一种从家禽全血样本快速分离高纯度红细胞的方法与流程

本发明涉及家禽血液分离鉴定检测技术领域。

背景技术：

1981年I. Siegel发现了红细胞的多种免疫功能，并预见了血清中存在着红细胞免疫调节系统及红细胞杀伤病原的作用。20世纪50年代，Nelson首次发现红细胞具有免疫粘附功能，粘附的复合物更易被白细胞吞噬。现已证实，红细胞能自我调控和参与机体免疫调控，具有粘附、杀伤抗原、传递抗原信息和清除循环中免疫复合物的作用，是完整机体兔疫系统中的重要组成部分。“红细胞免疫系统”的新概念，更新了人们对红细胞功能的认识，使红细胞免疫研究得到了迅速发展。

红细胞与其他细胞均来源于骨髓造血干细胞，以往认为红细胞的主要功能是运输气体及调节酸碱平衡。目前的研究表明，红细胞通过自身C3b受体去识别、粘附、浓缩、杀伤抗原和清除有害物质，是整体兔疫系统不可缺少的组成成分。

红细胞能清除循环兔疫复合物，促进吞噬作用，类似兔疫细胞的功能红细胞还具有识别、储存、递呈抗原的功能和效应细胞样作用。此外，红细胞对免疫功能的还具有调控作用。红细胞对吞噬细胞、淋巴细胞具有调控作用，并促进T细胞分化。红细胞还能直接增强NK细胞的抗肿瘤活性，显著提高淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞的活性。影响红细胞免疫功能的影响因素主要有，血清中红细胞兔疫调节因子，神经内分泌系统的调控以及温度调控。

动物红细胞免疫研究起步较晚，郭峰等1982年建立的红细胞免疫粘附能力测定方法，国内张德成(1992)等率先测定了多种健康动物的红细胞C3b和IC花环率，其中包括对鸡、鸭、鹅等家禽的测定，由此开始了对家禽红细胞免疫功能的研究。随后，国内学者对健康家禽、患病家禽及疫苗免疫家禽的红细胞免疫功能等方而进行了以下几方面比较深入的研究。

1、正常家禽的红细胞免疫功能：

研究表明，不仅马、牛、羊、猪、驴等哺乳动物的红细胞具有免疫粘附功能，鸡、鸭、鹅、鸽、鹤鹑等禽类的红细胞同样具有免疫粘附活性，证明红细胞免疫系统假说不仅在哺乳动物中成立，也同样适用于禽类。

2、疾病对家禽红细胞免疫功能的影响：

患病家禽的红细胞免疫粘附活性有明显改变。患鸡霍乱、禽流感、鸡传染性囊病、鸡传染性喉气管炎、鸡传染性支气管炎、鸭病毒性肝炎、鸡包涵体肝炎等病的家禽的红细胞免疫粘附功能受损，C3b花环率明显降低。球虫病鸡红细胞C3b花环率显著降低，IC花环率升高。氟中毒病鸡的红细胞C3b花环率和IC花环率均降低，并有剂量一时间效应。对马立克氏病的研究相对较多，但结果不尽一致。高学军(1999)研究表明，1日龄AA雏鸡马立克氏病强毒人工感染后，红细胞C3b和IC花环率均先升高后降低。鲍恩东的研究显示，马立克氏病自然发病鸡C3b花环率降低，IC花环率略有降低。笔者认为，以上研究结果不一致的原因，可能与受试鸡龄期及种属不同有关，也可能与检测方法不够规范，标准不够统一有关。

3、疫苗免疫对红细胞免疫功能的影响：

李淑芳等(2002)研究表明，传染性喉气管炎疫苗免疫3天后，C3b和IC花环率显著降低，免疫后9天，花环率恢复至正常水平，疫苗免疫的同时使用中药增强剂能够消除红细胞免疫后功能短暂性降低的不良反应。鲍恩东等(2000)比较研究了马立克氏病18口龄胚胎免疫和1日龄雏鸡免疫对雏鸡红细胞免疫粘附功能的影响，发现胚胎免疫及雏鸡免疫均导致鸡红细胞C3b花环率升高，IC花环率降低，但胚免组C3b花环率升高幅度更大；IC花环率卜降幅度更大。作者认为，胚免鸡血清中红细胞免疫粘附抑制因子活性卜降，使得红细胞兔疫功能更好地发挥。

总体而言，国内外对于动物红细胞免疫功能的研究还停留在初级阶段，仅仅停留在红细胞玫瑰花环检测实验。主要限制红细胞功能研究的因素是难以获得高纯度的红细胞个体，排除血液中其他细胞的污染。

技术实现要素：

针对以上研究现状，本发明目的是提出一种快速、高效、高纯度分离家禽红细胞的方法，以利于对于家禽红细胞功能的研究。

本发明方法是：将柠檬酸钠或肝素抗凝的家禽血样先与PBS或生理盐水混合后再加到淋巴细胞分离液表面，经水平离心机离心处理，弃去离心后的血浆、淋巴细胞、淋巴细胞分离液和最上层的红细胞，取得高纯家禽红细胞。

通过该发明的方法高效，得到的家禽红细胞纯度达到99.9%以上，没有血液中其他细胞，尤其是淋巴细胞的污染，为研究家禽红细胞的生物学功能提供了非常好的生物样品。本发明建立了一种方便快速有效分离高纯度家禽红细胞的方法，便于显微操作，能够高效、准确地获取高纯度家禽红细胞进行后续的细胞鉴定及生物学功能研究。

进一步地，本发明所述淋巴细胞分离液的密度为1.119。为了使分离的红细胞污染淋血液中巴细胞的几率降到最低，本发明选择SIGMA公司密度为1.119的淋巴细胞分离液进行红细胞的分离。

所述家禽血样与PBS或生理盐水的混合体积比为1:1。为了达到淋巴细胞与红细胞分离的最佳效果，将家禽血样与PBS或生理盐水预先按此体积比混合。

所述水平离心机的离心率为200g，离心处理20分钟后采用离心机自然停止的方式。该离心条件操作可以最大程度避免分离的红细胞受到淋巴细胞的污染。

附图说明

图1为高纯度红细胞光学显微镜下的形态。

图2为高纯度红细胞瑞氏染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

一、高纯度家禽红细胞的分离：

利用柠檬酸钠或肝素抗凝管静脉采集家禽血液。

用密度梯度离心法，从取得的柠檬酸钠或肝素抗凝的家禽血样中分离红细胞的具体步骤如下：

1、采集2mL家禽血样与2mL的PBS或生理盐水混合。

2、缓慢地将4ml混合血样加到SIGMA公司销售的密度为1.119的4mL淋巴细胞分离液上，血液与淋巴细胞分离液的界面保持清晰。

3、将具有血液与淋巴细胞分离液的试瓶置于水平离心机上进行离心处理，调整水平离心机的离心率为200g，室温离心20min，离心结束时不能使用离心机自带的刹车系统，让离心机离心结束后自然逐渐停止。

4、离心结束后弃去血浆、淋巴细胞、淋巴细胞分离液以及最上层的红细胞，取得剩余物质。

5、将步骤4取得的剩余物质加入PBS或生理盐水至10mL，室温下，在离心率为200g的水平离心机中离心处理20min，弃去上清，取沉淀以PBS或生理盐水洗涤。

6、再将洗涤后的沉淀物经过两次与PBS或生理盐水混合，经离心，弃去上清的处理，取得洗涤三次的沉淀物。

7、将洗涤三次的沉淀物用淋巴细胞培养液重新悬浮。

二、分离红细胞的形态学观察：

将分离得到的家禽红细胞，置于光学显微镜下观察，形态成椭圆形，如图1所示，并肉眼可见明显的细胞核存在。利用细胞计数板对红细胞进行计数，每1000个红细胞才看见1-2个污染的淋巴细胞，因此利用本发明的方法分离的家禽红细胞纯度达到99.9%以上。

三、瑞氏染色法对家禽有核血细胞染色：

（1）玻片置于染片架上，滴加3～5滴瑞氏复合染色液，使其迅速覆盖标本1min。

（2）滴加缓冲液5～10滴，吸耳球对准玻片吹气，使缓冲液与染液充分混合，染色5-10 min。

（3）双蒸水冲洗，晾干。

（4）光学显微镜观察。

将染色的家禽红细胞置于光学显微镜下观察，如图2所示：形态呈椭圆形，细胞核成蓝紫色。同样在显微镜不同的视野中，利用细胞计数法对红细胞进行计数，每1000个红细胞看见1-2个污染的淋巴细胞，因此利用本发明的方法分离的家禽红细胞纯度达到99.9%以上。