本发明属于体外细胞培养技术领域，涉及一种体外骨髓间充质干细胞培养基。
背景技术：
骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derivedmesenchymal stem cells,BM-MSCs)是存在于骨髓基质系统中非造血性的成体干细胞，能在体内和体外诱导分化成骨、软骨、脂肪、肌肉等组织，且具有免疫调节功能，因而可以作为组织工程理想的种子细胞来源。但骨髓中间充质干细胞含量极少，必须在体外进行扩增以获得足够的细胞数量来满足应用需求。
目前，在BM-MSCs的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用是胎牛血清。血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用。但它也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞性作用。动物血清可能存在动物携带的已知未知病原体，对以后可能的临床应用构成威胁，对用于规模化培养细胞增加了难度。且每个批次的血清之间存在批间差异，使得到的培养结果出现差异。尽管研究人员尝试了很多的无血清培养基的方案，但无血清培养基普遍存在生长缓慢、甚至负增值的问题，致使处于RS的细胞进展到SR状态而丢失分化的能力。因此，无血清培养基用于间充质干细胞培养的研究至今也未取得重大突破。
华南理工大学吴伟等人在论文“骨髓间充质干细胞无血清培养”中建立了一种化学成分明确的、能用于体外扩增骨髓间充质干细胞的无血清培养基α-MEM培养基添加10mg/L bFGF、10mg/L EGF、5g/L BSA、1.5mg/L还原型谷胱甘肽、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、1％(V/V)SITE、10mg/L氢化可的松、10nmol/L地塞米松和氨基酸浓缩液。该培养基中骨髓间充质干细胞集落形成率仅为有血清组的一半，表明该无血清培养基中可能还缺乏促进集落形成的细胞因子，培养基组分和各组分的有效浓度还需进一步优化，以促进干细胞的自我更新(生物工程学报，2009，25(1)：121-128.)。
专利申请(CN101735980A)公布了一种体外培养骨髓间充质干细胞的完全培养基，其基础培养基为DMEM-L或DMEM/F12；所述培养基中还添加有胰岛素、白蛋白、转铁蛋白、业硒酸钠、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子、孕酮、还原型谷胱甘肽以及胎牛血清。该培养基采用低浓度的胎牛血清及其他添加成分进行复配，各成分起到协同作用，成功培养了骨髓间充质干细胞，从促进细胞增殖方面达到了与高浓度血清相同效果，在维持间充质干细胞干性方面优于胎牛血清。
由此可知，随着骨髓干细胞研究进一步深入，干细胞的应用研究也有了逐步发展，进而如何安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的问题也越来越突出，亟需开发一种骨髓间充质干细胞合适的培养基。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，其能够促进骨髓间充质干细胞快速增殖。
本发明通过以下技术方案实现：
一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，主要包括以下组分：基础培养基0.5-1g/mL，白蛋白2-4g/mL，胰岛素3-6g/mL，环庚三烯酚酮1.37-2.67μM，柠檬酸铁铵1.83-2.18μM，川续断皂苷Ⅵ4-8μM，亚硒酸钠20-60ng/mL，氢化可的松10-50μg/mL，还原型谷胱甘肽4.5-8μg/mL，成纤维细胞生长因子35-75ng/mL，和鸟氨酸浓度为0.01-0.10mM。
优选地，所述培养基由以下成分及浓度组成：基础培养基4.5g/mL，白蛋白2.75g/mL，胰岛素4.3g/mL，环庚三烯酚酮1.48μM，柠檬酸铁铵1.95μM，川续断皂苷Ⅵ5.7μM，亚硒酸钠35ng/mL，氢化可的松39μg/mL，还原型谷胱甘肽5.35μg/mL，成纤维细胞生长因子43ng/mL和鸟氨酸0.07mM。
进一步，所述基础培养基为DMEM-L培养基或DMEM/F12培养基。
本发明体外骨髓间充质干细胞无血清培养基各培养基成分是经过科学筛选得到的。白蛋白主要通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定和调节上述物质在无血清培养基中的活性作用，此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞的影响作用。胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是重要的细胞存活因子。环庚三烯酚酮和柠檬酸铁铵两者联合可与细胞表面受体结合传递铁离子，代替传统培养基中转铁蛋白的作用。在细胞培养基中，环庚三烯酚酮和柠檬酸铁铵两者联合能够影响铁的运输，进而影响细胞的生长，因此，确定环庚三烯酚酮和柠檬酸铁铵两者联合的最佳浓度尤为关键。川续断皂苷Ⅵ有促进骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的能力。微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的损害，因此亚硒酸钠的加入对细胞生长具有保护作用。成纤维细胞生长因子是维持骨髓间充质干细胞体外培养生存、增殖和分化所必须的补充因子。鸟氨酸在代谢中起到重要的作用。
本发明体外骨髓间充质干细胞无血清培养基与现有体外骨髓间充质干细胞培养基相比，具有以下优点：
(1)利用本发明培养基培养细胞，在细胞生长过程中，漂浮细胞少，具有良好的贴壁效果。
(2)在本发明细胞培养基中，细胞增殖迅速，细胞延滞期短，扩增倍数高。
附图说明
图1骨髓间充质干细胞在A培养基(实施例1培养基)、B培养基(对比例1培养基)、C培养基(对比例2培养基)和培养基D(市售培养基，货号：BW110017)中生长曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
原料来源：
DMEM(L)干粉：美国Hyclone公司
DMEM/F12干粉：Hyclone公司
川续断皂苷Ⅵ：中国药品生物制品检定所
下述骨髓间充质干细胞培养液配制所用到的基础培养基可以是DMEM(L)，也可以是DMEM/F12。
实施例1 一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基
一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基干粉4.5g/mL，白蛋白2.75g/mL，胰岛素4.3g/mL，环庚三烯酚酮1.48μM，柠檬酸铁铵1.95μM，川续断皂苷Ⅵ5.7μM，亚硒酸钠35ng/mL，氢化可的松39μg/mL，还原型谷胱甘肽5.35μg/mL，成纤维细胞生长因子43ng/mL和鸟氨酸0.07mM。
体外骨髓间充质干细胞无血清培养基制备方法为：
(1)准确称取相应浓度的基础培养基干粉，白蛋白，胰岛素，环庚三烯酚酮，柠檬酸铁铵，川续断皂苷Ⅵ，亚硒酸钠，氢化可的松，还原型谷胱甘肽，成纤维细胞生长因子，鸟氨酸，溶于体积为1L、温度为20-30℃超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液I；
(2)用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调溶液II的pH至7.2，得溶液II。
(3)将溶液II用0.22μm滤膜正压过滤除菌，即得。
实施例2 一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基
一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基干粉0.5g/mL，白蛋白2g/mL，胰岛素3g/mL，环庚三烯酚酮1.37μM，柠檬酸铁铵1.83μM，川续断皂苷Ⅵ4μM，亚硒酸钠20ng/mL，氢化可的松10μg/mL，还原型谷胱甘肽4.5μg/mL，成纤维细胞生长因子35ng/mL和鸟氨酸0.01mM。
制备方法与实施例1类似。
实施例3 一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基
一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基干粉1g/mL，白蛋白4g/mL，胰岛素6g/mL，环庚三烯酚酮2.67μM，柠檬酸铁铵2.18μM，川续断皂苷Ⅵ8μM，亚硒酸钠60ng/mL，氢化可的松50μg/mL，还原型谷胱甘肽8μg/mL，成纤维细胞生长因子75ng/mL和鸟氨酸0.10mM。
制备方法与实施例1类似。
对比例1 一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基
一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基干粉4.5g/mL，白蛋白2.75g/mL，胰岛素4.3g/mL，环庚三烯酚酮1.48μM，柠檬酸铁铵1.95μM，川续断皂苷Ⅵ1.5μM，亚硒酸钠35ng/mL，氢化可的松39μg/mL，还原型谷胱甘肽5.35μg/mL，成纤维细胞生长因子43ng/mL和鸟氨酸0.07mM。
制备方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，加入川续断皂苷Ⅵ浓度降低为1.5μM。
对比例2 一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基
一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基干粉4.5g/mL，白蛋白2.75g/mL，胰岛素4.3g/mL，环庚三烯酚酮1.25μM，柠檬酸铁铵1.81μM，川续断皂苷Ⅵ5.7μM，亚硒酸钠35ng/mL，氢化可的松39μg/mL，还原型谷胱甘肽5.35μg/mL，成纤维细胞生长因子43ng/mL和鸟氨酸0.07mM。
制备方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，环庚三烯酚酮与柠檬酸铁铵的配比不同。
对比例3 一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基
一种体外骨髓间充质干细胞无血清培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基干粉4.5g/mL，白蛋白2.75g/mL，胰岛素4.3g/mL，环庚三烯酚酮1.48μM，柠檬酸铁铵1.95μM，川续断皂苷Ⅵ5.7μM，亚硒酸钠35ng/mL，氢化可的松39μg/mL，还原型谷胱甘肽5.35μg/mL，成纤维细胞生长因子43ng/mL，鸟氨酸0.12mM。
制备方法与实施例1类似。
与实施例1区别在于，将鸟氨酸浓度提升至0.12mM。
试验例1 细胞生长曲线的测定
人骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增：用骨穿针在骼后上棘抽取骨髓5ml，装入1mL含500μL肝素的PBS的无菌离心管中，等量PBS稀释，加到等体积的比重为1.073g/mL的淋巴细胞分离液上。2000转/min，离心30min，取中间云雾状的单个核细胞层，用DMEM(L)培养液离心洗涤2次，每次1000转/min，离心5min，弃去上清液。
分别用实施例1、对比例1-3人骨髓间充质干细胞培养基混悬并计数细胞，按5×106/ml接种于的培养瓶中，置37℃5％CO2饱和湿度的CO2孵箱中培养。2天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3天更换培养液1次。8～10d后细胞融合达50％-60％时第一次传代，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA 37℃消化2-2.5min。收取细胞悬液，1000转/min，离心5min。弃上清后用所述培养基重新悬浮细胞按1×104/mL传代培养。
细胞生长曲线的测定：取上述培养3代的培养细胞，制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5×103/ml，接种于24孔细胞培养板中，24h后用胰酶消化孔板中3个孔中的细胞并计数，连续每天取3孔，直至细胞长满孔时停止计数，以时间(d)为横坐标，以细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。结果如图1所示，在培养基A(实施例1培养基)、细胞培养基B(对比例1培养基)、细胞培养基C(对比例2培养基)和细胞培养基D(对比例3培养基)中，在接种后的第1、2天细胞数没有明显的变化，从第3天起，细胞大量增加，至第7天细胞量达到高峰，以后细胞增长速度减慢；其中培养基A(实施例1培养基)中细胞增殖最快，达到高峰，其中培养基A中细胞密度最大。