专利名称：一种提取体液中病毒rna或dna的试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生化领域，具体涉及核酸的分离。
背景技术：
血浆、血清中病毒RNA/DNA提取的主流方法是"Trizol"法，但这种方法需要在提取过 程中吸取上清并换管，上清不能完全吸出，总要损失一部分RNA/DNA，且步骤比较繁琐，因 此对于严格的绝对定量并不是很合适。另外我国及国外市场上也出现了一管式病毒RNA/DNA 提取试剂，但该类试剂的提取效率较低，需要200ul以上的液体标本才能达到较高的敏感性， 如罗氏公司的HIV定量试剂及国内天泽基因的RNAout提取试剂。罗氏公司的HIV定量试剂用 200ul血浆可使HIV定量敏感性达到200copies/ml ，而RNAout提取试剂据其广告宣称用200ul 血桨可使病毒定量敏感性达到50 100copies/ml，但实际上由于该试剂在沉淀病毒RNA的同 时沉淀了大量蛋白，且最终RNA溶解体积要100ul以上，所以其效率并不高，因此阻碍了其 大规模应用。
发明内容
本发明要解决的问题是提高体液中病毒RNA或DNA的提取效率。 本发明解决上述问题的技术方案是-
一种提取体液中病毒RNA或DNA的试剂，其特征在于每升试剂由以下组分组成异硫 氰酸胍4 6mo1，盐酸胍l 2.5mo1，柠檬酸钠20 50mmo1， & -巯基乙醇10 30ml ，十二垸 基肌氨酸钠5 10g，尿素1.5 3mo1，糖原60 100mg，余量为水。
每升本发明试剂中各组分的含量优选异硫氰酸胍5.4mol，盐酸胍2rao1，柠檬酸钠 25鹏o1， e-巯基乙醇20ml，十二烷基肌氨酸钠7g，尿素2mo1，糖原64mg，余量为水。
本发明试剂的制备方法为将异硫氰酸胍、盐酸胍、柠檬酸钠、e-巯基乙醇、十二烷基
肌氨酸钠、尿素和糖原溶于水中即可。上述制备方法中所用的水均经DEPC处理过。 采用本发明试剂提取体液中病毒RNA或DNA的方法是 (1 )取三体积份本发明试剂，加入标本，上下颠倒混匀4 6次至混匀，常温下静置10min， 然后加入四体积份的异丙醇，上下颠倒混匀4 6次至混匀，在20 25'C下用高速离心机 12000-13000rpm离心15min;
(2) 倾去上清液，再以12000rpm离心lmin;
(3) 吸净剩余的上清液，然后加入体积百分比浓度为50%的冷异丙醇八体积份，然后 在4。C下离心5min，倾去上清液体，留沉淀物；
3(4)以12000rpm离心lmin，吸净剩余的上清液，留沉淀物。
上述步骤中，所述的标本是体液标本，如血浆、血清及用离心法除去细胞的脑脊液、胸 水、腹水等；所述的体积份均以标本量为一单位体积计算得到的体积份数。
为了方便后续工作的进行，上述方法获得RNA或DNA沉淀物后应尽快用逆转录溶液或 水溶解。所述的逆转录溶液是用于逆转录反应的缓冲液，如市售逆转录试剂盒中的buffer。
用本发明试剂提取病毒RNA或DNA的效率较高，体液标本的用量可低至100 y L，且所 得RNA或DNA纯度较高，用于反转录或定量PCR检测时，可使检测敏感性可达到 50copies/mL。本发明之所以有这样的效果，是因为本发明试剂选用了合适的蛋白变性剂以及 提高了提取体系中的盐浓度。本发明试剂中所含的异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素蛋白质的强变 性剂，三者组合可使病毒的蛋白质外壳快速变性并溶解在试剂里，充分暴露出蛋白质外壳内 的RNA，这样可极大提高标本的利用率；本发明试剂中高浓度的柠檬酸钠提高了提取体系中 的盐浓度，有利于减少在异丙醇沉淀RNA或DNA时蛋白质的共沉淀，尽可能减少病毒RNA/DNA 沉淀物中的蛋白杂质，大大提高了所得病毒RNA/DNA的纯度，使最终溶解体积可低至8微升。
图1是实施例1所得RNA的逆转录后的定量PCR扩增曲线图。 图2是实施例1定量PCR扩增的标准曲线图。 图3是实施例2所得DNA的定量PCR扩增曲线图。 图4是实施例2定量PCR扩增的标准曲线图。
具体实施方式
例1
本发明试剂组成异硫氰酸胍5. 4mo1，盐酸胍2mo1，柠檬酸钠25mmo1， P -巯基乙醇20ml， 十二垸基肌氨酸钠7g，尿素2mo1，糖原64mg，其余为水。
本发明试剂的制备取异硫氰酸胍、盐酸胍、柠檬酸钠2、 巯基乙醇、十二烷基肌氨 酸钠、尿素和糖原混合，用经DEPC处理过的水溶解并定量至1L，然后用0.45um滤膜过滤。
病毒RNA的提取
(1) 材料将SIV病毒标准品(国际通用SIV病毒颗粒标准品，法国巴黎第五大学卢葳 教授惠赠)用猴血浆稀释为6个浓度，分别为0.5X107 copies/ml、 0.5X106 copies/ml、 0. 5X105 copies/ml、 0. 5X 104 copies/ml、 0. 5X 103 copies/ml、 0. 5X 102copies/ml，每个 浓度做12个平行提取实验。同时设立猴血浆为阴性对照孔2孔。
(2) 方法向1. 5ml离心管中加入300ul本发明试剂，然后加入上述血浆标本100ul， 上下颠倒混匀4次至混匀(不可剧烈摇荡)，常温下静置10min;然后加入400ul常温的异丙醇，上下颠倒混匀4次至混匀，于常温下12000rpm离心15min。倾去上清液，再以12000rpm 离心lmin。用移液枪小心吸干净管底的剩余液体(不可触碰管底的沉淀)，然后加入体积百 分比浓度为50M的冷异丙醇800ul，然后在4'C下离心5min，倾去上清液体。再以12000rpm 离心lmin。用移液枪小心吸干净管底的剩余液体(不可触碰管底的沉淀)。最后加入8ul水 溶解沉淀(如沉淀难溶，需用移液枪吹打，务必使沉淀散开)。 所得RNA的质量鉴定
将所得RNA逆转录定量PCR实验，逆转录反应体系和条件如下 逆转录反应体系为(RNA样品为沉淀，不计入体积)。
5X Buffer 1.6ul
Reverse引物(250nM) 0. 4ul
d證(lOmM) 0.8ul
Rnase inhibitor (40u/ul) 0. 2ul
水 4.6ul
逆转录酶(200u/ul)_0. 4ul
总体积
5XBuffer、 Rnase inhibitor和逆转录酶均为立陶宛MBI公司产品，购自深圳中晶公司，水 为DEPC处理水，DEPC购自广州威佳公司。
逆转录条件为置入42'C水浴锅中1小时，然后即可进行PCR反应，亦可冻存于冰箱 中长期保存。
将逆转录反应所得的cDNA进行定量PCR检测，反应体系和条件如下
引物sense (250nM): 0. 25ul
引物antisense (250nM): 0. 25ul
Probe (200nM) : 0. 2ul
水 9.8ul
定量PCRraix: 12. 5ul (市售ABI公司定量PCR试剂盒)
cDNA Sample:_^_
总体积 25ul
引物与探针均为上海基康公司合成及标记，定量PCRMix为美国ABI公司产品，水为DEPC 处理水。DEPC购自广州威佳公司。
上机条件95°C， 10min，然后95。C， 15sec， 6CTC， lmin， 45个循环。
用本发明试剂提取所得的病毒RNA的定量PCR扩增结果如图1所示同一个浓度的12 个平行样的Ct值都几乎重合，说明用本发明试剂提取病毒RNA的重复性极好；以病毒拷贝 数的对数值为自变量，Ct值为因变量作图，得一标准曲线(见图2)，标准方程为 y=-3.34x+39.01， R2=0.993。上述结果显示定量PCR可检测出低至50拷贝/毫升的所得RNA 样品，说明用本发明试剂提取病毒RNA的纯度很高。
例2
本发明试剂组成异硫氰酸胍5. 4mo1，盐酸胍2mol，柠檬酸钠25mmol， P -巯基乙醇20ml，
5十二垸基肌氨酸钠7g，尿素2mo1，糖原64mg，其余为水。
本发明试剂的制备取异硫氰酸胍、盐酸胍、柠檬酸钠、e-巯基乙醇、十二烷基肌氨酸
钠、尿素和糖原混合，用经DEPC处理过的水溶解并定量至1L，然后用0.45um滤膜过滤。 实验材料医院临床检测的HBVDNA定量拷贝数在le9以上的病人血清标本。 将HBVDNA病人血清标本用细胞培养用新生牛血清进行稀释，稀释为5e8拷贝/毫升、 5e7拷贝/毫升、5e6拷贝/毫升、5e5拷贝/毫升、5e4拷贝/毫升、5e3拷贝/毫升、5e2拷贝/ 毫升、5el拷贝/毫升，每个浓度设3个复孔，并同时设立新生牛血清为阴性对照孔l孔，向 1. 5ml离心管中加入300ul本发明试剂，然后加入血清标本100ul，上下颠倒混匀4次至混匀 (不可剧烈摇荡)，常温下静置10min;然后加入400ul常温的异丙醇，上下颠倒混匀4次至 混匀，于常温下12000rpm离心15min。倾去上清液，再以12000rpm离心lmin。用移液枪小 心吸干净管底的剩余液体(不可触碰管底的沉淀)，然后加入体积百分比浓度为50%的冷异 丙醇800ul，然后在4。C下离心5min，倾去上清液体。再以12000rpm离心lmin。用移液枪小 心吸干净管底的剩余液体(不可触碰管底的沉淀)。最后加入8ul水溶解沉淀(如沉淀难溶， 需用移液枪吹打，务必使沉淀散开)。
将所得病毒DNA进行PCR反应，PCR反应体系及条件如下
引物sense (250nM): 0. 25ul
引物antisense (250nM): 0. 25ul
Probe (200nM) : 0.2ul
水 9.8ul
定量PCRmix: 12. 5ul (市售ABI公司定量PCR试剂盒)
DNA S柳ple:__
25ul
上述试剂中，引物与探针均为上海基康公司合成及标记，定量PCRMix为美国ABI公司 产品，水为DEPC处理水。DEPC购自广州威佳公司。
上机条件95。C, 10min，然后95。C, 15sec， 60°C， lmin， 共反应40个循环。
用本发明试剂提取所得的病毒DNA的定量PCR扩增结果如图3所示同一个浓度的12 个平行样的Ct值都几乎重合，说明用本发明试剂提取病毒RNA的重复性极好；以病毒拷贝 数的对数值为自变量，Ct值为因变量作图，得一标准曲线(见图4)，标准方程为 y=-3.285566x+42.496368， R2-0.994。上述结果显示定量PCR可检测出低至50拷贝/毫升的 所得RNA样品，且重复性极好，说明用本发明试剂提取病毒RNA的纯度很高。
例3
本发明试剂组成异硫氰酸胍4mo1，盐酸胍lmol，柠檬酸钠20國o1， P -巯基乙醇10ml，十二垸基肌氨酸钠5g，尿素1.5mo1，糖原60mg，余量为水。
本发明试剂的制备取异硫氰酸胍、盐酸胍、柠檬酸钠、巯基乙醇、十二烷基肌氨酸 钠、尿素和糖原混合、用经DEPC处理过的水溶解并定量至1L，然后用0.45lim滤膜过滤。
实验材料医院临床检测的HBVDNA定量拷贝数在le9以上的病人血清标本。
将HBVDNA病人血清标本用细胞培养用新生牛血清进行稀释，稀释为5e8拷贝/毫升、 5e7拷贝/毫升、5e6拷贝/毫升、5e5拷贝/毫升、5e4拷贝/毫升、5e3拷贝/毫升、5e2拷贝/ 毫升、5el拷贝/毫升，每个浓度设3个复孔，并同时设立新生牛血清为阴性对照孔l孔，向 1. 5ml离心管中加入300ul本发明试剂，然后加入血清标本100ul，上下颠倒混匀4次至混匀 (不可剧烈摇荡)，常温下静置10min;然后加入400ul常温的异丙醇，上下颠倒混匀4次至 混匀，于常温下12000rpm离心15min。倾去上清液，再以12000rpm离心lmin。用移液枪小 心吸干净管底的剩余液体(不可触碰管底的沉淀)，然后加入体积百分比浓度为50%的冷异 丙醇800ul，然后在4'C下离心5min，倾去上清液体。再以12000rpm离心lmin。用移液枪小 心吸干净管底的剩余液体(不可触碰管底的沉淀)。最后加入8ul水溶解沉淀(如沉淀难溶， 需用移液枪吹打，务必使沉淀散开)。
例4
本发明试剂组成异硫氰酸胍6mo1,盐酸胍2.5tno1，柠檬酸钠50ramo1， P-巯基乙醇 30ml，十二烷基肌氨酸钠10g，尿素3mo1,糖原100mg,余量为水。
本发明试剂的制备取异硫氰酸胍、盐酸胍、柠檬酸钠、e-巯基乙醇、十二垸基肌氨酸
钠、尿素和糖原混合，用经DEPC处理过的水溶解并定量至1L，然后用0.45nm滤膜过滤。 病毒RNA的提取
(1) 材料将SIV病毒标准品(国际通用SIV病毒颗粒标准品，法国巴黎第五大学卢葳 教授惠赠)用猴血浆稀释为6个浓度，分别为0.5X107 copies/ml、 0.5X106 copies/ml、 0. 5X105 copies/ml、 0. 5X 104 copies/ml、 0. 5X 103 copies/ml、 0. 5X 102copies/ml，每个 浓度做12个平行提取实验。同时设立猴血浆为阴性对照孔2孔。
(2) 方法向1.5ml离心管中加入300ul本发明试剂，然后加入上述血浆标本100ul， 上下颠倒混匀4次至混匀(不可剧烈摇荡)，常温下静置10min;然后加入400ul常温的异丙 醇，上下颠倒混匀4次至混匀，于常温下12000rpm离心15min。倾去上清液，再以12000rptn 离心lmin。用移液枪小心吸干净管底的剩余液体(不可触碰管底的沉淀)，然后加入体积百 分比浓度为50X的冷异丙醇800ul，然后在4'C下离心5min，倾去上清液体。再以12000rpm 离心lmin。用移液枪小心吸干净管底的剩余液体(不可触碰管底的沉淀)。最后加入8ul水 溶解沉淀(如沉淀难溶，需用移液枪吹打，务必使沉淀散开)。
权利要求
1、一种提取体液中病毒RNA或DNA的试剂，其特征在于每升试剂由以下组分组成异硫氰酸胍4～6mol，盐酸胍1～2.5mol，柠檬酸钠20～50mmol，β-巯基乙醇10～30ml，十二烷基肌氨酸钠5～10g，尿素1.5～3mol，糖原60～100mg，余量为水。
2、 如权利要求l所述的试剂，其特征在于每升试剂由以下组分组成 异硫氰酸胍5.4rao1，盐酸胍2mo1，柠檬酸钠25ramo1， e-巯基乙醇20ml，十二烷基肌氨酸钠7g，尿素2mo1，糖原64mg，余量为水。
3、 一种提取体液中病毒RNA或DNA的方法，该方法由以下步骤组成 (1) 取三体积份权利要求1或2所述试剂，加入标本，上下颠倒混匀4 6次至混匀， 常温下静置10min，然后加入四体积份的异丙醇，上下颠倒混匀4~6次至混匀，在20 25 。C下用高速离心机12000 13000rpm离心15min;(2) 倾去上清液，再以12000rpm离心lmin;(3) 吸净剩余的上清液，然后加入体积百分比浓度为50%的冷异丙醇八体积份，然后 在4。C下离心5min，倾去上清液体，留沉淀物；(4) 再以12000rpm离心lmin，吸净剩余的上清液，留沉淀物；其中，所述的标本是体液标本；所述的体积份均以标本量为一单位体积计算得到的体积 份数。
全文摘要
本发明提供了一种提取体液中病毒RNA或DNA的试剂，其特征在于每升试剂由以下组分组成异硫氰酸胍4～6mol，盐酸胍1～2.5mol，柠檬酸钠20～50mmol，β-巯基乙醇10～30ml，十二烷基肌氨酸钠5～10g，尿素1.5～3mol，糖原60～100mg，余量为水。用本发明试剂提取出来的病毒RNA或DNA的效率较高，仅用100μL的体液标本稳定即可获得高纯度的病毒RNA或DNA。所得RNA或DNA用于定量PCR检测时，检测敏感性可达到50copies/mL。
文档编号C12N15/10GK101565700SQ200910039350
公开日2009年10月28日 申请日期2009年5月8日 优先权日2009年5月8日
发明者何金洋 申请人:广州中医药大学