L氨苄青霉素的LB培养基中培养。然后，在相同条件下进行PCR，并且通过在1.0％琼脂糖凝胶上观察较小的PCR产物来证实氯霉素标志物的消除。最后，制备metB基因缺失菌株。获得的甲硫氨酸营养缺陷型菌株命名为CC03-0132。
1-2：thrB基因的缺失
为了增加从高丝氨酸产生O-琥珀酰高丝氨酸，缺失了作为编码高丝氨酸激酶的基因的thrB基因。特别是，当使用苏氨酸生产菌株时，thrB基因的缺失是必要的，因为高丝氨酸利用活性非常强。为了缺失在1-1中制备的CC03-0132株中的thrB基因，进行FRT一步PCR缺失方法(PNAS(2000)Vol.97,p6640-6645)。对于thrB基因的缺失，使用SEQ ID NO:5和6的引物和pKD3载体(PNAS(2000)Vol.97,p6640-6645)作为模板进行PCR，以制备缺失盒。
SEQ ID NO:5:
5’-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
SEQ ID NO:6:
5’-GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCCGCGCCTCATATGAATATCCTCCTTAG-3’
PCR条件为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟的30个循环。将如此获得的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，然后洗脱和纯化1.1kb的条带。将如此获得的DNA片段电穿孔到预先用pKD46载体(PNAS(2000)Vol.97,p6640-6645转化的CC03-0132菌株中。对于电穿孔，用pKD46转化的CC03-0132菌株在含有200μg/L氨苄青霉素和5mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养到OD600达到0.5。然后，用10％甘油洗涤菌株三次。在2500V下进行电穿孔。将回收的菌株在含有30μg/L氯霉素的LB平板培养基上划线，然后在37℃培养1天至2天。然后，选择展现抗性的菌株。
通过在上述条件下使用经选择的菌株作为模板和SEQ ID NO:7和8的引物进行PCR。通过在1.0％琼脂糖凝胶上鉴定1.5kb大小的基因来证实thrB基因的缺失。
SEQ ID NO:7:5’-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3’
SEQ ID NO:8:5’-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3’
然后用pCP20载体(PNAS(2000)vol.97,p6640-6645)转化如此证实的菌株，并在含有100μg/L氨苄青霉素的LB培养基中培养。然后，在相同条件下进行PCR，并且通过在1.0％琼脂糖凝胶上观察较小的PCR产物来证实氯霉素标志物的消除。最后，制备thrB基因缺失菌株。如此制备的菌株命名为CC03-0133。
1-3：metA基因的缺失
为了将反馈抗性metA基因导入染色体，基于通过缺失大肠杆菌(K12)W3110菌株中的metB和thrB基因制备的CC03-0133菌株，缺失了真正的染色体metA基因。对于metA基因的缺失，进行FRT一步PCR缺失方法(PNAS(2000),Vol.l97,p6640-6645)。对于metA基因的缺失，使用SEQ ID NO:9和10的引物和pKD3载体(PNAS(2000)Vol.l97,pP6640-6645)作为模板进行PCR，以制备缺失盒。
SEQ ID NO:9:
5’-TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGCAGAGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
SEQ ID NO:10:
5’-CCGTCACAAAGGCAATGCGCTTATCTTTACTGGCAAACAGATATGCATCCCATATGAATATCCTCCTTAG-3’
PCR条件为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟的30个循环。将如此获得的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，然后洗脱和纯化1.1kb的条带。将如此获得的DNA片段电穿孔到预先用pKD46载体(PNAS(2000)Vol.97,p6640-6645)转化的CC03-0133菌株中。对于电穿孔，用pKD46转化的CC03-0133菌株在含有200μg/L氨苄青霉素和5mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养到OD600达到0.5。然后，用10％甘油洗涤菌株三次。在2500V下进行电穿孔。将回收的菌株在含有30μg/L氯霉素的LB平板培养基上划线，然后在37℃培养1天至2天。然后，选择展现抗性的菌株。
通过在上述条件下使用经选择的菌株作为模板和SEQ ID NO:11和12的引物进行PCR。通过在1.0％琼脂糖凝胶上鉴定1.5kb大小的基因来证实metA基因的缺失。
SEQ ID NO:11:5’-CTCATTAACGTTGGTTGTCA-3’
SEQ ID NO:12”5’-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3’
然后用pCP20载体(PNAS(2000)vol.97,p6640-6645)转化如此证实的菌株，并在含有100μg/L氨苄青霉素的LB培养基中培养。然后，在相同条件下进行PCR，并且通过在1.0％琼脂糖凝胶上观察较小的PCR产物来证实氯霉素标志物的消除。最后，制备metA基因缺失菌株。如此制备的菌株命名为CC03-0134。
1.4：插入metA11基因
-制备用于metA11插入的pSG载体
高丝氨酸琥珀酰基转移酶的大部分活性通过加入培养基的少量甲硫氨酸的反馈抑制来调节，并且因此替换除去了甲硫氨酸的反馈调节的突变体，以用于大量生产L-甲硫氨酸前体O-琥珀酰高丝氨酸。为了用metA11(SEQ ID NO:27)替换编码大肠杆菌的高丝氨酸琥珀酰基转移酶的野生型染色体metA基因，制备用于插入的pSG-metA11载体，所述metA11编码其中除去了甲硫氨酸的反馈调节的突变体。根据韩国专利公开号2009-0106365，获得metA11基因的碱基序列信息，并且基于该碱基序列，合成引物(SEQ ID NO:13和14)，其包括metA11基因的ATG至ORF和限制酶EcoRI和SacI的识别位点。使用pMetA11-CL质粒作为模板(韩国专利公开号2009-0106365)和以下SEQ ID NO的引物进行PCR，所述pMetA11-CL质粒通过将metA11基因与pCL1920载体连接而制备：
SEQ ID NO:13:5’-ggccgaattcatgccgattcgtgtgccgga-3’
SEQ ID NO:14:5’-ggccgagctcgttaatccagcgttggattca-3’
使用pfu-X DNA聚合酶(SolGent；SPX16-R250)进行PCR，并且PCR条件为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸2分钟的30个循环。结果，获得了扩增的metA11ORF的PCR产物，其包括位于两端的限制酶EcoRI和SacI的识别位点。通过PCR获得的metA11基因用限制酶EcoRI和SacI处理，并与用限制酶EcoRI和SacI处理的pSG76-C载体(Nucleic Acids Res.1999Nov 15；27(22)：4409-15)连接，以克隆该基因。最后，制备metA11基因克隆的pSG-metA11重组载体。
-metA11基因插入菌株的制备
用准备好的用作metA11基因插入载体的pSG-metA11转化参照例1-3中获得的CC03-0134菌株，并在LB Cm(10g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨和30μg/L氯霉素)培养基中培养。然后，选择具有氯霉素抗性的菌落。经选择的转化体是菌株，其中pSG-metA11载体主要插入染色体metA。用表达I-SceI的pST76-ASceP载体(Nucleic Acids Res.1999Nov 15；27(22):4409-15)转化metA11基因插入菌株，所述I-SceI是消化在pSG载体中的I-SceI的限制酶，选择在LB-Amp(10g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨和100μg/L氯霉素)中生长的菌株。由此选择的菌株是其中野生型metA被metA11替代并且除去插入的pSG76-C载体的菌株。该菌株命名为大肠杆菌CC03-0038。
实施例1：zwf基因的减弱和缺失
1-1：zwf基因的减弱
-制备用于替换zwf基因的起始密码子的pSG载体
为了减弱参照例1-4中制备的CC03-0038菌株中的zwf基因，应用通过GTG替换zwf基因的ORF区的起始密码子ATG的方法。使用SEQ ID NO:15和16以及SEQ ID NO:17和18的引物和大肠杆菌W3110的基因组作为模板进行PCR。
SEQ ID NO:15:5’-ggccgaattcctgaaagaaatcgaaatgcag-3’
SEQ ID NO:16:5’-cacgtcattctccttaagaattc-3’
SEQ ID NO:17:5’-gaattcttaaggagaatgacgtg-3’
SEQ ID NO:18:5’-ggccgagctcgggcatggcaaagtagttaatg-3’
使用pfu-X DNA聚合酶(SolGent；SPX16-R250)进行PCR，并且PCR条件为在95℃变性30秒；在55℃退火30秒；并在72℃延伸1分钟的30个循环。SOEing(重叠延伸剪接)使用由此获得的两个片段作为模板进行PCR。结果，获得了包含位于两端的限制酶EcoRI和SacI的识别位点和起始密码子GTG的zwf区域。将限制酶EcoRI和SacI处理到包括酶的识别位点的获得的片段的末端，并通过连接克隆到用限制酶EcoRI和SacI处理的pSG76-C载体(NucleicAcids Res.1999Nov 15；27(22):4409-15)中。最后，制备pSG-zwf(GTG)重组载体。
-制备具有zwf基因起始密码子替换的菌株
将如上所述为了替换zwf基因的起始密码子而制备的pSG-zwf(GTG)转化到参照例1-4中制备的CC03-0038菌株中，并在LB_Cm(10g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨和30μg/L氯霉素)培养基中培养。然后，选择具有氯霉素抗性的菌落。经选择的转化体是其中pSG-zwf(GTG)载体主要插入染色体zwf的菌株。用表达I-SceI的pST76-ASceP(Nucleic Acids Res.1999Nov15；27(22):4409-15)转化选择的菌株，所述I-SceI是在pSG载体中消化I-SceI的限制酶，并且选择在LB-Amp(10g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨和100μg/L氯霉素)中生长的菌株。由此选择的菌株是通过用GTG替换zwf基因的起始密码子ATG使zwf基因减弱，然后除去插入的pSG76-C载体的菌株。该菌株命名为CC03-0038zwfGTG。
1-2：zwf基因的缺失
为了缺失参照例1-4中制备的CC03-0038菌株中的zwf基因，进行FRT一步PCR缺失方法(PNAS(2000)Vol.97,p6640-6645)。为了缺失zwf基因，使用SEQ ID NO:19和20的引物和pKD3载体(PNAS(2000)vol.97P6640-6645)作为模板进行PCR，以制备缺失盒。
SEQ ID NO:19:
5’-CAAGTATACCCTGGCTTAAGTACCGGGTTAGTTAACTTAAGGAGAATGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
SEQ ID NO:20:
5’-CTGCGCAAGATCATGTTACCGGTAAAATAACCATAAAGGATAAGCGCAGATACATATGAATATCCTCCTTAG-3’
PCR条件是在95℃变性30秒，在55℃退火30秒和在72℃延伸1分钟的30个循环。将由此获得的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，然后洗脱和纯化1.1kb的条带。将如此获得的DNA片段电穿孔到先前用pKD46载体(PNAS(2000),Vol.97,p6640-6645)转化的CC03-0038菌株中。对于电穿孔，在30℃下在含有200μg/L氨苄青霉素和5mM阿拉伯糖的LB培养基中培养用pKD46转化的CC03-0038菌株，直到OD 600达到0.5。然后，用10％甘油洗涤菌株三次。在2500V下进行电穿孔。将回收的菌株在含有30μg/L氯霉素的LB平板培养基上划线，然后在37℃培养1天至2天。然后，选择展现抗性的菌株。
通过在上述条件下使用经选择的菌株作为模板和SEQ ID NO:21和22的引物进行PCR。通过在1.0％琼脂糖凝胶上鉴定2kb大小的基因来证实zwf基因的缺失。
SEQ ID NO:21:5’-CATAACATGATCAGTGTCAGAT-3’
SEQ ID NO:22:5’-CGCGTAACAATTGTGGATTCAT-3’
如此鉴定的菌株命名为CC03-0156。
1-3：基于苏氨酸生产菌株的O-琥珀酰高丝氨酸生产菌株的制备
使用国际专利WO 2005/075625中公开的苏氨酸生产菌株大肠杆菌KCCM 10541P，以与参照例1中所述相同的方式缺失metB，thrB和metA基因，然后导入反馈抗性的metA11基因以制备具有O-琥珀酰高丝氨酸生产能力的菌株，其命名为CJM2-A11。此外，以与实施例1-2中所述相同的方式制备zwf基因缺失菌株，并命名为CJM2-A11Z。
实施例2：用于O-琥珀酰高丝氨酸生产的发酵
为了检查实施例1中制备的菌株中zwf基因缺失的影响，进行锥形瓶培养。烧瓶培养基组成与下表1中相同。
此外，导入具有在韩国专利公开NO.2009-0018128中描述的scrKYABR(下文称为“scrO”)序列的pAscrSM质粒(SEQ ID NO:28)以制备能够利用粗糖的菌株，随后进行烧瓶培养。烧瓶培养基组成与在下表2中相同。通过上述方法制备的菌株分别命名为CC03-0038/pAscrSM、CC03-0038zwfGTG/pAscrSM、CC03-0156/pAscrSM、CJM2-A11/pAscrSM和CJM2-A11Z/pAscrSM。
表1：烧瓶培养基组成
[表1]
表2：烧瓶培养基组成
[表2]
将CC03-0038、CC03-0038zwfGTG、CC03-0156、CJM2-A11、CJM2-A11Z、CC03-0038/pAscrSM、CC03-0038zwfGTG/pAscrSM、CC03-0156/pAscrSM、CJM2-A11/pAscrSM和CJM2-A11Z/pAscrSM的每种接种到LB平板培养基上并在33℃下培养过夜。将单菌落接种到2ml LB培养基中，然后在33℃培养2小时。以OD600＝0.5在含有25ml烧瓶培养基的250ml锥形瓶中接种培养物，然后在33℃，200rpm下培养48小时。进行HPLC以比较O-琥珀酰高丝氨酸产量。在下表3中给出结果。
表3：通过烧瓶培养的O-琥珀酰高丝氨酸的生产
[表3]
烧瓶培养的结果显示zwf基因减弱或缺失的CC03-0038zwfGTG、CC03-0156、CJM2-A11Z、CC03-0038zwfGTG/pAscrSM、CC03-0156/pAscrSM、和CJM2-A11Z/pAscrSM菌株显示比各自对照菌株高8.9％至40.0％的O-琥珀酰高丝氨酸产量。此外，观察到高丝氨酸生产的降低，提示通过增强TCA循环增加琥珀酰-CoA的生产。
本发明人确认，可以通过CC03-0038菌株和CJM2-A11菌株中zwf基因的减弱或缺失以高产率制备O-琥珀酰高丝氨酸。根据布达佩斯条约于2013年11月22日将CC03-0156菌株保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM11487P。
关于zwf基因对增强TCA循环的应用，应当理解，zwf基因的减弱或缺失不限于大肠杆菌，而是同样适用于所有具有TCA循环的微生物，包括埃希氏菌属物种，棒状杆菌属物种，酵母等，以用于高产率生产O-琥珀酰高丝氨酸。
自由文本
本文示出的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:28列于所附序列表。
序列表
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物和使用该微生物生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法
<130> PX048557
<150> KR 2014/043187
<151> 2014-04-10
<160> 28
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metB缺失盒的正向引物
<400> 1
ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa agcccaggga acttcatcac gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metB缺失盒的反向引物
<400> 2
cgctgcgcca gctccatacg cggcaccagc gttcgcaacc cacgtagcag catatgaata 60
tcctccttag 70
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于缺失的metB的正向引物
<400> 3
tattcgccgc tccattcagc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于缺失的metB的反向引物
<400> 4
taccccttgt ttgcagcccg 20
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于thrB缺失盒的正向引物
<400> 5
catggttaaa gtttatgccc cggcttccag tgccaatatg agcgtcgggt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于thrB缺失盒的反向引物
<400> 6
ggagataccg ctcgctaccg cgccgatttc cgcgaccgcc tgccgcgcct catatgaata 60
tcctccttag 70
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于缺失的thrB的正向引物
<400> 7
actcgacgat ctctttgcc 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于缺失的thrB的反向引物
<400> 8
acgccgagag gatcttcgca g 21
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于metA缺失盒的正向引物
<400> 9
tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcaacacg cccgcagagc gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 10
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于metA缺失盒的反向引物
<400> 10
ccgtcacaaa ggcaatgcgc ttatctttac tggcaaacag atatgcatcc catatgaata 60
tcctccttag 70
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于缺失的metA的正向引物
<400> 11
ctcattaacg ttggttgtca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于缺失的metA的 反向引物
<400> 12
tatcttgctg ctgctgaatg 20
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于metA11的正向引物
<400> 13
ggccgaattc atgccgattc gtgtgccgga 30
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于metA11的反向引物
<400> 14
ggccgagctc gttaatccag cgttggattc a 31
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于zwf的起始密码子取代的正向引物
<400> 15
ggccgaattc ctgaaagaaa tcgaaatgca g 31
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 16
cacgtcattc tccttaagaa ttc 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于zwf的起始密码子取代的正向引物 2
<400> 17
gaattcttaa ggagaatgac gtg 23
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于zwf的起始密码子取代的反向引物 2
<400> 18
ggccgagctc gggcatggca aagtagttaa tg 32
<210> 19
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于zwf缺失盒的正向引物
<400> 19
caagtatacc ctggcttaag taccgggtta gttaacttaa ggagaatgac gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 20
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于zwf缺失盒的 反向引物
<400> 20
ctgcgcaaga tcatgttacc ggtaaaataa ccataaagga taagcgcaga tacatatgaa 60
tatcctcctt ag 72
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于缺失的zwf的正向引物
<400> 21
cataacatga tcagtgtcag at 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于缺失的zwf的反向引物
<400> 22
cgcgtaacaa ttgtggattc at 22
<210> 23
<211> 491
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(491)
<223> 葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶
<400> 23
Met Ala Val Thr Gln Thr Ala Gln Ala Cys Asp Leu Val Ile Phe Gly
1 5 10 15
Ala Lys Gly Asp Leu Ala Arg Arg Lys Leu Leu Pro Ser Leu Tyr Gln
20 25 30
Leu Glu Lys Ala Gly Gln Leu Asn Pro Asp Thr Arg Ile Ile Gly Val
35 40 45
Gly Arg Ala Asp Trp Asp Lys Ala Ala Tyr Thr Lys Val Val Arg Glu
50 55 60
Ala Leu Glu Thr Phe Met Lys Glu Thr Ile Asp Glu Gly Leu Trp Asp
65 70 75 80
Thr Leu Ser Ala Arg Leu Asp Phe Cys Asn Leu Asp Val Asn Asp Thr
85 90 95
Ala Ala Phe Ser Arg Leu Gly Ala Met Leu Asp Gln Lys Asn Arg Ile
100 105 110
Thr Ile Asn Tyr Phe Ala Met Pro Pro Ser Thr Phe Gly Ala Ile Cys
115 120 125
Lys Gly Leu Gly Glu Ala Lys Leu Asn Ala Lys Pro Ala Arg Val Val
130 135 140
Met Glu Lys Pro Leu Gly Thr Ser Leu Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn
145 150 155 160
Asp Gln Val Gly Glu Tyr Phe Glu Glu Cys Gln Val Tyr Arg Ile Asp
165 170 175
His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Leu Asn Leu Leu Ala Leu Arg Phe
180 185 190
Ala Asn Ser Leu Phe Val Asn Asn Trp Asp Asn Arg Thr Ile Asp His
195 200 205
Val Glu Ile Thr Val Ala Glu Glu Val Gly Ile Glu Gly Arg Trp Gly
210 215 220
Tyr Phe Asp Lys Ala Gly Gln Met Arg Asp Met Ile Gln Asn His Leu
225 230 235 240
Leu Gln Ile Leu Cys Met Ile Ala Met Ser Pro Pro Ser Asp Leu Ser
245 250 255
Ala Asp Ser Ile Arg Asp Glu Lys Val Lys Val Leu Lys Ser Leu Arg
260 265 270
Arg Ile Asp Arg Ser Asn Val Arg Glu Lys Thr Val Arg Gly Gln Tyr
275 280 285
Thr Ala Gly Phe Ala Gln Gly Lys Lys Val Pro Gly Tyr Leu Glu Glu
290 295 300
Glu Gly Ala Asn Lys Ser Ser Asn Thr Glu Thr Phe Val Ala Ile Arg
305 310 315 320
Val Asp Ile Asp Asn Trp Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg
325 330 335
Thr Gly Lys Arg Leu Pro Thr Lys Cys Ser Glu Val Val Val Tyr Phe
340 345 350
Lys Thr Pro Glu Leu Asn Leu Phe Lys Glu Ser Trp Gln Asp Leu Pro
355 360 365
Gln Asn Lys Leu Thr Ile Arg Leu Gln Pro Asp Glu Gly Val Asp Ile
370 375 380
Gln Val Leu Asn Lys Val Pro Gly Leu Asp His Lys His Asn Leu Gln
385 390 395 400
Ile Thr Lys Leu Asp Leu Ser Tyr Ser Glu Thr Phe Asn Gln Thr His
405 410 415
Leu Ala Asp Ala Tyr Glu Arg Leu Leu Leu Glu Thr Met Arg Gly Ile
420 425 430
Gln Ala Leu Phe Val Arg Arg Asp Glu Val Glu Glu Ala Trp Lys Trp
435 440 445
Val Asp Ser Ile Thr Glu Ala Trp Ala Met Asp Asn Asp Ala Pro Lys
450 455 460
Pro Tyr Gln Ala Gly Thr Trp Gly Pro Val Ala Ser Val Ala Met Ile
465 470 475 480
Thr Arg Asp Gly Arg Ser Trp Asn Glu Phe Glu
485 490
<210> 24
<211> 386
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(386)
<223> 胱硫醚γ合酶
<400> 24
Met Thr Arg Lys Gln Ala Thr Ile Ala Val Arg Ser Gly Leu Asn Asp
1 5 10 15
Asp Glu Gln Tyr Gly Cys Val Val Pro Pro Ile His Leu Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Asn Phe Thr Gly Phe Asn Glu Pro Arg Ala His Asp Tyr Ser Arg
35 40 45
Arg Gly Asn Pro Thr Arg Asp Val Val Gln Arg Ala Leu Ala Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Gly Ala Gly Ala Val Leu Thr Asn Thr Gly Met Ser Ala Ile
65 70 75 80
His Leu Val Thr Thr Val Phe Leu Lys Pro Gly Asp Leu Leu Val Ala
85 90 95
Pro His Asp Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Ser Leu Ala
100 105 110
Lys Arg Gly Cys Tyr Arg Val Leu Phe Val Asp Gln Gly Asp Glu Gln
115 120 125
Ala Leu Arg Ala Ala Leu Ala Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Val Glu
130 135 140
Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Val Asp Ile Ala Lys Ile Cys
145 150 155 160
His Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Val Ser Val Val Asp Asn Thr Phe
165 170 175
Leu Ser Pro Ala Leu Gln Asn Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val
180 185 190
Leu His Ser Cys Thr Lys Tyr Leu Asn Gly His Ser Asp Val Val Ala
195 200 205
Gly Val Val Ile Ala Lys Asp Pro Asp Val Val Thr Glu Leu Ala Trp
210 215 220
Trp Ala Asn Asn Ile Gly Val Thr Gly Gly Ala Phe Asp Ser Tyr Leu
225 230 235 240
Leu Leu Arg Gly Leu Arg Thr Leu Val Pro Arg Met Glu Leu Ala Gln
245 250 255
Arg Asn Ala Gln Ala Ile Val Lys Tyr Leu Gln Thr Gln Pro Leu Val
260 265 270
Lys Lys Leu Tyr His Pro Ser Leu Pro Glu Asn Gln Gly His Glu Ile
275 280 285
Ala Ala Arg Gln Gln Lys Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser Phe Glu Leu
290 295 300
Asp Gly Asp Glu Gln Thr Leu Arg Arg Phe Leu Gly Gly Leu Ser Leu
305 310 315 320
Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Ser His
325 330 335
Ala Ala Thr Met Thr His Ala Gly Met Ala Pro Glu Ala Arg Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Ile Ser Glu Thr Leu Leu Arg Ile Ser Thr Gly Ile Glu Asp
355 360 365
Gly Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Glu Asn Gly Phe Arg Ala Ala Asn
370 375 380
Lys Gly
385
<210> 25
<211> 310
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(310)
<223> 高丝氨酸激酶
<400> 25
Met Val Lys Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Ala Asn Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Phe Asp Val Leu Gly Ala Ala Val Thr Pro Val Asp Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Gly Asp Val Val Thr Val Glu Ala Ala Glu Thr Phe Ser Leu Asn Asn
35 40 45
Leu Gly Arg Phe Ala Asp Lys Leu Pro Ser Glu Pro Arg Glu Asn Ile
50 55 60
Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Phe Cys Gln Glu Leu Gly Lys Gln Ile
65 70 75 80
Pro Val Ala Met Thr Leu Glu Lys Asn Met Pro Ile Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Gly Ser Ser Ala Cys Ser Val Val Ala Ala Leu Met Ala Met Asn Glu
100 105 110
His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala Leu Met Gly
115 120 125
Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Asp Asn Val Ala
130 135 140
Pro Cys Phe Leu Gly Gly Met Gln Leu Met Ile Glu Glu Asn Asp Ile
145 150 155 160
Ile Ser Gln Gln Val Pro Gly Phe Asp Glu Trp Leu Trp Val Leu Ala
165 170 175
Tyr Pro Gly Ile Lys Val Ser Thr Ala Glu Ala Arg Ala Ile Leu Pro
180 185 190
Ala Gln Tyr Arg Arg Gln Asp Cys Ile Ala His Gly Arg His Leu Ala
195 200 205
Gly Phe Ile His Ala Cys Tyr Ser Arg Gln Pro Glu Leu Ala Ala Lys
210 215 220
Leu Met Lys Asp Val Ile Ala Glu Pro Tyr Arg Glu Arg Leu Leu Pro
225 230 235 240
Gly Phe Arg Gln Ala Arg Gln Ala Val Ala Glu Ile Gly Ala Val Ala
245 250 255
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Pro Thr Leu Phe Ala Leu Cys Asp Lys
260 265 270
Pro Glu Thr Ala Gln Arg Val Ala Asp Trp Leu Gly Lys Asn Tyr Leu
275 280 285
Gln Asn Gln Glu Gly Phe Val His Ile Cys Arg Leu Asp Thr Ala Gly
290 295 300
Ala Arg Val Leu Glu Asn
305 310
<210> 26
<211> 309
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(309)
<223> 高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶
<400> 26
Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg
1 5 10 15
Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Pro Gly Gln Glu
20 25 30
Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile
35 40 45
Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln
50 55 60
Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr
65 70 75 80
Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln
85 90 95
Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu
100 105 110
Val Gly Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu
115 120 125
Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Ser Val Cys Trp Ala
130 135 140
Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg
145 150 155 160
Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His
165 170 175
Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser
180 185 190
Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu
195 200 205
Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser
210 215 220
Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala
225 230 235 240
Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp
245 250 255
Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr
260 265 270
Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp
275 280 285
Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met
290 295 300
Asn Pro Thr Leu Asp
305
<210> 27
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metA11
<400> 27
atgccgattc gtgtgccgga cgagctaccc gccgtcaatt tcttgcgtga agaaaacgtc 60
tttgtgatga caacttctcg tgcgcctggt caggaaattc gtccacttaa ggttctgatc 120
cttaacctga tgccgaagaa gattgaaact gaaaatcagt ttctgcgcct gctttcaaac 180
tcacctttgc aggtcgatat tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcaacacg 240
cccgcagagc atctgaacaa cttctactgt aactttgaag atattcagga tcagaacttt 300
gacggtttga ttgtaactgg tgcgccgctg ggcctggtgg ggtttaatga tgtcgcttac 360
tggccgcaga tcaaacaggt gctggagtgg tcgaaagatc acgtcacctc gacgctgtct 420
gtctgctggg cggtacaggc cgcgctcaat atcctctacg gcattcctaa gcaaactcgc 480
accgaaaaac tctctggcgt ttacgagcat catattctcc atcctcatgc gcttctgacg 540
cgtggctttg atgattcatt cctggcaccg cattcgcgct atgctgactt tccggcagcg 600
ttgattcgtg attacaccga tctggaaatt ctggcagaga cggaagaagg ggatgcatat 660
ctgtttgcca gtaaagataa gcgcattgcc tttgtgacgg gccatcccga atatgatgcg 720
caaacgctgg cgcaggaatt tttccgcgat gtggaagccg gactagaccc ggatgtaccg 780
tataactatt tcccgcacaa tgatccgcaa aatacaccgc gagagagctg gcgtagtcac 840
ggtaatttac tgtttaccaa ctggctcaac tattacgtct accagatcgc gccatacgat 900
ctacggcaca tgtatccaac gctggattaa 930
<210> 28
<211> 9960
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAscrSM
<400> 28
tgccgaacag ttctctatgc tctgcatata attcatctaa ggggacacct ttataaacac 60
cacttttaac aacagacact ccattaggat gcgcagaaat cgcccaatat tctcccgtcg 120
tttcactagg aatgtcataa ccaaattctt ttctgagccg attgccgccc cagatttttt 180
tatgcatttg tgattgtaaa aacaaaggtt ctgccatagt gttctccttt ctgtttttca 240
atataccact atctagtttc agaggaaatc aagagtaatt atattcactt cattatcctc 300
ataaaatgaa aatttcgttc acgtaaattc taacagttta atattgaata ttagaaggtg 360
ctttaatctt ccaattcatt tttaattaac gcgctgctat ctttttagct aaagcgagat 420
ttcccaatgt tgctgaacca ttttctgcaa cagctggtgt cacaatataa tctttaacat 480
ctggaactgg aagatagtca ttcaaaagtg aagtaaattt ttcacgaacc cgattgagca 540
tatgttcttg tgccataacg cctccgccaa atacaatgac ttgcggacga taaaggacag 600
tcgcttgaat agccgcctga gcaatgtagt atgcctgaat atcccaaact tctgagtttt 660
gctcaattaa ctcaccacga ataccagtac gagcctctaa gctaggaccc gctgcaagtc 720
cttctaaaca gcctttatgg aaaggacagg tgcctacaaa accatgatga acatcattgg 780
gatgcggagc catgtaaacg tgtccagctt ccgtatgtcc cataccgcca atgaattcgc 840
cattttgaat agtccctgct ccaatgcctg ttccaatagt ataataaacc agacttttaa 900
catttgaacg agcaattgtt tccccataag cagaagaatt aacatctgtc gtaaagtaaa 960
atggaatttt aaaatcttta gaaattaagc cgacaaaatc aacgttagcc cagtttggct 1020
ttggtgttga agtaatgtaa ccataagtgt ctgaattttg atcaatatca atagggccaa 1080
aagaaccaat ggcaacactg gctaaatcag cttcaaattt tttaaagaaa gcaactgttt 1140
tttctattgt ttcataaggt gttgttgttg ggaactgaac tttttctaaa atttgaaaat 1200
tttcatcacc tacagcacag acaaattttg ttccgccagc ttcgatgctg ccatataatt 1260
tagacataat aaacctctta tattttactt aacttaccaa atcaattttt ggatttgaat 1320
acccttaatc tacccttaag gactacttaa cattatatca taatttgcta aatttcaagt 1380
attagttagc caaaaggctt taatactatt gttactgaat cttttaagca gtcaaaaaga 1440
ccttacggtc tttctgataa tatttcttat tttttaactt caagtaagct atcacctaca 1500
gcaacagttc ctgaagaagc gagggtttca actgacgcat aatcggctgt attagtaaca 1560
atgaacattg ttgtattatc aagaccagct tctgcaattt tgtcactatc aaatgttccg 1620
agaacgtcac cttttttaat tttttgatct gcttgaactt tttgttcaaa tcctttacct 1680
tccattgata ctgtatcaat accaatatga ataagaatct ccgcaccatt gtctgactta 1740
ataccataag catggccagt atcaaaagca atttgaacag tcccatcaac cggtgcataa 1800
actgtattac cactaggttt gatagcaatc cccttaccca ttgcttcgct agaaaaaaca 1860
gggtcattaa cagaggttaa ttcaacagct tcaccagcaa gaggagccgc aagaacttca 1920
tcagtaactt gtgccttatt tgctgcagaa gcagcttctt ctggaatttc ttgcacttct 1980
tcaatagctt cttcgacagc agcttcagca gcaaagacat caacagcctt cgtcttacca 2040
tagccataag ttactgcaaa agctatagca aaactgatta attcacagac tacataaaat 2100
ggaatagaac ttgccttaat agaaaggaaa ccaagaaaac ctgccgaacc aagggaaacc 2160
gctacaactt gaagtaagcc cgcaattgct gcagcactag ctgagccaat cagagcacaa 2220
aagaatggga aacgatattt caaattcacc ccaaaaagag caggttctgt aataccaaga 2280
agcgctgaca cacctgaaga agatgagaga cctttcatct tcttatcttt tgttaagaag 2340
taaattgcaa aggttgctgc gccttgtgcg acattggcca ttgaagctgt aacaaagata 2400
aagtcaccat gaccagtacc attttggaaa gctgaaatga gttgggtttc aatagctggg 2460
aaactttgat ggagaccagt cataactaca ggtgaataca gagcaccaaa gacacccata 2520
cctaggaatc ccgttgtatc atacagccat acgattccat ttgtaagcca gtcagaaact 2580
tctttcataa caggaccaat aacgataaat gtcaaaaatc cagtaataat aactgacaat 2640
aaaggtgtaa aggtaaagtc aactgctgag ggcaatctct tatggaaaaa tttttctaag 2700
atagataaaa gccatacagc cacaagtact ggaatcactt gataagtata acttgcctga 2760
gtaacatgca acccaaaaat attccaaaat cctgtataag caccaatagt agcagccttt 2820
gaaattggag cattagctgc taaaccaatg atatttgctg cccccggtgc gaccataatc 2880
atgccgattg aagctcctaa gaattggtta gcaccaaaac gtttagctgc tgaaatccca 2940
accaaaatgg gtaagaacca gaaaggcgct gctgacatta attgaatcat gtcagatgaa 3000
cccttaataa tcgggaattg ttgaaccagt gacttagtac caaataaacc ttctgaagtt 3060
aaaaagttat ttaaagccat taagagaccg cctgctacca aggcagggat aattggtaca 3120
aagatatcag acaacagttt gatcaaagcc ataataggat tgaacttttt accactggca 3180
gcaatctttt tcaaatcatc tgttgagact tctgttaaac ctgtttgttt aataatttca 3240
tcataaacaa agttaacatc accagggcca ataataactt gatattgacc atccgtttta 3300
aaagttccct tgacatcagc atttttatcc aacgcttttt gatctacttt actgtcatct 3360
tttaaaacaa gacgaagacg tgtcgcacag tgagcggcag ctacaagatt atctttacca 3420
acagctgtga tgacttcact agctactttg ctataatcca tttgcaaaaa actccttaat 3480
aattattttg ttttgaaagc gtttttttac tttccacgtt attcatttta tcattttttt 3540
ccaatatgtc aatcgtttta cataaaattc ttttttgcaa caaaagattg atttttagaa 3600
agaaaacgtt tactatatta gtatgtagat aaactattat taggagtaga taaacgatga 3660
atttgcctca aaatatcaga tatcgccgct atcaagattg gactgaagaa gaaataaaaa 3720
gtattaaaac caatgtagct ttgtctcctt ggcatacaac gtatcatata gaacctaaaa 3780
caggactcct taatgatcca aacggttttt cctattttaa tggaaaattt aacctttttt 3840
atcaaaattg gccatttgga gcagctcacg gcttaaaatc ttggatccat actgaaagtg 3900
aagacttagt ccatttcaaa gaaacaggta cagtccttta tcccgatact tcccatgaca 3960
gccatggtgc atactcgggc agtgcctatg aaatcggtga tcagcttttt ctcttttata 4020
caggaaatgt ccgagatgaa aattgggttc gtcatccact tcaaatcggc gcttttatgg 4080
ataaaaaagg taatatccaa aaatttactg atgtccttat taaacagcca aatgatgtta 4140
ctgaacactt tcgcgatccc caaattttta attataaagg acaattttac gctattgttg 4200
gagcacaaag tctagataaa aaaggattta tcaaactcta taaagctgtt gataatgata 4260
ttaagaattg gcaagaagtt ggtaatctag actttggcgg aagtaaatct gagtatatga 4320
ttgagtgccc aaatcttgtt tttataaacg aacagcctgt cctgatttat agtcctcagg 4380
gactcagtaa atctgaatta gattatcata atatttatcc taatacttac aaagtatgtc 4440
aatcgtttga cacagaaaag cctgccctag ttgatgcatc ggaaattcaa aatcttgact 4500
tcggatttga atgttatgct acccaagctt tcaatgctcc tgatggccgt gtttatgctg 4560
tctcatggat tgggttacca gatattgatt atccaagtga ttcatacgac tatcaaggag 4620
ctttgagcct cgtcaaagag ctaagcctaa aacacggtaa actctatcaa tatcccgttg 4680
aagctgttcg ttcattacgt tctgaaaaag aagcagtcac ttacaagcca gaaaccaata 4740
atacttatga attagagtta acttttgact cttcatcagt taatgaattg ctcctttttg 4800
ctgataataa aggcaatggt ctagctatta cagttgatac taagatggga accattctga 4860
tcgatcgctc taaagcaggg gagcaatatg ccttagaatt tggaagccaa cgttcttgct 4920
ctatccaagc aaaagagact gttgtcaata tttttgttga caaatcgatt tttgaaattt 4980
ttattaataa gggagaaaaa gtttttactg gacgtgtttt tccaaatgac aaacaaactg 5040
gtattgtgat taaatctgga aagccaagcg gtaattacta cgaattgaaa tattaactat 5100
ggttgcaaaa ttaacagatg tcgcaaaact cgctggcgta agtccaacaa ccgtttcacg 5160
cgtgattaat cgaaaaggct atctctctga aaaaacaatt actaaagtac aggctgccat 5220
gaaaactcta ggatacaagc ccaataatct cgctcgcagc cttcagggga aatctgccaa 5280
gctaattgga cttattttcc ctaatatcag tcacatcttc tattctgaac ttattgaata 5340
tttagaaata gagttgttta aacatggcta caaagccatt atttgtaaca gtcagaataa 5400
tcccgataaa gaacgggatt atctcgaaat gttagaagct aatcaggttg atggcattat 5460
ttccagtagt cacaacctcg gcattgatga ctatgagaaa gtttctgctc ctattattgc 5520
ctttgatcgt aacttagcac ccaatattcc catcgtctct tctgacaatt ttgaaggcgg 5580
acgaatggcc gcaaaacttt taaaaaaaca cggctgccaa catcccatta tgatcgctgg 5640
aaaagataat tctaattctc ggacaggact gcgacaatta ggctttaagt ccgtctttgc 5700
tcaagcacct atttttcatc tatctggaga gctgtccatc attcgtaaag aaatggaaat 5760
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tattttaaca atgaaaattg ctaaccagtt aaacattacc attccccatg aacttaaaat 5880
tattgggtac gatggaacac actttgttga gaactactat ccttatctaa caactattag 5940
gcaacctatt aaagatatcg cacatctttt ggtagacgta ttgctaaaga aaattgatca 6000
ccaagatact cctaaagatt atattctccc cgttggtctt ttatcaggag aaagtgttta 6060
gaatcaaaag gtttatttag gtttgtcttt tgtgggttga ttaaaagtcc ttacctaatt 6120
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ttcttagttt taaattcaaa aagaagaggt aagatttaag cctaaaatct tacctcttct 6240
tttatcagcc cttattattt tctttcaagc acaaactgac ttaaaacgcc attaataaac 6300
ttactggatt tctcatctga atactttttt gcaatttcaa taatttcatt aagagcaaca 6360
cgttctggtg tttccttatg atatttaatt tcgtataaac ctaaacgcaa caggctctta 6420
tcaatcaaag tcaatcgaga aagcgtccag ccagactagt agggcaaact attaactggc 6480
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gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 6660
cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 6720
atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 6780
tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 6840
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gaccccttaa taagatgatc ttcttgagat cgttttggtc tgcgcgtaat ctcttgctct 6960
gaaaacgaaa aaaccgcctt gcagggcggt ttttcgaagg ttctctgagc taccaactct 7020
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gcagcggtcg gactgaacgg ggggttcgtg catacagtcc agcttggagc gaactgccta 7260
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gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca 7800
gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga 7860
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gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat catcatgaac aataaaactg tctgcttaca 8040
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cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg 8160
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ctggtatgag tcagcaacac cttcttcacg aggcagacct cagcgctcaa agatgcaggg 9180
gtaaaagcta accgcatctt taccgacaag gcatccggca gttcaacaga tcgggaaggg 9240
ctggatttgc tgaggatgaa ggtggaggaa ggtgatgtca ttctggtgaa gaagctcgac 9300
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ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 9780
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 9840
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 9900
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 9960
9960
PCT/RO/134表