专利名称：体液中lbp的定量方法
本申请是申请日为1994年1月24日的美国专利申请系列号08/186,811的部分继续申请。
本发明的背景本发明涉及确定在包括血样的体液样品中脂多糖结合蛋白质(LBP)之存在的方法。
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜常见的成份，并引起许多与革兰氏阴性细菌感染和内毒素血病有关的病理效应。因为细菌感染和脓毒病之间的关系，所以已尝试建立内毒素的血清/血浆水平与疾病之间的相关性。一般地，使用鲎属阿米巴状细胞溶胞产物(LAL)试验测定内毒素水平，其中内毒素起动一种能用物理测定、浊度测定或发光光度术测定的凝固级联反应。尽管作了这些努力，然而，并没有确定内毒素水平和脓毒病的严重程度或后果之间的可信的相关性。这很可能是由下述事实造成的(1)脓毒症病人的内毒素水平非常低()10pg/L)；(2)一些血清蛋白质干扰蛋白水解LAL级联反应；(3)内毒素一旦与血液接触就能够通过与包括高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的各种血液成份互相作用而解毒；以及(4)来源于不同革兰氏阴性有机体的内毒素触发LAL级联反应的能力不同。因此，病人样品中内毒素的绝对水平可能不会与体内存在的生物活性内毒素的实际浓度相对应。
在人类和其它以高亲和力结合LPS的动物中鉴定了两种相关的蛋白质。这两种蛋白质脂多糖结合蛋白质(LBP)和杀菌/增强通透性蛋白质(BPI)具有大约相同的分子量并且共有45％的氨基酸同源，但仍然表现出明显的生理差异。LBP是在肝脏中合成的60KD的糖蛋白，而BPI在中性白细胞的嗜苯胺蓝粒中发现。在正常人血清中发现的LBP水平为5-10μg/mL，但在脓毒症病人中能达到50-100μg/mL。Schumann等，Science，249-1429页(1990)公开了人类和兔LBP的氨基酸序列以及编码CDNA。象BPI一样，LBP具有一个脂质A结合位点并且结合来自于粗糙(R-)和光滑(S-)型细菌的LPS。不同于BPI，LBP不具有显著的杀菌活性。已发现BPI能中和和抑制由于LBP与LPS和单核白细胞和巨噬细胞上的CD14的相互作用而引起的TNF生产。Marra等，J.Immunol.148-532页(1992)，Weiss等，J.Clin.Invest.90-1122页(1992)。相反，发现LBP能提高LPS诱发的TNF生产。Wright等，Science，249-1131页(1990)。因此，与BPI相对比，LBP被认为是一种免疫刺激分子。例如，参见Seihamer的PCT国际申请WO93/06228，其公开了一种被定义为LBP-3的LBP变异体形式。对于本发明，同样要考虑Vlevitch的PCT国际申请WO91/01639，其中公开了抗LBP抗体作为一种抗脓毒症治疗剂，以及美国专利号5,245,013，它涉及LBP，并公开了能与LBP同源的多肽进行免疫反应的抗体。
在本领域中LBP被鉴定为“急性期蛋白质”，它是许多随感染性和非感染性组织破坏过程而升高浓度的血浆蛋白质(例如C-反应蛋白质、纤维蛋白原和血清淀粉状蛋白A)中的一种。因此，可预料到来自患有许多自身免疫疾病例如类风湿性关节炎和红斑狼疮的病人的样品中的LBP水平将提高。
对于本发明感兴趣的是涉及在受试者中测定BPI活性的公开内容。 Von der Mohien等，Abstract，13th International Symposiumon Intensive care and Emergency Medicine，Brussels(1993年3月)公开了在革兰氏阴性脓毒症病人和健康受试者中BPI血清水平的测定结果。这篇文摘公开了在这种测定条件下在健康受试者血清中检测不到BPI，而在所有脓毒症病人中检测到循环的BPI。同时值得注意的是申请日为1993年12月29日的共同未决的美国专利申请系列号08/175,276的说明书，它是申请日为1993年9月22日的申请08/125,677的部分继续申请，在此引入其说明书以供参考。这些专利申请公开了在血浆样品中BPI水平与脓毒症的存在或不存在相关，而血清样品中的BPI水平与之无关。这份专利申请指出血清中的BPI水平不代表循环血液中的内源性细胞外BPI水平，而血浆中的BPI水平可代表。
同时，对于本发明所感兴趣的是Letureq等，Keystone TahoeEndotoxin conference，1992年3月，1-7(摘要)，其中报导了抗人体LBP单克隆抗体的产生。还报导了用于测定LBP存在的正常人血清样品的筛选。据报导正常血清样品的LBP水平是1μg/ml-24μg/ml，平均为7μg/ml。更感兴趣的是Richard Ulevitch at theAmerican Society for Microbiology General Meeting in Atlanta，Geor-gia May 16-21(1993)的公开内容，它提供了脓毒症患者和健康人血清中LBP和可溶性CDl4的水平。健康成人血清中的平均可溶性CD14和LBP浓度分别为1μg/ml和7μg/ml。据报导，脓毒症患者血清中的平均可溶性CD14和LBP浓度分别为2μg/ml和55μg/ml。
Geller等，Arch.surg.，128期22-28(1993)公开了一些实验，其中在已知的诱导急性期反应的三种模型(1)LPS注射；(2)微小棒状杆菌注射及(3)松节油注射中研究了LBP mRNA的诱导。该刊物报导了在肝的炎症期间诱导LBP mPNA，并建议LBP是在调节体内对内毒素发生反应的重要急性期蛋白质。
Gallay等的Intect.Immun.，61期378-383页(1993)公开了在注射诱导LBP合成的硝酸银的小鼠中的急性期反应，并且在急性期反应之后LBP水平比正常水平大约提高了10倍。
在本领域中存在对用于测定受试者所接受的内毒素和用于从其它急性期生理反应中辨别接受内毒素的效应之方法的需要。同时需要用于诊断受试者中革兰氏阴性脓毒症之存在或严重性和用于预测患有脓毒症受试者预后的方法。
本发明的概述本发明提供了通过对LBP的分析来测定受验者所接受的内毒素的方法。本发明还进一步提供了通过LBP分析筛选在人类的急性期反应中所接触的革兰氏阴性细菌性内毒素的方法。具体地说，这种方法包括测定受验者体液样品中LBP浓度并使LBP浓度与指示所接受的内毒素的标准发生关系。这样的标准可以包括用于以例如进行外科手术前的治疗前状态下受试者LBP水平所确定的给定受试者的主观标准。由于这样的外科手术而引起的与内毒素的接触可以通过比较手术后的LBP水平和手术前对该受试者所确定的标准来测定。对于指定个体，在不能获得LBP的预治疗标准水平的情况下，可运用根据种群或亚种群平均值得到的客观标准进行比较。一种这样的标准可以是比人体血浆或血清中的大约15μg/ml的浓度更大的浓度，本文所测定的该标准用于患有许多疾病症状的受验者的LBP值。表现出LBP水平高于标准的受验者可以假定地诊断为患有接触内毒素，而那些浓度低于这个标准的则不患有。很清楚，根据测定方法所需的灵敏度和选择性以及指定受验者所属的亚种群可确定可供选择的标准。例如，对于各种亚种群的不同年龄、性别、人种以及内在的健康状况可确定不同水平的标准。此外，应该明白标准水平将随所分析的特定体液的特性不同而不同。
本发明还提供了用于诊断受验者脓毒症存在或严重性的方法，其包括测定受验者体液试样中的LBP浓度以及使LBP浓度与指示脓毒症存在或严重性的标准发生联系的步骤。另外，本发明还提供了用于预测患有脓毒症受验者预后的方法，其包括测定受验者体液试样中的LBP浓度并使LBP浓度与指示患有脓毒病受验者预后的标准发生联系的步骤。
附图简述
图1表示在LBP夹心测定中rLBP、rLBP25、rBPI和rBPI23的剂量-反应曲线；图2表示健康受验人体和患有各种疾病的受验人体血浆中的LBP水平(平均值±标准误差)；图3表示用LPS治疗的健康受验者中的LBP水平(平均值±标准误差)；图4表示怀疑患有革兰氏阴性脓毒病并被划分为或者是血浆LBP高水平或者是低水平的病人的比较存活曲线；以及图5a-5c表示健康受验者、类风湿性关节炎受验者和脓毒病受验者中的LBP、C-反应蛋白质(CRP)和纤维蛋白原水平(平均值±标准误差)。
本发明的详细描述本发明涉及包括血液在内的体液中存在的LBP的定量方法。尽管这种测定方法能用来测定治疗上施用的LBP的存在和数量，但对于定量在循环血液中作为受验者接触内毒素之指示剂的内源性LBP的存在特别有用的。此外，估计LBP存在的定量在判断革兰氏阴性脓毒病患者的诊断和预后方法中有用。
本发明提供了一种人体LBP和夹心ELISA测定，其表现出高的测定灵敏度、高的特异性以及极好的可重复性。本文所用的根据测定方法定量的“LBP”包括天然LBP、重组LBP、LBP片断和类似物以及其它LBP蛋白质和蛋白质产物。
重组LBP的氨基酸和核苷酸序列在申请日为1993年6月17日的共同拥有和共同未决的美国专利申请顺序号08/029,510中进行了阐述，本文以SEQ ID NOS1和2表示。重组LBP氨基末端片断的特征在于LBP氨基末端的前197个氨基酸的氨基酸序列在SEQ ID NOS3和4中描述，其生产在申请日为1993年6月12日的共同拥有和共同未决的美国专利申请顺序号08/079,510中描述，本文引用了其说明书。这种LBP蛋白质产物可以使用包括免疫学测定和生物测定的测定方法，在每ml低于毫微克的范围中容易地定量。能够定量LBP的免疫学测定优选通过酶联免疫吸附(ELISA)夹心试验来完成，但也可使用利用其它标记形式的竞争性测定和免疫学测定。本发明优选的测定使用抗LBP抗体，包括单克隆抗体和亲合纯化的兔多克隆抗体。兔多克隆抗LBP抗体可以根据常规方法使用LBP作为免疫原来制备。非免疫学方法也可以用来测定LBP。例如，Ulveitch等的美国专利号5,245,013，公开了包括将LBP结合到LPS上以及用密度梯度离心法分离这个复合物的测定方法。再例如，Geller等的Arch.Surg.128 22～28页(1993)中公开了LBP的生物活性测定，其中测定IL-6和TNF的增量调节。
可以用来测定LBP存在的体液包括全血，优选血清和血浆。因为LBP是一种血清蛋白质，预计它可能被排泄出且尿中LBP水平的分析可以具有诊断和预后用途。本发明的LBP免疫测定也可以用来测定在包括(但不限于)肺灌洗液、玻璃体液，间隙液、脑脊液、唾液和滑液的其它体液中的LBP浓度。
因为LBP被称为“急性期蛋白质”，所以可预料到患有自身免疫性疾病的受验者的LBP水平将升高。本发明的一方面是已经发现患有急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性移植抗宿主病(aGvHD)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、I型糖尿病、再生障碍性贫血(AA)、节段性回肠炎、银屑病、类风湿性关节炎(RA)、硬皮病和全身性红斑狼疮(SLE)的受验者的LBP水平不是普遍地升高超过正常水平。
某些暂时鉴定为患有革兰氏阴性脓毒症但最终鉴定为患有革兰氏阳性脓毒症的受验者的LBP水平也升高。值得注意的是在任何感染中都可能发生细菌和/或内毒素，从消化道向血流中的转移。因此，由革兰氏阳性细菌和真菌引起的感染也可以导致在血液中存在内毒素或革兰氏阴性细菌，并且因此LBP的水平升高。
本发明部分是以观测到的血清和血浆LBP水平直接与受验者对生物活性LPS的接触发生联系为基础的。此外，LBP水平似乎与推测患有革兰氏阴性脓毒病病人的存活率有关。例如，循环LBP水平低于27.3μg/ml(58位患有革兰氏阴性脓毒病受验者的平均值)的受验者往往比那些LBP水平高于这个平均值的受验者多存活14天以上。另外，例如，当血浆LBP阈值水平定为46μm/ml时，那些治疗前LBP血浆水平小于46μm/ml的受验者比那些治疗前血浆LBP水平大于46μm/ml的受验者在27天的时间期间内具有明显较大的存活率(P＝0.004)。
本发明进一步期望LBP水平的升高可能起因于接触更大量的内毒素，并且因此可以诊断更严重的感染和/或内毒素血症的严重程度。LBP水平的提高也可以用来表明对革兰氏阴性细菌直接使用抗菌素或其它例如BPI或包括单克隆抗体E5的抗内毒素抗体的直接针对内毒素的治疗剂的适应性。
本发明的其它方面和优点将根据下面所描述的实施例的情况来理解。实施例1涉及亲和纯化的兔抗BPI抗体的制备；实施例2涉及这种抗体的生物素标记；以及实施例3涉及利用这类抗体的ELISA操作。实施例4涉及rLBP、rLBP25、rBPI和rBPI23的比较免疫反应性。实施例5涉及加入到合并人体血浆中的rLBP的测定；以及实施例6涉及人体血浆和血清中LBP水平的比较。实施例7涉及内源LBP免疫反应性与脓毒病和其它人体血浆中疾病症状的临床关系；以及实施例8涉及健康受验者中LPS给药对内源LBP水平的影响。实施例9涉及血浆LBP水平和推测患有革兰氏阴性脓毒病病人存活率之间的临床关系；和实施例10涉及健康人、类风湿性关节炎和脓毒病病人的急性期蛋白质的临床相关性。
实施例1亲和纯化的兔抗rLBP抗体的制备根据这个实施例来制备亲和纯化的兔抗rLBP抗体。具体地说，根据申请日为1993年6月17日的共同拥有和共同未决的美国专利申请顺序号08/079,510(这里引入其说明书以供参考)制备的rLBP(20mg)在0.2M碳酸氢盐、PH为8.6并含有0.5NaCl的溶液中与10ml溴化氰活化的Sepharose 4B(Sigma Chemieal Co.，StLouis，Mo)偶联。大约94％的rLBP与树脂偶联。将混合的来自最初用按照中请日为1993年6月17日的美国专利申请顺序号08/079，510的方法制备的rLBP25免疫并随后用rLBP免疫的两只兔的抗血清(125ml)用等体积的PH为7.2的磷酸盐缓中溶液(PBS)稀释。一部分(50ml)稀释的抗血清通过10ml rLBP Sepharose柱；然后用PBS冲洗该柱，并用0.1M甘氨酸、PH2.5的溶液洗脱结合的抗体。收集的馏分立即用1M的磷酸盐缓冲液PH8.0的中和。峰值部分按照Harlow等的AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringsHarbor Laboratory Press，New York，312页(1988)的方法通过在280nm下测定吸光率来鉴定。在几个依次的柱循环之后，用PH7.2的PBS迭氮化合物透析亲和纯化的兔抗LBP抗体。
实施例2生物素标记的兔抗rLBP抗体的制备在这个实施例中，20毫克按照实施例1的方法生产的亲和纯化兔抗rLBP抗体和2mg生物素酰胺己酸N一羟基琥珀亚酰胺酯(Sig-ma Chemical Co.，St.Louis，MO)在11mL0.1M、碳酸氢钠PH8.3中在室温下温育2小时。移去没有结合的生物素并且通过在使用含有0.1％叠氮化钠的PBS平衡的PD-10柱(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)上分离反应混合物交换碱性缓冲液。
实施例3ELISA程序50毫升亲和纯化的兔抗rLBP抗体(2μm/ml PBS)在2～8℃在Immulon己(Dynatech Laboratories Inc.，Chantilly，VA)微滴度平板的井中温育过夜(或可选择在37℃下温育1小时)。移去抗体溶液，并在所有井中加入200μl 1％的脱脂乳PBS溶液(封闭剂)。在室温下，封闭平板1小时之后，用300μl的冲洗缓冲液(PBS/0.05％Tween-20)冲洗井三次。
标准样、样品和对照样用含有1％的牛血清白蛋白、0.05％吐温20(BSS-BSA/吐温)和10单位/ml的肝素钠(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)的PBS在单独地96井平板中稀释成一式三份。以从100到0.012ng/ml进行系列两倍稀释来制备rLBP或rLPB25标准溶液，标准样、样品和对照样(50μl)各自的同样样品和稀释液被转移到封闭的微滴定板上并在37℃下温育1小时。在初次温育之后，用中洗缓冲液冲洗井3次。生物素标记的兔抗LBP抗体在PBS-BSA/吐温中稀释1/2000倍并将50μl加入到所有的井中。然后平板在37℃下温育1小时。接着，所有的井用冲洗缓冲液3次。碱性磷酸酶标记的抗生蛋白链菌素(Zymed Laboratories Inc.，San Francisco，CA)在PBS-BSA/吐温中稀释1/2000倍，并且将50μl加到所有的井中。在37℃下温育15分钟之后，所有的井用冲洗缓冲液冲洗3次，并用去离子水冲洗3次，然后将50μl体积的产色底物磷酸一硝基苯酯(××1mg/ml溶于10％的二乙醇胺缓冲液)加到所有的井中。在室温下，使进行显色1小时，然后加入50μl1N的NaOH以终止该反应。使用Vmax平板读数器(Molecular Devices Corp.，MenloPark，CA)在405nm下测定所有井的吸光率。
所有样品和标准样(一式三份)在405nm下的平均吸光率(A405)通过减去在初次温育阶段仅接收样品稀释缓冲液(没有LBP)的井的平均A405来作本底修正。然后以A405对rLBP或rLBP25ng/ml作标准曲线。选择直线范围进行线性回归分析，并且借助于内插法从标准曲线上确定样品和对照样的浓度。
实施例4rLBP、rLBP25、rBPI和rBPI23的比较免疫反应性在这个实施例中，在BPI夹心ELISA中比较rLBP、rLBP25、rBPI和rBPI23的免疫反应性来测定可能的免疫学交叉反应性。尽管LBP和BPI之间有相当大的序列同源性(例如，参Schumann等，Science，2491429(1990))，但图1所示的结果表明，在大量基础上，rBPI23产生的信号比rLBP25和rLBP产生的信号大约低3个数量级，而rBPI产生的信号比rLBP和rLBP25的大约低5个数量级。例如，浓度为100,000ng/mL(100μg/mL)的rBPI或400ng/mL的rBPI23产生的信号与0.8ng/mL的rLBP或0.4ng/mL的rLBP25产生的相同。这些结果表明抗体与BPI的交叉反应性最低，并证实了LBP测定的特异性。
实施例5加入合并的人类血浆中的rLBP的测定在这个实施例中，通过检查加有不同浓度rLBP的合并人体血浆然后在夹心ELISA测量前冷冻并解冻来提高人体血液中rLBP的回收率。加入的LBP的回收率被定义为在加入LBP的人体血浆样品中所测的LBP量减去未加入LBP的对照样中的浓度除以实际在样品中加入的量。回收的部分乘以100，结果就表示为加入浓度的百分数。加入合并的人体血浆样品的不同浓度的rLBP的回收率平均为68％并且在从42μg/ml时的59％到168μg/ml时的78％之间变动。表1概括了加入血浆样品中的每种LBP的回收率数据。
表I
加入合并的含柠檬酸的人血浆中的rLBP的回收率加入量测定量回收量回收百分率0 2.47 - -10.5 9.85 7.38 70％2116.1 13.63 65％4227.3 24.83 59％8460.8 58.33 69％168 133 130.5378％平均回收率68％实施例6血浆和血清LBP水平的比较根据这个实施例，测定了健康受验者血清和血浆中的LBP浓度，并按照实施例3利用夹心ELISA试验进行了比较。当校正由于加入抗凝血剂对血浆体积的稀释(除以系数0.85)时，发现LBP的血浆浓度与LBP的血清浓度基本相同。与3.7μg/ml(S.D.0.9μg/ml)的血清浓度相比，发现正常人类受验者的血浆浓度为3.1μg/ml(S.D.0.9μg/ml)或修正后为3.7μg/ml(S.D.1.1μl/ml)。
实施例7人类血浆中内源性LBP免疫反应性的临床相关性在这个实施例中，测量了从各种患有革兰氏阴性脓毒病和各种其它临床症状的受验者得到的人类血浆或血清样品的内源性LBP免疫反应性。具体地说，分析了健康个体(30名受验者)和诊断为革兰氏阴性脓毒病个体(363名受验者)的血浆样品的LBP水平。分析了患有急性淋巴母细胞白血病(ALL)个体(6名受验者)、急性移植抗宿主病(aGvHD)个体(8名受验者)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)个体(9名受验者)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)个体(12名受验者)、1型糖尿病个体(13名受验者)、再生障碍性贫血(AA)个体(16名受验者)、节段性回肠炎(8名受验者)、银屑病个体(13名受验者)、类风湿性关节炎(RA)(86名受验者)、硬皮病个体(4名受验者)和全身性红斑狼疮(SLE)个体(10名受验者)血清样品的LBP水平。结果见图2。
尽管在诊断为患有革兰氏阴性脓毒病受验者中的LBP水平升高，但发现患有急性淋巴母细胞白血病、急性移植抗宿主病、慢性淋巴细胞白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、1型糖尿病、再生障碍性贫血、节段性回肠炎、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病和全身性红斑狼疮(SLE)的受验者的LBP水平不超过正常水平。所以，本发明的LBP分析对于从其它急性期症状(例如RA、SLE等等)中辨别与内毒素有关的症状很有用。
实施例8施用LPS对健康受验者内源性LBP水平的影响在这个实施例中，测定了施用LPS对健康人类受验者内源性LBP免疫反应性的影响。具体地说，利用LBP夹心测定来监测健康受验者在静脉内施用4ng/kg LPS(16名受验者)之后或没有接受LPS的对照受验者(2名)在不同时间点的LBP血浆水平的变化。图3所示结果表示平均血浆LBP浓度随时间的变化。对于那些用LPS治疗的受验者，在LPS给药后大约6小时LBP水平开始上升。在LPS给药后10～12小时之间大多数受验者出现峰值LBP血浆水平。从基线LBP水平到峰值LBP水平大约平均提高3倍。在这个时间期间，对照受验者的平均LBP水平保持在正常范围(大约5μg/ml)之内。
可预料到更多的分析将显示体液的LBP水平与接触内毒素症状的相关性，以及LBP水平将用于由接触内毒素引起的疾病症状的诊断和预后。
可预料到另外的分析将显示LBP水平与细菌感染、内毒素血症和包括与包括DIC和ARDS的脓毒症相关的症状的脓毒症之症状的相关性。
实施例9血浆LBP水平和怀疑患有革兰氏阴性脓毒病的病人存活率之间的临床相关性利用从实施例子中描述的脓毒病受验者得到的数据比较血浆LBP水平和怀疑患有革兰氏阴性脓毒病病人存活率之间的相关性。在这种情况下，标准LBP浓度定为46μg/ml，将怀疑患有革兰氏阴性脓毒病病人划分为具有在治疗前样品中测定的LBP浓度是高(＞46μg/ml)或者是低(＜46μg/ml)LBP血浆水平。如图4提供的数据所示，在27天的时间期限内那些治疗前血浆LBP水平低的受验者与那些治疗前血浆LBP水平高的受验者相比具有明显更高的存活率(P＝0.004)。这些数据表明，测定LBP水平并与标准LBP值比较的应用对于预测患有脓毒病的受验者的预后很有价值。
实施例10健康人、类风湿性关节炎和脓毒病病人急性期蛋白质的临床相关性测量一小组健康人、类风湿关节炎和脓毒病病人的LBP、C-反应蛋白质(CRP)和纤维蛋白原的血浆水平，结果见图5a(LBP水平)，5b(CRP水平)和5C(纤维蛋白原水平)。结果表明，相对于健康受验者来说，类风湿关节炎和脓毒病受验者的平均纤维蛋白原水平大约提高2.5倍。相对于健康受验者来说，类风湿关节炎受验者的平均CRP水平大约提高40倍，脓毒病受验者的大约提高200倍。相反，和实施例7的结果一致，类风湿关节炎受验者的平均LBP水平仅仅有一点提高(小于2倍)，而脓毒病受验者的平均LBP水平提高6倍多。
对于本领域普通技术人员而言在考虑上述给出的优选实施例的基础上，在本发明的实施中进行许多修改和变化是可预料到的。因此，对于本发明的范围来说，仅有的限制是出现在所附的权利要求书中的那些限定。
序列表(1)一般资料(i)申请人XOMA CORPORATION(ii)发明题目体液中LBP的定量方法(iii)序列数4(iv)联系地址(A)联系人Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray & Borun(B)街道6300 Sears Tower，233 South Wacker Drive(C)城市Chicago(D)州Illinois(E)国家美国(F)邮编60606-6402(v)计算机可读形式(A)媒体类型Floppy盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOC/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Version#1.25(vi)目前申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)代理人资料
(A)姓名Sharp，Jeffrey S.
(B)登记号31,879(C)参考/文摘号27129/31843(ix)电信资料(A)电话312/474-6300(B)传真312/474-0448(C)电传25-3856(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特征(A)长度1443个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..1443(ix)特征(A)名称/关键词成熟肽(B)位置76..1443(ix)特征(A)名称/关键词相似特征
(D)其它资料“rLBP”(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG GGG GCC TTG GCC AGA GCC CTG CCG TCC ATA CTG CTG GCA TTG CTG48Met Gly Ala Leu Ala Arg Ala Leu Pro Ser Ile Leu Leu Ala Leu Leu-25 -20 -15 -10CTT ACG TCC ACC CCA GAG GCT CTG GGT GCC AAC CCC GGC TTG GTC GCC96Leu Thr Ser Thr Pro Glu Ala Leu Gly Ala Asn Pro Gly Leu Val Ala-5 1 5AGG ATC ACC GAC AAG GGA CTG CAG TAT GCG GCC CAG GAG GGG CrA TTG 144Arg Ile Thr Asp Lys Gly Leu Gln Tyr Ala Ala Gln Glu Gly Leu Leu10 15 20GCT CTG CAG AGT GAG CTG CTC AGG ATC ACG CTG CCT GAC TTC ACC GGG 192Ala Leu Gln Ser Glu Leu Leu Arg Ile Thr Leu Pro Asp Phe Thr Gly25 30 35GAC TTG AGG ATC CCC CAC GTC GGC CGT GGG CGC TAT GAG TTC CAC AGC 240Asp Leu Arg Ile Pro His Val Gly Arg Gly Arg Tyr Glu Phe Mis Ser40 45 50 55CTG AAC ATC CAC AGC TGT GAG CTG CTT CAC TCT GCG CTG AGG CCT GTC 288Leu Asn Ile His Ser Cys Glu Leu Leu His Ser Ala Leu Arg Pro Val60 65 70CCT GGC CAG GGC CTG AGT CTC AGC ATC TCC GAC TCC TCC ATC CGG GTC 336Pro Gly Gln Gly Leu Ser Leu Ser Ile Ser Asp Ser Ser Ile Arg Val75 80 85CAG GGC AGG TGG AAG GTG CGC AAG TCA TTC TTC AAA CTA CAG GGC TCC 384Gln Gly Arg Trp Lys Val Arg Lys Ser Phe Phe Lys Leu Gln Gly Ser90 95 100TTT GAT GTC AGT GTC AAG GGC ATC AGC ATT TCG GTC AAC CTC CTG TTG 432Phe Asp Val Ser Val Lys Gly Ile Ser Ile Ser Val Asn Leu Leu Leu105 110 115GGC AGC GAG TCC TCC GGG AGG CCC ACA GTT ACT GCC TCC AGC TGC AGC 480Gly Ser Glu Ser Ser Gly Arg Pro Thr Val Thr Ala Ser Ser Cys Ser120 125 130 135AGT GAC ATC GCT GAC GTG GAG GTG GAC ATG TCG GGA GAC TTG GGG TGG 528Ser Asp Ile Ala Asp Val Glu Val Asp Met Ser Gly Asp Leu Gly Trp140 145 150CTG TTG AAC CTC TTC CAC AAC CAG ATT GAG TCC AAG TTC CAG AAA GTA 576Leu Leu Asn Leu Phe His Asn Gln Ile Glu Ser Lys Phe Gln Lys Val155 160 165CTG GAG AGC AGG ATT TGC GAA ATG ATC CAG AAA TCG GTG TCC TCC GAT 624Leu Glu Ser Arg Ile Cys Glu Met Ile Gln Lys Ser Val Ser Ser Asp170 175 180CTA CAG CCT TAT CTC CAA ACT CTG CCA GTT ACA ACA GAG ATT GAC AGT 672Leu Gln Pro Tyr Leu Gln Thr Leu Pro Val Thr Thr Glu Ile Asp Ser185 190 195TTC GCC GAC ATT GAT TAT AGC TTA GTG GAA GCC CCT CGG GCA ACA GCC 720Phe Ala Asp Ile Asp Tyr Ser Leu Val Glu Ala Pro Arg Ala Thr Ala200 205 210 215CAG ATG CTG GAG GTG ATG TTT AAG GGT GAA ATC TTT CAT CGT AAC CAC 768Gln Met Leu Glu Val Met Phe Lys Gly Glu Ile Phe His Arg Asn His220 225 230CGT TCT CCA GTT ACC CTC CTT GCT GCA GTC ATG AGC CTT CCT GAG GAA 816Arg Ser Pro Val Thr Leu Leu Ala Ala Val Met Ser Leu Pro Glu Glu235 240 245CAC AAC AAA ATG GTC TAC TTT GCC ATC TCG GAT TAT GTC TTC AAC ACG 864His Asn Lys Met Val Tyr Phe Ala Ile Ser Asp Tyr Val Phe Asn Thr250 255 260GCC AGC CTG GTT TAT CAT GAG GAA GGA TAT CTG AAC TTC TCC ATC ACA 912Ala Ser Leu Val Tyr His Glu Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Ser Ile Thr265 270 275GAT GAG ATG ATA CCG CCT GAC TCT AAT ATC CGA CTG ACC ACC AAG TCC 960Asp Glu Met Ile Pro Pro Asp Ser Asn Ile Arg Leu Thr Thr Lys Ser280 285 290 295TTC CGA CCC TTC GTC CCA CGG TTA GCC AGG CTC TAC CCC AAC ATG AAC 1008Phe Arg Pro Phe Val Pro Arg Leu Ala Arg Leu Tyr Pro Asn Met Asn300 305 310CTG GAA CTC CAG GGA TCA GTG CCC TCT GCT CCG CTC CTG AAC TTC AGC 1056Leu Glu Leu Gln Gly Ser Val Pro Ser Ala Pro Leu Leu Asn Phe Ser315 320 325CCT GGG AAT CTG TCT GTG GAC CCC TAT ATG GAG ATA GAT GCC TTT GTG 1104Pro Gly Asn Leu Ser Val Asp Pro Tyr Met Glu Ile Asp Ala Phe Val330 335 340CTC CTG CCC AGC TCC AGC AAG GAG CCT GTC TTC CGG CTC AGT GTG GCC 1152Leu Leu Pro Ser Ser Ser Lys Glu Pro Val Phe Arg Leu Ser Val Ala345 350 355ACT AAT GTG TCC GCC ACC TTG ACC TTC AAT ACC AGC AAG ATC ACT GGG 1200Thr Asn Val Ser Ala Thr Leu Thr Phe Asn Thr Ser Lys Ile Thr Gly360 365 370 375TTC CTG AAG CCA GGA AAG GTA AAA GTG GAA CTG AAA GAA TCC AAA GTT 1248Phe Leu Lys Pro Gly Lys Val Lys Val Glu Leu Lys Glu Ser Lys Val380 385 390GGA CTA TTC AAT GCA GAG CTG TTG GAA GCG CTC CTC AAC TAT TAC ATC 1296Gly Leu Phe Asn Ala Glu Leu Leu Glu Ala Leu Leu Asn Tyr Tyr Ile395 400 405CTT AAC ACC TTC TAC CCC AAG TTC AAT GAT AAG TTG GCC GAA GGC TTC 1344Leu Asn Thr Phe Tyr Pro Lys Phe Asn Asp Lys Leu Ala Glu Gly Phe410 415 420CCC CTT CCT CTG CTG AAG CGT GTT CAG CTC TAC GAC CTT GGG CTG CAG 1392Pro Leu Pro Leu Leu Lys Arg Val Gln Leu Tyr Asp Leu Gly Leu Gln425 430 435ATC CAT AAG GAC TTC CTG TTC TTG GGT GCC AAT GTC CAA TAC ATG AGA 1440Ile His Lys Asp Phe Leu Phe Leu Gly Ala Asn Val Gln Tyr Met Arg440 445 450 455GTT 1443Val(2)SEQ ID NO2资料(i)序列特征(A)长度481个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词相似特征(D)其它资料“rLBP”(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Gly Ala Leu Ala Arg Ala Leu Pro Ser Ile Leu Leu Ala Leu Leu-25 -20 -15 -10Leu Thr Ser Thr Pro Glu Ala Leu Gly Ala Asn Pro Gly Leu Val Ala-5 1 5Arg Ile Thr Asp Lys Gly Leu Gln Tyr Ala Ala Gln Glu Gly Leu Leu10 15 20Ala Leu Gln Ser Glu Leu Leu Arg Ile Thr Leu Pro Asp Phe Thr Gly25 30 35Asp Leu Arg Ile Pro His Val Gly Arg Gly Arg Tyr Glu Phe His Ser40 45 50 55Leu Asn Ile His Ser Cys Glu Leu Leu His Ser Ala Leu Arg Pro Val60 65 70Pro Gly Gln Gly Leu Ser Leu Ser Ile Ser Asp Ser Ser Ile Arg Val75 80 85Gln Gly Arg Trp Lys Val Arg Lys Ser Phe Phe Lys Leu Gln Gly Ser90 95 100Phe Asp Val Ser Val Lys Gly Ile Ser Ile Ser Val Asn Leu Leu Leu105 110 115Gly Ser Glu Ser Ser Gly Arg Pro Thr Val Thr Ala Ser Ser Cys Ser120 125 130 135Ser Asp Ile Ala Asp Val Glu Val Asp Met Ser Gly Asp Leu Gly Trp140 145 150Leu Leu Asn Leu Phe His Asn Gln Ile Glu Ser Lys Phe Gln Lys Val155 160 165Leu Glu Ser Arg Ile Cys Glu Met Ile Gln Lys Ser Val Ser Ser Asp170 175 180Leu Gln Pro Tyr Leu Gln Thr Leu Pro Val Thr Thr Glu Ile Asp Ser185 190 195Phe Ala Asp Ile Asp Tyr Ser Leu Val Glu Ala Pro Arg Ala Thr Ala200 205 210 215Gln Met Leu Glu Val Met Phe Lys Gly Glu Ile Phe His Arg Asn His220 225 230Arg Ser Pro Val Thr Leu Leu Ala Ala Val Met Ser Leu Pro Glu Glu235 240 245His Asn Lys Met Val Tyr Phe Ala Ile Ser Asp Tyr Val Phe Asn Thr250 255 260Ala Ser Leu Val Tyr His Glu Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Ser Ile Thr265 270 275Asp Glu Met Ile Pro Pro Asp Ser Asn Ile Arg Leu Thr Thr Lys Ser280 285 290 295Phe Arg Pro Phe Val Pro Arg Leu Ala Arg Leu Tyr Pro Asn Met Asn300 305 310Leu Glu Leu Gln Gly Ser Val Pro Ser Ala Pro Leu Leu Asn Phe Ser315 320 325Pro Gly Asn Leu Ser Val Asp Pro Tyr Met Glu Ile Asp Ala Phe Val330 335 340Leu Leu Pro Ser Ser Ser Lys Glu Pro Val Phe Arg Leu Ser Val Ala345 350 355Thr Asn Val Ser Ala Thr Leu Thr Phe Asn Thr Ser Lys Ile Thr Gly360 365 370 375Phe Leu Lys Pro Gly Lys Val Lys Val Glu Leu Lys Glu Ser Lys Val380 385 390Gly Leu Phe Asn Ala Glu Leu Leu Glu Ala Leu Leu Asn Tyr Tyr Ile395 400 405Leu Asn Thr Phe Tyr Pro Lys Phe Asn Asp Lys Leu Ala Glu Gly Phe410 415 420Pro Leu Pro Leu Leu Lys Arg Val Gln Leu Tyr Asp Leu Gly Leu Gln425 430 435Ile His Lys Asp Phe Leu Phe Leu Gly Ala Asn Val Gln Tyr Met Arg440 445 450 455Val(2)SEQ ID NO3资料(i)序列特征(A)长度591个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..591(ix)特征(ix)特征(A)名称/关键词相似特征(D)其它资料“rLBP25”(xi)序列描述SEQ ID NO3GCC AAC CCC GGC TTG GTC GCC AGG ATC ACC GAC AAG GGA CTG CAG TAT48Ala Asn Pro Gly Leu Val Ala Arg Ile Thr Asp Lys Gly Leu Gln Tyr1 5 10 15GCG GCC CAG GAG GGG CTA TTG GCT CTG CAG AGT GAG CTG CTC AGG ATC96Ala Ala Gln Glu Gly Leu Leu Ala Leu Gln Ser Glu Leu Leu Arg Ile20 25 30ACG CTG CCT GAC TTC ACC GGG GAC TTG AGG ATC CCC CAC GTC GGC CGT 144Thr Leu Pro Asp Phe Thr Gly Asp Leu Arg Ile Pro His Val Gly Arg35 40 45GGG CGC TAT GAG TTC CAC AGC CTG AAC ATC CAC AGC TGT GAG CTG CTT 192Gly Arg Tyr Glu Phe His Ser Leu Asn Ile His Ser Cys Glu Leu Leu50 55 60CAC TCT GCG CTG AGG CCT GTC CCT GGC CAG GGC CTG AGT CTC AGC ATC 240His Ser Ala Leu Arg Pro Val Pro Gly Gln Gly Leu Ser Leu Ser Ile65 70 75 80TCC GAC TCC TCC ATC CGG GTC CAG GGC AGG TGG AAG GTG CGC AAG TCA 288Ser Asp Ser Ser Ile Arg Val Gln Gly Arg Trp Lys Val Arg Lys Ser85 90 95TTC TTC AAA CTA CAG GGC TCC TTT GAT GTC AGT GTC AAG GGC ATC AGC 336Phe Phe Lys Leu Gln Gly Ser Phe Asp Val Ser Val Lys Gly Ile Ser100 105 110ATT TCG GTC AAC CTC CTG TTG GGC AGC GAG TCC TCC GGG AGG CCC ACA 384Ile Ser Val Asn Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ser Ser Gly Arg Pro Thr115 120 125GTT ACT GCC TCC AGC TGC AGC AGT GAC ATC GCT GAC GTG GAG GTG GAC 432Val Thr Ala Ser Ser Cys Ser Ser Asp Ile Ala Asp Val Glu Val Asp130 135 140ATG TCG GGA GAC TTG GGG TGG CTG TTG AAC CTC TTC CAC AAC CAG ATT 480Met Ser Gly Asp Leu Gly Trp Leu Leu Asn Leu Phe His Asn Gln Ile145 150 155 160GAG TCC AAG TTC CAG AAA GTA CTG GAG AGC AGG ATT TGC GAA ATG ATC 528Glu Ser Lys Phe Gln Lys Val Leu Glu Ser Arg Ile Cys Glu Met Ile165 170 175CAG AAA TCG GTG TCC TCC GAT CTA CAG CCT TAT CTC CAA ACT CTG CCA 576Gln Lys Ser Val Ser Ser Asp Leu Gln Pro Tyr Leu Gln Thr Leu Pro180 185 190GTT ACA ACA GAG ATT 591Val Thr Thr Glu Ile195(2)SEQ ID NO4资料(i)序列特征(A)长度197个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(ix)特征
(A)名称/关键词相似特征(D)其它资料“rLBP25”(xi)序列描述SEQ ID NO4Ala Asn Pro Gly Leu Val Ala Arg Ile Thr Asp Lys Gly Leu Gln Tyr1 5 10 15Ala Ala Gln Glu Gly Leu Leu Ala Leu Gln Ser Glu Leu Leu Arg Ile20 25 30Thr Leu Pro Asp Phe Thr Gly Asp Leu Arg Ile Pro His Val Gly Arg35 40 45Gly Arg Tyr Glu Phe His Ser Leu Asn Ile His Ser Cys Glu Leu Leu50 55 60His Ser Ala Leu Arg Pro Val Pro Gly Gln Gly Leu Ser Leu Ser Ile65 70 75 80Ser Asp Ser Ser Ile Arg Val Gln Gly Arg Trp Lys Val Arg Lys Ser85 90 95Phe Phe Lys Leu Gln Gly Ser Phe Asp Val Ser Val Lys Gly Ile Ser100 105 110Ile Ser Val Asn Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ser Ser Gly Arg Pro Thr115 120 125Val Thr Ala Ser Ser Cys Ser Ser Asp Ile Ala Asp Val Glu Val Asp130 135 140Met Ser Gly Asp Leu Gly Trp Leu Leu Asn Leu Phe His Asn Gln Ile145 150 155 160Glu Ser Lys Phe Gln Lys Val Leu Glu Ser Arg Ile Cys Glu Met Ile165 170 175Gln Lys Ser Val Ser Ser Asp Leu Gln Pro Tyr Leu Gln Thr Leu Pro180 185 190Val Thr Thr Glu Ile19权利要求
1.一种测定受验者接触内毒素的方法，其包括测定受验者体液样品中的脂多糖结合蛋白质的浓度，并使脂多糖结合蛋白质的浓度与指示接触内毒素的标准发生联系的步骤。
2.权利要求1的方法，其中所述样品是血样。
3.权利要求1的方法，其中所说的样品是血浆或血清样。
4.权利要求1的方法，其中通过免疫分析测定脂多糖结合蛋白质的浓度。
5.权利要求4的方法，其中的免疫分析是一种夹心免疫分析。
6.权利要求1的方法，其中的标准是比在治疗前期间测定的所说的受验者的LBP浓度更高的一个浓度。
7.一种诊断受验者脓毒病存在或严重性的方法，其包括测定受验者体液样品中的脂多糖结合蛋白质的浓度，并使脂多糖结合蛋白质的浓度与指示脓毒病存在或严重程序的标准发生联系。
8.权利要求7的方法，其中所述的样品是血液样品。
9.权利要求7的方法，其中所说的样品是血浆或血清样品。
10.权利要求7的方法，其中通过免疫分析测定脂多糖结合蛋白质的浓度。
11.权利要求10的方法，其中免疫分析是夹心免疫分析。
12.权利要求7的方法，其中标准是比在无脓毒病期间测定的所述受验者的LBP浓度更高的一个浓度。
13.一种预测患有脓毒病受验者预后的方法，其包括测定受验者体液样品中的脂多糖结合蛋白质浓度，并使脂多糖结合蛋白质浓度与指示患有脓毒病受验者预后的标准发生联系。
14.权利要求13的方法，其中所述样品是血液样品。
15.权利要求13的方法，其中所述样品是血浆或血清样品。
16.权利要求13的方法，其中借助于免疫分析测定脂多糖结合蛋白质的浓度。
17.权利要求16的方法，其中免疫分析是夹心免疫分析。
18.权利要求13的方法，其中标准是比在无脓毒病期间测定的所说的受验者LBP浓度更高的浓度。
19.在人类急性期反应中筛选接触革兰氏阴性细菌性内毒素的方法，包括(a)测量人受验者血液循环中的脂多糖结合蛋白质水平，以及(b)将步骤(a)中测定的脂多糖结合蛋白质水平与正常受验者血液循环中的脂多糖结合蛋白质水平进行比较，脂多糖结合蛋白质水平的升高是涉及革兰氏阴性细菌性内毒素的急性期反应的征兆。
20.权利要求19的方法，其中急性期反应与脓毒病有关。
全文摘要
本发明提供一种定量受验者体液(包括血液)中所存在的细胞外LBP的方法，其包括对所说的受验者的血浆进行LBP免疫分析。
文档编号G01N33/53GK1139485SQ95191324
公开日1997年1月1日 申请日期1995年1月24日 优先权日1994年1月24日
发明者M.L.怀特, S.F.卡罗尔, J.K-K.马 申请人:爱克斯欧玛公司