一种人胎盘运输提取液及其替代胎牛血清制得的培养基的制作方法

本发明属于干细胞培养
技术领域：
，特别涉及一种人胎盘运输提取液及其替代胎牛血清制得的培养基。
背景技术：
：牛血清(胎牛血清和小牛血清)是培养细胞最重要的添加物，在各类细胞培养及生产中占据主导地位。然而，使用牛血清培养人细胞，特别是用于临床治疗的细胞，具有非常明显的缺点，包括：牛血清中可能含有疯牛病病毒、朊病毒等污染源，牛血清培养的人细胞会产生显著的免疫排斥反应，残留的牛血清白蛋白导致人体产生抗体及炎症等。有研究显示，牛血清培养的人细胞能吞噬牛血清蛋白成分，即使在多次且较长时间洗涤下仍然有较多的残留，足以诱导人产生免疫反应。因此，很多国家限制使用牛血清培养人细胞用于治疗。寻找合适的替代牛血清的添加物是进行细胞治疗的必要步骤，这些替代物包括添加生长因子的无血清培养基、人血小板裂解液、人自体及异体血清。其中，无血清培养基成分确定，但是价格昂贵，并非适合所有细胞类型。血小板裂解液具有类似人血清的功能，但是血小板数量少，来源匮乏，需要反复冻融处理释放内容物；而人自体血清相对于其他添加物具有明显的优势，如人自体血清培养自身细胞不会产生免疫反应，富含细胞生长所需的各种生长因子，有效的促进细胞生长和维持特性。到目前为止，采用自体血清培养成功的细胞类型，包括人树突状细胞(DC细胞)，雪旺细胞，上皮/内皮细胞，造血干祖细胞，类肝细胞，人骨髓、脐血、脂肪、软骨等来源的间充质干细胞。这些细胞培养过程中一般均采用牛血清为对照，对人自体/异体血清的培养性能进行了比较，包括生长速率、传代数、表面标记、分化潜能等。在基础研究方面，也对细胞的信号通路、表达谱、分子机制进行探索；整体的培养方面，有些研究认为自体血清优于小牛血清(FCS)，有些研究认为自体血清与FCS效果相当，有些研究表明FCS要好于自体血清。长期培养脂肪干细胞，采用人血清能加速扩增，延长寿命和克隆形成能力，表明应用性良好。将人的脂肪干细胞冻存4年后，采用5％人血清培养，从p2到p8代，细胞增殖速率加快，其中p5代细胞具有最佳的表面标记分布。在生长速率的比较上，树突状细胞用自体血清培养诱导仅为同浓度的胎牛血清(FBS)的得率的一半。人雪旺细胞用自体血清培养后，倍增时间为10.33天，比使用FBS的缩短1.4天。人内皮祖细胞的培养上，两者在生长及形态等各方面没有差别。StuteN等培养人间充质干细胞，采用低密度接种，3天内发现10％自体血清生长最好，优于10％FCS，且效果约等于3％人自体血清，到对数期时，仍然是自体血清快于FCS。同样的，在培养脂肪干细胞时，比较研究显示，第二代扩增速率产生显著差异，10％自体血清大于10％FBS，10％FBS约等于5％自体血清。培养人脂肪来源的干细胞，同时比较了FBS、人胎盘血清、自体血清和异体血清，在扩增效率方面，自体血清与人胎盘血清类似，优于异体血清，远好于FBS(见：StuteN，etal.ExpHematol.2004.32(12)：1212-1225)。经过血清培养后，干细胞的分化能力也进行了对比，不同的细胞对人血清的反应能力不同，分化方向也发生一些变化。用人血清培养间充质干细胞，对数期的表面标记没有差别，但是成骨分化能力上，人血清的比牛血清的好，在脂肪分化方面，则是FBS的更好；OreffoRO等的结果则是人血清促进了成骨和脂肪的分化能力(见：OreffoRO，etal.EurJCellBio1.1997.74：251-261)，有的研究通过成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)计数和碱性磷酸酶(ALP)阳性克隆计数表明具有相似的成骨分化能力(见：WolfF，etal.EurCellMater.2008.15：1-10.)。体外培养的细胞在第四代是分化能力产生显著差异，10％FBS的优于10％自体血清的，在体内两者则相差不大。另外的研究则显示培养到p6代，脂肪干细胞能有效的分化成脂肪和软骨细胞，但是成骨细胞形成能力减弱。分离的软骨细胞经过人自体血清培养后，仍然具备分化成软骨的能力，可以体外形成软骨块进行移植。通过上述的多个研究组的多例比较实验，人自体血清具有FBS类似的培养细胞的功能。在来源方面，MizunoN等简化了自体血清采集方法，他们用完全密封的无菌装置收集血清，并完成离心和分装，收集到的血清无需过滤除菌就可直接使用，并被成功用于骨髓间充质细胞的培养(见：MizunoN.etal.CellBiolInt.2006，30(6)：521-524.)。显然这种渠道获得范围很窄。人胎盘，又称紫河车，是常用的一种中药，中医认为胎盘是一种气血双补的良药。现代生物学和医学证明，胎盘中含有多种免疫球蛋白、活性肽、激素等生物活性物质及氨基酸、矿物质等成分。迄今为止，已有多种细胞生长因子从胎盘组织中分离出来，包括血小板源内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、转化生长因子、促细胞生长因子等。研究表明：胎盘提取液中含有多种细胞因子，可以促进细胞的生长；胎盘提取液可促进成纤维细胞、脐带血造血干细胞、人羊膜间充质干细胞的生长；人胎盘组织液可以通过提高抗氧化能力和减少细胞凋亡来延缓大鼠衰老。目前，储存胎盘干细胞时，同时提供了整个胎盘，胎盘包含胎盘血，是一个稳定的自体血清来源方式；此外，提取胎盘间充质干细胞只使用一小部分胎盘组织，剩余的胎盘组织往往被浪费掉，冻存的组织使用率微乎其微。因胎盘中含有多种细胞因子，可以从剩余的胎盘组织中制备胎盘提取物，添加到培养间充质干细胞的培养基中，促进细胞的增殖和延缓细胞的衰老。技术实现要素：本发明的第一目的是提供一种人胎盘运输提取液，通过将含胎盘血的合格人胎盘置于胎盘运输缓冲液中，静置、过滤得到一替代胎牛血清的人胎盘运输提取液，同时在培养基中加入人胎盘提取物，以解决现有技术中常使用胎牛血清作为细胞培养基添加物，而带来的引入污染源和免疫排斥反应等问题。本发明的第二目的是提供一种利用人胎盘运输提取液替代胎牛血清制得的培养基，通过将含胎盘血的合格人胎盘置于胎盘运输缓冲液中，静置、过滤得到一替代胎牛血清的人胎盘运输提取液，同时在培养基中加入人胎盘提取物，以解决现有技术中常使用胎牛血清作为细胞培养基添加物，而带来的引入污染源和免疫排斥反应等问题。本发明的第三目的是提供一种上述培养基在培养间充质干细胞的应用，通过将含胎盘血的合格人胎盘置于胎盘运输缓冲液中，静置、过滤得到一替代胎牛血清的人胎盘运输提取液，同时在培养基中加入人胎盘提取物，以解决现有技术中常使用胎牛血清作为细胞培养基添加物，而带来的引入污染源和免疫排斥反应等问题。本发明的技术方案如下：一种人胎盘运输提取液，所述的人胎盘运输提取液的制备包括以下步骤：无菌环境下，取合格的胎盘置于胎盘运输缓冲液中，4℃静置2～4h，收集上清液，离心，再经不同孔径的滤膜过滤，得到所述的人胎盘运输提取液。优选为，所述的胎盘运输缓冲液为6-10g/LNaCl，0.3-0.6g/LKCl，0.1-0.2g/LCaCl2，0.05-0.2g/LMgSO4，0.1-0.3g/LNa2HPO4·12HO2，0.04-0.1g/LKH2PO4，0.5-2g/L葡萄糖。优选为，所述的过滤步骤为依次经孔径为3um、1.6um、1.2um、0.8um、0.65um、0.45um和0.22um的滤膜过滤，其中孔径3um的滤膜为不锈钢筛网，孔径1.6um的滤膜为玻璃纤维素膜，孔径1.2um、0.8um、0.65um和0.45um的滤膜醋酸纤维素膜，孔径0.22um的滤膜为一次性500ml过滤系统。本发明还公开了一种利用上述的人胎盘运输提取液替代胎牛血清制得的培养基，所述的培养基中含有所述的人胎盘运输提取液。优选为，所述的人胎盘运输提取液的体积分数为5～40％，更为优选为5％、10％、20％、40％，最为优选为20％。优选为，所述的培养基中还含有体积分数为0.5％-2％的人胎盘提取物。优选为，所述的人胎盘提取物的制备包括以下步骤：无菌环境下，取人胎盘组织经清洗、除血水、匀浆破碎、消化、离心和过滤，得到所述的人胎盘提取物。优选为，所述的培养基为完全培养基。本发明还公开一种利用上述的培养基在培养间充质干细胞的应用。优选为，所述的间充质干细胞为胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞中的一种。与现有技术相比，本发明的有益效果如下：第一：本发明的一种人胎盘运输提取液，将含胎盘血的合格人胎盘置于胎盘运输缓冲液中，静置、过滤得到一替代胎牛血清的人胎盘运输提取液，避免胎牛血清作为培养基添加物时，带来的引入污染源和免疫排斥反应等问题；同时在培养基中还加入人胎盘提取物，提高了细胞增殖速率。第二：本发明的一种人胎盘运输提取液，可连续培养胎盘来源的多种自体间充质干细胞，建立自体间充质干细胞库，并可用于后续大规模培养制备，具有制备工艺简单、提取量大和成本低的优点；第三：本发明的一种人胎盘运输提取液，培养出来的大量间充质干细胞，可长期冻存，用于治疗自身免疫或炎症相关疾病。当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明图1为本实施例1的脐带间充质干细胞在含20％胎牛血清的α-MEMP0培养13天的示意图；图2为本实施例1的脐带间充质干细胞在含20％胎盘运输提取液的α-MEMP0培养13天的示意图；图3为本实施例1的脐带间充质干细胞在含10％胎牛血清的α-MEMP1培养6天的示意图；图4为本实施例1的脐带间充质干细胞在含20％胎盘运输提取液的α-MEMP1培养6天的示意图；图5为本实施例2的羊膜间充质干细胞在含20％胎牛血清的α-MEMP0培养3天的示意图；图6为本实施例2的羊膜间充质干细胞在含20％胎盘运输提取液的α-MEMP0培养3天的示意图；图7为本实施例2的羊膜间充质干细胞在含10％胎牛血清的α-MEMP1培养2天的示意图；图8为本实施例2的羊膜间充质干细胞在含20％胎盘运输提取液的α-MEMP1培养2天的示意图；图9为本实施例2的羊膜间充质干细胞在含10％胎牛血清的α-MEMP2培养1天的示意图；图10为本实施例2的羊膜间充质干细胞在含20％胎盘运输提取液的α-MEMP2培养1天的示意图；图11为本实施例2的羊膜间充质干细胞在含10％胎牛血清的α-MEMP3培养4天的示意图；图12为本实施例2的羊膜间充质干细胞在含20％胎盘运输提取液的α-MEMP3培养4天的示意图；图13为本实施例3的胎盘间充质干细胞在含20％胎牛血清的α-MEMP0培养5天的示意图；图14为本实施例3的胎盘间充质干细胞在含20％胎盘运输提取液的α-MEMP0培养5天的示意图；图15为本实施例3的胎盘间充质干细胞在含10％胎牛血清的α-MEMP1培养2天的示意图；图16为本实施例3的胎盘间充质干细胞在含20％胎盘运输提取液的α-MEMP1培养2天的示意图.具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。以下未注明具体技术和条件处，均按照本领域科技文献所描述的技术、条件或者产品说明书进行；所使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明的人胎盘运输、人胎盘运输提取液及其培养基和利用胎盘运输提取液培养自体胎盘附属物间充质干细胞均在严格的无菌环境下进行。人胎盘运输：对胎盘提供者进行血型检测、HLA分型检测、微生物学检测和病毒学检测，合格者的胎盘浸泡至胎盘运输缓冲液中，4℃冷链车、24小时内运输至指定地点。本发明的一种人胎盘运输提取液，所述的人胎盘运输提取液的制备包括以下步骤：1、收到上述胎盘的胎盘运输缓冲液，4℃静置2～4h，然后收集胎盘运输提取液的上清液，经5000rpm离心20分钟，收集上清；2、上清依次经孔径为3um、1.6um、1.2um、0.8um、0.65um、0.45um和0.22um的滤膜过滤，得到胎盘运输提取液，再用BCA试剂盒检测胎盘运输提取液中的总蛋白含量，如表1所示。表1胎盘运输提取液总蛋白含量检测样本总蛋白含量/(mg/ml)FBS21.53胎盘运输提取液11.39本发明还公开了一种利用上述的人胎盘运输提取液替代胎牛血清制得的培养基，所述的培养基中含有所述的人胎盘运输提取液和人胎盘提取物；所述的人胎盘运输提取液的体积分数为5～40％；所述的培养基中还含有体积分数为0.5％-2％的人胎盘提取物。本发明的人胎盘提取物的制备，包括以下步骤：取胎盘组织100g，用大量PBS清洗，尽量去除血水，然后把组织剪碎，再重悬在2-3倍体积的PBS中，匀浆破碎(10000rpm，1min/次，共5次)，添加胶原酶IV0.3g，37℃恒温摇床消化5h(消化2.5h后再添加0.3g消化酶)，然后低温高速离心(4℃，12000rpm，20min)，收集上清，上清经0.22um滤膜过滤，保存备用。本发明还公开一种利用上述的培养基在培养胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞的应用，所述的三种自体干细胞，原代开始，连续培养至少3代，培养P2或P3后，可以在液氮中长期冻存；原代培养的胎盘和羊膜间充质干细胞，第2天换液，然后每2天换液，原代培养的脐带间充质干细胞每3天换液，即消化法得到的细胞，一般是铺板24小时后首次换液，此后的换液恢复常规时间间隔，植块法从铺板后，换液时间间隔固定。实施例1：一种利用上述的人胎盘运输提取液替代胎牛血清制得的培养基培养脐带间充质干细胞采用植块法，把脐带剪成合适的小块，铺到平皿上，添加适量血清孵育1小时，然后添加适量的含本发明人胎盘运输提取液和人胎盘提取物的完全培养基，放置到温度为37℃、二氧化碳浓度为5％、湿度为95％的细胞培养箱培养。然后再做两组对比实验，每组3个重复，一组为含20％胎牛血清的α-MEM，一组为含20％胎盘运输提取液的α-MEM；且该两组均加入胎盘提取物。3天后添加2ml培养基，5天后观察细胞爬出情况，拍照记录，如图1～2所示，统计爬出细胞的组织块数。每2天观察细胞爬出情况，并统计。待细胞长至合适的数量，传代培养，即得P1细胞，培养6天，拍照记录如图3～4所示。胎牛血清培养的组血清浓度更换为10％，每3天换液，胎盘运输提取液培养的组胎盘运输提取液浓度依然为20％，每2天换液。待细胞长至融合度85％传代，计数，即得P2细胞。培养方法同P2细胞。以后每代细胞培养方法都同P1代细胞。每2天拍照观察细胞状态。实施例2：一种利用上述的人胎盘运输提取液替代胎牛血清制得的培养基培养羊膜间充质干细胞把10克羊膜剪成约0.1立方厘米大小的块，添加1mg/mlDispaseII和1mg/ml胶原酶IV，37℃，160rpm振荡消化1小时，200目筛网过滤收集细胞，收获的细胞用适量α-MEM培养基重悬，铺板，做两组对比实验，每组3个重复，变量为含20％胎牛血清的α-MEM和20％胎盘运输提取液的α-MEM；且该两组均加入胎盘提取物。第二天换液，去掉漂浮的未贴壁成分。更换培养基方法：胎牛血清培养的每3天更换新鲜培养基，胎盘运输提取液培养的每2天更换新鲜培养基。细胞长至融合度85％，传代，计数，即得P1细胞。胎牛血清培养的组血清浓度更换为10％，每3天换液，胎盘运输提取液培养的组胎盘运输提取液浓度依然为20％，每2天换液。P2、P3......培养方法同P1，拍照记录如图5～12所示。每2天拍照观察细胞状态。实施例3：一种利用上述的人胎盘运输提取液替代胎牛血清制得的培养基培养胎盘间充质干细胞剪取胎儿面的胎盘组织10克，酶消化法从胎盘组织中获得间充质干细胞。收获的细胞用适量α-MEM培养基重悬，做两组对比实验，每组3个重复，一组为含20％胎牛血清的α-MEM，一组为含20％胎盘运输提取液的α-MEM；且该两组均加入胎盘提取物。第二天换液，去掉漂浮的未贴壁成分。更换培养基方法：胎牛血清培养的每3天更换新鲜培养基，胎盘运输提取液培养的每2天更换新鲜培养基。细胞长至融合度85％，传代，计数，即得P1细胞。胎牛血清培养的组血清浓度更换为10％，每3天换液，胎盘运输提取液培养的组胎盘运输提取液浓度依然为20％，每2天换液。P2、P3......培养方法同P1，拍照记录如图13～16所示。每2天拍照观察细胞状态。以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属
技术领域：
技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。当前第1页1 2 3