一种夜蛾颗粒体病毒、含该病毒的制剂的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种病毒、含该病毒的制剂的制备方法及应用，尤其涉及夜蛾颗粒体病毒、含该病毒的制剂的制备方法及应用，属于生物【技术领域】。本发明将夜蛾颗粒体病毒GXW9-3接种于高龄夜蛾等幼虫食料中让其捕食致幼虫细胞病变，而在24h～32h搜集的罹病尸体经体表75％酒精消毒后粉碎创制高含量的颗粒体颗病毒GXW9-3制剂。可根据不同植物上夜蛾科害虫发生和危害的特点，将该制剂配制成所需浓度，对发生危害面大、暴食性和抗化性强的夜蛾幼虫进行防治，其有益效果是，防控效果好，防控时间长，可有效降低夜蛾后代发生基数。达到控制夜蛾害虫暴发和危害，促进生态平衡，保护植物生长、提高产量，改进品质之功能。
【专利说明】一种夜蛾颗粒体病毒、含该病毒的制剂的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种病毒、含该病毒的制剂的制备方法及应用，尤其涉及夜蛾颗粒体 病毒、含该病毒的制剂的制备方法及应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 半个多世纪以来，用化学农药防治害虫对农业增产增收作出了巨大贡献。但长期 依赖和大量使用化学农药所带来的环境及农产品污染、生态失衡以及食品安全等问题也日 益显现。减少使用高毒高残留农药，并推广无公害生产或防控技术就成了当务之急，害虫 的生物防治也就显得尤为迫切。寄生于农业害虫的病毒已发现约200余种，其中大多数属 于杆状病毒，少数是颗粒体病毒，由于昆虫病毒有高度的专一寄生性，通常一种病毒只侵染 一种昆虫，而对他种昆虫和人无害，因此不干扰生态平衡，已有小规模商品化生产的病毒杀 虫剂，多数用于防治鳞翅目害虫，例如棉铃虫舞毒蛾斜纹夜蛾天幕毛虫菜粉蝶等，我国在80 年代已广泛试验推广核型多角体病毒杀虫剂。现有生物制剂的缺陷是宿主窄、致病慢、效果 差、病原体易受光照影响而药效期短，其次制剂不耐40度以上高温贮存、货架期短会失去 防效。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是针对现有技术存在的缺陷，提出一种夜蛾颗粒体病 毒，该颗粒体病毒可使三种或三种以上的夜蛾幼虫致病死亡，俗称为夜蛾颗粒体病毒。如银 纹夜蛾、烟青虫、小莱蛾、钭纹夜蛾等、含该病毒的制剂的制备方法及应用，安全高效地防治 害虫。
[0004] 本发明首先提供夜蛾颗粒体病毒GXW9-3,于2013年9月20日保藏在中国武汉大 学（中国典型培养物保藏中心）其保藏号为CCTCC N0:V201340。
[0005] 夜蛾颗粒体病毒 Mamestra oleracea granulosis virus GV GXW9-3 隶属于杆状 病毒科颗粒体病毒属，是一种双链D N A包涵体病毒。在JSM-7001F扫描分析电镜下研究 发现，包涵体病毒呈折光性的颗粒，呈圆形，大小为320 X 189 n m，内部含有一个病毒粒 子，病毒粒子分子量为85. 9KB的DNA和蛋白质外壳组成，病毒的感染力主要由DNA和蛋白 衣壳的完整性决定的，病毒粒子外包裹了致密的晶格的颗粒体蛋白，形成病毒包涵体。
[0006] 本发明将夜蛾颗粒体病毒GXW9-3接种于高龄夜蛾幼虫食料中让其捕食致幼虫细 胞病变，而在24h?32h搜集的罹病尸体经体表75%酒精消毒后粉碎创制高含量的颗粒体 颗病毒GXW9-3制剂，具体的制备方法如下：
[0007] 第一步、将野外与室内交替繁育的幼虫喂食夜蛾颗粒体病毒GXW9-3,当野外繁育 的幼虫为3?5龄时开始接夜蛾颗粒体病毒GXW9-3 ;当室内工厂化繁育的3?5龄幼虫斜 纹夜蛾禁食3. 5?4. 5小时，再将夜蛾颗粒体病毒GXW9-3混入饲料中，搅拌均匀，喂食幼 虫，保持环境温度28?38°C，光照强度2500-3000LUX，相对湿度70?75%，待幼虫细胞病 变；
[0008] 第二步、在幼虫细胞病变的24?32小时内收集具有急剧痉挛反应、后足指尖插 入植物顶部组织或叶缘叶肉组织而倒挂死亡幼虫尸体，将幼虫尸体经体表酒精消毒后，待 80%以上的尸体体表破裂流出乳白色的浓稠液体后，将幼虫尸体粉碎至粒径在75nm以上；
[0009] 第三步、将粉碎出的幼虫体液制成大于110亿OB/mL的夜蛾颗粒体病毒GXW9-3制 剂。
[0010] 所述第一步中，选择野外或室内繁育的幼虫。幼虫包括银纹夜蛾、烟青虫、小莱蛾、 菜青虫、斜纹夜蛾、稻螟虫或粘虫的幼虫，交替繁育的步骤是室内工厂化繁育斜纹夜蛾等夜 蛾昆虫5代后，以保持毒力效价的稳定，再将斜纹夜蛾等夜蛾昆虫移至室外寄主作物上繁 殖1代，所述夜蛾颗粒体病毒GXW9-3的加入量为每百斤饲料接入干燥GXW9-3菌株100g。 所述步骤三中粉碎方式为砂磨粉碎。
[0011] 本发明进一步提供含有夜蛾颗粒体病毒的制剂的应用，将所述夜蛾颗粒体病毒 GXW9-3制剂用清水稀释500-600倍液后加入8mL的农用有机硅制成悬浮液，在晴天的傍晚 将悬浮液喷施于植株上即可。
[0012] 优选的喷施条件是28-381：、光照强度2500-30001^?，相对湿度65%?85%的环 境下喷施，防治效果可达100%，持效期达到60天以上。
[0013] 由于纯化的病原体具有与野外环境相适应的特性，具有耐高温强光和很强致病 性，目前已知宿主害虫近十种且具广谱性。本发明采用夜蛾幼虫活细胞在特定温度、光照 和相对湿度的条件下繁殖夜蛾颗粒体颗病毒GXW9-3,并利用夜蛾颗粒体颗病毒GXW9-3创 制一种安全、高效的含有夜蛾颗粒体颗病毒GXW9-3的微生物制剂。可根据不同植物上夜蛾 科害虫发生和危害的特点，将该制剂配制成所需浓度，对发生危害面大、暴食性和抗化性强 的夜蛾幼虫进行防治，本发明的优点是制剂致病快、效果好、杀虫谱广，又因 GXW9-3病毒耐 高和湿强光显示和较好野性，具有持续防控效果、防控时间长，可有效降低夜蛾后代发生基 数。达到控制夜蛾害虫暴发和危害，促进生态平衡，保护植物生长、提高产量，改进品质之功 能。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为110亿OB/ml夜蛾颗粒体颗GXW9-3制剂500倍液防治辣椒斜纹夜蛾的虫 尸体。
[0015] 图2为夜蛾颗粒体颗GXW9-3在JSM-7001F扫描分析电镜特征。
【具体实施方式】
[0016] 实施例
[0017] 本发明的夜蛾颗粒体病毒GXW9-3的来源是发明人于2004年8月13日（高温强 光季节）在镇江南山野茄子上发现采集的罹病倒挂斜纹夜蛾尸体。并于2013年9月20日 保藏在中国武汉大学（中国典型培养物保藏中心）其保藏号为CCTCC N0:V201340。
[0018] 本实施例通过以下方法制备含夜蛾颗粒体病毒GXW9-3的制剂：
[0019] (1)将从野外罹病夜蛾幼虫尸体中分离纯化的，具有高致病力夜蛾颗粒体颗病毒 GXW9-3经过-5°C、_15°C、_75°C冷冻干燥后备用。因冷冻前物料含水份的差异，每个温度的 冷冻时间分别为80-100分钟、1700-1800分钟、1200-1300分钟。
[0020] (2)将野外与室内交替繁育。即室内工厂化繁育斜纹夜蛾等夜蛾昆虫5代后，以 保持毒力效价的稳定，再将斜纹夜蛾等夜蛾昆虫移至室外寄主作物上繁殖1代，3?5龄 的幼虫时开始接夜蛾颗粒体病毒GXW9-3或室内工厂化繁育的3?5龄幼虫斜纹夜蛾禁食 3. 5?4. 5小时，再将夜蛾颗粒体病毒GXW9-3混入饲料中，搅拌均匀，喂食幼虫，保持环境温 度28?38°C，光照强度2500-3000LUX，相对湿度70?75%，待幼虫细胞病变；
[0021] (3)当（2)幼虫细胞病变，且在24h?32h搜集的罹病尸体经体表75%酒精消毒 后，待80%以上尸体体表破裂流出乳白色的浓稠液体时，用砂磨机粉碎至粒径在75nm以 上，制成每毫升GXW9-3菌株110亿0B以上高含量的颗粒体颗病毒GXW9-3制剂，主要是将 砂磨粉碎出的幼虫体液，抽样涂板电镜测定110?128亿OB/mL的夜蛾颗粒体病毒GXW9-3 制剂。
[0022] (4)对颗粒体颗病毒GXW9-3制剂进行相关试验。
[0023] 以上幼虫可以是银纹夜蛾、烟青虫、小莱蛾、菜青虫、钭纹夜蛾、稻螟虫、粘虫的幼 虫。
[0024] 1鉴别试验
[0025] 1. 1夜蛾颗粒体病毒体（M0GV)的形态特征
[0026] 夜蛾颗粒体颗GXW9-3制剂致中毒昆虫产生剧烈痉挛性反应攀登至辣椒顶部枝条 和叶缘部，后腹两对足剌插入叶肉呈倒挂死亡（见图1)。
[0027] 罹病尸虫体液在JSM-7001F扫描分析电镜下研究发现，病毒呈折光性的颗粒，圆 形，大小为320 X 185 n m，内部含有1?2个病毒粒子，病毒粒子分子量为85. 9KB的DNA 和蛋白质外壳组成，病毒粒子外包裹了致密的晶格的颗粒体蛋白（见图2)。
[0028] 1. 2 仪器
[0029] 移液器、量筒、试管、载玻片、酒精灯、WARNING型喷金仪、JSM-7001F扫描电镜分析 仪。
[0030] 1. 3试验方法
[0031] 1. 3. 1制备夜蛾颗粒病毒（M0GV)图片
[0032] 将制好的夜蛾颗粒病毒（M0GV)GXW9-3悬浮液，用移液器取lmL，稀释至10 -5-10-6,再取稀释液0. OlmL于2cm2载玻片上，将载玻片移置酒精灯上快速烤干。
[0033] 1. 3. 2玻片喷钼金
[0034] 将制作的载夜蛾颗粒病毒（M0GV)GXW9-3玻片标本输入WARNING型喷金仪内喷金， 约20秒，喷金厚度为20nm，停机取出。
[0035] 1. 3. 3夜蛾颗粒体病毒微粒图像的投影
[0036] 将喷有钼金的载玻片输入JSM-7001F扫描电镜分析仪，搜捕靶标，当屏幕上出现 病毒颗粒体320 X 185 nm左右的图形，即为夜蛾颗粒体病毒（M0GV)GXW9-3病毒颗粒。
[0037] 2含B0量及杂菌率测定
[0038] 2. 1待测样稀释
[0039] 取试管8支，每试管中装无菌水9mL，用无菌移液器抽取样品lmL加入第一支试管， 抽吸三次，充分摇匀后，移液器换上无菌吸头，吸取lmL转入第二支试管，依次类推，得到稀 释倍数为101、102、103、104、105、106、107、108的夜蛾颗粒体病毒稀释液。
[0040] 2. 2载片涂布及夜蛾颗粒体病毒计数
[0041] 2.2.1载片涂布
[0042] 分别取稀释倍数为106、107、108三个梯度的夜蛾颗粒体病毒（M0GV)GXW9-3稀释 液0. lmL，涂布在2*2cm载玻片上，重复5次，共15片，以无菌水作空白对照，将载玻片移置 酒精灯上快速烤干，将制作烤干的载夜蛾颗粒病毒（M0GV)GXW9-3玻片标本输入WARNING 型喷金仪内喷金，约20秒，喷金厚度为20nm，停机取出后，再将喷有钼金的载玻片输入 JSM-7001F扫描电镜分析仪，搜捕靶标，进行计数。
[0043] 2. 2. 2.夜蛾颗粒体病毒（M0GV)GXW9-3及杂菌计数
[0044] 在JSM-7001F扫描电镜分析仪下，选择2*2cm载玻片上夜蛾颗粒体病毒（M0GV) GXW9-3数在30?300范围内的同一稀释度片（5个），清点选中的5个片中的夜蛾颗粒体 病毒体总数。非夜蛾颗粒体病毒体（M0GV)GXW9-3形态特征的计数为杂菌。
[0045] 每片夜蛾颗粒体病毒体平均数A =病毒总数/5 :
[0046] 每片非夜蛾颗粒体病毒体平均数=非（M0GV)GXW9_3总数/5。
[0047] 3毒力效价的测定
[0048] 3. 1材料和试剂
[0049] 斜纹夜蛾：野外捕获，经室内饲养一代后备用。
[0050] 饲料：未施农药的甘蓝叶片或辣椒叶片。
[0051] 3. 2测定方法
[0052] 采用浸叶法测定。根据估计的LC50值，以此为中心上下2-3个梯度，将待测样和 标准品稀释成5-7个等比系列浓度，以清水为对照，将供饲喂的菜叶在不同浓度的待测液、 标准液中和清水中浸5s，取出后自然晾干，每烧杯内放入处理后的菜叶2-4片，接入三龄幼 虫20头，重复三次，每浓度共处理幼虫60头，用保鲜膜封口，放入温度27土 1°C，光周期为 14:10h(L:D)的养虫室内，48h检查试虫死亡情况，用细签触动虫体，完全无反应者为死虫。 计算待测样品和标准品的平均死亡率和校正死亡率。对照死亡大于10%，测试结果无效，必 须重新试验。
[0053] 校正死亡率=(药剂处理死亡率一空白对照死亡率να-空白对照死亡 率）Χ100%......(3)
[0054] 将试验所得的数字输入SPSS12软件，求出标准品和待测样品的LC50值及置信限， 计数待测样品的毒力效价。
[0055] 待测样品毒力效价=(标准品LC50值X标准品效价）/待测样品LC50 值..................⑷
[0056] 3. 3允许差
[0057] 毒力测定允许相对偏差，每个样品三次重复测定结果最大相对偏差不超过20%。 或经合适的统计方法检测差异不显著。
[0058] 4悬浮率的测定
[0059] 4. 1仪器、试剂
[0060] 量筒（250mL具塞），吸液管，秒表，三角瓶（500mL、100mL)，恒温水浴锅，标准硬水 (配制方法按GB/T5451-2001中标准硬水配制方法进行）。
[0061] 4. 2操作步聚
[0062] 将样品摇匀后取5mL(精确到0. OlmL)，于100mL三角瓶中，加入标准硬水，用手 摇动作圆周运动，左右旋各30次。制得悬浮液移到250mL具塞量筒中，用标准硬水稀释到 250mL。
[0063] 将量筒放入30°C ±1°C恒温水浴锅中，当悬浮液温度达30°C时，将量筒盖好，拿起 量筒轻轻摇起沉淀物，然后有规律地以量筒中部为中心上下颠倒30s，使呈均匀悬浮液，量 筒仍放入恒温水浴锅中，打开瓶塞，静置30min，用吸液管以抽气法将量筒上部9/10的悬浮 液抽出（在15s?30s内完成）。抽液过程中，吸管应依附筒壁随液面下降而下降，勿搅动 下部沉淀。
[0064] 用平板计数法测定试样和留在量筒底部25mL悬浮液的含夜蛾颗粒病毒量。
[0065] 4. 3 计算
[0066] 试样悬浮率（％ ) = 111. 1(B_C)/B
[0067] 式中：
[0068] B-配制悬浮液所取试样中的含颗粒体病毒，单位（亿0B);
[0069] C一留在量筒底部25mL悬浮液的含菌量，单位（亿0B)。
[0070] (4) · 5倾倒性试验
[0071] (4) .5.1 方法提要
[0072] 将置于容器中的悬浮剂试样放置一定时间后，按照规定程序进行倾倒，测定滞留 在容器
[0073] 内试样的量；将容器用水洗涤后，再测定容器内的试样量。
[0074] (4) · 5. 2 仪器
[0075] 具磨口塞量筒：500mL±2mL。量筒高度39cm，上、下刻度间距离25cm。
[0076] (4). 5. 3 试验步骤
[0077] 将抽取的样品倒入已称量的量筒中（包括塞子），装至量筒体积的8/10处，塞紧磨 口塞，称量，放置24h后，打开塞子，将量筒由直立位置旋转1350,倾倒60s，再倒置60s，重新 称量筒和塞子。
[0078] 将相当于80%量筒体积的水（20°C )倒人量筒中，塞紧磨口塞，将量筒颠倒10次 后，按上述操作倾倒内容物，第三次称量量筒和塞子。
[0079] (4). 5. 4 计算
[0080] 倾倒后的残余物W1 (% )，和洗涤后的残余物W2 (% )，分别按（6)、（7)式计算。
[0081]
【权利要求】
1. 一种夜蛾颗粒体病毒GXW9-3,其保藏号为CCTCC N0:V201340。
2. -种含有夜蛾颗粒体病毒的制剂的制备方法，包括以下步骤： 第一步、将野外与室内交替繁育的幼虫喂食夜蛾颗粒体病毒GXW9-3,当野外繁育的幼 虫为3?5龄时开始接夜蛾颗粒体病毒GXW9-3 ;当室内工厂化繁育的3?5龄幼虫斜纹夜 蛾禁食3. 5?4. 5小时，再将夜蛾颗粒体病毒GXW9-3混入饲料中，搅拌均匀，喂食幼虫，保 持环境温度28?38°C，光照强度2500-3000LUX，相对湿度70?75%，待幼虫细胞病变； 第二步、在幼虫细胞病变的24?32小时内搜集具有急剧痉挛反应、后足指尖插入植物 顶部组织或叶缘叶肉组织而倒挂死亡幼虫尸体，将幼虫尸体经体表酒精消毒后，待80 %以 上的尸体体表破裂流出乳白色的浓稠液体后，将幼虫尸体粉碎至粒径在75nm以上； 第三步、将粉碎出的幼虫体液制成大于110亿ΟΒ/mL的夜蛾颗粒体病毒GXW9-3制剂。
3. 根据权利要求2所述含有夜蛾颗粒体病毒的杀虫剂的制备方法，其特征在于：所述 第一步中，幼虫包括银纹夜蛾、烟青虫、小莱蛾、菜青虫、斜纹夜蛾、稻螟虫或粘虫的幼虫，所 述交替繁育是室内工厂化繁育斜纹夜蛾等夜蛾昆虫5代后，再将斜纹夜蛾等夜蛾昆虫移至 室外寄主作物上繁殖1代。
4. 根据权利要求3所述含有夜蛾颗粒体病毒的杀虫剂的制备方法，其特征在于：所述 幼虫为高龄斜纹夜蛾幼虫。
5. 根据权利要求3所述含有夜蛾颗粒体病毒的杀虫剂的制备方法，其特征在于：所述 夜蛾颗粒体病毒GXW9-3的加入量为每百斤饲料接入干燥GXW9-3菌株100g。
6. 根据权利要求2所述含有夜蛾颗粒体病毒的杀虫剂的制备方法，其特征在于：所述 步骤三中粉碎方式为砂磨粉碎。
7. 根据权利要求2所述含有夜蛾颗粒体病毒的制剂的应用，其特征在于：将所述夜蛾 颗粒体病毒GXW9-3制剂用清水稀释500-600倍液后加入8mL的农用有机硅制成悬浮液，在 晴天的傍晚将悬浮液喷施于斜纹夜蛾等幼虫取食植株上即可。
8. 根据权利要求7所述含有夜蛾颗粒体病毒的制剂的应用，其特征在于：所述喷施条 件是28?381：、光照强度2500?30001^?，相对湿度65%?85%的环境下喷施。
【文档编号】A01N63/00GK104059888SQ201410271452
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】高小文 申请人:高小文