专利名称：由与破伤风类毒素结合的霍乱弧菌o139的脂多糖的多糖部分组成的缀合疫苗的制作方法
自从1992年10月在印度马德拉斯市郊出现霍乱弧菌(Vibriocholerae)O139，由这个菌株导致的流行性霍乱在印度次大陆迅速蔓延(1)。与霍乱弧菌O139感染相关的临床疾病似乎与霍乱弧菌O1 El Tor感染所致疾病在本质上相同。然而，与霍乱弧菌O1感染相反，霍乱弧菌O139感染主要影响霍乱弧菌O1地域中的成年人口，表明对这个新演变的菌株缺乏保护性免疫(1)。推测对O1和O139菌株的免疫应答之间有差异，这在保护性方面可能是相当重要的(33)。霍乱弧菌O139出现后跟随着静止期，据信这是偶发事件。然而，1996年在加尔各答病例出现高峰，而且O139血清群再次成为1996年9月在印度导致霍乱的主要血清群(32)。自从这最后一次爆发，该O139血清群始终存在于印度和孟加拉国(15)，并需要严密监测。
霍乱弧菌O139的传染性和流行性对发展中国家造成严重恐慌，因此需要这种新菌株的疫苗。霍乱弧菌O1和霍乱弧菌O139血清群之间无交叉保护作用，这在用活细菌免疫(2)或用康复期霍乱患者的血清被动保护(33)的兔中被证实，提示抗霍乱的保护作用是LPS特异性的。这个论点由在兔O139抗血清和抗-LPS抗体效价的保护作用之间观测到相关性得以支持(25)。
推测霍乱弧菌O139的出现是一种复杂的染色体重排的结果，包括编码参与O-特异性多糖(O-SP)生物合成的基因的横向转移(horizontaltransfer)(3，8，14，43)。事实上，霍乱弧菌O1和霍乱弧菌O139之间的主要不同之处是其细胞表面成分。与霍乱弧菌O1不同，霍乱弧菌O139表达荚膜多糖(CP)(43，46)。对CP和霍乱弧菌O139脂多糖(LPS)的结构已经定性(图1)(11，12，28，36)。尽管O139 LPS和CP呈现相同的重复单位，但只有CP是聚合的(12)。然而CP和LPS呈现共同的表位(43)。
已经研制了一些口服霍乱疫苗，包括灭活的或减毒活疫苗，以激发对这种霍乱弧菌新血清群的保护作用(10，23，40，44)。皮下施用的霍乱弧菌O139的各种亚细胞组分已经在霍乱实验的兔回肠袢模型中进行测试，而且抗O139血清群抗原的免疫应答表现为对保护性免疫是决定性的(4)。已经提议血清IgG抗体通过灭活粘膜表面的接种体(inoculum)而授予抗肠道疾病的保护作用(38)。发现全身性施用特异于霍乱弧菌O1的O-SP的IgG抗体可以保护新生小鼠对抗用霍乱弧菌O1在消化道内激发(challenge)后引起的体重下降和死亡(5)。霍乱弧菌O139 CP-破伤风类毒素缀合疫苗在霍乱实验的兔回肠袢模型中产生保护作用(24)。最近，与白喉毒素的一种重组突变体缀合的霍乱弧菌O139 CP示出在小鼠中激发具有杀弧菌活性的高水平血清抗-CP IgG(30)。其它用于预防霍乱的、基于多糖-蛋白质缀合物的疫苗也被研制(16，17)。
在此项研究中，合成了用与破伤风类毒素(TT)结合的霍乱弧菌O139的LPS(pmLPS)的多糖组分(O-SP+核心)制备的缀合物。这种缀合物的合成、定性和在小鼠中免疫原性已经确定。
所述缀合疫苗在小鼠中激发抗-O139抗体；对这些抗体的免疫学性质也进行了研究。正如在各种革兰氏阴性菌的许多LPS中所观测到的，霍乱弧菌pmLPS通过Kdo附于分子的脂质A部分(12，48)。这个键通过适度的酸性水解而分裂(图1)，以释放在其还原末端的携带Kdo残基的多糖(22)。在多糖-蛋白质偶联中应用Kdo部分的羧基，产生具有一个单一末端活性的缀合位点的糖。这个单一末端活性的pmLPS示出用作疫苗的高度潜力(i)O139特异性抗原决定簇是保守的；(ii)其是最简单的缀合构型，其中多糖链自蛋白质载体发出；(iii)偶联过程最易于控制，产生充分限定的非交联的、已知构型的水溶性缀合分子(22)。
已经示出荚膜细菌的酚一水提取产生一种LPS和CP水相混合物(11，28，37，46)。为证实在进一步纯化步骤后，LPS从CP中有效分离，将这两种细胞表面多糖使用鉴别染色通过三(羟甲基)甲基甘氨酸SDS-PAGE(tricine SDS-PAGE)鉴别。只有相当于LPS的快速移动的物质被银染，但缓慢移动形式的O139抗原不被银染。这个结果与O139 CP不被银染的先前观测资料一致(34)。认为多糖的银染色依赖于单糖残基中高碘酸盐敏感性顺式羟基基团的存在(9)。因此，O139 CP重复单位与LPS核心不同，缺少顺式羟基(11，12，28，36)而不被银染色。然而，这种CP是酸性的，通过阳离子染料爱茜蓝(Alcian Blue)染色。
本发明的各个方面均基于霍乱弧菌O139的LPS的单糖组分(O-SP+核心)，也称为pmLPS的性质的揭示，及更特别涉及用与破伤风类毒素(TT)结合的这种多糖组分制备的缀合物。
因此，本发明提供了抗弧菌感染的一种免疫原性组合物或所述组合物的聚合物，其包含与弧菌LPS的核心分子相结合的弧菌LPS的一个O-SP单位。
如本文所用本发明组合物的“聚合物”是指一种组合物，其包含一些、至少两个通过任何方法一个连一个或连接在一起的O-SP+核心(pmLPS)。
根据所述免疫原性组合物的一个优选的实施方案，与弧菌LPS的核心分子相结合的O-SP单位是缀合物的一部分，所述缀合物还包含一种载体蛋白。
载体蛋白为本领域技术人员所已知。细菌载体蛋白例如是白喉毒素、破伤风类毒素。
优选地
-所述弧菌O-SP单位和核心分子通过共价键与缀合物的载体蛋白结合。
-所述载体蛋白是细菌蛋白，例如破伤风类毒素。
根据所述免疫原性组合物的另一个优选的实施方案，其还包含一种佐剂和/或药用可接受的载体。
本领域技术人员已知所述佐剂和药用可接受的载体。
弧菌科(Vibrionacae)的菌种例如是解藻朊酸弧菌(V.alginolyticus)、霍乱弧菌、辛辛那提弧菌(V.cincinnatiensis)、V.diabolicus、双氮养弧菌(V.diazotrophicus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、火神弧菌(V.logei)、需钠弧菌(V.natriegens)、海蛹弧菌(V.nereis)、灿烂弧菌(V.splendidus)、塔氏弧菌(V.tubiashii)、V.halioticoli、V.ichthyoenteri、V.pectenicida和V.wodani。
根据所述免疫原性组合物的另一个优选的实施方案，LPS来自霍乱弧菌，更优选来自霍乱弧菌血清群O139。
根据所述免疫原性组合物的再一个优选的实施方案，O-SP单位和核心分子来自两种不同的弧菌。
本发明还包括一种疫苗组合物或所述组合物的聚合物，其包含与弧菌LPS的核心分子相结合的LPS的O-SP单位，所述疫苗组合物可以具有抗霍乱弧菌感染的保护作用。
根据所述疫苗组合物的一个优选的实施方案，所述疫苗具有抗霍乱弧菌感染的保护作用，优选抗霍乱弧菌血清群O139感染。
本发明还包括一种制备上述缀合物的方法，所述缀合物包含与弧菌LPS的核心分子相结合的一个O-SP单位和一种载体蛋白，所述方法包括a)从弧菌中提供LPS；
b)水解所述脂质A-核心键以获得与核心分子相结合的O-SP单位；c)衍生步骤b)中所述与核心分子相结合的O-SP单位；d)将步骤c)中所述衍生化的与核心分子相结合的O-SP单位与一种载体分子结合；e)收集步骤d)中所述与载体蛋白结合的结合核心分子的O-SP单位。
根据所述方法，与核心分子相结合的O-SP单位通过共价键与载体蛋白结合。
更优选地，在所述方法中-所述载体蛋白是一种细菌蛋白-所述细菌蛋白是破伤风类毒素-步骤a)的LPS来自霍乱弧菌，更优选来自霍乱弧菌血清群O139。
pmLPS的衍生比率，是本发明偶联过程的一个基本步骤，其低于常用的其它多糖(13，16)。然而，在此获得的多糖/蛋白质比率(0.99mol/mol)对在免疫的小鼠中产生强IgG应答是足够的。未缀合的pm-LPS主要激发IgM抗体，但只检测到低水平的IgG抗-LPS抗体。这种应答与在小鼠中测试的多糖的那些先前报道相似(45)。相反，pmLPS-TT缀合物主要激发IgG抗-LPS抗体，其在再免疫后加强。另外，在第四次免疫后，高水平的这些IgG抗体保持5个月。发现pm-LPS-TT具有典型的T细胞依赖性质。用来自一些其它肠细菌病原体的O-SP获得相似结果(7，29)。
令人感兴趣地，在用缀合于TT的pmLPS免疫的小鼠中获得的抗体识别纯化自霍乱弧菌O139的O-SP和CP。这个结果与CP和LPS共享由普通的六糖单位表达的共同表位的观测完全一致(12，43)。O139pmLPS和CP之间的这种交叉反应性由本发明的发现得以解释，即pmLPS-TT抗体与有荚膜和无荚膜的霍乱弧菌O139菌株均反应，而且与抗霍乱弧菌O139的保护作用可由这个新霍乱弧菌的LPS或CP的抗体介导这个观测结果一致(24，25，33，34，39)。本发明证明了缀合的pmLPS在激发小鼠中IgG应答的效力，还证明对这种霍乱弧菌O139缀合物的临床评估是正确的。
本发明还包括一种免疫人或动物抗弧菌感染的方法，其中所述方法包括为所述人或动物施用上述组合物，其中弧菌感染优选是霍乱弧菌感染，更优选是霍乱弧菌血清群O139感染。
因此，本发明还包括组合物在制备预防弧菌感染，优选预防霍乱弧菌感染及更优选预防霍乱弧菌血清群O139感染的药物中的用途，所述组合物包含与一种蛋白载体结合的结合弧菌LPS的核心分子的弧菌LPS的一个O-SP单位。
本发明还包括一种缀合化合物，其包含与一种蛋白载体结合的结合弧菌LPS的核心分子的弧菌LPS的一个O-SP单位。
根据所述缀合物的一个优选的实施方案，所述结合弧菌核心分子的弧菌O-SP单位通过共价键与所述蛋白载体结合。
根据所述缀合物的另一个优选的实施方案，所述蛋白载体是一种细菌蛋白，优选破伤风类毒素。
根据所述缀合物的另一个实施方案，所述弧菌LPS来自霍乱弧菌，更优选来自霍乱弧菌血清群O139。
根据所述缀合物的再一个实施方案，所述O-SP单位和核心分子来自两种不同的弧菌。
本发明通过以下本发明缀合物的制备和应用实施例得以进一步阐述。
然而应清楚地意识到这些实施例只是例证了本发明而无任何限制之意。
图1霍乱弧菌O139的LPS的全部结构。所述O-特异性多糖(O-SP)及核心结构取自Cox等所述(11，12)，脂质A结构根据Kabir(26)和Wilkinson(48)中所述排列。箭头表示通过乙酸处理水解的脂质A-核心键这种处理释放LPS(pmLPS)的多糖组分(O-SP+核心)。
图2霍乱弧菌O139的多糖制备分析。(A)三(羟甲基)甲基甘氨酸SDS-PAGE(16.5％)。将凝胶用银染色。(B)SDS-PAGE(10％)。将凝胶在用银染色之前用爱茜蓝预处理，爱茜蓝是一种结合酸性多糖的阳离子染料。(C)用超免疫O139小鼠抗血清作探针的免疫印迹分析。Mr值在左侧示出。MF迁移前沿。
图3双重免疫扩散。A、抗-LPS O139单克隆抗体(mAb)；1、pmLPS O139；2、LPS O139；3、CP O139；4、LPS O1；5、衍生化的pmLPS O139；6、pmLPS-TT。
图4在用pmLPS-TT免疫4次的单一小鼠血清中IgM(■)和IgG(●)抗-O139抗体、及O139杀弧菌药的抗体效价(▲)数量的时程。
图5在乳鼠模型中用10×LD50的霍乱弧菌O139激发产生的抗pmLPS-TT抗体的保护性活性NI，非免疫血清集合；IS，在第152和231天从用pmLPS-TT免疫的小鼠中获得的免疫血清集合。在激发48小时后记录健康状况。
实施例1LPS、pmLPS和CP的制备和定性将霍乱弧菌O139(菌株MO45，由日本京都大学Y.Takeda惠赠)在37℃在胰胨豆胨琼脂(Difco)中生长18小时。LPS通过热酚水提取(47)获得，随后经酶处理(Dnase、Rnase和蛋白酶)及超速离心。含有LPS的沉淀具有0.5％(w/v)的蛋白质和低于0.2％(w/v)的核酸。将LPS用乙酸处理以水解脂质A-核心键(图1)(19)。所得产物称为pmLPS。为制备CP，将LPS在含有脱氧胆酸的缓冲液中经过Sephacryl S-200柱从超速离心上清中除去(37)。含有CP的外水体积组分用10％(v/v)乙醇广泛透析以除去脱氧胆酸(37)，所述含有CP的外水体积组分通过在银染色之前在用爱茜蓝(结合酸性多糖的一种阳离子染料)处理的凝胶中的折射率和10％SDS-PAGE检测(9)。通过Limulus阿米巴状细胞溶胞产物分析确定所述LPS具有2×104单位内毒素/μg，所述pmLPS具有10单位内毒素/μg(21)。这种降低2000倍与先前的资料一致(16，42)。霍乱弧菌O139的LPS在16.5％三(羟甲基)甲基甘氨酸SDS-PAGE(31)中有两条致密的银染色条带(41)，Mr值为大约4,000和6,200(图2A)。霍乱弧菌O1的LPS有两条条带，Mr值为4,000和15,000(图2A)。这与已经观测到的O139 O-SP有一个六糖单位(12)而O1 O-SP有12-18个重复单糖单位(27)的结果一致。在10％SDS-PAGE(图2B)中，在用银染色之前用爱茜蓝处理的凝胶中，O139 LPS有一条条带，在凝胶的底部有成片条带，O139 CP有两条条带，Mr值为100,000和200,000，与这种多糖的聚合结构一致(28，36)。霍乱弧菌O139 LPS和CP在免疫印迹试验中均由抗-O139超免疫小鼠血清识别(图2C)。这与已经观测到的O139 O-SP与O139 CP共有一个表位的结果一致(43)。这种超免疫(hyperimmune)小鼠血清在相同条件下不与霍乱弧菌O1 LPS反应。如前所述(6)制备的单克隆抗体(mAb)用纯化的O139 LPS通过ELISA筛选，并通过针对O139和O1 LPS的免疫印迹分析及通过用霍乱弧菌O139和O1细菌细胞凝集以检测特异性。检测IgM类的克隆B-16-5对O139 pmLPS和O139 CP的高度亲和力，通过ELISA抑制试验确定。双扩散分析示出在LPS、pmLPS、CP和B-16-5 mAb(图3)之间的一个单一条带的沉淀。所述pmLPS产生与LPS相同的一个条带提示O-139-特异性抗原决定簇在pmLPS纯化期间被保护。用霍乱弧菌O1的LPS，血清型Inaba未观测到交叉反应性。在Bruker AC 300P分光计上记录的pmLPS的1H和31PNMR光谱，与先前报道的那些相同(11)。1H NMR光谱证实不存在小的有机分子。
实施例2霍乱弧菌O139缀合物的制备和定性-细菌菌株霍乱弧菌O139，菌株MO45，于1992年从马德拉斯(印度)的一个患者体内分离，由Y.Takeda(日本京都大学)惠赠。使用这个菌株制备O139抗原。
-制备LPS和pmLPS将细菌在37℃在Roux瓶中的胰胨豆胨琼脂(Difco，Detroit，Michigan)中生长18小时。将细胞再悬浮于蒸馏水中，并通过热酚水提取(47)获得LPS，随后经酶处理(Dnase、Rnase和蛋白酶)和超速离心(100,000g，3小时)。将超速离心的上清在-20℃贮存。含有LPS的沉淀用蒸馏水透析并冻干。这种制品含有0.5％(w/v)蛋白质和低于0.2％(w/v)核酸。将LPS用乙酸处理以水解脂质A-核心键(图1)(19)。将LPS(于1％(v/v)乙酸水溶液中10mg/ml)在100℃加热60分钟。通过低速离心(350g，10分钟)除去沉淀的脂质。将上清用等体积的氯仿—乙醇(2∶1)提取。反应混合物用力振荡，并在10,000g离心30分钟。该水相用蒸馏水透析以除去乙醇，然后冻干。所得产物称为pmLPS。
pmLPS的衍生化和缀合pmLPS用己二酸二酰肼(ADH)衍生化，如针对嗜血流感杆菌b(Haemophilus influenzae b)和志贺氏菌属(Shigella dysenteriae)多糖进行衍生化所述(7，22，29)。将多糖(于0.2M NaCl中5mg/m)用0.1MNaOH将pH调节为10.75，并加入等数量的溴化氰(Cyanogen Bromide)(于乙腈中10mg/ml)。将该混合物在冰上温育6分钟，并用于pHStat719S(Metrohm，Herisau，瑞士)中的0.1M NaOH将pH保持在10.75。加入于0.5M NaHCO3中的等体积的0.8M ADH，并用0.1M HCl将pH调节为8.5，在4℃用pHStat保持3.5小时。然后，将该反应混合物在4℃搅动过夜，并用去离子水在相同温度透析3天。将透析袋的内容物冻干，在超纯水中重建，经过P-10 Sephadex柱，集合外水体积组分并冻干。
将衍生化的pmLPS(pmLPS-AH)以5mg/ml溶解于0.2M NaCl中。加入等重量的TT(Pasteur-Mérieux，Marcy-l’Etoile，法国)，并用0.1M HCl将pH调节为5.3。加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)至终浓度为0.05M，并在4℃用pHStat将pH保持4小时。将该反应混合物在4℃用PBS透析两天，然后经过于PBS中的CL-6B Sepharose柱(1.5×90cm)。通过在280nm测定光密度检测TT，并通过测定折射率检测多糖。
激活的pmLPS的衍生化程度以ADH/多糖的比率计算，为5.2％(mol/mol)。针对缀合物而言，pmLPS/蛋白质(wt/wt)比率为1.90％，相当于0.99mol/mol比率。通过缀合物中糖的数量与衍生化的多糖的初始数量的比率计算，产量为9.6％。在双重免疫扩散分析中，mAb B-16-5有与pmLPS，衍生化的pmLPS和TT-pmLPS相同的一个线系，提示与O-SP和CP共有的O139抗原性决定簇在pmLPS缀合期间被保护(图3)。
多糖制品的定性在于具有0.05％(w/v)NaN3的0.5M NaCl中的1％(w/v)琼脂糖(IndubioseIBF，Villeneuve-la-Garenne，法国)中进行双重免疫扩散分析。通过Lowry’s分析测定蛋白质浓度，使用牛血清白蛋白作为标准。通过Limulus阿米巴状细胞溶胞产物(LAL)分析(Bio-Whittaker，Walkersville，Md)检测的残留LPS，以相对于美国标准的内毒素单位表示(21)。使用1％琼脂糖平板经电泳检测核酸，用由HindIII水解的λDNA作为标准。LPS、pmLPS和CP通过10％SDS-PAGE分析，并在银染色之前用0.5％(w/v)爱茜蓝染色(9)或者电转移至硝化纤维以进行免疫印迹分析。通过三(羟甲基)甲基甘氨酸SDS-PAGE(31，49)，使用16.5％(w/v)电泳胶和4％积层凝胶及银染色分析LPS和pmLPS。pmLPS的1H和31PNMR光谱在Bruker AC 300P分光计上记录。
实施例3制备霍乱弧菌O1缀合物-细菌菌株于1995年从马里的一个患者体内分离的霍乱弧菌O1 CNRVC950707，血清型Inaba菌株，用于制备O1 LPS。
-制备LPS和pmLPS使用与霍乱弧菌O139相同方法制备(见实施例2)。
pmLPS的衍生化和缀合唯一修改之处是在pHStat中试剂温育步骤的温度，针对O1缀合物使用室温代替前述针对O139缀合物的+4℃(见实施例2)。
实施例4小鼠的抗-O139和抗-TT抗体应答-免疫将6周龄的雌性BALB/c鼠皮下注射2.5μg的pmLPS O139，或者作为缀合物注射(见2)，如表1的脚注所述。将一组小鼠相似地用2.5μg的TT免疫。通过ELISA测定LPS和TT抗体水平。将平板用LPS或TT包被。分析连续两倍稀释的小鼠血清(1/100-1/6,400)。所用的二级抗体是过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG(γ链特异性)或IgM(μ链特异性)。针对每类免疫球蛋白计算结果，作为高效价的参考血清的百分率使用疾病控制中心的程序通过平行线性分析特定为100单位ELISA(EU)值，并以几何平均数表示(35)。根据相同的方法，抗TT抗体水平根据用TT重复免疫小鼠制备的超免疫小鼠集合的标准血清表示。血清抗-O139抗体效价示于表1。预免疫的血清和PBS对照血清含有不可检测水平的抗体。在第二次免疫后，pmLPS激发中等强度的IgM应答和非常弱的IgG应答，与由T细胞非依赖性抗原产生的应答一致。在用pmLPS-TT第三次免疫后，IgM效价与应答pmLPS激发的那些抗体效价相等。在第四次免疫后，pmLPS-TT与pmLPS相比激发非常高的IgG应答(P＝0.0011)，持续至少231天(P＝0.0046)。这种IgG应答表明一种加强作用和一种免疫球蛋白同种型转变。这强有力地提示由于蛋白质载体的作用，pmLPS转变为T细胞依赖性抗原。在抑制ELISA中(42)，O139LPS的抗pmLPS-TT抗体由O139 LPS(产生50％抑制的抗原数量8μg/ml)或O139 CP(1μg/ml)抑制。血清抗-TT抗体效价示于表1。预免疫的血清含有不可检测水平的抗体。在第三次免疫后，pmLPS-TT激发抗-TT IgG水平明显升高(P＜0.01)，与在只用TT免疫的小鼠中的结果相似。
-杀弧菌抗体应答如(5)中所述进行杀弧菌试验，使用霍乱弧菌O139菌株MO10-T4的两倍稀释液(以初始1∶10稀释液开始)作为靶菌株及使用豚鼠血清作为补体来源，所述霍乱弧菌O139菌株MO10-T4是MO10的一种自发的无荚膜变体(43)，由A.Weintraub(Karolinska Institute，Huddinge，瑞典)惠赠。杀弧菌效价限定为血清最高稀释液相反导致100％细菌裂解。除了通常的细胞对照和补体对照，每个分析的对照还包括效价为1/2560的阳性超免疫对照血清。对用pmLPS-TT免疫的一个小鼠的连续血清测试杀弧菌活性(图4)。在杀弧菌抗体效价的动力学和抗-O139 IgG水平之间存在相关性(相关系数＝0.89)。在用pmLPS-TT免疫的其它小鼠血清中的发现支持这种相关性。
-抗-pmLPS-TT抗体的保护性活性使用5天龄和3.3-4,4g重的瑞士小鼠进行口服霍乱弧菌O139激发实验。霍乱弧菌O139菌株用于在小鼠中进行口服激发实验，所述菌株于1992年从印度一个患者体内分离，并根据其产生高水平霍乱毒素(5μg/ml)的能力加以选择。在除去分泌的霍乱毒素之后，将在37℃与0.1ml各种稀释的免疫血清预温育30分钟的剂量为3.5×108的霍乱弧菌细胞(半数致死剂量的10倍)，用钝头的喂食针管送入小鼠胃中。只接受弧菌悬浮液，只接受PBS或只接受具有未免疫的小鼠血清的弧菌悬浮液的小鼠组作为对照。将小鼠在30℃保持48小时或直至死亡，对所有存活的小鼠在48小时评价为健康或患病。如果小鼠符合所有以下标准则认为其患病腹泻，皮肤充实感明显降低，而且对刺激应答较低。接受1∶5稀释的从pmLPS-TT免疫的小鼠中在第152天和231天收集的集合免疫血清的小鼠明显被保护(图5)。随着集合血清的稀释度升高，保护水平降低，因此保护是剂量依赖性的。在接受集合的未免疫对照血清的小鼠中观测到无保护作用。
表1在单独用pmLPS或作为缀合物进行免疫后的小鼠中激发的血清抗-LPS和抗TT抗体几何平均数ELISA效价(25-75％)a抗体和免疫原天b抗-TT IgG 抗-LPS IgM 抗-LPS IgG PcpmLPS-TT pm-LPS pmLPS-TT pm-LPSpmLPS-TT0*＜1＜1 ＜1＜1 ＜1NSd7＜12.8(2.3-3.5)1.8(1.5-2.2) 1.4(1.3-.5) 1.2(0.9-1.6) NS14*21 9.3(5.3-2.2) 7.9(4.8-6.2(5.4-8.8) ＜1 1(0.8-1) NS14.2)28*35 61.9(52.8- 17.5(7.5- 17.7(12.3- ＜1 1.8(0.9-4.6) NS109.5) 41.8) 24.3)56*63 193.5 6.5(3.6-1.4)8.1(6.2-9) 2(1.2-4.9)11.7(8.1- 0.0011
(155.9- 15.3)219.2)91 280.5 4.2 (3.1-7.5 (5.7- ＜136.3 (11.7-0.0357(204.1-6.8) 8.8)67.3)454.8)119191.3 4.4 (2.5-2.8(2-3.5) 1.2 (1.1-21.4 (7.3- 0.0249(156.4-6.9) 3.3) 45.8)308.8)152209.5 4.2 (2.9-12.7(10.1- 2.5 (2.1-29.9 (14.8-0.0131(181.1-6.4) 15.3)3.1) 78.3)295.3)190192.2 4.6 (3.5-7.2(6-9.5) 1.3 (1.1-30.6 (15.7-0.0055(147.9-6.6) 2.2) 72.3)277.9)231183e(144.4- 4.5 (3.1-6.3e(4.5- ＜1 23.8e(12.3-0.0046249.5) 6.5) 9.3) 60.6)
a将10只小鼠皮下注射含有皮下注射含有2.5μg缀合物的盐水溶液，以两周将注射3次，并在4周后进行第4次注射。在每次注射后7天放血，然后在第4次注射后6个月每月再次放血。
b用*标示免疫天数。
c由pmLPS-TT与pmLPS对比激发的抗LPS IgG的效价对比(P值由研究者的t试验计算)。
dNS，无意义。
e测试9只小鼠。
实施例5用霍乱弧菌O1缀合物获得的结果将小鼠如前述用霍乱弧菌O139缀合物免疫。在第一次免疫后7天和68天血清抗O1抗体效价示于表2。
表2在用霍乱弧菌O1缀合物免疫7天和68天后，小鼠中血清抗霍乱弧菌O1 LPS抗体的ELISA效价aELISA效价小鼠数抗-LPS IgM 抗-LPS IgG免疫后 免疫后 免疫后免疫后第7天 第68天 第7天 第68天1 ＜14262 ＜151823 ＜162134 ＜164185 ＜172136 ＜14277 ＜132188 ＜113 2369 ＜1421410 ＜1937a将小鼠皮下注射含有2.5μg缀合物的盐水溶液，以两周将注射3次，并在4周后进行第4次注射。将小鼠在第一次免疫后第7天和第68天放血。
霍乱弧菌O1缀合物激发高水平的IgG抗体，相比之下IgM抗体水平较低。因此，霍乱弧菌O1多糖的缀合赋予这种多糖以T细胞依赖性。
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权利要求
1.一种抗弧菌感染的免疫原性组合物或所述组合物的一种聚合物，所述组合物包含与弧菌LPS的核心分子相结合的一种弧菌LPS的O-SP单位。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中与弧菌LPS的核心分子相结合的O-SP单位是一种缀合物的一部分，所述缀合物还包含一种载体蛋白。
3.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述弧菌O-SP单位和核心分子通过共价键与所述缀合物的载体蛋白结合。
4.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是一种细菌蛋白。
5.权利要求4的免疫原性组合物，其中所述细菌蛋白是破伤风类毒素。
6.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含一种佐剂和/或药用可接受的载体。
7.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述LPS得自霍乱弧菌。
8.权利要求1的免疫原性组合物，其中LPS得自霍乱弧菌血清群O139。
9.一种具有抗弧菌感染的保护作用的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含权利要求1的免疫原性组合物。
10.权利要求9的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物具有抗霍乱弧菌感染的保护作用。
11.权利要求10的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物具有抗霍乱弧菌血清群O139感染的保护作用。
12.一种制备缀合物的方法，所述缀合物包含与一种蛋白质载体结合的来自弧菌LPS的一个O-SP单位，所述O-SP单位与弧菌LPS的核心分子相结合，所述方法包括a)从弧菌中提供LPS；b)水解脂质A-核心连键，以获得与核心分子相结合的一个O-SP单位；c)衍生步骤b)中所述与核心分子相结合的O-SP单位；d)将步骤c)中所述衍生化的与核心分子相结合的O-SP单位与一种载体蛋白结合；e)收集步骤d)所述与载体蛋白结合的结合核心分子的O-SP单位。
13.权利要求12的方法，其中与核心分子相结合的O-SP单位通过共价键与载体蛋白结合。
14.权利要求12的方法，其中所述载体蛋白是一种细菌蛋白。
15.权利要求14的方法，其中所述细菌蛋白是破伤风类毒素。
16.权利要求12的方法，其中步骤a)的LPS来自霍乱弧菌。
17.权利要求16的方法，其中步骤a)的LPS来自霍乱弧菌血清群O139。
18.包含一种缀合化合物的组合物在制备用于预防弧菌感染的药物中的用途，所述缀合物包含与一种蛋白载体结合的弧菌LPS的一个O-SP单位，所述O-SP单位与弧菌LPS的一个核心结合。
19.权利要求18的用途，其中所述弧菌感染是霍乱弧菌感染。
20.权利要求19的用途，其中所述霍乱弧菌感染是霍乱弧菌血清群O139感染。
21.一种缀合化合物，其包含与一种蛋白载体结合的弧菌LPS的一个O-SP单位，所述O-SP单位与弧菌LPS的一个核心分子相结合。
22.权利要求21的缀合化合物，其中所述与弧菌核心分子相结合的弧菌O-SP单位通过共价键与蛋白载体结合。
23.权利要求21的缀合化合物，其中所述蛋白载体是一种细菌毒素。
24.权利要求23的缀合化合物，其中所述细菌毒素是破伤风类毒素。
25.权利要求21的缀合化合物，其中所述弧菌LPS来自霍乱弧菌。
26.权利要求25的缀合化合物，其中所述霍乱弧菌LPS来自霍乱弧菌血清群O139。
27.权利要求1的组合物，其中所述O-SP单位和核心分子来自两种不同的弧菌。
28.权利要求21的缀合物，其中所述O-SP单位和核心分子来自两种不同的弧菌。
29.一种对人和动物进行免疫以抗弧菌感染的方法，其中所述方法包括给所述人或动物施用上述组合物，其中所述弧菌感染优选是霍乱弧菌感染且更优选是霍乱弧菌血清群O139感染。
全文摘要
本发明涉及一种由霍乱弧菌O139的脂多糖(LPS)的多糖部分(O－特异性多糖+核心)(pmLPS)制成的缀合物，其通过用己二酸二酰肼对pmLPS衍生化，并通过碳二亚胺介导的缩合与破伤风类毒素(TT)偶联而制备。所述缀合物激发高水平的IgG抗体，该抗体在第一次接种3个月后达到高峰，并在随后的5个月内缓慢降低。TT单独或作为缀合物的一种成分主要诱导IgG抗体。由该缀合物激发的抗体识别来自霍乱弧菌O139的荚膜多糖(CP)和LPS，而且是杀弧菌的。它们在霍乱感染的新生小鼠模型中也有保护性。O139 pmLPS的缀合因此增强其免疫原性并赋予此多糖T细胞依赖性质。
文档编号A61K47/48GK1558773SQ02807887
公开日2004年12月29日 申请日期2002年4月5日 优先权日2001年4月6日
发明者琼－米歇尔·福涅尔, 阿兰·布托尼尔, 布托尼尔, 琼-米歇尔 福涅尔 申请人:巴斯德研究院