预防黄病毒感染的核酸疫苗的制作方法

专利名称：预防黄病毒感染的核酸疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及新地疫苗、诊断试剂及其在治疗和预防由黄病毒引起的疾病中应用两者的方法。尤其是，所述疫苗为含有诸如日本脑炎病毒(JEV)，西尼罗脑炎病毒(WNV)或相关黄病毒的黄病毒结构蛋白基因的重组核酸。这些疫苗在体内施用时用作病毒蛋白抗原生物合成的转录单位。诊断试剂为含有抗原的组合物，所述抗原从可用来检测黄病毒感染的重组核酸制备而来。
背景技术：
黄病毒为黄病毒属的成员，其被分类在黄病毒科中。黄病毒主要对人类和其它哺乳动物致病。给人类和动物造成疾病的黄病毒包括Alfuy，Apoi，Aroa，Bagaza，Banzi，Batu Cave，Bouboui，Bukalasa蝙蝠，Bussuquara，Cacipacore，Carey Island，Cowbone Ridge，达喀尔蝙蝠，登革(血清型1，2，3和4)，Edge Hill，Entebbe蝙蝠，Gadgets Gully，Iguape，Ilheus，以色列火鸡脑膜脑炎(Israel turkeymeningoencephalitis)，日本脑炎(Japanese encephalitis)，Jugra，Jutiapa，Kadam，Karshi，Kedougou，Kokobera，Koutango，Kunjin，Kyasanur森林出血热(Kyasanur Forest disease)，Langat，Meaban，Modoc，Montanamyotis白质脑炎(leukoencephalitis)，墨累谷(Murray Valley)脑炎，Naranjal，Negishi，Ntaya，Omsk出血热，金边蝙蝠(Phnom Penh bat)，Potiskum，玻瓦桑(Powassan)，Rio Bravo，罗西奥(Rocio)，Royal Farm，俄国春夏脑炎(Russian spring summer encephalitis)，Saboya，Sal Vieja，San Perlita，Saumarez Reef，Sepik，Sokuluk，Spondweni，圣路易脑炎，Stratford，壁虱性脑炎-中欧亚型(Tick-borne encephalitis-centralEuropean subtype)，壁虱性脑炎-远东亚型(Tick-borne encephalitis-fareastern subtype)，Tembusu，THCAr，Tyuleniy，Uganda S，Usutu，西尼罗脑炎(West Nile)，Yaounde，黄热病(Yellow fever)，Yokose，Ziki，细胞融合试剂和其它的相关黄病毒列在Kuno等(J.Virol.7273-83(1998))中。
黄病毒含有下列三种结构蛋白prM/M，前膜蛋白和膜蛋白；E，包膜蛋白；和C，衣壳蛋白。(Monath，Virology(Fields编)，Raven Press，New York，1990，pp.763-814；Heinz和Roehrig，病毒免疫化学II血清学诊断和疫苗基础(Immunochemistry of Viruses IIThe Basis forSerodiagnosis and Vaccines)(van Regenmortel和Neurath编)，Elsevier，Amsterdam，1990，pp.289-305)。M的分子量(MW)大约为7-8千道而顿(kDa)，E的分子量(MW)大约为55-60kDa。M的较大合成前体为prM。在成熟病毒粒子中，prM经加工形成M蛋白，prM的pr部分被去除。M和E位于病毒颗粒的膜上，并且长期以来被认为构成了病毒的重要免疫原性部分。
黄病毒为RNA病毒，含有单链RNA，在不同种中，长度大约为10千碱基(kb)。MW为12-14kDa的C蛋白和RNA复合形成核壳复合体。很多非结构蛋白也由RNA基因组编码，其命名为NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5。基因组在宿主细胞中被翻译成多蛋白，然后通过病毒或者宿主特异性蛋白酶进行共翻译或者翻译后加工形成单独的基因产物(

图1)
几种黄病毒的基因组核苷酸序列已知概述在美国专利No.5,494,671中。JEV序列由Sumiyoshi等(Virology 161497-510(1987))和Hashimoto等(Virus Genes 1305-317(1988))提供。JEV的毒株SA-14和在中国作为疫苗使用的减毒株SA-14-14-2的核苷酸序列在Nitayaphan等人(Virology 177541-552(1990))的工作中进行了比较。
编码其它黄病毒种的结构蛋白的核苷酸序列也已经公知。在很多例子中，已经报道了全基因组序列。报道的序列包括登革病毒血清型1，登革病毒血清型2(Deubel等，Virology 155365-377(1986)；Gruenberg等，J.Gen.Virol.691391-1398(1988)；Hahn等，Virology 162167-180(1988))，登革病毒血清型3(Osatomi等，Virus Genes 299-108(1988))，登革病毒血清型4(Mackow等，Virology 159217-228(1987)，Zhao等，Virology 15577-88(1986))，西尼罗病毒(Lanciotti等，Science2862331-2333(1999))，玻瓦桑病毒(Mandl等Virology 194173-184(1993))和黄热病毒(YFV)(Rice等，Science 229726-733(1985))。
包括圣路易脑炎病毒(SLEV)，WNV和JEV的很多黄病毒通过蚊子传播给人类和其它宿主动物。因此这些病毒在很广泛的地区传播流行而且很难阻断或者预防其传播。
西尼罗热是一种蚊媒的黄病毒感染，主要通过多种Culexmosquitoes(库蚊)传播给脊椎动物。类似于其它黄病毒的日本脑炎(JE)抗原复合物，包括JE，SLE和墨累谷脑炎(MVE)病毒，，WNV在节肢动物传播介体和鸟类之间保持了一种自然循环。该病毒最初在1937年分离自乌干达西尼罗地区的一个发热病人(Smithburn等，Am.J.Trop.Med.Hyg.20471-492(1940))。很快该病毒就被公认为一种分布最广泛的黄病毒，其地理分布区包括非洲，中东，西亚，欧洲和澳洲(Hubalek等，Emerg.Infect.Dis.5643-50(1999))。临床上，人类的西尼罗热是一种自限急性发热疾病，伴随着头痛，肌痛，多关节病，皮疹和淋巴结肿大(Monath和Tsai，Clinical Virology，(Richman，Whitley和Hayden编)，Churchill-Livingtone，New York，1997，pp.1133-1186)。偶尔也报道急性肝炎或胰腺炎，在WNV感染的老年患者的例子中有时还并发脑炎或脑膜炎(Asnis等，Clin.Infect.Dis.30413-418(2000))。因此WNV感染在世界上的很多地区都是受到广泛关注的健康问题。
该疾病的地理传播，尤其是1999年WNV进入美国，大大提高了对于患该病的人类和动物的健康关注意识。在1999年8月底和9月初，纽约和周边地区经历了病毒性脑炎的爆发，62例确诊病例中有7例死亡。与这次爆发同时，地方卫生官员观察到鸟类(特别是乌鸦)和马死亡率的提高。后来根据人类，鸟和蚊子物种的单克隆抗体(Mab)图谱和基因组序列检测发现这次爆发是由WNV引起的(Anderson等，Science 2862331-2333(1999)；Jia等，Lancet 3541971-1972(1999)；Lanciotti等，Science 2862333-2337(1999))。随后在冬天的几个月内检测到的病毒活性显示该病毒已经在北美定居(Morb.Mortal.Wkly.Rep.49178-179(2000)；Asni等，Clin.Infect.Dis.30413-418(2000)；Garmendia等，J.Clin.Micro.383110-3111(2000))。在2000年间来自东北和大西洋中部州报道的监视数据证实了动物流行/流行传播的增强以及记录了鸟类，蚊子和马，以及人类的大量病毒感染个例地理分布的延伸(Morb.Mortal.Wkly.Rep.49820-822(2000))。
目前，还没有现成的人用或者兽用疫苗预防WNV的感染，蚊子的控制是唯一抗击疾病蔓延的实用策略。
日本脑炎病毒(JEV)感染成人和儿童，并在热带和亚热带的亚洲地区的婴儿，儿童和老人中有很高的死亡率(Tsai等，Vaccines(Plotkin编)W.B.Saunders，Philadelphia，Pa，1999，pp.672-710。在幸存者中，有涉及脑炎症状感染后遗留的严重神经症状。在这个地区的发达国家，诸如日本，台湾和韩国，JEV通过使用灭活JEV疫苗已经大部分得到控制。但是在这个地区的其它国家仍在流行。
合适用于抗JEV感染的疫苗包括通过诸如福尔马林方法处理的灭活病毒，以及减毒病毒(Tsai等，Vaccines(Plotkin编)W.B.Saunders，Philadelphia，Pa，1994，pp.671-713)。全病毒疫苗，虽然有效，但确实存在一定的问题和/或缺点。病毒培养在小鼠的脑部或采用哺乳动物细胞作为宿主的细胞培养物中。这种培养方法很烦琐并很昂贵。此外，也伴随着将宿主细胞，即脑或者其它宿主的抗原掺入最终疫苗产物的危险，可能导致疫苗受体不想要和不需要的变态反应。也存在参与疫苗生产的工人被不经意感染的危险。最后，还存在病毒没有完全或者全部灭活或者减毒，因而疫苗可能实际上引起疾病的危险。
登革热和登革出血热(DF/DHF)由登革病毒引起，也是蚊媒黄病毒。有四种抗原性相关，但是不同的登革病毒血清型(DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4)，所有都能引起DF/DHF。DF属于登革相关疾病的温和型，其症状包括发热，皮疹，严重头痛和关节痛。这些患有DF的个体死亡率很低，但是患有DHF的个体的死亡率可能高达5％。可靠的证据显示，在过去的40年间，多于3百万的DHF个例和58,000的死亡个例是由于DHF引起，使得DHF成为一种主要的新出现疾病(Halstead，登革和登革出血热(Dengue and DengueHemorrhagic Fever)(Gubler和Kuno编)CAB International，New York，NY，(1997)pp 23-44)。然而，尽管进行了几十年的努力，还没有出现适合的防止登革病毒感染的安全有效的疫苗。
黄热病在南美洲热带地区和非洲撒哈拉沙漠以南地区流行，并由蚊子传播。感染导致发热，寒战，严重头痛和其它疼痛，厌食，恶心和呕吐，并伴随黄疸的出现。培养在感染鸡胚中的活病毒疫苗1 7D，被认为是安全有效的。但是，仍然需要在诸如在非洲热带地区和最需要疫苗的美洲地区通常遇到的恶劣条件下稳定存在的疫苗。
两种黄病毒嵌合体的重组黄病毒公开于PCT申请WO 93/06214中。该嵌合体是融合了一种“类型”，或血清型的登革病毒或黄病毒的结构蛋白和另一种不同“类型”，或血清型的登革病毒或其它黄病毒的结构蛋白的构建体。
近年来，一些重组亚单位和病毒疫苗已被设计。美国专利No.4,810,492描述了生产JEV的E糖蛋白作为疫苗的抗原。将相应的DNA克隆到表达系统，目的是在合适的宿主细胞，诸如，大肠杆菌，酵母，或者高等生物细胞培养物中表达抗原蛋白。美国专利No.5,229,293公开了包含JEV E蛋白基因的重组杆状病毒。该病毒用于感染培养物中的昆虫细胞，以产生E蛋白并回收用作疫苗。
美国专利No.5,021,347公开了一种整合了JEV E蛋白基因的重组牛痘病毒基因组。活重组牛痘病毒作为疫苗免疫抗JEV。整合了登革血清型2，登革血清型4和JEV的E蛋白平截C-末端基因的重组牛痘病毒和杆状病毒公开于美国专利5,494,671。美国专利5,514,375公开了多种重组牛痘病毒，其表达从prM延伸到NS2B的部分JEV可读框。这些痘病毒诱导形成含有加工后M蛋白和E蛋白的细胞外颗粒。编码这些JEV蛋白的两种重组病毒在小鼠体内产生了高滴度的中和抗体和血凝素-抑制抗体，以及保护性免疫。两种免疫处理后的影响程度高于只进行一种免疫处理的情况。当含有JEV的prM/M和E蛋白的基因的重组痘病毒给小鼠施用后赋予小鼠保护性免疫(Konishi等，Virology 180401-410(1991))。用携带JEV prM和E基因的重组痘病毒感染HeLa细胞后显示产生亚病毒颗粒(Konishi等，Virology188714-720(1992))。Dmitriev等人报道了用编码壁虱性脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus)结构蛋白和特定非结构蛋白的重组痘病毒免疫小鼠(J.Biotechnology 4497-103(1996))。
重组病毒载体也已被制备用作登革热的病毒疫苗。Zhao等人(J.Viro1.614019-4022(1987))制备了携带登革血清型4结构蛋白和NS1的重组痘病毒并且用重组病毒感染哺乳动物细胞后获得了表达。用重组杆状病毒感染靶昆虫细胞后也获得了类似表达(Zhang等，J.Virol.623027-3031(1988))。Bray等(J.Virol.632853-2856(1989))也报道了一种基于E蛋白基因的重组痘登革疫苗，其能够对小鼠实施保护性免疫抵抗登革脑炎的攻击。Falgout等(J.Virol 631852-1860(1989))和Falgout等(J.Virol.644356-4363(1990))报道了类似的结果。Zhang等(J.Virol 623027-3031(1988))的研究显示编码登革E和NS1蛋白的重组杆状病毒同样保护小鼠免遭登革脑炎的攻击。其它结构基因和非结构基因整合到重组病毒疫苗的组合不能产生显著免疫(Bray等，J.Virol.632853-2856(1989))。同样，用表达E蛋白的重组杆状病毒免疫猴子时，对登革病毒攻击不能产生完全的保护性免疫(Lai等(1990)pp.119-124，F.Brown，R.M.Chancock，H.S.Ginsberg和R.Lerner(编)疫苗90生产包括预防AIDS的新疫苗的现代方法(Vaccines 90Modemapproaches to new vaccines including prevention of AIDS)，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY。
使用重组DNA制备物的免疫已被报道于使用断乳小鼠作为模型的SLEV和登革病毒-2(Phillpotts等，Arch.Virol.141743-749(1996)；Kochel等，Vaccine 15547-552(1997))。通过使用单剂量或双剂量的DNA免疫，编码SLEV的prM和E基因的质粒DNA提供了抗SLEV攻击的部分保护。在这些试验中，对照小鼠显示大约25％的存活率，DNA免疫的小鼠中没有检测到保护性抗体(Phillpotts等，Arch.Virol.141743-749(1996))。在接受3次皮内注射含prM的重组登革-2质粒DNA的小鼠中，100％产生了抗登革-2中和抗体，并且92％接受相应E基因的小鼠同样产生了中和抗体(Kochel等，Vaccine 15547-552(1997))。但是采用双剂量方案的攻击试验没能保护小鼠免于致命登革-2病毒的攻击。
用来定期免疫抗JEV，SLEV，登革病毒和其它黄病毒感染的疫苗在应用中有很多缺点和问题。灭活疫苗的制备费用昂贵也很困难。此外，任一这种疫苗都必须承担来自制备病毒中所使用宿主细胞蛋白变态反应的危险。另外，这些疫苗对于从事生产的工人也有很大的危险性。候选减毒JEV疫苗正在进行临床试验，但是自1996年以来还未在中国以外的地方没有获得广泛的接受(Hennessy等，Lancet3471583-1586(1996))。
基于仅仅使用诸如JEV黄病毒特定蛋白的重组疫苗，其生产方法是在细胞培养物中生物合成表达后纯化或处理抗原，并不诱导高滴度的抗体。同样，类似于全病毒制备物，这些疫苗具有对宿主或者载体抗原不利的变态反应的危险。抗登革病毒和WNV疫苗的开发还很落后，且这些以病毒为基础的或者以重组蛋白为基础的疫苗面临着如上所述疫苗的相同问题。
因此需要开发直接抗诸如黄热病毒，登革病毒，JEV，SLEV和WNV的黄热病毒的疫苗或者改良疫苗，其制备要便宜，而且对于参与生产的工人呈现很小的危险性，由于杂质或者不定的免疫原性部分而导致不利变态反应的危险性最低，并且高效诱导中和抗体和保护性免疫。此外还需要抗JEV，WNV和相关黄病毒的疫苗使需要的免疫剂量数最小化。
如详述的生产疫苗的现有技术的很多缺点也适于免疫诊断试剂的抗原和抗体的生产中。尤其是，在生产病毒抗原时并发的危险性和费用，以及大多数目前可用的重组表达抗原诱导有效免疫应答的失败，在免疫诊断试剂领域与相同的危险性，高昂的费用和相应灵敏度的缺乏并行。因此，由于用活病毒意外感染的高昂费用和危险性，而且灵敏度低于从前试验所需要的水平，所以目前需要开发快速，简单，高敏感度的诊断试剂用于黄病毒感染和/或污染的检测。
本发明通过提供高效免疫原性重组抗原用于检测针对待选黄病毒的抗体的诊断方法满足了这些需要。本发明还提供了衍生自黄病毒，黄病毒基因或者其类似物的重组抗原在检测针对黄病毒蛋白的抗体的免疫诊断方法中的应用。
发明概述
本发明提供了含有免疫原性黄病毒抗原转录单位(TU)的核酸分子。TU整合到细胞后指导细胞合成抗原。本发明的一个重要方面，黄病毒可以为黄热病毒(YFV)，登革病毒血清型1(DEN-1)，登革病毒血清型2(DEN-2)，登革病毒血清型3(DEN-3)，登革病毒血清型4(DEN-4)，圣路易脑炎病毒(SLEV)，日本脑炎病毒(JEV)，西尼罗病毒(WNV)，玻瓦桑病毒或者任一其它黄病毒。在本发明的重要实施方案中，抗原可以为黄病毒prM/M蛋白，E蛋白，或两者。在本发明的重要实施方案中，抗原可以为嵌合黄病毒蛋白。尤其是，当TU包括prM/M和E蛋白时，宿主细胞分泌含有prM/M和E抗原的亚病毒颗粒。本发明的另一个重要方面，核酸为DNA分子。在另一个重要实施方案中，核酸TU包括适当排列的控制序列，其可操作地控制prM/M和E抗原的表达，这个控制序列可以为巨细胞病毒立即早期启动子。在另一个实施方案中，TU的核苷酸序列经改造后优化在真核细胞中的翻译，操作方法是使由TU产生的mRNA的5＇-端非翻译区的大发夹结构最小化和/或在由TU产生的mRNA的翻译起始位点包含Kozak共有序列。在另外的实施方案中，转录单位也包括聚腺苷酸(poly-A)终止子。
本发明也提供了含有核酸分子的宿主细胞，该核酸分子包含免疫原性黄病毒抗原的转录单位指导宿主细胞合成免疫原性抗原。黄病毒可以为YFV，DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4，SLEV，JEV，WNV，玻瓦桑病毒或其它黄病毒。在重要的实施方案中。抗原可以为prM/M蛋白，E蛋白，或prM/M和E蛋白两者。在后者情况下，细胞分泌含有prM/M和E抗原的亚病毒颗粒。
此外，本发明提供了免疫接种受试者抗黄病毒感染的组合物，其包括含有免疫原性黄病毒抗原转录单位的核酸分子。该转录单位在受试者体内细胞中整合之后，就指导该细胞合成免疫原性抗原。该组合物还含有药学上可接受的载体。在重要的实施方案中，黄病毒可以为YFV，DEN-1，DEN-2，DEN3，DEN-4，SLEV，JEV，WNV，玻瓦桑病毒或其它黄病毒。此外，抗原可以为prM/M蛋白，E蛋白，或prM/M和E蛋白两者。在后者的情况下，细胞分泌含有黄病毒prM/M和E抗原的亚病毒颗粒。这些亚病毒颗粒也称为非传染性的重组抗原(NRA)。在重要的实施方案中，核酸分子为DNA分子。在其它的重要实施方案中，转录单位还含有适当排列的控制序列，当核酸导入个体细胞后，所述控制序列可操作地控制prM/M和E抗原的合成。这个控制序列可以为巨细胞病毒立即早期启动子。在另外的实施方案中，转录单位也包括聚腺苷酸终止子。
本发明提供的用于免疫接种个体抗黄病毒的组合物可以包括一种或多种核酸分子，其包括一种以上免疫原性黄病毒抗原的转录单位。一种以上免疫原性黄病毒抗原可以来自不同的黄病毒种，株或者任一组合的分离物。在重要的实施方案中，黄病毒可以包括两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，或者七种或更多种黄病毒。这些黄病毒的例子包括，但不限于YFV，DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4，SLEV，JEV，WNV，玻瓦桑病毒或其它黄病毒。可以设计组合疫苗以对特定地理地区常见的黄病毒疾病提供免疫。直接针对热带和亚热带的亚洲的特定实施方案中，可以选择DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4，WN，和JE病毒。在直接着对非洲的特定实施方案中，可以选择DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4，WN和YF。在直接针对拉丁美洲的特定实施方案中，可以选择DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4，Rocio和YF病毒。
本发明进一步提供了免疫受试者抗黄病毒感染的方法。改方法包括对受试者施用有效剂量的免疫接种组合物，该组合物含有包括免疫原性黄病毒抗原转录单位的核酸分子。转录单位被细胞吸收后指导受试者体内的细胞合成免疫原性抗原。组合物还包括药学上可接受的载体。在方法的重要实施方案中，黄病毒可以为YFV，DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4，SLEV，JEV，，WNV，玻瓦桑病毒或其它黄病毒。在方法的另外一个重要方面，抗原可以为prM/M蛋白，E蛋白，或prM/M和E蛋白两者。当抗原为prM/M和E蛋白两者时，受试者体内的细胞，在其中整合了核酸后，分泌含有黄病毒prM/M和E抗原的亚病毒颗粒。此外，在方法的重要实施方案中，免疫接种的组合物以单剂量通过肠胃外途径施用给受试者。该方法的另一方面，核酸为DNA分子。在该方法的其它实施方案中，转录单位还包括合适排列的控制序列，其可操作地控制prM/M和E抗原的合成，以及在该实施方案的重要方面，这个控制序列为巨细胞病毒立即早期启动子。此外，转录单位也包括聚腺苷酸终止子。
本发明的这些方面和实施方案是其明显特征和优点的基础。作为只含有部分黄病毒基因组而非包括全基因组序列的核酸构建体，含有核酸TU的疫苗是完全非存活的。因此对于参与其生产或者接受疫苗的受试者不存在被黄病毒感染的危险。核酸疫苗制备简单，施用简单，且在使用前储存稳定。令人意外地已发现，只给哺乳动物施用单剂量的本发明的核酸疫苗后，基本上100％成功地提供了保护性免疫。另外一个令人意外的结果是核酸TU能够在雌性哺乳动物体内产生对于黄病毒的免疫可通过乳液传递给后代。不希望被理论所限制，本发明人认为核酸成功提供保护性免疫的可能机制是因为含有核酸的宿主细胞，诸如施用疫苗的受试者的细胞，产生了含有黄病毒prM/M和E抗原的亚病毒颗粒。这些颗粒具有类似于天然的黄病毒粒子的免疫原性特征。
本发明也提供了非感染性抗原多肽，抗原多肽片段和含有黄病毒prM/M和/或E蛋白的NRA，其中跨膜信号序列衍生自第一种黄病毒，而M和/或E蛋白来自第二种黄病毒。此外，prM/M蛋白可以含有来自第一种和第二种黄病毒的氨基酸序列。另外，E蛋白可以包含来自第一种和第二种黄病毒的氨基酸序列。此处应用的“嵌合体”是指含有来自一种以上黄病毒序列的任一蛋白或核酸。此处所用的“无毒”是指本发明的抗原或者疫苗不能引起疾病。更具体而言，重组蛋白抗原不含有来自黄病毒的对于黄病毒感染，复制和致病所必须的污染的基因组材料。
本发明的多肽可以含有此处定义，或者本领域技术人员公知的所选择黄病毒prM，M和/或E蛋白的氨基酸序列。本发明的核酸可以含有编码所选择黄病毒prM，M和/或E蛋白的核苷酸序列。
本发明的抗原可以为非连接的，或者可以与载体分子结合以有助于将抗原放置在固相上。载体分子可以为一种与抗原共轭结合的分子，并且载体分子不与人血清中的抗体反应。这种载体的一个例子是小牛血清白蛋白(BSA)。
本发明的抗原也可以为重组蛋白，其通过在能够产生抗原的表达系统中表达编码抗原的核酸而获得。
本发明抗原的氨基酸序列含有prM，M和/或E抗原的免疫反应部分。这些抗原可以另外结合到其它序列，这些序列就是设计用来提供一些其它特征的，诸如去除/添加能够进行二硫键连接的氨基酸提供更坚固的二级结构以提高表位的反应活性，从而提高其生物存活期或者改变其毒性或者预防感染。在任一情况下，抗原必须具有免疫反应性和/或免疫原性。
附图简述
图1为黄病毒多蛋白加工的示意图。中间水平区提供了病毒基因组的示意图。划线表示5＇和3＇非-翻译区，盒区代表结构蛋白(左侧和上部)和非结构蛋白(右侧和下部)的可读框。宿主细胞信号酶在E蛋白的C-末端的剪切和翻译同时发生，将结构区和非结构区分开。弗林蛋白酶(furin)为类枯草杆菌酶(subtilase-like)细胞酶，可能负责prM剪切。病毒多蛋白的可能跨膜区由阴影区表示。
图2是JEV基因组(上面)的图谱，以及用于逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)的寡核苷酸DNA序列(中间)以构建表达prM-E蛋白编码区(下面)转录单位。病毒多蛋白的可能跨膜区由阴影区表示。
图3显示了质粒载体pCDNA3，pCBamp和pCIBamp以及它们之间关系的示意图。这些质粒CMV(巨细胞病毒)启动子/增强子元件，BGHp(A)(牛生长激素多腺苷酸化信号和转录终止序列)，包括用于大肠杆菌中选择和维持的氨苄青霉素抗性基因和ColE1复制起点。将大肠杆菌中的单链拯救复制起点f1，SV40复制起点(SV40 ORI)，新霉素抗性编码区和SV40p(A)序列从pCDNA3中删除产生pCBamp。内含子序列插入到pCBamp的NcoI-KpnI位点产生质粒pCIBamp。
图4显示了来自JE-4B COS-1培养液的蔗糖梯度纯化的亚病毒颗粒SDS-PAGE-免疫印迹分析(4B，每对泳道的右侧泳道)。来自JEV感染的C6/36细胞培养物的密度梯度纯化的JE病毒粒子作为阳性对照(JEV，每对泳道的左侧泳道)。JE HIAF(超免疫腹水)；4G2，抗-E单克隆抗体；JM01，抗-M单克隆抗体；NMAF(正常小鼠腹水)。
图5显示了差速区带蔗糖梯度分析的E抗原谱，E抗原从用或不用Triton X-100处理的JE-4B细胞培养基的PEG沉降制备而来。
图6显示了由SignalP-HMM软件程序(A)预测的pCBJE1-14(pCBJE)信号肽的概率。通过在-4和-2位置(C-4G和G-2S)(板B，JE-LSS-M)改变c-区的序列，通过缩短n-区(板C，JE-SS-ORI)，或者通过这两种修饰的组合(板D，JE-SS-M)，信号肽概率得到提高。
图7显示了质粒载体pCBD2-14-16(100％DEN-2 E)，pCBD2-1J-4-3(90％DEN-2 E10％JEV E)，和pCB8D2-2J-2-9-1(80％DEN-2 E20％JEV E)的示意图。这些质粒包括人巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子，JE病毒信号序列；DEN-2病毒prM和E基因区(氨基末端分别为100％，90％，或80％)；JE病毒E基因区(分别为无，10％或20％)；以及牛生长激素poly A信号(BGH)。
图8显示了通过western印迹比较分泌型和膜结合的重组蛋白。(A)PEG-沉降和用乙醇从培养液中提取DEN-2质粒pCB8D2-2J-29-1，pCB9D2-1J-4-3，pCBD2-14-16，和对照质粒pEGFP后，分析分泌的重组抗原。泳道1(V)，金印迹(Gold Blot)(Owl Separation Systems，Portsmouth，NH)染色的纯化DEN-2病毒。来自每种质粒分泌的重组抗原与下列物质的反应性a，抗-包膜(E)特异性Mab 1A6A-8；b，MAB1A6A-8a，抗-衣壳(C)特异性Mab 1A2A-1和特异于DEN-2病毒前膜(prM)蛋白的抗-血清的混合物；和c，正常小鼠腹水。(B)重组质粒-转化的细胞疏水膜蛋白的分析。泳道1(V)，通过金印迹染色的纯化的DEN-2病毒；泳道2(V)，纯化DEN-2病毒和Mab 1A6A-8，Mab 1A2A-1，特异于DEN-2病毒M蛋白的抗-血清，和特异于DEN-2病毒prM蛋白的抗-血清的混合物的反应性。自每种质粒-转化的细胞系分离的疏水性膜蛋白与下列物质的反应性a，Mab 1A6A-8；b，Mab 1A6A-8，Mab 1A2A-1，特异于DEN-2病毒M蛋白的抗-血清，和特异于DEN-2病毒prM蛋白的抗-血清的混合物；和c，正常小鼠腹水。
本发明的详细描述
本发明包括编码诸如prM/M和E蛋白抗原的黄病毒抗原蛋白的核酸转录单位。当核酸被合适的细胞吸收时，尤其是当细胞为受试者的细胞时，核酸的功能是表达prM/M和E蛋白抗原。本发明也包括一种疫苗，其活性剂为核酸转录单位(TU)。本发明进一步包括含有TU的细胞。此外，本发明包括通过给受试者施用有效剂量的含核酸TU分子的疫苗免疫受试者抗黄病毒感染的方法。
本发明提供了包含转录单位的分离核酸，该转录单位编码第一种黄病毒结构蛋白的信号序列和第二种黄病毒的免疫原性黄病毒抗原，其中的转录单位指导抗原的合成。本发明进一步包括利用核酸转录单位(TU)产生黄病毒抗原以及由核酸TU产生的黄病毒抗原。本发明包括的黄病毒抗原包括整合了第一种黄病毒和至少另一种黄病毒的氨基酸序列的嵌合黄病毒抗原。本发明还包括利用由本发明的TU编码的黄病毒抗原产生黄病毒-特异性抗体以及检测黄病毒-特异性抗体的存在。
在一个实施方案中，本发明分离的核酸可以含有编码日本脑炎病毒信号序列的转录单位。
在另一个实施方案中，本发明的转录单位可以编码一种免疫原性黄病毒抗原，其可来自一种或多种下列黄病毒黄热病毒；登革病毒血清型1，登革病毒血清型2，登革病毒血清型3，登革病毒血清型4，日本脑炎病毒，玻瓦桑病毒和西尼罗病毒。
在另一个实施方案中，本发明的转录单位可以编码一种免疫原性嵌合黄病毒抗原，其可包括来自一种以上下列病毒的序列黄热病毒；登革病毒血清型1，登革病毒血清型2，登革病毒血清型3，登革病毒血清型4，日本脑炎病毒，玻瓦桑病毒和西尼罗病毒。
在一个具体的实施方案中，本发明的核酸可编码日本脑炎病毒的信号序列和西尼罗病毒，SLEV，YFV和/或玻瓦桑病毒的M蛋白和E蛋白。核酸还可编码免疫原性抗原，其可以是一种黄病毒的M蛋白，一种黄病毒的E蛋白，一种黄病毒的M蛋白和E蛋白，一种黄病毒的部分M蛋白，一种黄病毒的部分E蛋白和/或一种黄病毒的部分M蛋白和一种黄病毒的部分E蛋白。在一个优选的实施方案中，分离的核酸编码一种黄病毒的M蛋白和E蛋白。另外，本发明的核酸可以为DNA，并可包括核苷酸序列SEQ ID NO15，SEQ ID NO19，SEQ IDNO21，SEQ ID NO23或SEQ ID NO42。
在另一个具体的实施方案中，本发明的核酸可以编码日本脑炎病毒的信号序列，第二种病毒的M蛋白和嵌合E蛋白，所述嵌合E蛋白通过用编码相应部分的JEV E蛋白的核酸取代编码第二种病毒E蛋白的核酸部分取代形成。或者，相应于第二种病毒E蛋白的缺失部分的部分序列可以被选自第三种病毒的其它序列取代，或者为非病毒序列。第二种蛋白可以为西尼罗病毒，SLEV，YFV，玻瓦桑和/或登革病毒的一种血清型的蛋白。嵌合E蛋白可以包括那些其C末端部分来自一种黄病毒，而嵌合E蛋白的剩余部分来自另一种黄病毒。C末端部分可以为，例如嵌合E蛋白的5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，60或75％。本发明的核酸可以为DNA，并可以包括来自核苷酸序列SEQ ID NO44或SEQ ID NO46的蛋白编码序列。本发明的核酸可以包括核苷酸序列SEQ ID NO44或SEQ ID NO46。
本发明的转录单位还可以包括适当排列的控制序列，其可操作地控制抗原的合成。控制序列可以为，例如，巨细胞病毒立即早期启动子。本发明的核酸还可以包括Kozak共有序列，所述共有序列位于含有由转录单位编码的抗原多肽的翻译起始位点。本发明的转录单位还可以包括polyA终止子。
本发明进一步提供了含有本发明核酸的细胞。
本发明还提供了含有药学上可接受的载体和本发明的核酸或者细胞或抗原的组合物。本发明还提供了免疫受试者抗黄病毒感染的方法，包括给受试者施用有效剂量的本发明的组合物。在具体的实施方案中，用来免疫受试者的组合物指导黄病毒的M蛋白和E蛋白两者的合成，以及受试者体内的细胞在其中整合核酸后，分泌含有M蛋白和E蛋白的亚病毒颗粒。或者，组合物可以含有一种黄病毒的M蛋白和/或E蛋白或者含有M蛋白和E蛋白的亚病毒颗粒。在本发明的方法中，免疫部分可以以单剂量通过肠胃外给药的途径给受试者施用。
本发明进一步提供了产自本发明分离核酸的抗原。作为例子，由TU核苷酸序列编码的来自第二种黄病毒的抗原可以为M蛋白，其可来自，例如，西尼罗病毒。抗原也可以为来自登革病毒，圣路易脑炎病毒，日本脑炎病毒，玻瓦桑病毒和/或黄热病毒的蛋白。在进一步的实施方案中，抗原包括一种prM/M蛋白，所述蛋白含有来自第一种黄病毒的跨膜信号序列和来自第二种黄病毒prM/M蛋白剩余部分的其它氨基酸序列，第二种黄病毒可选自SLEV，JEV，YFV，WNV，和/或玻瓦桑病毒。来自第一种黄病毒的跨膜信号序列可以为改良的或者修饰的信号序列，其中信号序列被赋予了需要的特征，诸如高度信号序列可能性。通过设计或者选择完成这些目的可以通过使用机器学习计算机程序，包括但不限于使用隐马尔科夫模型(hidden Markov Model)的程序。
由TU的核苷酸序列编码的抗原可以为西尼罗病毒抗原，登革病毒抗原，圣路易脑炎病毒抗原，日本脑炎病毒抗原，玻瓦桑病毒和/或黄热病毒抗原。
由TU的核苷酸序列编码的抗原也可以为E蛋白，其可以为来自西尼罗病毒，登革病毒，圣路易脑炎病毒，日本脑炎病毒，玻瓦桑病毒和/或黄热病毒的E蛋白。这些编码的抗原也可以为包含选自一种以上黄病毒的氨基酸序列的嵌合E蛋白。
此外，由TU的核苷酸序列编码的抗原可以为M蛋白和E蛋白，可以选自西尼罗病毒，登革病毒，圣路易脑炎病毒，日本脑炎病毒，玻瓦桑病毒和/或黄热病毒。
此处所用的“M蛋白”或者“pr/M蛋白”或者“prM/M蛋白”是指黄病毒M蛋白或黄病毒prM蛋白。例子包括但不限于，含有一种或者多种黄病毒prM蛋白的氨基酸序列的prM蛋白，不含有其它氨基酸序列的M蛋白以及含有其它氨基酸序列的蛋白，它们经体内或者体外加工产生成熟的M蛋白。
此处所用的“核酸转录单位”或“核酸转录单位分子”是指编码一种或者多种特异性蛋白的核酸。TU具有被导入合适的细胞后，核酸就能诱导合成一种或者多种由该核酸编码的特异性基因产物的生物活性。一种或多种基因产物为其它的生物大分子，诸如蛋白，与TU化学上不相关。核酸TU诱导细胞利用其细胞组分产生由TU的核酸编码的特异性基因产物。虽然，任一核酸都可以用作TU，但是在优选的实施方案中，TU为质粒或者类似载体的DNA，其中质粒或者载体包含标志基因或者其它序列构建体的编码序列，所述编码序列有助于使用TU进行试验和生物合成。
此处所用的“控制序列”是整合到TU中的调控核苷酸序列，其与细胞的合适细胞组分相互作用并增强或者激活由TU编码的基因产物的生物合成。因此，合适的控制序列为细胞组分可以与其相互作用后合成基因产物的序列。当根据特定编码序列可操作地排列在核酸中时，控制序列可以有效地控制特定核酸的表达以产生基因产物。
此处所用的“启动子”为TU中的一段核苷酸序列作为控制序列。
此处所用的“Kozak序列”或者“Kozak共有序列”是在翻译起始位点的核苷酸序列，用来优化真核mRNA的翻译(Kozak，Mol.Cell.Biology 95134-5142(1989))。
此处所用的“终止子”是一段延伸的核苷酸序列，用来诱导成熟mRNA的3＇端聚腺苷酸化。终止子序列发现在特定编码序列的后面或者下游。
此处所用的“细胞”是含有编码一种或者多种基因产物的原核或者真核细胞，或者TU被导入的细胞。因此，细胞含有外来的或者异源物质TU，其不是自然或者内源性细胞组分。合适的细胞是在导入T U后能够生物合成基因产物的细胞。尤其是，合适的细胞为能够响应控制序列和终止子序列的细胞，如果有的话，所述序列包含在TU之中。在本发明重要的实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在本发明尤其重要的实施方案中，细胞为在施用了TU作为疫苗组分的人类或者非人类受试者体内自然存在的细胞。或者，在分析或者诊断应用中，包括制备抗原用作疫苗或者用于免疫诊断分析，或者为了说明的目的，细胞可以为在体外培养的人类或者非人类的细胞。
此处所用的特异于特定病原体的“疫苗”或者“用于免疫接种受试者的组合物”是指一种制备物，当施用给受试者后引起受试者的免疫原性反应。此处所用的“免疫原性反应”是指赋予受试者抗病原体的保护性免疫。不希望受限于理论，相信免疫原性反应可能来自中和抗体的产生(即，体液免疫反应)或者来自免疫系统的胞毒细胞(即，细胞免疫反应)。此处所用的“免疫原性抗原”为当将其导入受试者后，或者当其在宿主或者受试者体内合成后诱导免疫原性反应的抗原。此处所用的“有效剂量的”疫苗或者免疫接种组合物是指当施用给受试者后使用量足以给受试者赋予保护性免疫。从历来的观点看，疫苗被理解为含有作为有效成分的一种或者多种含有病原体，尤其是其表面的特异性分子组分或者结构。这些结构可以包括通常在病源微生物中发现的诸如蛋白，复合碳水化合物，和/或复合脂类的表面组分。
此处所用的，但是必须强调的术语“疫苗”或者“免疫接种受试者的组合物”延伸了前段概述的传统含义。此处所用的这些术语也涉及本发明的TU或者含有TU的组合物。TU诱导了一种或者多种由受试者的细胞中TU所编码的特异性基因产物的生物合成，其中基因产物为病原体的特异性抗原。生物合成的抗原作为免疫原。和已经说明的一样，TU，也就是疫苗可以为编码特异性免疫原性抗原的任一核酸。在本发明优选的实施方案中，疫苗的TU为DNA。TU可以包括整合了为了分子生物学领域，细胞生物学领域，和病毒免疫学领域的技术人员操作方便的其它基因或者特定序列的质粒或载体(参见MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989；和CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等，John Wiley和Sons，NewYork 1987(最新的季刊)，此处引作参考)。
本发明的TU分子包括核酸，或者核酸衍生物，具有编码与黄病毒的抗原相关的特定基因产物的核苷酸序列，这些黄病毒包括但不限于，WNV，JEV，登革病毒，黄热病毒和SLEV。虽然任一核酸都可以作为TU，但是在重要实施方案中，TU为DNA。或者，核酸可以为RNA分子。核酸还可以为任一种具有磷酸二酯键主链的DNA或者RNA的若干种衍生物，该主链进行了化学修饰提高了TU作为药剂的稳定性。预想的修饰包括但不限于，硫代磷酸酯衍生物或者磷酸酯衍生物。衍生物的这些和其它例子是核酸化学领域技术人员公知的。
JEV的基因组已经被鉴定和测序(图1和2)。M结构蛋白表达成包括pre-M序列(pr)多蛋白的一部分。该pr序列，紧临M蛋白序列的氨基末端，预防了多蛋白加工中构象的问题。尤其是，pr序列的存在对于阻止E蛋白的错误折叠非常重要。因此，prM的存在允许JEV颗粒的装配。一旦形成了病毒粒子或者颗粒，pr序列就可以从prM蛋白剪切掉形成含有M蛋白的成熟病毒颗粒，虽然prM蛋白的剪切产生M蛋白并不是产生感染性颗粒所必须的。来自多种不同相关黄病毒的prM序列剪切到几乎很短的长度，但是黄病毒自身却有传染性。这些具有相似基因组结构和功能的相关黄病毒的例子包括但不限于WNV，YFV，登革病毒和SLEV。
在一个实施方案中，本发明中编码黄病毒M和E蛋白的TU为DNA。根据上段中的讨论，该DNA含有编码M蛋白的核苷酸序列，包括pre-M序列，和编码E蛋白的核苷酸序列。以这种方式，目的基因产物能够在细胞内形成亚病毒颗粒。然后pre-M序列以类似于完整病毒粒子发生的方式被剪切。
为了在体内作为疫苗有效发挥功能，TU中优选包括控制序列，可以增强或者促进编码抗原的核苷酸序列的转录。这些启动子的应用是分子生物学领域，细胞生物学领域和病毒免疫学领域的技术人员公知的(参见Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989；和Current Protocols in Molecular Biology，Ausube等，JohnWiley和Sons，New York 1987(最新季刊))。当TU作为疫苗用于哺乳动物宿主时，采用的启动子优选为能够在哺乳动物细胞中有效操作的启动子。这种启动子根据转录受到其促进的编码序列进行排列，排列位置可操作性地促进这种转录。在本发明的一个重要实施方案中，启动子为巨细胞病毒早期启动子。此外，在本发明进一步优选的实施方案中，在TU核酸中，编码序列后连接了终止子序列(Sambrook等)。本发明的特定实施方案涉及原核生物和真核生物细胞。很多启动子序列已知可用于原核或者真核细胞。(参见Sambrook等)。
本发明的核酸还包括本领域技术人员公知的DNA序列作为免疫刺激元件。这些元件的例子包括但不限于，细菌DNA中的某些CpG基元(Sato等，Science 273352-354(1996)；Klinman等，Vaccine 1719-25(1998))。
本发明的TU的制备可以通过分子生物学领域的技术人员公知的方法很容易地实现。涉及的步骤阐述在，例如Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989和Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等，John Wiley和Sons，New York 1987(最新季刊))。黄病毒RNA分子可以通过熟悉例如黄病毒，和其它病毒组的病毒学家公知的方法分离自活病毒样品。JEV使用的方法概述在Kuno等(J.Virol.7273-83(1998))中。RNA作为模板利用逆转录酶合成cDNA。从cDNA，含有从pre-M到E编码区(图2)的片段通过已知用来合适地剪切cDNA提供这种片段的限制性核酸酶的消化而获得。JEV限制性酶切的例子提供在Nitayaphan等(1990)和Konishi等(1991)中。整合启动子，例如巨细胞病毒启动子，促进有效翻译的序列，例如Kozak序列，和聚腺苷酸化信号，也同样是分子生物学领域和重组DNA工程领域技术人员公知的(Kozak，Mol.Cell.Biology95134-5142(1989)；Azevedo等，Braz.J.Med.Biol.Res.32147-153(1999))。当含有包括目的编码序列和控制序列的核酸被制备后，可以通过扩增核酸的方法大量获得产物。这些方法是分子生物学领域和重组DNA工程领域技术人员公知的。这些方法的例子包括将核酸整合到复制质粒中，其步骤是将质粒在诸如原核细胞的细胞中培养，培养完成后收集质粒，并通过本领域公知的诸如PCR和其它扩增方法扩增核酸。这些例子并不是想要限制获得含有TU的核酸的可能方式。
本发明的含有TU的核酸分子可以通过在分子生物学领域和病毒免疫学领域公知的多种方式导入合适的细胞。导入方式的例子包括但不限于，导入被细胞吸收的质粒或者类似的核酸载体，或者包裹在诸如脂质体，特别是含有阳离子脂类的脂质体的泡囊状脂类结构中，或者吸附通过胞吞作用导入细胞中的颗粒。
通常，本发明的细胞为含有TU或者其中已导入TU的原核或者真核细胞。本发明的TU诱导胞内生物合成编码的prM/M和E抗原。合适的细胞为导入核酸后能够生物合成基因产物的细胞。在本发明的一个具体实施方案中，合适的细胞为能够响应控制序列和终止序列的细胞，若有的话，所述序列包含在TU内。为了以这种方式响应，这种细胞包含与控制序列和终止序列相互作用并且用来执行各自的启动和终止功能的组分。当细胞体外培养时，可以为原核生物，单细胞真核生物细胞或者多细胞真核生物细胞。在本发明的一个具体实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在这些例子中，合成的prM/M和E蛋白基因产物适用于分析或诊断，包括制备用作疫苗的抗原或者，用于免疫诊断分析，或者用于说明的目的。
在一些情况下，诸如，当细胞为培养的哺乳动物细胞时，prM/M和E抗原以亚病毒颗粒的形式分泌。它们是prM/M和E蛋白的聚集物，类似于活病毒的表面超微结构形态和免疫原性特征。因为本发明的TU不包括黄病毒基因组的其它部分，所以没有整合的衣壳，最重要的是没有传染性的病毒RNA。
在本发明的另一个重要实施方案中，细胞为已经施用了TU作为疫苗的受试者自然细胞组分。当TU施用给受试者后，被受试者的细胞吸收。如果存在任一启动子序列和终止子，受试者的细胞具有响应所述启动子序列和终止子的能力。在任一情况下，TU诱导受试者的细胞合成黄病毒prM/M和E基因产物。不希望被理论所限制，相信受试者的细胞体内产生由prM/M和E抗原组成的亚病毒颗粒，如同体外培养的哺乳动物细胞中发生的一样。这些亚病毒颗粒，相信作为体内免疫原，刺激受试者的免疫系统产生免疫反应，对受试者赋予保护性免疫。依然不希望被理论所限制，产生的保护性免疫可以通过体液或者细胞免疫产生，即分别通过MHC II型或I型限制的机制，或者同时利用两个机制产生。
根据本发明，受试者通过施用有效剂量的含编码prM和/或E抗原的核酸的TU免疫抗黄病毒，诸如JEV，YFV，登革病毒，SLEV，WNV或者其它黄病毒的感染。此核酸被导入受试者的细胞后引起黄病毒prM和/或E抗原的合成。
为了将TU施用给受试者，可以使TU掺入到含有可药用载体的组合物中。术语“可药用载体”不是指生物学的材料或者是其它不合适的材料，而是可将其连同免疫原性材料一起施用给受试者的材料(即，重组黄病毒蛋白抗原或其部分)，同时所述材料不引起不需要的生物效果或者以有害的方式和疫苗中所含的其它任一组分相互作用。可药用载体或者其组分的例子包括水，生理盐水和普通生理缓冲液(其它例子，参见Arnon，R.(编)Synthetic Vaccines Ipp.83-92，CRCPress，Inc，Boca Raton，Florida，1987)。
本领域的技术人员应该明白，所述疫苗接种剂量的临界值为诱导宿主保护性反应所需的免疫原的总量，所述宿主易发生由毒性或者野生型黄病毒感染引起的传染性疾病。剂量的数目和体积可以变化，由操作者根据诸如年龄，体重，性别，种族，施用疫苗的类型，施用的方式，受试者的全面条件等，以及本领域技术人员意识到的其他重要因素的参数来确定。
TU可以通过口服，肠胃外(例如，静脉内)，肌内注射，腹膜内注射，经皮，体外，鼻内，局部等给受试者施用。通过插管可以直接到达呼吸系统(例如，肺部)的任一区域。所需TU的准确量在受试者之间各不相同，依赖于种族，年龄，体重和受试者的整体条件，使用疫苗的免疫原性，受试者免疫所抗的黄病毒株或者种，施用的方式等等。因此，不可能明确说明本发明的每个实施方案中的准确剂量。但是，通过本领域的普通技术人员仅仅利用这里教导给出的常规试验程序和本领域现成的程序就可确定合适的剂量。
如果肠胃外施用本发明的疫苗，通常其特征在于注射给药。注射剂可以制备成常规的形式，作为液体溶液或者悬浮液，在注射前适合溶于或者悬浮于液体中的固体，或者作为乳化剂。最近肠胃外给药的改进方法包括使用慢慢释放或者持续释放系统，这样就保持了恒定的剂量。参见例如，美国专利No.3,610,795,此处引作参考。
对于固体组合物而言，传统非毒性固相载体包括，例如，药用级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等等。药学上可施用的液体组合物的制备可以通过，例如将此处描述的活性化合物和药用佐剂溶解，分散等到赋形剂，例如水，盐水，含水葡萄糖，甘油，乙醇等中形成溶液或者悬浮液。如果需要，待给药的药用组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，例如增湿剂或者乳化剂，pH缓冲剂等，例如乙酸钠，失水山梨糖醇单月桂酸酯，三乙醇胺乙酸钠，油酸合三乙醇胺等等。制备这些剂型的实际方法是公知的，或者对于本领域技术人员是显而易见的，例如参见Remington＇s Pharmaceutical Sciences(Martin，E.W.(编)，最新版MackPublishing Co，Easton，PA)。
在一个实施方案中，本发明的TU可以通过利用电转移介导的体内基因递送的方法施用给受试者，其中在TU施用给受试者后立即将经皮的电脉冲施加给受试者，从而更加高效可重复的将核酸体内转移给受试者的组织(Mir等，Proc.Nat.Acad.Sci USA 964262-4267(1999))。
在本发明的方法中，描述了通过将本发明的疫苗施用给受试者从而免疫受试者的过程，免疫的功效可以根据本领域技术人员公知的临床方法进行监控，从而监测受试者的免疫状况。
本领域的技术人员很容易确定接种组合物的有效剂量，就是当施用给受试者后给受试者赋予保护性免疫的剂量。为了进行这种确定，技术人员可以估计在施用了疫苗的受试者的血液中诱导出现黄病毒prM/M-和E-特异性抗体和/或黄病毒prM/M-和E-特异性胞毒T淋巴细胞的能力。通过用相应于用来免疫试验受试者的抗原性组合物的活黄病毒攻击，还可以确定赋予给试验受试者的保护性免疫的水平。这种攻击试验是本领域技术人员公知的。
通常，根据本发明，为了免疫受试者抗WNV，JEV，YFV，登革病毒，SLEV，或者其它的黄病毒，并且意识到这种方法中所用的TU有不同的大小，可以使用的剂量范围从大约0.1μg/kg体重到大约50μg/kg体重。
令人意外的发现，本发明为DNA的TU在通过肌内注射或者通过电转移对受试者仅仅施用单次有效剂量的TU后，就赋予受试者保护性免疫的有效性水平为大约100％。这个结果和利用传统疫苗实施的许多免疫方法(如上描述)形成对照，后者需要一次或者多次加强接种并且不能赋予有效性接近100％的保护性免疫。
进一步令人意外的发现，保护性免疫可以从免疫接种的母体受试者传递给受试者的后代。利用本发明的TU DNA免疫接种母体后，大部分初生小鼠表现出抗病毒攻击的保护。不希望被理论所限制，已知可以对初生哺乳动物赋予被动免疫，因为母亲的乳液中存在特异于多种病原体的中和抗体。可能这些初生儿中发现的抗JEV保护性免疫是以这种方式传递给他们的。
在本发明的另一个实施方案中，TU编码第一种黄病毒结构蛋白的信号序列和第二种黄病毒的免疫原性黄病毒抗原。因此，在一个实施方案中，例如第一种黄病毒结构蛋白的信号序列被第二种黄病毒结构蛋白的信号序列替换，其产生新多肽的正确折叠，在宿主中的正确加工，和/或加工蛋白的正确折叠。
在本发明的另一个实施方案中，TU可以编码免疫原性黄病毒抗原，其中抗原含有一种或者多种黄病毒的序列。信号序列可以为改良的信号肽。信号序列的改良，或多种最适信号序列的选择可以通过应用实施例1 8和其引用的参考文献教导的原理和技术来完成，每个参考文献在此处引作参考，专门用于在分别涉及选择，鉴定和设计具有需要特征和功能的信号序列中的教导。通常，这些需要的特征和功能将包括较高的信号序列概率。
在本发明的另一个实施方案中，一个单独的组合物中包括了多种TU或者包括编码来自多种黄病毒的免疫原性黄病毒抗原的一种TU。因此，在一个实施方案中，例如，TU可以编码新生多肽或被加工成来自多种黄病毒的蛋白的多肽。优选地，加工的蛋白形成引发抗蛋白的免疫反应的亚病毒颗粒。亚病毒颗粒可以形成自源于同一黄病毒，多种黄病毒组合的序列的加工蛋白，或者嵌合黄病毒蛋白。含有多种TU或者一种编码来自多种黄病毒的免疫原性黄病毒抗原的TU的联合疫苗可被定制用于特定的地理区域，其方法是包含本地区流行或者可能碰到的黄病毒的蛋白。例如，地处热带或者亚热带的亚洲的疫苗可以包括编码来自DEN的四种血清型，WN和JE病毒疫苗蛋白的TU。类似地，非洲和拉丁美洲的有用疫苗可以包括分别编码来自DEN的四种血清型，WN和YF病毒和来自DEN的四种血清型，罗西奥(Rocio)和YF病毒的蛋白的TU。
在另一个实施方案中，TU编码第一种黄病毒的信号序列和包括来自多种黄病毒的氨基酸序列的免疫原性嵌合黄病毒抗原。信号序列可以为日本脑炎病毒的信号序列。嵌合黄病毒抗原可以包括日本脑炎病毒抗原的序列。在特定实施方案中，嵌合抗原为E蛋白。E蛋白的C末端部分可以为来自日本脑炎病毒的E蛋白序列。C末端部分可以为，例如，嵌合E蛋白的5，10，15，20，25，30，40，50或者75％。在优选的实施方案中，TU编码日本脑炎病毒结构蛋白的信号序列，登革病毒的prM蛋白以及含有日本脑炎病毒和登革病毒序列的嵌合E蛋白。嵌合蛋白可以为E蛋白，其中C末端部分含有日本脑炎病毒的序列。TU的例子包括SEQ ID NO44和SEQ ID NO46显示的核酸序列，其指导诸如SEQ ID NO45和SEQ ID NO47所示的黄病毒抗原的合成。
本发明进一步提供了在可药用的载体中含有本发明多肽的免疫原性组合物用作蛋白疫苗。产自本发明的转录单位的抗原可以用来引发受试者的有效免疫反应。用于该目的的抗原可以含有黄病毒prM蛋白，黄病毒M蛋白，黄病毒E蛋白或者它们的任一组合，包括蛋白免疫原性片段。特别优选的实施方案采用此处描述的NRA。更加优选的实施方案是含有一种黄病毒的信号序列和一种或多种不同黄病毒的结构蛋白的嵌合蛋白。在尤其优选的实施方案中，抗原的信号序列为日本脑炎病毒的信号序列。在其它优选的实施方案中，信号序列为改良的信号肽。信号序列的改良或者选择多种最适的信号序列，可以通过实施实施例18和其引用的参考文献所教导的原理和技术完成，每个参考文献在此处引作参考专门用于在选择，鉴定和设计具有需要特征和功能的信号序列中的教导。通常，这些需要的特征和功能将包括较高的信号序列概率。
在其它的实施方案中，本发明的蛋白疫苗还包括合适的佐剂。此处所用的“佐剂”为免疫反应的增效剂或者增强剂。术语“合适”是指包括任一能够用来与疫苗免疫原(即，黄病毒prM蛋白，黄病毒M蛋白，黄病毒E蛋白或者它们的任一组合)组合以增强免疫反应，同时对于免疫接种的受试者不产生副反应的物质。特定佐剂的有效剂量可以通过优化佐剂对于接种受试者免疫反应的潜在效果很容易确定。在优选的实施方案中，本发明疫苗的佐剂的辅助作用是一个2-阶段过程，首先利用2％的氢氧化铝溶液然后使用矿物油。在具体的实施方案中，合适的佐剂可以选自矿物质，带有水乳液的植物油或者鱼油，不完全弗氏佐剂，E.coli J5，葡聚糖硫酸酯，氧化铁，藻酸钠，Bacto-佐剂，特定的合成聚合物，诸如Carbopol(BF Goodrich Company，Cleveland，Ohio)，聚合氨基酸和氨基酸的共聚物，皂苷，角叉藻聚糖，REGRESSIN(Vetrepharm，Athens，GA)，AVRIDINE(N，N-双十八烷基-N＇，N＇-双(2-羟乙基)丙二胺)，长链多分散的β(1，4)连接的点缀有O-乙酰化基团的甘露聚糖聚合物(例如，ACEMANNAN)，源自分支杆菌种非病原菌株去蛋白的高度纯化的细胞壁提取物(例如，EQUIMUNE，Vetrepharm Research Inc，Athens GA)，单油酸甘露醇酯，石蜡油和胞壁酰二肽。
另一方面，本发明提供了用免疫原性量的本发明蛋白疫苗免疫受试者引发受试者有效免疫反应的方法。可以通过口服，肠胃外，鼻内，气管内，肌内，乳房内，皮下，静脉内，和/或真皮内施用方法实施免疫。含有黄病毒prM蛋白，黄病毒M蛋白和/或黄病毒E蛋白的疫苗可以通过注射，吸入，摄取，或者灌输进行给药。可以施用单剂量和/或重复剂量的疫苗制备物，即“加强剂”可以通过定期间隔给药加强最初的免疫反应或者从上次给药后间隔较长的时间进行给药。免疫接种的时间间隔可以根据受试者的年龄和条件改变。
术语“免疫原性量”是指免疫原或者其部分的使用量，其足以诱导接种受试者的免疫反应并保护受试者免于由通过接触野生型或者强毒黄病毒感染所导致的疾病，或者具有降低黄病毒感染对于接种受试者影响的治疗或者商用的有益效果。
本发明进一步提供了由本发明的抗原免疫反应产生的抗体。本发明的抗体可包括多克隆和单克隆抗体，其可以为完整的免疫球蛋白分子，嵌合免疫球蛋白分子，“人源化抗体”或者Fab或F(ab′)2片段。这种抗体和抗体片段可以通过本领域技术人员公知的技术生产，这些技术包括描述于Harlow和Lane(AntibodiesA Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989)和Kohler等人(Nature 256495-97，1975)和美国专利5,545,806，5,569,825和5,625,126的技术，此处引作参考。抗体可以为任一同种型的IgG，IgA，IgD，IgE和IgM。
本发明也可包括含有相连的VH和VL结构域的单链抗体(ScFv)，并且其保持了原来独特型抗体的构象和特异性结合活性。这种单链抗体是本领域公知的，并可以通过标准方法制备。(参见，例如Alvarez等，Hum.Gene Ther.8229-242(1997))。
可以制备抗本发明的抗原的抗体，所述抗原通过编码一种或多种黄病毒的prM，M和/或E抗原的免疫原性氨基酸序列和另一种不同黄病毒(例如，JEV)的信号序列的核酸序列合成。使用这些嵌合构建体合成的免疫原性肽，采用本领域公知的鉴定氨基酸序列中的免疫原性区域的方法可以很容易地得以鉴定，并用于制备本发明的抗体。
抗原/抗体复合物能够形成的条件，以及检测抗原/抗体复合物的形成和被检蛋白定量的方法是本领域公知的。这些方法包括但不限于，Western印迹，免疫沉淀，免疫荧光，免疫细胞化学，免疫组化，荧光激活细胞分类术(FACS)，荧光原位杂交(FISH)，免疫磁性测定法，ELISA，ELISPOT(Coligan等编，1995.Current Protocols in Immunology.Wiley，New York)，凝集试验，絮凝试验，细胞筛选等，正如本领域技术人员所公知的。
此处所用的术语“结合”是指很好鉴定的抗体和抗原的结合，以及和抗原的其它非随机结合。此处所用的“特异性结合”描述了一种抗体或者其他配体除一种特异性抗原以外基本上不与其它任一抗原进行交叉反应，所述一种特异性抗原在此情形下为本发明抗原。
本发明的抗体或者配体可以结合到基质上(例如，珠子，管子，载玻片，培养皿，硝酸纤维板等)或者与可检测部分共轭结合，或者即结合到基质上又共轭结合。预期用于本发明的可检测部分包括，但不限于，免疫荧光部分(例如，荧光素，罗丹明)，放射性部分(例如32P，125I，35S)，酶部分(例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶)，胶体金部分和生物素部分。这些结合技术是本领域标准技术(例如，Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Yang等，Nature 382319-324(1996))。
本发明进一步提供了检测样品中黄病毒抗体的方法，包括将样品和本发明的黄病毒抗原在抗原/抗体复合物可以形成的条件下接触；并检测复合物的形成，从而检测样品中的黄病毒抗体。
本发明进一步提供了检测样品中黄病毒抗原的方法，包含将样品和本发明的抗体在抗原/抗体复合物可以形成的条件下接触；并检测复合物的形成，从而检测样品中的黄病毒抗原。
检测样品中黄病毒抗原的方法可以例如通过将来自受试者的流体样品或者组织样品和本发明的抗体结合并检测抗体和抗原的结合来进行。可以设想抗原会在完整的黄病毒粒子上，可以是显示在表达抗原的黄病毒感染细胞表面上的黄病毒编码的蛋白，或者可以为抗原片段。该方法的流体样品可以包括含有抗原或者含有抗原的细胞的任一生物流体，诸如，脑脊液，血液，胆汁，血浆，血清，唾液和尿液。其它可能的体液例子包括痰，粘液等等。
检测样品中黄病毒抗体的方法可以通过将来自受试者的流体样品或者组织样品和本发明的抗原结合并检测抗原和抗体的结合来进行。该方法的流体样品可以包括含有抗体的任一生物流体，诸如，脑脊液，血液，胆汁，血浆，血清，唾液和尿液。其它可能的体液例子包括痰，粘液等等。
酶免疫测定，诸如免疫荧光测定(IFA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹可以很容易适应根据本发明的方法来检测黄病毒抗体。有效用于检测抗体的ELISA方法可以为，例如如下方法(1)将抗原结合到基质上；(2)将结合的抗原和含有抗体的流体或者组织样品接触；(3)将上述抗原抗体复合物和结合到可检测部分的二级抗体接触，可检测部分可以和结合的抗体反应(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)；(4)将上述反应物和酶的底物反应；(5)将上述反应物和染色剂接触；和(6)观察/测定颜色变化或者显影。
用于检测黄病毒抗体的其它免疫技术采用单克隆(MAbs)检测在竞争性抑制测验中与黄病毒抗原特异性反应的抗体。简而言之，将样品和结合到基质(例如ELISA 96-孔板)的本发明抗原接触。多余的样品被完全清洗掉。接着，标记的(例如，酶联，荧光，放射性等)单克隆抗体与任一前面形成的抗原/抗体复合物接触并测定单克隆抗体结合的量。抑制单克隆抗体结合的量相对于对照(没有抗体)进行测定，同时检测并测定样品中的抗体。当基于黄病毒特定类型或病毒株的单克隆抗体特异性结合时，单克隆抗体抑制程度可以对检测特定黄病毒类型和毒株而言是非常特异的分析方法。MAbs也可以通过常规方法，例如免疫荧光测定(IFA)直接用于检测细胞中的黄病毒抗原。
作为其它的例子，微量凝集试验也可用于检测样品中黄病毒抗体的存在。简而言之，乳胶珠，红细胞或者其它可凝集的颗粒用本发明的抗原包被，并与样品混合，这样样品中与抗原特异性反应的抗体与抗原交联，引起凝集。凝集的抗原/抗体复合物形成用肉眼可以观察或者通过分光光度计可以测定的沉降。在上述测验的修饰中，本发明的抗体能被结合到样品中可凝集的颗粒和抗原上，然后进行检测。
本发明进一步提供了诊断受试者黄病毒感染的方法，包括将来自受试者的样品和本发明的抗原在抗原/抗体复合物可以形成的条件下接触；并检测抗原/抗体复合物的形成，由此诊断受试者黄病毒的感染。
本发明进一步提供了诊断受试者黄病毒感染的方法，包括将来自受试者的样品和本发明的抗原在抗原/抗体复合物可以形成的条件下接触；并检测抗原/抗体复合物的形成，由此诊断受试者黄病毒的感染。
在此处教导的诊断方法中，本发明的抗原可以与基质结合并与诸如血液，血清，尿液或者唾液的流体样品接触。这些样品可以直接采自病人或者以部分纯化的形式获得。以这种方式，抗原的特异性抗体(一级抗体)将与结合的抗原特异性反应。因此，结合到或者标记有可检测部分的二级抗体可被加入以增强一级抗体的检测。通常，与抗原的不同表位特异性反应或者与配体或反应抗体非特异性反应的二级抗体或者其它配体，可根据其与一级抗体的多个位点反应的能力加以选择。因此，例如，二级抗体的若干分子可以与每种一级抗体反应，使一级抗体更易检测到。
可检测部分能够可视性检测到沉降或者颜色的变化，还可通过显微术可视性检测，或者通过光谱测定，放射测定等方法自动检测。可检测部分的例子包括荧光素和罗丹明(用于荧光显微术)，辣根过氧化物酶(用于光或电显微术和生化检测)，生物素-链霉亲和素(用于光或者电显微术)和碱性磷酸酶(通过颜色变化用于生化检测)。
本发明的具体实施方案在下列的实施例中详细描述。这些实施例并不旨在限制说明书中公开的本发明的范围。
实施例
采用涉及制备和表达本发明的核酸TU分子的分子生物学和重组DNA技术的通用方法描述在，例如，Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等，John Wiley和Sons，New York 1987(最新季刊)，和Molecular CloningA Lahoratory Manual第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989。
实施例1.制备含有编码JEV prM和E抗原转录单位的重组质粒。采用QIAampTM Viral RNA试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)从接种生长在小鼠大脑的150μL的JEV病毒株SA14病毒中提取基因组RNA。将吸附到硅胶膜上的RNA稀释在80μL不含核酸酶的水中，作为扩增JEV prM和E基因编码序列的模板。根据Nitayaphan等人(Virology177541-552(1990))的工作获得引物序列。含有基因组核苷酸序列389-2478区的单链cDNA片段通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行扩增。限制性位点KpnI和XbaI，共有Kozak核糖体结合序列，以及翻译起始位点通过扩增引物14DV389经改造连接到cDNA的5’末端(核苷酸序列，SEQ ID NO1；氨基酸序列，SEQ ID NO2)。在NotI限制性位点之后的符合读框的翻译终止密码子通过扩增引物c14DV2453(SEQ ID NO3)插入到cDNA的3＇末端(图2)。通过TitanRT-PCR试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)进行一管RT-PCR。10μL的病毒RNA和各1μL的14DV389(50μM)和c14DV2453(50μM)和18μL无核酸酶的水混合，并将混合物在85℃加热5分钟，然后冷却到4℃。加入75μ1的反应混合物[20μL的5×缓冲液，2μL的dNTP混合物(各10mM)，5μL的二硫苏糖醇(0.1mM)，0.5μL的RNasinTM(40U/μL，Boehringer Mannheim)，2μL的聚合酶混合物，和45.5μL的无核酸酶的水]，并进行如下的RT-PCR1个循环(50℃30分钟，94℃3分钟，50℃30秒钟，68℃2.5分钟)，9个循环(94℃30秒钟，50℃30秒钟，68℃2.5分钟)，20个循环(94℃30秒钟，50℃30秒钟，在第一个循环中68℃2.5分钟，随后的每个循环增加5秒钟)，最后在68℃延伸15分钟。RT-PCR产物用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，并用50μL的1mM pH7.5 Tris-HCl稀释。
所有载体的构建和分析通过标准技术进行(Sambrook等，1989)。RT-PCR扩增的cDNA用KpnI和NotI核酸酶进行酶切，然后插入真核表达质粒载体(pCDNA3，Invitrogen，Carlsbad，CA)的KpnI-NotI位点。电穿孔-感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞(Stratagene，La Jolla，CA)通过电穿孔进行转化(Gene Pulser，Bio-Rad，Hercules，CA)，然后涂布到含100μg/mL羧苄青霉素(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)的LB琼脂培养皿中。挑选克隆并接种到含有100μg/mL羧苄青霉素的3mLLB肉汤中。用QIAprepTM旋转微量制备试剂盒(Qiagen)从培养了14个小时的培养物中提取质粒DNA。按推荐的方法进行DNA自动测序(Applied Biosystems/Perkin Elmer，Foster City，CA)。cDNA的两条链均被测序并显示与原始SA14毒株的序列(Nitayaphan等，1990)相同。
含有f1起始点(ori)，SV40起始点，新霉素抗性基因，和SV40的poly(A)元件的质粒pCDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA)，将其核苷酸(nt)1289到nt3455的片段用PvuII酶切缺失，然后连接产生pCBamp质粒。包含嵌合内含子的载体pCIBamp，该嵌合内含子插入到pCBamp的NcoI/KpnI位点，通过用NcoI和KpnI酶切将内含子序列从pCI(Promega，Madison，WI)剪切下来构建而成。产生的566-bp的片段通过用NcoI-KpnI酶切克隆到pCBamp中，替换其289-bp的片段。图3说明了质粒pCDA3，pCBamp和pCIBamp之间的关系。
含有编码JEV prM和E蛋白转录单位的质粒从这些质粒进行制备。在重组质粒pCDJE2-7(核苷酸序列SEQ ID NO10；氨基酸序列，SEQ ID NO11)中含有JEV prM和E编码区的cDNA片段衍生自pCDNA3载体，其通过NotI和KpnI或XbaI进行酶切并克隆到pCBamp，pCIBamp，pCEP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)或者pREP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)的KpnI-NotI位点，或者克隆到pRc/RSV(Invitrogen，Carlsbad，CA)表达载体的SpeI-NotI位点以分别构建pCBJE1-14(核苷酸序列，SEQ ID NO17；氨基酸序列SEQ IDNO18)，pCIBJES14，pCEJE，pREFE，和pRCJE。来自每种质粒克隆的双链cDNA被测序，并鉴定含有正确核苷酸序列的重组克隆。在体外转化哺乳动物细胞或者在小鼠免疫试验中使用的质粒DNA用EndoFreeTM Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)通过阴离子交换层析法进行纯化。
实施例2.采用间接免疫荧光抗体测定法评价由多种重组质粒表达的JEV prM和E蛋白。在瞬时转化细胞系COS-1，COS-7和SVT2(ATCC，Rockville MD；分别为1650-CRL，1651-CRL，和163.1-CCL)中由多种重组表达质粒表达的JEV特异性基因产物采用间接免疫荧光抗体测定法(IFA)进行评价。SV-T2细胞系在后面的试验中被排除，因为预实验结果显示只有1-2％的转化SV-T2细胞为JEV抗原阳性。为了转化，细胞在150cm2的培养瓶中生长到75％汇合时，用胰蛋白酶处理，在4℃重悬浮在磷酸盐缓冲液(PBS)中，最终细胞数为5×106/mL。10μg的质粒DNA通过电穿孔利用设定在150V，960μF和100Ω电阻的BioRad Gene PulseTM(Bio-Rad)导入300μL的细胞悬浮液中。电穿孔5分钟后，用25mL的新鲜培养基稀释细胞并接种到75cm2的培养瓶中。转化48小时后，将培养基从细胞移走，细胞用胰蛋白酶处理，并重悬浮在含3％标准山羊血清的5mL PBS中。10μL等分试样点到玻片上，空气干燥，并用丙酮在-20℃固定20分钟。使用荧光素异硫氰酸盐共轭的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(Sigma Chemical Co.)和JEV HIAF对丙酮固定的质粒转化细胞进行IFA测定。
为了确定各种启动子和poly(A)元件对于JEV prM和E蛋白表达的影响，用等量的pCDJE2-7(SEQ ID NO10)，pCEJE，pREJE，或pRCJE质粒DNA瞬间转化COS-1和COS-7细胞系。JEV抗原在由所有四种重组质粒转化的两种细胞系中均有表达，从而证明了CMV或者RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子和BGH或者SV40 poly(A)元件具有功能活性。但是，分别由IFA阳性细胞数目和IFA强度确定的转化细胞的百分比以及JEV抗原的表达水平在不同质粒之间差别很大(表1)。由pCDJE2-7(SEQ ID NO10)，pCBJE1-14(SEQ ID NO17)和pCIBJES14转化的COS-1细胞中有百分比显著高的细胞表达JEV抗原，而且蛋白的表达水平和JEV感染的细胞的表达水平一致。另一方面，在用pCEJE，pREJE，或pRCJE载体转染的细胞中抗原表达细胞的百分比低，而且荧光的强度也低，显示抗原表达弱。
为了确定pCDJE2-7(SEQ ID NO10)表达JEV蛋白的增强是否受到SV40-编码的真核复制起点的影响，构建质粒pCBJEI-14(SEQ IDNO17)使得含有f1起始点，SV40起始点，新霉素抗性基因，和SV40poly(A)的元件的2166bp的片段从pCDJE2-7上被去除。然后将嵌合内含子插入pCBJE1-14产生pCIBJES14。pCIBJES14质粒被用来确定JEV蛋白的表达是否可以被内含子的序列增强。转化后，含有pCBJE1-14和pCIBJES14两载体的细胞表达的JEV抗原的水平与pCDJE2-7中观察到的相类似(表1)。这个结果显示JEV prM和E抗原由重组载体的表达仅仅受到转录调控元件的影响。真核复制起点和内含子序列都不增强JEV抗原在所用细胞中的表达。含有CMV启动子和BGH poly(A)的载体(图3)被选择用于进一步分析。
实施例3.选择体外转化的组成型表达JEV特异性基因产物的稳定细胞系。用10μg的pCDJE2-7 DNA通过前面例子中描述的电穿孔转化COS-1细胞。在非选择性培养基中培养24小时后，用新霉素(0.5mg/mL.Sigma Chemical Co.)处理细胞。在2到3星期后可见的新霉素抗性克隆通过限度稀释在含新霉素的培养基中进行克隆。利用JEVHIAF通过IFA，载体编码的JEV基因产物的表达被首先筛选出来。选择一个JEV-IFA阳性克隆(JE-4B)和一个阴性克隆(JE-5A)用于进一步的分析，并保存在含200μg/mL新霉素的培养基中。
由JE-4B克隆表达的JEV E蛋白的真实性通过采用一组JEV E-特异性鼠源单克隆抗体(Mab)的IFA的表位图谱加以说明(Kimura-Kuroda等，J.Virol.45124-132(1983)；Kimura-Kuroda等，J.Gen.Virol.672663-2672(1986)；Zhang等，J.Medd.Virol.29133-138(1989)；和Roehrig等，Virol.128118-126(1983))。JEV HIAF和标准小鼠血清分别作为阳性或者阴性对照。四种JEV-特异性Mabs，六种黄病毒-亚型特异性Mabs，和两种黄病毒-组反应的Mabs同样和4B克隆或者JEV-感染的COS-1细胞反应(表2)。
实施例4.由JF-4BR COS-1细胞系分泌的亚病毒颗粒的抗原特征和免疫检测。
a.制备亚病毒颗粒。JE-4B COS-1细胞生长并维持在含200μg/mL新霉素的培养基中。培养基按常规收集并保存在4℃，每星期两次补充培养基，每7-10天细胞分裂成1∶5。用Sorvall F16/250转子在10,000rpm离心30分钟，然后通过5％的蔗糖垫(w/w，用10mM的Tris HCl，pH 7.5，100mM的NaCl(TN缓冲液)进行制备)用SorvallTH641转子在4℃，39,000rpm离心4小时对培养基进行澄清。含有亚病毒颗粒的沉淀重悬浮在TN缓冲液中并储存在4℃。或者，加入7％或10％的PEG-8000(w/v)到澄清的培养基中。混合物在4℃至少搅拌2小时，沉降的颗粒在10,000rpm离心30分钟进行收集。沉降物重悬浮在TN缓冲液中并保存在4℃。通过TN中5-25％的连续蔗糖梯度以38,000rpm，4℃下差速区带离心90分钟，从沉淀部分和PEG-沉降的制备物中纯化亚病毒颗粒。从梯度上层收集1-mL级分，通过抗原捕捉ELISA(参见下面)进行试验，阳性部分添加到TN中的25-50％蔗糖梯度上。在35,000rpm，4℃平衡密度梯度离心过夜。从底部收集0.9-mL平衡梯度的级分。通过抗原捕捉ELISA进行试验，并在pH6.6对红血球凝集(HA)活性进行评价。每级分称取100μL等分试样以确定其密度。合并ELISA-阳性级分，并在39,000rpm，4℃离心3-4小时进行沉淀，将沉淀重悬浮在TN缓冲液中。在沉淀样品上测定抗原-捕捉ELISA和HA滴度。JEV-感染的COS-1细胞上清液也进行如上文详细描述的纯化程序并作为梯度分析的阳性对照。也通过甘油/酒石酸盐平衡梯度中沉降从感染后5-6天的感染C6/36细胞中纯化JE病毒粒子。
b.亚病毒颗粒的Western印迹。亚病毒颗粒梯度纯化的样品和电泳样品缓冲液混合，然后如Laemmli(Nature 277680-685(1970))描述的方法在含10％或12.5％十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上电泳。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，然后用多克隆JEVHIAF，黄病毒交叉反应抗-E Mab 4G2(Henchal等，Amer.J.Trop.Med.Hyg.31830-836(1982))，或者小鼠抗-prM肽超免疫血清(JM01)进行免疫化学检测。图4显示由JEV感染的C6/36和JE-4B COS-1细胞产生的M和E蛋白的比较。在标准小鼠腹水和Jmol抗肽血清中观察到了一些针对E蛋白的非特异性反应。在大小上与M和E相同的蛋白从亚病毒颗粒中分泌出来，并分别通过E-特异性Mab 4G2和prM-特异性JM01抗血清可以进行检测。
c.在培养基中JEV亚病毒颗粒的密度梯度检测。为了进行ELISA，抗原捕捉抗体(4G2)稀释在0.1M，pH9.6的碳酸钠缓冲液中，并通过在4℃的过夜温育用来包被96-孔微量滴定板(Immulon II，Dynatech.Chantilly，VA)。用3％标准山羊血清的PBS封闭反应后，将两倍系列稀释的样品加入4G2-包被的微滴板，然后在37℃温育1.5小时。通过辣根过氧化物酶共轭的6B6C-1 Mag，在37℃温育1小时检测捕捉抗原。通过TMB(3，3＇，5，5＇-四甲基联苯胺)-ELISA(LifeTechnologies，Grand Island，NY)检测固相上的酶活。
细胞接种四天后从15×150cm2的培养瓶中收集大约500mL JE-4B细胞的细胞培养基。PEG-沉降的亚病毒颗粒重悬浮在2mL的pH 7.5的TN缓冲液中；将0.7mL等分试样的重悬浮沉淀加入5-25％蔗糖梯度上。将能够破裂亚病毒颗粒的Triton X-100加入另外0.7mL等分试样，终浓度达到0.1％，然后加到由含有0.1％ Triton X-100的TN缓冲液制备的5-25％蔗糖梯度上。从含Triton X-100的梯度上部观察到一条大约2.5cm的明确的混浊带，但在不含表面活性剂的梯度中未观察到。从上层到下层对每层梯度收集级分(1mL)(图5)。通过抗原捕捉ELISA分析各个收集的级分。在级分4-6检测抗原，显示亚病毒颗粒相对快速的沉降特征。用Triton X-100处理JE-4B培养基的PEG沉淀物将ELISA-反应材料转移到了梯度的上层。因此，用Triton X-100处理仅仅产生了慢速沉降分子。相似的发现由Konishi等(Virol.188714-720(1992))报道。这些结果显示含有prM/M和E的亚病毒颗粒的快速沉淀可以被表面活性剂的处理破坏。
在pH 6.1到7.0的范围内通过Clarke和Casals(Amer.J.Trop.Med.Hyg.7561-573(1958))的方法确定了红血球凝集(HA)活性。由JE-4B细胞分泌的亚病毒颗粒和由JEV感染的COS-1细胞产生的病毒粒子颗粒在确定的最适pH6.6时，有相似的HA图谱。
实施例5.用本发明的pCDJE2-7核酸疫苗接种的小鼠的免疫反应和用市售JEV疫苗接种的小鼠的免疫反应之间的比较。每组5只3周大的雌性ICR远交小鼠在左侧和右侧四头肌肌内注射100μg pCDJE2-7质粒的100μL蒸馏水，或者皮下施用JE-VAX(由the ResearchFoundation for Microbial Disease of Osaka University生产，并由Connaught Laboratories，Swiftwater，PA.销售)，剂量为人剂量的1/5。编码和表达不相关蛋白的质粒pCDNA3/CAT(Invitrogen)作为阴性接种对照。除了一组pCDJE2-7接种的小鼠，所有的动物在3周后又施用额外剂量的质粒或者JE-VAX而加强接种。小鼠在接种3，6，9，23，40和60周后自后眼窝处取血。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，或者通过噬斑减少中和实验(PRNT)(Roehrig等，Virol.17149-60(1989)；以及Hunt和Calisher，Amer.J.Trop.Med.Hyg.28740-749(1979))测定抗纯化JEV的JEV抗体滴度。
pCDJE2-7核酸疫苗和JE-VAX，第一次接种3星期内，所有三组小鼠都100％地提供了血清转化(表3)。JEV ELISA和PRNT抗体滴度分别在免疫6周和8周后达到了最高水平。接受单剂量DNA疫苗的小鼠和接受了双剂量疫苗的小鼠有相似的抗体反应。可比较的ELISA抗体滴度在DNA-接种的小组中，实验结束后保持长达60周。但是，JE-VAX小组中仅仅四分之一在接种60周后为JEV抗体阳性。pCDNA3/CAT对照组不含有任一可检测的JEV抗体。这些结果显示，单剂量的JEV-特异性核酸疫苗在小鼠体内比市售FDA-认证的JE-VAX疫苗更有效地保持JEV抗体。
实施例6.在不同年龄接种本发明的多种核酸疫苗构建体和市售JEV疫苗有效性的比较。通过pCDJE2-7，pCBJE1-14，或pCIBJES14转化的COS-1细胞表达相似水平的JEV蛋白。由这些核酸构建体诱导的JEV抗体在两个不同接种年龄和JE-VAX市售疫苗进行比较。3-天(混合性别)或者3-周-龄(雌性)ICR远交小鼠，每组10只，用50或100μg的质粒DNA肌内接种，或者用十分之一或者五分之一人剂量的JE-VAX皮下接种。免疫后3和7周收集血清样品，1∶1600稀释后通过ELISA采用纯化JEV作为抗原进行测定。结果显示在表4。
质粒pCBJE1-14在两个接种年龄段均表现出最大程度的血清转化，即，抗体滴度大于1∶1600，达到80-100％。3天大接种pCDJE2-7或pCIBJES14的小鼠至7周时表现适中的血清转化(每种60％)，但是接种3周后测定时，表现较弱的血清转化(分别为40％和10％)。但是，3周龄接种这些质粒时，接种后3周和7周血清转化达到90％或100％。相比而言，市售疫苗，JE-VAX，3天大给药后没有血清转化，3周龄给药达到100％。因此，JEV prM和E的核酸TU比非常高剂量的市售疫苗提供了更好的血清转化的程度，并在幼年动物和成熟动物体内都提供了出乎意料的高水平血清转化。
实施例7.由本发明的核酶疫苗赋予的保护性免疫。实施例6中的三天大的接种组接种7周后用腹膜内注射50,000pfu/100μL的小鼠适应性JEV毒株SA14进行攻击，观察3周。在接受了多种含核酸TU的疫苗构建体的小组中获得了长达21天的100％保护(表5)。相比之下，60％的JE-VAX-接种小鼠，和70％的pCDNA3/CAT-接种的阴性对照，至21天时无一幸免于病毒攻击。这些结果显示，本发明的核酸TU对于接种小鼠提供了出人意料的有效保护。这暗示可以采用本发明的核酸疫苗作为人类儿童疫苗的可能性。相比之下，目前使用的人用JE-VAX灭活疫苗对于幼年动物无效。
实施例8.与母体抗体滴度相关的初生小鼠的被动保护。3周龄的雌性ICR小鼠用单剂量或者剂量间之间间隔两天的双剂量的100μg/100μL pCDJE2-7质粒DNA，或者用五分之一人剂量的双剂量JE-VAX接种。阴性对照组接受双剂量的100μg/100μL pCDNA-3/CAT质粒。来自母体抗体的被动保护通过幼崽来评价，幼畜产自试验用雌性小鼠和非免疫的雄性小鼠之间的交配，交配发生在第一次接种后9周，或者第二次接种后6周。幼崽出生后3-15天通过腹膜内接种5,000pfu/100μL的小鼠适应的SA14病毒进行攻击试验，每天观察共3周(表6)。存活率相关于母体中和抗体的滴度。带有1∶80 PRNT的母亲哺乳的幼崽100％幸免于病毒感染，但是对照母亲哺乳的幼崽没有存活的(表6)。带有1∶20和1∶40 PRNT滴度的母亲哺乳的较大幼崽中分别观察到45％和75％的部分保护。存活率也相关于由免疫母亲哺育的时间长度。如上所述，13-15天大的幼崽有更高的存活率。母亲带有1∶20和1∶40 PRNT滴度时3-4天大的幼崽无一幸免于病毒攻击。因此，母体抗体给后代提供了部分到完全的保护性免疫。此外，在97％(29/30)的攻击后幼崽的血清中，通过ELISA检测到了JEV抗体。
用1或2、100μg剂量的质粒DNA肌内接种小鼠，或者用两次1/5人剂量的JE-VAX疫苗接种小鼠。接种后9周收集血清用于与非免疫的雄性小鼠交配前的PRNT试验。
实施例9.制备含编码WNV prM和E抗原转录单位的重组质粒。从用NY99-6480病毒株感染的150μL Vero细胞培养基中，利用QIAampTM Viral RNA试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)提取基因组RNA，所述的NY99-6480病毒株分离自1999年纽约爆发的毒株。提取的RNA经过洗脱悬浮在80μl不含核酸酶的水中，并作为WNV prM和E基因编码序列的扩增模板。引物序列获自Lanciotti等人(Science2862333-2337(1999))的工作。含有基因组核苷酸区的cDNA片段通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行扩增。利用扩增引物WN466(核苷酸序列SEQ ID NO12)将限制性位点BsmBI和KasI改建到cDNA的5＇端。NotI限制性位点后面的符合读框翻译终止密码子利用扩增引物cWN2444(SEQ ID NO13)导入在cDNA的3＇末端。利用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化RT-PCR产物。
上述两个扩增引物(SEQ ID NO12和SEQ ID NO13)产生的双链扩增子用KasI和NotI酶切产生998bp(nt-1470到2468)的DNA片段，并插入pCBJESS载体的KasI和NotI位点形成中间质粒，pCBINT。PCBJESS衍生自pCBamp质粒，其含有巨细胞病毒早期基因启动子和翻译控制序列元件以及改造的JE信号序列元件(Chang等，J.Virol.744244-4252(2000))。JE信号序列元件含有JE信号序列(SEQ IDNO14)。
随后cDNA扩增子用BsmBI和KasI酶消化，剩下的1003bp片段(nt-466到1470)插入pCBINT的KasI位点形成pCBWN(核酸序列，SEQ ID NO15；氨基酸序列SEQ ID NO16)。利用ABI prism377测序仪(Applied Biosystems/Perkin Elmer，Foster City，CA)自动测序DNA序列，以证实重组质粒具有如Lanciotti等(Science 2862333-2337(1999))限定的正确的prM和E序列。
用于哺乳动物细胞体外转化和小鼠免疫试验的质粒DNA通过实
施例1描述的阴离子交换层析法进行纯化。
实施例10.免疫化学鉴定和评价由pCBWN表达的WNV prM和E蛋白。由pCBWN质粒编码的WNV特异性基因产物表达在COS-1细胞中。根据Chang等人(J.Virol.744244-4252(2000))的方法对细胞进行电穿孔，并用pCBWN转化。电穿孔的细胞接种在75cm2的培养瓶或者含有一个无菌盖玻片/孔的12-孔组织培养皿中。所有培养瓶和12-孔板培养置于37℃，5％ CO2的培养箱内。电穿孔40小时后，含有吸附细胞的盖玻片从小孔中移走，用PBS简单清洗，用丙酮在室温下固定2分钟，然后空气干燥。
采用实施例2所述的间接免疫荧光抗体测定法(IFA)检测蛋白表达。利用黄病毒E-蛋白特异性单克隆抗体(Mab)4G2，WNV小鼠超免疫腹水(HIAF)和以1∶200稀释于PBS的标准小鼠血清(NMS)作为一级抗体检测蛋白表达(Henchal等，Am.J.Trop.Med.Hyg.31830-836(1982))。
电穿孔后40和80小时收集组织培养基。利用抗原捕捉(Ag-捕捉)ELISA检测瞬时转化的COS-1细胞培养基中分泌的WN病毒抗原。Mab 4G2和辣根过氧化物酶-共轭的Mab 6B6C-1分别用来捕捉WN病毒抗原并检测捕捉的抗原(Chang等，J.Virol.744244-4452(2000)；Henchal等，Am.J.Trop.Med.Hyg.31830-836(1983)；Roehrig等，Virology 128118-126(1983))。
培养基中的WN病毒抗原用10％的聚乙二醇(PEG)-8000沉淀进行浓缩。沉淀物重悬浮在TNE缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，10mM EDTA，pH 7.5)中，通过离心澄清，并保存在4℃。或者，将沉淀物重悬浮在冷冻的缓冲液(0.1M TRIZMA和0.4％牛血清白蛋白的硼酸盐缓冲液中，pH9.0)中，冻干并保存在4℃。冻干的制备物用作评价MAC-和间接IgG ELISA的抗原。
通过IFA检测瞬时转化的COS-1细胞中的WN病毒-特异性蛋白。在这些细胞中表达的E，prM和M蛋白分泌到培养基中。通过PEG沉淀浓缩的WN病毒抗原用70％的乙醇提取，去除残余的PEG(Aizawa等，Appl.Enviro.Micro.3954-57(1980))。乙醇提取的抗原和梯度纯化的WN病毒粒子用Excel Plus电泳装置(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)在NuPAGE，4-12％梯度Bis-Tris凝胶上进行分析，然后利用Excel PlusBlot Unit(Invitrogen Corp.)电印迹到硝酸纤维膜上。由瞬时转化的COS-1细胞产生的WN病毒-特异性蛋白通过WN病毒特异性小鼠HIAF或者黄病毒E蛋白反应性Mab 4G2在Western印迹分析中进行检测，利用NMS作为阴性血清对照。蛋白表现出和来自WN病毒感染的乳鼠大脑(SMB)对应的梯度纯化的病毒粒子E，prM和M蛋白相似的反应性和相同的分子量。
在NRA作为抗原用于诊断ELISA的分析中，一小瓶冻干NRA代表从40ml的组织培养液中收集的抗原，重新溶于1.0ml的蒸馏水中，并且和重新溶解的WN病毒感染的乳鼠大脑(SMB)抗原比较，WN病毒感染的乳鼠大脑(SMB)抗原为冻干的β-丙醇酸内酯灭活的蔗糖-丙酮提取物(Clarke等，Am.J.Trop.Med.Hyg.7561-573(1958))。所有重组蛋白，prM，M和E具有和梯度纯化的病毒粒子E，prM和M蛋白相似的反应性。
在试验阶段，相同的检测中同时用抗原测试编码的人类的样品。所用的MAC-和IgG ELISA方法和公开的方法(Johnson等，J.Clin.Microbiol.381827-1831(2000)；Martin等，J.Clin.Microbiol.381823-1826.(2000))相同。人血清样品获自我们实验室的血清库，其由1999年爆发时送到DVBID用于WN病毒确认的样品组成。在这些试验中，筛选MAC-和IgG ELISA以1∶400的样品稀释比进行。产生阳性/阴性(P/N)OD比在2和3之间的样品被认为是可疑阳性。可疑血清样品通过ELISA终点滴定和噬斑减少中和实验(PRNT)证明均为阳性。所有其(P/N)OD比大于3.0的样品均认为是阳性，不需要其它的确证试验。
采用黄病毒-组反应性，抗-E Mab，4G2和6B6C-1的Ag-捕捉ELISA用于检测分泌到pCBWN转化的COS-1细胞培养液中的NRA。转化一天后可以在培养基中检测到抗原；而在第2到第4天之间可以观察到无需进一步浓缩的培养液中最大的ELISA滴度(1∶32-1∶64)。通过PEG沉淀浓缩NRA，重悬浮在冷干的缓冲液中，冻干保存。为了进行诊断实验，一瓶冻干的NRA重新溶解在1.0ml的蒸馏水中，然后利用WN病毒阳性和阴性对照人血清在MAC-或者间接IgG ELISA中进行滴定(Johnson等，J.Clin.Microbiol.381827-1831(2000)；Martin等，J.Clin.Microbiol.381823-1826(2000))。发现NRA的1∶320和1∶160稀释比分别是用于MAC-和IgG ELISA的最佳浓度。这些稀释比对于MAC-和IgG试验分别产生4.19和4.54的P/N OD450比。由NY-6480和Eg101毒株产生的WN病毒SMB抗原在MAC-ELISA试验和IgG ELISA试验中分别采用1∶320和1∶640以及1∶120和1∶320的稀释比。阴性对照抗原，标准COS-1细胞的培养基的PEG沉降物和标准SMB抗原使用和NRA和SMB各自抗原相同的稀释比。稀释比为1∶400的人血清样品用病毒特异性和阴性对照抗原一式三份同时进行试验。为了阳性实验结果的有效性，和病毒抗原(P)反应的试验血清的OD450必须至少大于相应的和阴性对照抗原(N)反应的相同血清的光密度值两倍。
NRA和NY-06480的反应性，Eg101和SLE病毒SMB的反应性通过MAC-和IgG ELISAs，利用21个编码的人血清样品进行比较。21个样品中，有19个在全部三种抗原上产生相同的结果(8个阴性，11个可疑阳性或者阳性)。用SLE SMB抗原分别对18个样品进行试验。13个Eg-101-SMB阳性样品中只有三个在SLE MAC-ELISA中呈阳性(表1)。通过SLE MAC-ELISA没有一个WN抗原阴性样品呈阳性。该结果证实了前面的观察，即，抗-WN病毒IgM不与其它黄病毒有显著的交叉反应(Tardei等，J.Clin.Microbiol.382232-2239(1940))而且特异性诊断急性WN病毒感染，不管NRA或者SMB抗原是否用于试验中。所有的样品也通过间接IgG ELISA同时试验。使用3种抗原中任一种，21个样品中有10个为阳性。
来自相同病人的两个差异血清样品(7和9)，分别在疾病发作第4天和第44天收集，在最初试验中，用NRA和SMB NY抗原试验为IgM-阴性，用Eg-101 SMB抗原试验为IgM-阳性。为了进一步调查二者之间的差异，从该病人按序收集的6个样品通过终点MAC-和IgG ELISA重新试验。在第3天和第15天之间，MAC-ELISA的滴度显示大于32倍的系列增加可以用使用的所有抗原证明。疾病发作后第9天收集的脑脊液也证实了这个病人在采集样品前不久确实感染了WN。脑脊液抗Eg-101-和SLE-SMB抗原的IgM P/N读数分别为13.71和2.04。第31天和第44天的样品用NY-SMB抗原时为阴性(＜1∶400)，但是使用NRA和Egl01-SMB时为阳性。在这个试验中使用的所有3种抗原均观察到了一致的IgG滴度。
实施例11评价接种有pCBWN的动物的免疫反应。研究中使用了每组10只3周龄的雌性ICR小鼠。小鼠肌内(i.m.)注射单剂量的pCBWN或者绿色荧光蛋白表达质粒(pEGFP)DNA(Clonetech，SanFrancisco，CA.)。通过EndoFree Plasmid Giga Kits(Qiagen)从XL-1 blue细胞纯化pCBWN质粒DNA，然后重悬浮于pH7.5的PBS中，浓度为1.0μg/μl。注射100μg的pEGFP的小鼠作为未接种对照。小鼠用pCBWN质粒注射，剂量分别为100μl体积中100，10，1.0，或者0.1μg。接受了10，1.0，或者0.1μg的pCBWN的小组利用EMC-830方形波电穿孔仪(Genetronics Inc.San Diego，CA.)通过电转移介导的体内基因转运的方法进行接种。电转移方法基于Mir等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 964262-4267(1999))。DNA注射后，立即通过两个不锈钢板电极施加经皮的电脉冲，在每侧腿部间距4.5-5.5mm放置。用PBS完全润湿腿部保证腿部皮肤的电接触。实施两组四个40伏/mm的25毫秒的脉冲，两个脉冲之间间隔200毫秒。在每组脉冲之间颠倒电极极性以提高电转移的效率。
注射后每3周对小鼠取血。WN病毒特异性抗体反应通过Ag-捕捉ELISA和噬斑减少中和实验(PRNT)进行评价。单独血清用IgG-ELISA进行试验，来自每组10只小鼠的合并血清通过PRNT进行试验。在接种3周后，所有用pCBWN接种的小鼠的IgG ELISA滴度范围为1∶640到1∶1280。在3和6周收集的合并血清Nt抗体滴度为1∶80。来自pEGFP对照小鼠的血清样品无一显示对WN病毒的任何ELISA或者Nt滴度。
为了确定单独i.m.接种pCBWN是否能够保护小鼠免受WN病毒的感染，小鼠通过腹膜内注射或者暴露于病毒感染的库蚊叮咬下用NY-6480病毒进行攻击试验。半数小鼠组在接种6周后用1,000LD50(1,025PFU/100μl)的NY99-6480病毒进行腹膜内(ip)攻击。剩下的小鼠分别暴露于在攻击试验前7天感染有NY99-6480病毒的三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus mosquitoes)的叮咬下。让蚊子叮咬小鼠直至蚊子充分饱食。在攻击试验后每天观察小鼠2次，共三周。
很显然，Nt抗体的出现相关于保护性免疫，因为所有用WN病毒DNA免疫的小鼠在病毒攻击后都保持健康，而所有对照小鼠在病毒攻击4-6天后均表现出CNS感染的症状，并且腹膜内或者感染性蚊子攻击后分别平均6.9和7.4天后死亡。在接种组中，病毒攻击(免疫后9周)3周后收集的合并血清的Nt抗体滴度为1∶640或1∶320。在Western印迹分析中，合并的接种小鼠的血清仅仅和E蛋白反应。
通过电转移用每只动物10.0到0.1μg的pCBWN免疫每组10只小鼠。所有接受pCBWN的组都完全免于病毒攻击。免疫后6周，所有电转移小鼠的Nt滴度低于接受常规i.m.注射，而非电转移100μgpCBWN的动物的4倍。这些证明有效免疫的结果暗示电转移方法增提高了本发明DNA疫苗的免疫原性和保护功效(当按(Mir等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9642624267(1999))等描述的方法进行时)。
本研究中所用的混合繁殖的各种年龄的母马和被阉割的公马通过ELISA和PRNT试验显示为WN病毒和SLE病毒抗体阴性。四匹马i.m注射单剂量的pCBWN质粒(1,000μg/1,000μl的PBS，pH 7.5)。在病毒攻击前每隔1天收集血清样品，共38天，用MAC-或IgG ELISA和PRNT评价WN病毒特异性抗体反应。
病毒攻击前两天，将12匹马(4匹接种，8匹对照)重新放入位于科罗拉多州立大学的生物安全级(BSL)-3动物房。8匹未接种的对照马是设计用来调查马中WN病毒诱导的发病机理以及马作为扩增宿主的潜力研究的亚群。在对马进行攻击实验前12天用NY99-6425或者BC787病毒感染的14或者15只白纹伊蚊(Aedes albopictusmosquitoes)叮咬攻击每匹试验马。让蚊子叮咬马10分钟。每天两次检查马的发病信号。测量体温，从第0天(感染的日子)到第10天每天两次收集血清样品，从第11天到第14天每天一次。攻击后每天记录脉博和呼吸作用。通过噬斑滴定测定收集的血清样品用于检测病毒血症，以及通过MAC-或者IgG ELISA和PRNT用于抗体反应。
在任一接种的马中没有观察到全身性或者局部反应。通过PRNT测定单个马血清。接种的马在第14和第31天之间Nt抗体大于或者等于1∶5。在第37天时(蚊子攻击前2天)接种马#5，#6，#7，和#8的终点滴度分别为1∶40，1∶5，1∶20，和1∶20。用pCBWN质粒接种的马在病毒攻击后依然保持健康。从第1到第14天无一表现出可检测的病毒血症或者发烧。所有未接种的对照马在暴露于感染蚊子的叮咬下都被WN病毒感染。八匹未接种的马中有7匹在病毒攻击头6天内表现出病毒血症。患病毒血症的马在病毒攻击后第7和第9天之间出现Nt抗体。所有研究中表现疾病临床症状的唯一一匹马为#11马，其在感染8天后开始发烧并表现出神经症状。这匹马在48小时内发展成严重的临床疾病，并在第9天对其实施了安乐死。在表现0，2，4或者6天的病毒血症的四匹代表性马#9，10，14和15被选择作为本实施例的例子。病毒滴度范围从最低可检测水平的101.0PFU/ml血清(#10马)到102.4/ml(#9马)。在实验期间#14马没有表现可检测的病毒血症。但是，第12天后的Nt抗体检测证实这匹马感染了病毒。
在实验期间，在接种的马中没有观察到如Nt滴度逐渐增加所显示的Nt抗体回忆应答。在蚊子攻击前接种马中现存的Nt抗体能抑制最初的病毒感染和复制。没有病毒复制，由感染蚊子提供的攻击病毒抗原可能不含有足够的抗原量以刺激接种马中的免疫回忆应答。所有的接种马在病毒攻击14天后实施安乐死。没有观察到指示WN病毒感染的宏观病理学和组织病理学损害。
实施例12.制备含有黄热病毒(YFV)或者圣路易脑炎病毒(SLEV)prM和E蛋白编码序列的重组质粒。用类似于构建pCDJE2-7重组质粒的路线制备YFV和SLEV重组质粒。采用QIAampTM ViralRNA试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)从150μL的YFV病毒株TRI-788379或者SLE毒株78V-6507的病毒种子中提取基因组RNA。病毒RNA作为扩增YFV或SLEV的prM和E基因编码区的模板。引物YFDV389(核苷酸序列SEQ ID NO4；氨基酸序列，SEQ ID NO5)，cYFDV2452(SEQ ID NO6)，SLEDV410(核苷酸序列SEQ ID NO7；氨基酸序列，SEQ ID NO8)和cSLEDV2449(SEQ ID NO9)用来产生如上所述用于制备JEV和WNV重组质粒的相应重组核酸。用KpnI和NotI酶消化的RT-PCR扩增cDNA插入真核表达质粒载体pCDNA3(Invitrogen)的KpnI-NotI位点。测序cDNA的两条链，并验证和来自YFV毒株TRI-788379或者SLEV毒株78V-6507的序列的同一性。分别含有YFV或者SLEV的prM和E编码区的核苷酸序列的重组质粒pCDYF2和pCDSLE4-3利用EndoFreeTM Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)进行纯化，并用于体外转化或者小鼠免疫。
YFV或者SLEV特异性抗原分别表达在被pCDYF2或者pCDSLE4-3转化的COS-1细胞中。蛋白的表达水平和YFV-或者SLEV-感染的COS-1细胞对照相似。如同在JEV模型中，被携带病毒抗原基因的载体转化获得的COS-1细胞系组成型表达YFV或者SLEV抗原蛋白。利用一组YFV或者SLEV E-特异性Mabs通过IFA进行的表位图谱显示真实的E蛋白由pCDYF2-或者pCDSLE4-3-转化的COS-1细胞表达。初步研究显示100％的三周龄雌性ICR小鼠在用单剂量的100μg/100μL pCDSLE4-3质粒的去离子水肌内接种后形成抗血清。
实施例13.制备含有圣路易脑炎病毒的prM和E蛋白编码序列和JEV信号序列的重组质粒。采用QIAampTM Viral RNA试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)从150μL的用圣路易脑炎病毒MSI-7毒株感染的Vero细胞培养基中提取基因组RNA。提取的RNA洗脱后悬浮在80μl不含核酸酶的水中，并作为扩增圣路易脑炎病毒prM和E基因编码序列的扩增模板。引物序列获自Trent等人(Virology 156293-304(1987))的工作。含有基因组核苷酸区的cDNA片段通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行扩增。利用扩增引物SLE463(SEQ ID NO30)将限制性位点AfeI改建到cDNA的5＇端。在NotI限制性位点后面的符合读框翻译终止密码子利用扩增引物cSLE2447(SEQ ID NO31)导入cDNA的3＇末端。利用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化RT-PCR产物。
上述两个扩增引物(SEQ ID NO30和SEQ ID NO31)产生的双链扩增子用AfeI和NotI酶消化产生2004bp(463到2466nt)的DNA片段，并插入pCBJESS-M载体的AfeI和NotI位点形成pCBSLE(核苷酸序列，SEQ ID NO21；氨基酸序列，SEQ ID NO22)。pCBJESS-M衍生自pCBamp质粒，其含有巨细胞病毒早期基因启动子和翻译控制序列元件以及改造的修饰JE信号序列元件(SEQ ID NO27)。JE信号序列元件含有在原始pCBJESS质粒的-4(Cys到Gly)和-2(Gly到Ser)位置上修饰的JE信号序列。
利用ABI prism377测序仪(Applied Biosystems/Perkin Elmer，FosterCity，CA)自动测序DNA序列，以证实重组质粒具有按Trent等人(Virology 156293-304(1987))所限定的正确prM和E序列。
实施例14.制备含有黄热病毒(YFV)的prM和E蛋白编码序列和JE信号序列的重组质粒。采用QIAampTM Viral RNA试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)从150μL的用黄热病毒17D-213毒株感染的Vero细胞培养基中提取基因组RNA。提取的RNA洗脱后悬浮在80μl不含核酸酶的水中，并作为扩增黄热病毒prM和E基因编码序列的扩增模板。引物序列获自Santos等人(Virus Research 3535-41(1995))的工作。含有基因组核苷酸区的cDNA片段通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行扩增。利用扩增引物YF482(SEQ ID NO28)将限制性位点AfeI改建到cDNA的5＇端。在NotI限制性位点后面的符合读框翻译终止密码子利用扩增引物cYF2433(SEQ ID NO29)导入cDNA的3＇末端。利用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化RT-PCR产物。
上述两个扩增引物(SEQ ID NO28和SEQ ID NO29)产生的双链扩增子用AfeI和NotI酶消化产生1971bp(482到2452nt)的DNA片段，并插入pCBJESS-M载体的AfeI和NotI位点形成pCBYF(核苷酸序列，SEQ ID NO23；氨基酸序列，SEQ ID NO24)。pCBJESS-M衍生自pCBamp质粒，其含有巨细胞病毒早期基因启动子和翻译控制序列元件以及改造的JE信号序列元件(SEQ ID NO27)。JE信号序列元件含有在pCBJESS质粒的JESS的-4(Cys到Gly)和-2(Gly到Ser)位置上修饰的JE信号序列。
利用ABI prism377测序仪(Applied Biosystems/Perkin Elmer，FosterCity，CA)自动测序DNA序列，以证实重组质粒具有如Santos等人(VirusResearch 3535-41(1995))所限定的正确prM和E序列。
实施例15.制备含有玻瓦桑病毒的prM和E蛋白编码序列和JEV信号序列的重组质粒。采用QIAampTM Viral RNA试剂盒(Qiagen，SantaClarita，CA)从150μL的用玻瓦桑LB毒株感染的Vero细胞培养基中提取基因组RNA。提取的RNA洗脱后悬浮在80μl不含核酸酶的水中，并作为扩增玻瓦桑病毒prM和E基因编码序列的扩增模板。引物序列获自Mandl等人(Virology 194173-184(1993))的工作。含有基因组核苷酸区的cDNA片段通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行扩增。利用扩增引物POW454(SEQ ID NO25)将限制性位点AfeI改建到cDNA的5＇端。在NotI限制性位点后面的符合读框翻译终止密码子利用扩增引物cPOW2417(SEQ ID NO26)导入cDNA的3＇末端。利用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化RT-PCR产物。
上述两个扩增引物(SEQ ID NO25和SEQ ID NO26)产生的双链扩增子用AfeI和NotI酶消化产生1983bp(454到2436nt)的DNA片段，并插入pCBJESS-M载体的AfeI和NotI位点形成pCBPOW(核苷酸序列，SEQ ID NO19；氨基酸序列，SEQ ID NO20)。pCBJESS-M衍生自pCBamp质粒，其含有巨细胞病毒早期基因启动子和翻译控制序列元件以及改造的JE信号序列元件(SEQ ID NO27)。JE信号序列元件含有在pCBJESS质粒的JESS的-4(Cys到Gly)和-2(Gly到Ser)位置上修饰的JE信号序列。
利用ABI prism377测序仪(Applied Biosystems/Perkin Elmer，FosterCity，CA)自动测序DNA序列，以证实重组质粒具有如Mandl等人(Virology 194173-184(1993))所限定的正确prM和E序列。
实施例16.含有登革血清型2结构蛋白质编码序列的质粒的制备。遵照如实施于其它黄病毒的那些方法(参见实施例1，9和12-15)来制备含有登革血清型2抗原的核酸TU的载体。依照实施例，用于载体构建的扩增引物可被选择来改造正常的登革病毒信号序列或被选择以改造其它黄病毒的信号序列，例如修饰的日本脑炎病毒信号序列。
一个含有从prM到E的登革血清型2基因区的质粒被构建。登革血清型2 prM和E基因(Deubel等，Virology 155365-377(1986)；Gruenberg等，J.Gen.Virol.691301-1398(1988)；Hahn等，Virology162167-180(1988))被连接到质粒，诸如pCDNA3中，然后被切下并克隆到诸如pCBamp，pCEP4，pREP4或pRc/RSV的载体(由Invitrogen，Carlsbad，CA提供)中，以使其表达。如果必要，cDNA序列中编码的登革病毒血清型2-特异性序列可利用诸如聚合酶链式反应(PCR)的方法来扩增。或者，如果病毒RNA是基因区域来源的，DNA序列可通过RT-PCR方法来扩增。一个在5`端包含一个起始密码子以及在3`端包含一个终止密码子的DNA片段将被克隆到一个表达载体的合适限制性核酶特异性位点中，通过如此的方式使得巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子，一个起始密码子和一个终止子，被可操作地连接于登革病毒血清型2的序列中。
实施例17.使用登革血清型2DNA疫苗接种小鼠。
实施例16中制备的编码从prM到E的基因区域的登革血清型2核酸TU疫苗悬浮在适当的可药用载体中，诸如注射用水中或缓冲生理盐水中，并且肌内注射到刚断奶小鼠组的体内。对照组接受缺少登革血清型2特异性基因的可比较的质粒制备物。登革血清型2特异性抗体，和/或登革血清型2-特异性免疫系统胞毒细胞的产生，在其后以固定时间间隔评价，例如以周间隔。在核酸TU疫苗给药后大约二到四个月，小鼠用登革血清型2病毒攻击。其后以合适的间隔评价病毒血症的水平，例如每隔一天进行评价。母体抗体赋予的被动保护的评价显示在实施例8中。
实施例18.改良的信号肽的设计和构建。信号肽能决定插入蛋白质的易位和方向，因而确定prM和E蛋白的拓扑学。真核细胞信号肽的最基本特征由被称为h-区域的一段8到12个疏水氨基酸组成(vonHeijne，“信号序列，变化的限制”(″Signal sequences.The limits ofvariation″)J.Mol.Biol.18499-105(1985))。在启动子Met和h-区域之间的区域，已知为n-区域，通常具有一到五个氨基酸，且通常带有正电的氨基酸。在h-区域和切割位点之间是c-区域，其由三到七个极性的但是最通常不带电的氨基酸残基组成。在病毒多蛋白合成的过程中，在C和prM蛋白的结合区信号酶切割位点从隐蔽到可切割构象的调节依赖于C蛋白通过病毒蛋白酶复合物NS2B/NS3的在先去除((Lobigs，“黄病毒膜蛋白的切割和尖峰异源二聚体的分泌需要病毒蛋白酶NS3的功能”(″Flavivirus premembrane protein cleavage and spikeheterodimer secretion require the function of the viral proteinase NS3，″)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.906218-6222(1993))。因此，当prM和E蛋白质通过表达质粒单独表达时，考虑病毒信号序列的有效性是很关键的。
不同质粒构建体中的信号肽的区别可用来至少部分解释，蛋白质易位，切割位点的出现以及正确的拓扑学的差异，因此说明prM和E分泌和VLP形成。这些特性的调整或优化可通过带有能够赋予所期望特征的信号序列的选择或应用而得以改进。其可通过使用例如，一个在真核生物上进行的隐马尔可夫模型(HMM)的计算机程序学习机器来完成(参见Henrik Nielsen等，“通过隐马尔可夫模型预测信号肽和信号锚定”(″Prediction of signal peptides and signal anchors by a hiddenMarkov model″)，分子生物学智能系统第六届国际会次会议录(InProceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systemsfor Molecular Biology(ISMB 6))，AAAI Press，Menlo Park，California，pp.122--130(1998)；Nielsen等，“预测信号肽和其它蛋白分选信号的机器学习方法”(″Machine learning approaches to the prediction of signalpeptides and other protein sorting signals，″)Protein Engineering 123-9(1999)；Nielsen等，“神经网络方法用于鉴定原核和真核生物信号肽并预测其切割位点”(″A neural network method for identification ofprokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavagesites，″)Int.J.Neural Sys.8581-599(1997)；“从序列到分选信号肽的预测”(″From sequence to sortingPrediction of signal peptides，″)HenrikNielsen，博士论文，Defended at Department of Biochemistry，StockholmUniversity，Sweden(May 25 1999)；每个文献均在此处引作参考，尤其是对使用计算机运算法则优化信号序列相关教导的参考文献)。
所用程序类型的一个例子可在http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/上自2002年4月3日起找到。所描述的HMM和所引用的参考文献被用于计算prM信号肽序列在不同质粒构建体中的信号肽概率(表7)。SignalP-HMM搜索正确地预测在所有构建体中信号肽酶的切割位点。然而，观察到的切割概率(范围在0.164和1.000之间)和信号肽概率(范围在0.165到1.00之间)的区别很大(表7)。这不令人惊讶，因为切割位点和信号肽概率已知也被n-区域的正电荷氨基酸，构建体中h-区域的疏水氨基酸长度和c-区域的氨基酸组成所影响((Chang等，“黄病毒DNA疫苗现状及前景”(″Flavivirus DNA vaccinescurrent status and potential，″)Annals of NYAcad.Sci.951272-285(2001)；Sakaguchi等，“通过疏水区段和N-末端电荷之间的平衡确定信号和信号锚定序列的功能”(″Functions of Signal and Signal-Anchor Sequences are Determined bythe Balance Between the Hydrophobic Segment and the N-TerminalCharge，″)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8916-19(1992))。
各起源于不同JE病毒毒株的3个JE病毒质粒构建体，显示出不同的疫苗潜力(Lin等，“用日本脑炎病毒非结构蛋白NS1的DNA免疫引发小鼠的保护性免疫”(″DNA immunization with Japaneseencephalitis virus nonstructural protein NS 1 elicits protective immunity inmice，″)J.Virol.72191-200(1998)；Konishi等，“通过用编码日本脑炎病毒前膜蛋白和包膜蛋白的基因的质粒免疫诱导小鼠抗日本脑炎的保护性免疫”(″Induction of protective immunity against Japaneseencephalitis in mice by immunization with a plasmid encoding Japaneseencephalitis virus premembrane and envelope genes，″)J.Virol.724925-4930(1998)；Chang等，“单次肌内注射重组质粒DNA诱导小鼠的保护性免疫和预防日本脑炎”(″A single intramuscular injection ofrecombinant plasmid DNA induces protective immunity and preventsJapanese encephalitis in mice，″)J.Virol.744244-4252(2000))。这些构建体中的信号肽序列区别在可能含有或不含有带电荷氨基酸的n-区域的长度(表7)。包含正电荷氨基酸的n-区域在细胞质一侧形成一个短环，其导致h-区域(跨膜螺旋)从尾部方向被插入，暴露出信号酶切割位点。在我们的研究中，包含prM/M和E蛋白的分泌性VLP可由pCDJE2-7转化的细胞系，JE4B或pCBJE1-14瞬间转化的COS-1细胞的培养基中纯化而来。梯度纯化的VLP和病毒粒子具有相同的免疫学和生物化学特性。VLP和病毒粒子之间从prM到成熟M蛋白的加工效率，这是黄病毒形态发生的标记，也是相似的。因此，通过pCDJE2-7和pCBJE1-14表达的prM和E蛋白可以类似于病毒粒子prM和E的方向被表达成I型跨膜蛋白(Chang等，“单次肌内注射重组质粒DNA诱导小鼠的保护性免疫和预防日本脑炎”(″A singleintramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protectiveimmunity and prevents Japanese encephalitis in mice，″)J.Virol.744244-4252(2000))。相反，pcDNA3JEME的prM蛋白质可被表达为II型跨膜蛋白，且因为其n-区域正电荷氨基酸缺失使其跨膜h-区域以头的方向插入(Konishi等，“通过用编码日本脑炎病毒前膜蛋白和包膜蛋白的基因的质粒免疫诱导小鼠抗日本脑炎的保护性免疫”(″Induction ofprotective immunity against Japanese encephalitis in mice byimmunization with a plasmid encoding Japanese encephalitis viruspremembrane and envelope genes，″)J.Virol.724925-4930(1998))。有效的蛋白质合成与具有正确的拓扑学的表达蛋白组合，尤其是与表达的prM和E组合，能增强VLP的形成和分泌，并因此提高了DNA疫苗的免疫原性(Chang等，“单次肌内注射重组质粒DNA诱导小鼠的保护性免疫和预防日本脑炎”(″A single intramuscular injection ofrecombinant plasmid DNA induces protective immunity and preventsJapanese encephalitis in mice，″)J.Virol.744244-4252(2000))。
基于计算机计算的使用，如上所述，已经被应用于优化表达质粒的设计。尤其是，SignalP-HMM程序的预测能力被用于设计WN病毒表达质粒(表2)(Davis等，“西尼罗病毒重组DNA疫苗保护小鼠和马免受病毒的攻击，且体外表达非感染的重组抗原能够用于酶联免疫吸附试验”(″West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouseand horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectiousrecombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbentassays，″)J.Virol.754040-4047(2001))。pCBWN质粒的组成是短形式的JE病毒信号肽，其后跟着WN病毒prM-E基因序列。此构建体的疫苗潜能已被充分地证明，因为单次i.m.注射pCBWN DNA不仅诱导保护免疫而且也预防了小鼠和马的WN病毒感染。
如更早所讨论及如实施例13-15所证明，来自相同病毒的病毒编码信号序列如同抗原编码区域一样不必是有效的最佳的信号肽。此外，非修饰的信号序列不是必须最佳的。例如，质粒pCBJE1-14中编码的信号肽可被改进，如由信号序列概率测定一样，通过缩短n-区域，改变c-区域序列，或将两个修饰组合(图6)。通过例证的方式，JE病毒信号肽的缩短的形式已被用于WN病毒prM和E基因的表达，如在此所述，或在此引作参考的文献教导所述(Davis等，“西尼罗病毒重组DNA疫苗保护小鼠和马免受病毒的攻击，且体外表达非感染的重组抗原能够用于酶联免疫吸附试验”(″West Nile virus recombinantDNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expressesin vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used inenzymelinked immunosorbent assays，″)J.Virol.754040-4047(2001))。由单次i.m.接种的剂量滴定研究表明pCBWN在小鼠中比pCBJEI-14的免疫原性多至少2-4倍。
实施例19.多价疫苗。
设计用来免疫抗多种黄病毒的多价和/或联合疫苗也可被制备。在多价疫苗的制备中，单价疫苗成分的制备包括与目的病原体相关的元件，诸如YF，不同血清型的DEN，JE，WN，SLE和TBE(RSSE和CEE)病毒或任一其它黄病毒的组合。DNA构建体的设计和制备如其它实施例和说明书中所描述的进行。可制备适当疫苗的组合，以提供多价的或组合疫苗防御多种病原体。来自我们小组的初步数据证明pCBJE1-14和pCBWN DNA联合疫苗i.m.注射小鼠，诱导JE病毒和WN病毒特异性Nt抗体的产生(表8)。每种单价组分，即使使用同一转录和翻译调控子进行构建的，也应当优选在类似模型系统中测试来保证其疫苗潜力。然后以此配制组合的鸡尾酒疫苗。这种鸡尾酒疫苗可被特异性定制以适用于特定的地理区域。例如，一种用于热带和亚热带亚洲的鸡尾酒疫苗应包括四种血清型的DEN，WN和JE病毒疫苗。同样地，对于非洲和拉丁美洲有用的鸡尾酒疫苗应分别包括四种血清型的DEN，WN和YF病毒疫苗以及包括四种血清型的DEN，Rocio和YF病毒疫苗。
实施例20.重组登革病毒2型疫苗的制备和试验。
a.实施例的概述。构建一系列编码登革病毒2型(DEN-2)前膜(prM)和外膜(E)蛋白的质粒。这些质粒包括一个真正的编码由SEQID NO43所描述的蛋白的DEN-2 prM-E构建体(pCBD2-14-6)(SEQ IDNO42)，一个90％DEN-2E-10％日本脑炎(JE)病毒E嵌合构建体(pCB9D2-1J-4-3)(SEQ ID NO44)，其编码由SEQ ID NO45所描述的蛋白，以及一个80％DEN-2E-20％JE E嵌合构建体(pCB8D2-2J-2-9-1)(SEQ ID NO46)，其编码由SEQ ID NO47所描述的蛋白。单克隆抗体(MAb)反应性表明所有三个质粒均表达与一组1，2和3个抗体的结构域反应的E蛋白表位。然而，只有pCB8D2-2J-2-9-1构建体(SEQ IDNO46)分泌高水平的prM，M(成熟prM)和E到质粒转化的COS-1细胞的培养基中。用pCBD2-14-6质粒(SEQ ID NO42)转化的COS-1细胞表达的和用pCB9D2-4-3质粒(SEQ ID NO44)转化的COS-1细胞表达的prM和E蛋白质的主要部分保持了膜结合活性。20％的编码DEN-2E的E蛋白的序列用编码相应的JE E蛋白序列替换对MAbs反应性没有影响。
在试验中，每组小鼠在0和3周接受两次肌内免疫所选的质粒，且通过测定特异性中和和ELISA抗体评价免疫应答。表达分泌的prM和E的质粒，其可以形成亚病毒颗粒(SVP)，在刺激抗体免疫应答上优于其它的构建体。90％的中和滴度范围从1∶40到＞1∶1000在pCB8D2-2J-2-9-1免疫小鼠的9个血清标本中有7个被观察到。
b.DEN-2病毒和疫苗的重要性。
登革(DEN)热是一个在亚热带和热带地区发生的急性感染。它是人类最重要的黄病毒疾病之一。如较早所述，有四种不同的登革病毒的DEN血清型(DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4)。由任意这些病毒导致的感染通常无症状或仅仅引起自限的发热，已知为登革热(DF)。然而，在百分比小的病例中，登革病毒感染造成一种比较严重的，威胁生命的登革热出血发烧或登革热休克综合症(DHF/DSS)。因此，虽在全球每年大约有一亿例相对轻微的DF，受到有限的关注，同时据估计每年还有500,000就医的DHF/DSS病例被报道。为了防御这种疾病，需要将有效抗所有四种血清型的安全和有效的DEN疫苗施用给DEN地方病区和传染区的孩子和非免疫的成人。
安全的疫苗必须使有毒病毒的严重感染的潜在危险最小化。此种有毒力的病毒可通过衍生自减毒疫苗病毒的某些类型疫苗的基因回复突变或重组而出现。此种情况确实在消灭脊髓灰质炎病毒的活动中出现过(Guillot等，“人类疫苗和野生型脊髓灰质炎毒株之间的自然基因交换”(″Natural Genetic Exchanges between Vaccine and Wild PoliovirusStrains in Humans，″)J Virol.748434-8443(2000)；Liu等，“1型野生型脊髓灰质炎重组疫苗在中国广泛流行的分子演化”(″MolecularEvolution of a Type 1 Wild-Vaccine Poliovirus Recombinant duringWidespread Circulation in China，″)J.Virol.7411153-11161(2000))。此外，一个黄热病毒的美国毒株TRINID79A的基因测序，表明在这一毒株和减毒的黄热病疫苗病毒FNV之间有广泛的相似性(Chang等，“包膜蛋白基因核苷酸序列的变异鉴定两种不同的黄热病毒基因型”(″Nucleotide sequence variation of the envelope protein gene identifiestwo distinct genotypes of yellow fever virus，″)J.Virol.695773-5780(1995)；Pisano等，“美国黄热病毒株TRINID79A的全核苷酸序列和系统发育”(″Complete nucleotide sequence and phylogeny of anAmerican strain of yellow fever virus，TRINID79A，″)Arch.Virol.1441837-1843(1999))。虽然不考虑其本身，相似性强烈地表明TRINID 79 A起源于FNV疫苗病毒。
基于DNA的疫苗的应用是一种新的和有前景的用于开发黄病毒疫苗的免疫方法(如这里所描述的，Chang等，“黄病毒DNA疫苗现状及前景”(″Flavivims DNA vaccinescurrent status and potential，″)Ann.NY Acad.Sci.951272-285(2001)，在此处引用作为参考)。在此实施例中，大量的DEN-2疫苗被生产且在DEN-2构建体i.m免疫小鼠后，其免疫应答与prM/M和E分泌的效率相关联。一种导致prM/M和E抗原显著分泌的构建体显示能够在质粒接种的小鼠体内刺激高滴度的中和抗体。
c.材料和方法
i.细胞培养物和病毒毒株。COS-1细胞(ATCC，Manassas，VA；1650-CRL)在37℃、5％CO2的条件下生长在Dulbecco氏改良Eagle基础培养基(DMEM，GIBCO，Grand Island，NY)中，该基础培养基补充10％热灭活的胎牛血清(FBS，Hyclone Laboratories，Inc，Logan，UT)，1mM丙酮酸钠盐，lmM非必需氨基酸，30ml/L 7.5％的NaHCO3，100单位/毫升的青霉素，和100μg/毫升的链霉素。Vero和C6/36细胞在与COS-1细胞相同的条件下培养。DEN-2病毒，毒株-16681用于cDNA克隆，IgG ELISA和噬斑还原中和试验(PRNT)。病毒在C6/36细胞培养物中繁殖。用于免疫学或生物化学研究的病毒通过7％聚乙二醇(PEG-8000；Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)沉淀，然后用30％甘油-45％钾-酒石酸盐梯度上的超高速离心进行纯化(Obijeski等，“LaCrosse病毒的区段化基因组和核衣壳”(″Segmented genome andnucleocapsid of La Crosse virus，″)J.Virol.20664-675(1976))。
ii.质粒构建。通过利用QIAampTM病毒RNA试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)从150μl的DEN-2 16681毒株感染的C6/36细胞培养基中提取基因组RNA。提取的RNA重悬浮在80μl的焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC，Sigma，ST.Louis，MO)中，然后用作DEN-2病毒prM和E基因的RT-PCR扩增中的模板。引物序列(表9)的设计基于已公开的序列(Gadkari等，“蝙蝠中发现的森林病毒中和抗体的临界评价(初步报告)”(″Critical evaluation of Kyasanur Forest disease virusneutralizing antibodies found in bats(a preliminary report)，″)Indian J.Med.Res.6464-67(1976)；Kinney等，“构建登革2型病毒的感染cDNA克隆毒株16681及其减毒疫苗衍生物，毒株PDK-53”(″Construction of infectious cDNA clones for dengue 2 virusstrain16681 and its attenuated vaccine derivative，strain PDK-53，″)Virology230300-308(1997))。限制性酶KasI的识别和切割位点被插入在cDNA扩增子的5`末端。接着一个NotI限制性位点的一个框内终止密码子导入cDNA扩增子的3`末端。DEN-2病毒cDNA扩增子用KasI和NotI酶消化，然后被插入到pCBJESS载体的KasI和NotI位点以形成100％DEN-2 E质粒，pCBD2-14-6(SEQ ID NO42)。
为了构建90％和80％的DEN-2E质粒，该100％DEN-2质粒，pCBD2-14-6(SEQ ID NO42)，和JE质粒，pCBJE1-14(SEQ ID NO17)被用作PCR模板来分别扩增DEN-2和JE DNA序列。用于扩增反应来获得DEN-2和JE基因片段的一系列引物列在表9中。T7和SP6引发位点发现在pCBamp质粒中，其衍生自原始pCDNA-3质粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，且可按期望或需要使用。90％DEN-2-I0％JEE蛋白基因的PCR扩增DNA片段用BxtXI限制性核酸内切酶消化，用T4 DNA连接酶连接，用KasI和NotI酶消化，并插入到pCBJESS载体的KasI和NotI位点中来获得质粒pCB9D2-1J-4-3(SEQ ID NO44)。80％DEN-2-20％JE E基因的PCR扩增DNA片段用BsmBI消化，用T4DNA连接酶连接，用KasI和NotI酶消化，并插入到pCBJESS载体的KasI和NotI位点中以获得质粒pCB8D2-2J-2-9-1(SEQ ID NO46)。三个质粒构建体的示意图显示在图7中。90％DEN-2-10％JE E和80％DEN-2-20％JE E蛋白的结合区域，分别显示在表9中。
自动化的DNA测序在ABI Prism 377测序仪(AppliedBiosystems/Perkin Elmer，Foster City，CA)上依照厂商推荐的方法进行。带有正确prM和E序列的重组质粒通过序列分析得以鉴定。
iii.DEN-2重组抗原通过电穿孔在COS-1细胞中的瞬间表达。
COS-1细胞分别用DEN-2质粒或绿色荧光蛋白表达质粒对照(pEGFP，Clonetech，San Francisco，CA)通过在其它实施例中和Chang等的方法(“单次肌内注射重组质粒DNA诱导小鼠保护性免疫和预防日本脑炎”(″A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNAinduces protective immunity and prevents Japanese encephalitis inmice，″)J.Virol.744244-4252(2000))进行电穿孔。电穿孔细胞接种到75cm2培养瓶上，并保持在37℃和5％ CO2。在电穿孔之后的六个小时培养基用含有2％胎牛血清的维持培养基替换。电穿孔48小时后收集组织培养基和细胞用于抗原的鉴定。
iv.利用DEN-2E特异性单克隆抗体进行表位绘图。
电穿孔48小时后，吸附细胞被胰蛋白酶化，重悬浮在含有5％山羊血清的PBS中，点在12孔玻片上并空气干燥。吸附在点玻片上的细胞在-20℃与丙酮一起混合10分钟并使其空气干燥。E蛋白特异性单克隆抗体(MAb)用于通过间接免疫荧光抗体试验(IFA)检测蛋白表达，如前描述(表10；Chang等，单次肌内注射重组质粒DNA诱导小鼠保护性免疫和预防日本脑炎(″A single intramuscular injection ofrecombinant plasmid DNA induces protective immunity and preventsJapanese encephalitis in mice，″)J.Virol.744244-4252(2000))。
v.重组DEN-2病毒抗原的鉴定。电穿孔48小时后收集组织培养基。抗原-捕获(Ag-capture)ELISA用于检测瞬间转化的COS-1细胞的培养基中分泌的DEN-2病毒抗原。Mab 4G2和辣根过氧化物酶结合的Mab 6B6C-1分别用于捕获DEN病毒抗原和检测捕获的抗原(Chang等，“单次肌内注射重组质粒诱导小鼠的保护性免疫并预防日本脑炎”(″A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNAinduces protective immunity and prevents Japanese encephalitis inmice，″)J.Virol.744244-4252(2000)；Hunt等，“在稳定转化的细胞中产生的日本脑炎病毒的重组颗粒性抗原是有效的非感染性抗原和亚基免疫原”(″A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitisvirus produced in stably-transformed cells is an effective noninfectiousantigen and subunit immunogen，″)J.Virol.Methods.97133-149(2001))。
电穿孔48小时后，每一质粒转化的细胞被胰蛋白酶化并重悬浮在PBS中使等分试样含有5×106个细胞。这些细胞样品使用Mem-PER哺乳动物膜蛋白质提取试剂盒(Pierce，Rockford，IL)，依照生产商建议的方法，经处理后用于膜蛋白质提取。疏水和亲水性蛋白质被分开。此方法被发展成富集疏水相中的完整的膜蛋白。疏水和亲水性部分均通过Ag-capture ELISA用于DEN-2重组抗原的分析。
培养基中的重组抗原通过10％聚乙二醇(PEG)-8000沉淀而浓缩。沉淀物重悬浮在TNE缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，10mM EDTA，pH 7.5)中至原始体积的1/100，通过离心使其澄清，并4℃下保存。通过PEG沉淀浓缩并重悬浮在TNE缓冲液中的重组抗原用4.0％的乙醇提取以除去残余的PEG(Hun等，“在稳定转化的细胞中产生的日本脑炎病毒重组颗粒抗原是有效的非感染性抗原和亚基免疫原”(Arecombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced instably-transformed cells is an effective noninfectious antigen and subunitimmunogen，″“J.Virol.Methods.97133-149(2001))。乙醇提取的抗原，来自转化细胞的疏水膜蛋白和梯度纯化的DEN-2病毒粒子利用ExcelPlus Electrophoresis ApparatusTM(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)在NuPAGE，4-12％ Bis-Tris梯度凝胶上进行分析，然后使用Excel PlusBlot Unit(Invitrogen Corp.)在硝化纤维膜上进行电印迹。DEN-2病毒-特异性蛋白通过western印迹使用DEN-2病毒特异性MAbs1A6A-8(E特异性)和1A2A-1(衣壳特异性)，以及对DEN-2 prM特异性的兔抗血清和对包含DEN-2M蛋白的氨基酸1-34的肽特异性的小鼠血清进行检测，以正常小鼠腹水作为阴性对照(Murray等，“登革2型病毒蛋白prM和C-prM的加工”(″Processing of the dengue virus type 2 proteinsprM and C-prM，″)J.Gen.Virol.74(Pt 2)175-182(1993)；Roehrig等，“牙买加登革2型病毒Jamaica包膜糖蛋白的单克隆抗体图谱”(″Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of thedengue 2 virus，″)Virology 246317-328(1998))。
vi.小鼠接种。每组10只3周大的雌性ICR远交小鼠用于研究中。小鼠在第0周和第3周用pCBD2-14-6，pCB9D2-1J-4-3，pCB8D2-2J-2-9-1或pEGFP以每只小鼠100μg/100μl的剂量进行i.m注射。质粒DNA用EndoFree Plasmid Giga kitsTM(Qiagen)纯化自XL-1蓝细胞并重悬浮在pH7.5的PBS中，浓度为1.0μg/μl。接受100μg pEGFP的小鼠被用作质粒接种的对照。小鼠在注射之后每3三周取血一次，且DEN-2病毒特异性抗体应答通过利用间接ELISA和PRNT进行评价。
vii.血清学试验。接种疫苗之前和之后的血清标本通过ELISA测试其抗体结合纯化的DEN-2病毒粒子的能力，通过PRNT测试中和(Nt)抗体，通过Western印迹测试识别纯化的DEN-2病毒蛋白的抗体。如前面所述(Chang等，“单次肌内注射重组质粒诱导小鼠的保护性免疫并预防日本脑炎病毒”(″A single intramuscular injection ofrecombinant plasmid DNA induces protective immunity and preventsJapanese encephalitis in mice，″)J.Virol.744244-4252(2000))，使用DEN-2(毒株-16681)和JE(毒株-Nakayama)病毒对Vero细胞进行PRNT。测定终点在90％的噬斑减少水平(Hunt等，“在稳定转化的细胞中产生的日本脑炎病毒重组颗粒抗原是有效的非感染性抗原和亚基免疫原”(″A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virusproduced in stably-transformed cells is an effective noninfectious antigenand subunit immunogen，″)J.Virol.Methods.97133-149(2001))。
d.结果。
i.DFN-2病毒重组抗原的瞬间表达。通过分别转化3种重组DEN-2 DNA质粒到COS-1细胞中来完成DEN-2病毒的prM和E基因以及来自DEN-2病毒和JE病毒序列组合(80％DEN-20％JE或90％DEN-10％JE)的嵌合E基因的表达。基本质粒设计基于在前的用JE病毒和WN病毒重组质粒进行的研究结果，其中质粒转化的细胞表达并分泌真正的病毒蛋白到细胞培养液中(Chang等，“单次肌内注射重组质粒诱导小鼠的保护性免疫并预防日本脑炎病毒”(″A singleintramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protectiveimmunity and prevents Japanese encephalitis in mice，″)J.Virol.744244-4252(2000)；Davis等，“西尼罗病毒重组DNA疫苗保护小鼠和马抗病毒的攻击，并且体外表达可用作酶联免疫吸附试验的非感染型重组抗原”(″West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse andhorse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectiousrecombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbentassays，″)J.Virol.754040-4047(2001))。DEN-2重组蛋白质的瞬间表达通过细胞培养物上清液的Ag-捕捉ELISA和通过丙酮-固定的转化COS-1细胞的IFA被首先评价(Chang等，“单次肌内注射重组质粒诱导小鼠的保护性免疫并预防日本脑炎病毒”(″A single intramuscularinjection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity andprevents Japanese encephalitis in mice，″)J.Virol.744244-4252(2000))。最佳抗原表达时间确定在电穿孔后48小时。
ii.通过瞬间转化COS-1细胞表达的E蛋白表位图谱。
由每种重组质粒表达的DEN-2蛋白通过IFA利用一组带有已知与DEN-2病毒反应的鼠源MAbs进行评价(表10；Henchal等，“利用单克隆抗体表位分析登革-2病毒粒子表面的抗原决定簇”(″Epitopicanalysis of antigenic determinants on the surface of dengue-2 virions usingmonoclonal antibodies，″)Am.J.Trop.Med.Hyg.34162-169(1985)；Roehrig等，“牙买加登革2病毒包膜糖蛋白的单克隆抗体图谱”(″Monoclonalantibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus，Jamaica，″)Virology 246317-328(1998))。MAb试验组包括与黄病毒的E蛋白以及prM和C蛋白的3个抗原结构域的每种反应的抗体(Mandl等，“使用壁虱性脑炎病毒作为模型，黄病毒包膜蛋白E分子水平上的抗原结构”(″Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E atthe molecular level，using tick-borne encephalitis virus as a model，″)J.Virol.63564-571(1989)；Rey等，“2分辨率的壁虱性脑炎病毒的包膜糖蛋白”(″The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitisvirus at 2A resolution，″)Nature 375291-298(1995))。对黄病毒抗原结构域2和3特异的MAbs显示与DEN-2病毒和3种质粒表达蛋白每一个有几乎相同的定性反应。结构域1-特异性MAbs之一，1B4C-2也显示出与所有表达蛋白相似的反应模式。然而，结构域1-特异性MAbs，2B3A-1和9A4D-1中的两个与由质粒pCBD2-14-6和pCB9D2-1J-4-3表达的E蛋白如终点滴定显示有较少的反应(值在括号中，表10)。终点滴定的比较显示了表位C3和C4在含有100％DEN-2 E和90％DEN-2 E-10％ JE E的构建体中表达水平明显低。对prM特异的MAb2H2，具有与所有3种质粒表达的抗原相同的反应性。抗C MAb 1A2A-1与DEN-2病毒反应较好并且与质粒表达的病毒蛋白有低水平的非特异性反应，所述病毒蛋白包括prM和E，但不包括C。
iii.由三种DEN-2重组质粒分别产生的分泌蛋白和膜结合蛋白的比较。
从每种重组DEN-2质粒转化48小时后的COS-1细胞中收集相似量的细胞培养液。在培养液中发现的分泌的重组抗原通过PEG沉淀浓缩100倍，然后通过乙醇提取除去干扰随后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的PEG。由每种质粒表达的分泌抗原的相对量通过对PEG-沉淀和乙醇抽提的细胞培养液制备物进行Ag-捕捉ELISA分析来测定(表11)。分泌的抗原仅从用pCB8D2-2J-2-9-1(SEQ ID NO34)转染的细胞中检测到，其包含80％ DEN-2 E和20％ JE E基因。尽管努力浓缩表达的蛋白，但含有100％ DEN-2E或90％ DEN-2 E-10％ JE E基因的重组质粒在培养液中不产生ELISA-可检测的抗原。
Wetern印迹分析也被用于评价由每种DEN-2重组质粒产生的分泌抗原。为了比较的目的，将等体积的PEG沉淀和乙醇提取的细胞培养上清液在NuPAGE梯度凝胶上电泳，电印迹到硝化纤维膜上，并利用MAbs或能与所有DEN-2结构蛋白反应的多克隆抗血清进行分析(图8A)。在检测重组抗原中，Wetern印迹分析显示比Ag-捕获ELISA有较高的灵敏度，这是因为DEN-2特异性蛋白在来自两种质粒pCB8D2-2J-2-9-1和pCB9D2-1J-4-3(分别为SEQ ID NO46和44)的培养液中被检测到。质粒pCB8D2-2J-2-9-1(SEQ ID NO46)表达了最大量的分泌抗原，其包括E，prM和M蛋白。由pCB9D2-1J-4-3(SEQ IDNO44)生产相对较少的分泌抗原，且对pCBD2-14-6(SEQ ID NO42)制备物而言几乎未发现可检测的水平，其显示含有相对低的表达E蛋白，特别是如果考虑到E特异性MAb，1A6A-8和对照pEGFP的非特异性反应(图8A，14-6和GFP的泳道a，b)。
由于E，prM和M在其胞内合成中是与膜结合的蛋白，因此这些蛋白通过3种重组DEN-2质粒表达的任意评价应包括来自质粒转化细胞的细胞膜制备物的评估。Mem-PER哺乳动物膜蛋白提取试剂盒(Pierce)用于分离来自相同数量被每种重组质粒转化的细胞的完整膜蛋白。疏水蛋白通过相分离与亲水蛋白分开。通过Ag-捕捉ELISA的初步分析显示亲水性蛋白部分是非反应性的；然而，来自用每一重组DEN-2质粒转化的COS-1细胞的疏水蛋白部分与ELISA试验有相似的滴度(表11)。这些结果表明由所有3种质粒编码的重组抗原在转化后被表达，但表达的重组抗原并非全部在相同的水平上分泌。
疏水蛋白部分的Ag-捕捉ELISA结果的证实通过western印迹完成(图8B)。相同体积的来自每一质粒转化细胞的疏水蛋白部分依据厂商对SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的建议进行稀释，以减少带和泳道的扭曲。与E-，prM-，C-，和M特异性MAbs或多克隆抗血清的免疫印迹证实所有3种重组DEN-2质粒诱导产生相似量的含有E和prM的重组抗原。没有M蛋白被检测到，因为其不是从自prM加工而来，或者因为其水平太低检测不到。尽管努力减少带扭曲，与不含有高浓度表面活性剂的样品比较，疏水蛋白样品中高水平的表面活性剂显然引起E和prM以轻微异常的方式(较慢的迁移)进行电泳(图8A和8B中比较E和prM迁移)。
iv.用3种不同DEN-2重组DNA质粒接种小鼠的免疫应答比较.
三周龄的ICR小鼠在第0和第3周时用100μg的pCB8D2-2J-2-9-1(SEQ ID NO46)，pCB9D2-1J-4-3(SEQ ID NO44)，pCBD2-14-6(SEQ ID NO42)或pEGFP通过i.m注射免疫。小鼠在初次免疫后的3，6，和9周取血。单独和合并血清在接种3和6周后使用1∶100和1∶400的筛选稀释比通过间接ELISA测定，且在接种9周后进行终点滴定。9-周血清也通过PRNT利用DEN-2和JE病毒进行测定。ELISA结果显示在一次免疫后(3周血清)，所有接受pCB8D2-2J-2-9-1的小鼠形成血清转化，然而只有50％的pCB9D2-1J-4-3和20％的pCBD2-14-6接种小鼠与DEN-2病毒反应(表12)。至接种后9周，所有用pCB8D2-2J-2-9-1或pCBD2-1J-4-3接种的小鼠显示了抗DEN-2 ELISA反应；然而，滴度的几何平均数显著不同(分别为滴度1∶20,000对1∶708)。只有40％的pCBD2-14-6免疫小鼠的抗DEN-2 ELISA的滴度大于1∶100。来自pCB8D2-2J-2-9-1免疫小鼠的合并9周血清对纯化的DEN-2病毒的western印迹显示对E糖蛋白免疫显性应答。也检测到对prM和M的轻微反应。
更显然，根据3种DEN-2质粒疫苗潜力的评价，基于90％噬斑减少终点，9只用pCB8D2-2J-2-9-1(SEQ ID NO46)免疫的小鼠中有7只观察到诱导的病毒中和抗体(表10)。然而，如果使用50％的中和终点，则所有9只小鼠血清均具有31∶40的PRNT滴度。7份带有中和活性的血清，90％的中和滴度范围是从1∶40到＞1∶1000。用pCB9D2-1J-4-3免疫的小鼠无一产生中和抗体，且10只pCBD2-14-6接种小鼠的血清中只有一份产生中和病毒，其滴度仅为1∶8。
因为两个重组质粒，即pCB9D2-IJ-4-3(SEQ ID NO44)和pCB8D2-2J-2-9-1(SEQ ID NO46)含有JE病毒E基因序列，所有的血清可用于评价JE病毒中和活性的存在。然而，对任意免疫小组中的小鼠而言，90％中和终点没有检测到这种活性。并不令人惊讶，用对照质粒pEGFP免疫的小鼠对DEN-2或JE病毒没有表现出活性。
e.讨论。较早用于JE和WN疫苗生产的相同步骤被首先用于构建由确定的DEN-2 prM和E基因区域组成的重组DEN-2质粒，pCBD2-14-6(SEQ ID NO42)。此质粒转化的COS-1细胞所表达的DEN-2蛋白的抗原性图谱用一组MAb通过IFA显示prM和E蛋白具有相容的荧光强度和与病毒感染细胞类似的MAb反应性(表10)。然而，这些由编码真正DEN-2 prM和E区域的质粒所转化的COS-1细胞不能分泌可检测的DEN-2抗原到培养液中(如通过抗原-捕获ELISA所测定)。此外，利用编码确定的DEN-2 prM和E区域的质粒接种不能刺激i.m.免疫小鼠产生抗DEN-2病毒中和抗体(表13)。有趣的是，通过pCBD2-14-6转化细胞产生带标点的球状萤光染色，表明DEN-2的E蛋白质的C-末端可能有助于蛋白的膜保留信号。这种IFA染色模式在JE或WN构建体转化的细胞中没有观察到(Chang等，“单次肌内注射重组质粒诱导小鼠的保护性免疫并预防日本脑炎病毒”(″A singleintramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protectiveimmunity and prevents Japanese encephalitis in mice，″)J.Virol.744244-4252(2000)；Davis等，“西尼罗病毒重组DNA疫苗保护小鼠和马免受病毒的攻击，且体外表达非感染的重组抗原可用于酶联免疫吸附试验”(″West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horsefrom virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinantantigen that can be used in enzymelinked immunosorbent assays，″)J.Virol.754040-4047(2001))。因此，根据本发明教导所进行的观察，其它两种质粒pCB9D2-1J-4-3(SEQ ID NO44)和pCB8D2-2J-2-9-1(SEQ IDNO46)，其中对DNA序列进行适当的操作，将DEN-2的C末端的10％或20％分别用JE病毒E蛋白的相应区域取代。不同构建体在刺激免疫小鼠的可检测抗DEN-2 ELISA抗体中的相对效果显示在表13中。
这些结果与prM和E之间的交互作用能够影响粒子组装和分泌过程的模型相符。对此模型的支持发现在对壁虱性脑炎病毒的研究中，其假设prM和E的胞外域之间的交互作用参与prM介导的prM-E胞内运输，因而参与病毒类颗粒的分泌(Allison等，“壁虱性脑炎病毒包膜蛋白E的茎锚区功能元件的图谱”(″Mapping of functionalelements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virusenvelope protein E，″)J.Virol.735605-5612(1999))。
在本实施例中，用JE E蛋白质替换DEN-2 E蛋白的C-末端部分，相应于TBE H1pred替换TM2，导致DEN-2 prM蛋白质和嵌合E蛋白质的分泌。然而，相比之下，TM1和TM2在TBE中的替换，仅引起抗原分泌的较小改进。由pCBD2-14-6和pCB9D24-3质粒转化的COS-1表达的prM和E蛋白的主要部分保持膜结合(表13)。这些结果表明未确定的膜保留序列位于DEN-2E蛋白的C末端茎区。此C末端茎区用来自JE病毒的序列替换去除了此保留序列或使此保留序列无效。
其他人主张prM蛋白对于在prM-E成熟加工过程中维持E蛋白质的适当构象和分泌是必要的(Aberle等，“以不同物理形式用表达壁虱性脑炎病毒包膜蛋白E的构建体进行DNA免疫模式研究”(″A DNAimmunization model study with constructs expressing the tick-borneencephalitis virus envelope protein E in different physical forms，″)J.Immunol.1636756-6761(1999)，Allison等，“以可溶性或者颗粒形式合成和分泌重组壁虱性脑炎病毒蛋白E”(″Synthesis and secretion ofrecombinant tick-borne encephalitis virus protein E in soluble andparticulate form，″)J.Virol.695816-5820(1995))。此外，也已经证明E蛋白的外区域与prM互相作用。此相互作用已经被估计涉及墨累谷脑炎病毒中E的氨基酸残基200-327中的氨基酸序列(Guirakhoo等，“墨累谷脑炎病毒prM蛋白对病毒颗粒赋予了抗酸特征并且改变了E糖蛋白的R2结构域中表位的表达”(″The Murray Valley encephalitisvirus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters theexpression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein，″)Virology191921-931(1992))。
适当的prM和E相互作用以及E蛋白结构保持完整可能保持在所有3种Den-2构建体表达的蛋白中，至少在免疫反应所要求的范围内。此外，pCB8D2-2J-2-9-1中的C末端20％E的取代产生保持真正DEN-2E的395个氨基酸的蛋白。任意的这种修饰预计具有对E和prM-E相互作用的最小影响以及它们对嵌合E蛋白抗原特性的影响。由于用JE茎锚定序列替换DEN-2E的C-末端区域对MAb反应性没有影响(表10)，如此替换的DEN-2序列的保持仅仅在获得DEN-2特异性免疫应答中是任选的。
以前，已经显示一个编码壁虱性脑炎病毒prM和E蛋白的分泌亚病毒颗粒的质粒构建体，在抗体应答的程度和功能性以及在对病毒攻击的应答方面，优于其它编码C末端平截的分泌的可溶性E二聚物，不分泌的全长E，没有有效分泌的平截E的构建体(Aberle等，“以不同物理形式用表达壁虱性脑炎病毒包膜蛋白E构建体进行DNA免疫模式研究”(″A DNA immunization model study with constructsexpressing the tick-borne encephalitis virus envelope protein E in differentphysical forms，″)J.Immunol.1636756-6761(1999))。然而，在这里我们已经说明了DEN-2 DNA的疫苗效力和prM/M和E的分泌相关(表13)。但是，分泌的prM和E的形态和物理特征在本研究中没有说明。然而，由pCB8D2-2J-2-9-1构建体分泌的prM和E确实可能形成类病毒颗粒。相信在粒子表面呈递的多价保护性抗原提高了该构建体的疫苗效力。
早先开发DEN-2病毒DNA疫苗的尝试已经取得了不同程度的成功(Kochel等，“接种表达登革-2包膜基因的质粒引发小鼠的中和抗体”(″Inoculation of plasmids expressing the dengue-2 envelope geneelicit neutralizing antibodies in mice，″)Vaccine 15547-552(1997)；Konishi等，“表达登革2型病毒前膜和包膜基因的DNA疫苗诱导小鼠的中和抗体和记忆B细胞”(″A DNA vaccine expressing dengue type2 virus premembrane and envelope genes induces neutralizing antibodyand memory B cells in mice，″)Vaccine 181133-1139(2000))。为了提高有效性水平，已经采用不同的策略。例如，已采用含有pUC19质粒的免疫刺激CpG基元的共免疫，该质粒在疫苗系统中表达鼠源GM-CSF，或用溶酶体相关的膜保留序列替换C-末端的43个氨基酸提高了对DEN-2疫苗的抗体反应(Porter等，“登革2 DNA疫苗对小鼠的保护性功效以及CpG免疫刺激基元对于抗体应答的影响”(″Protectiveefficacy of a dengue 2 DNA vaccine in mice and the effect of CpGimmuno-stimulatory motifs on antibody responses，″)Arch.Virol.143997-1003(1998)；Raviprakash等，“通过引入溶菌酶相关膜蛋白序列和使用表达GM-CSF的质粒对于登革2型病毒DNA疫苗的协同中和抗体应答”(″Synergistic Neutralizing Antibody Response to aDengue Virus Type 2 DNA Vaccine by Incorporation of Lysosome-Associated Membrane Protein Sequences and Use of Plasmid ExpressingGM-CSF，″)Virology 29074-82(2001))。未甲基化的CpG基元直接激活巨噬细胞，自然杀伤细胞和淋巴细胞以分泌细胞因子和趋化因子，并支持通过Thl细胞因子介导的免疫应答的发生(Manders等，“DNA疫苗的免疫CpG基元和抗原呈递”(″Immunology of DNAvaccinesCpG motifs and antigen presentation，″)Inflamm.Res.49199-205(2000))。然而，CpG的包含可能偏离宿主细胞因子图形，从而有助于发生Th-1介导的器官特异性自身免疫失调和干扰免疫平衡(Smith等，“DNA疫苗的调节”(″The regulation of DNA vaccines，″)Curr.Opin.Biotech.12299-303(2001))。也有证据显示小鼠体内过高水平的细胞因子虽然提高了特定T-辅助细胞的应答，但是能够降低或者关闭其它因素在免疫应答中的应答，从而导致全面的免疫抑制或慢性炎症(Robertson等，“确保DNA疫苗的质量，安全性，和功效”(″Assuringthe quality，safety，and efficacy of DNA vaccines，″)Mol.Biotechnol.17143-149(2001))。因此，黄病毒DNA免疫的安全性和功效可以通过操作质粒表达以增强转录和翻译以及靶向prM和E蛋白的分泌以促进多蛋白的正确加工和装配而获益(Chang等，“黄病毒DNA疫苗现状及前景”(″Flavivirus DNA vaccinescurrent status and potential，″)Ann.NY Acad.Sci.951272-285(2001))。今后的发展可能集中于加强抗原呈递细胞和肌肉细胞对于DNA的吸收(Rodriguez等，“加强DNA免疫”(″Enhancing DNA immunization，″)Virology 268233-238(2000))。
表1在两个转化的细胞系中多种重组质粒瞬时表达JE prM和M蛋白
*用pCDNA3/CAT(阴性对照)，pCDJE2-7，pCBJE1-14，pC1BJES14，pCEJEm pREJE，或pRCJE转化不同的细胞系，然后细胞用胰蛋白酶作用48小时，并用JE病毒特异性HIAF通过间接免疫荧光抗体测定法(IFA)检测。数据表示为IFA阳性细胞的强度(1+到4+的范围)和百分比。采用pCDNA3/CAT转化细胞作为阴性对照。
表2.由带有JE病毒-反应抗体的COS-1细胞的pCDJE2-7稳定转化克隆(JE-4B)表达的蛋白的鉴定
表3.用pCDJE2-7或JE-VEX疫苗免疫的小鼠免疫反应的持久性
小鼠接种1或2，100μg/剂量的质粒DNA或1/5人剂量的JE-VAX疫苗。在第二次免疫之前收集血清用于测试。
*单个血清滴度。
表4.用各种不同的JEV疫苗接种后小鼠年龄依赖的血清阳性率百分数
表5.在3天大时用各种不同JEV疫苗接种后8周龄的小鼠免于对JEV攻击
表6.评价用JEV-核酸接种的雌性小鼠产生的母亲抗体保护它们的幼崽免受致死JEV脑炎感染的能力
小鼠用1或2，100μg剂量的质粒DNA肌内接种，或用2，1/5人剂量的JE-VAX疫苗皮下接种。接种9周后收集血清在与非免疫的雄性交配前用于PRNT试验。
1每一滴度的幸存者的数目/总数。
2JEV ELISA-抗体-阳性动物的数目(滴度≥1∶400)/幸存者的数目；在受攻击12周后收集血清用于试验。
表7.信号肽的特性及其在黄病毒DNA疫苗构建体中的疫苗潜力
信号肽概率a免疫方式/保护
质粒prM蛋白前的信号肽序列 SP AP C位点
pSLEI ？LDTINRRPSKKRGGTRSLLGLAALIGLASS/LQLLSTYQG(SEQ ID NO32) 0.7020.2920.352imx2/部分
pJME 0.9980.0000.778imx2/部分
MWLASLAVVIACAGA/MKLSNFQGK(SEQ ID NO33)
pCJEMEMNEGSIMWLASLAVVIACAGA/MKLSNFQGK(SEQ ID NO34)0.9850.0120.785imx2/100％
pCBJE1-14 MGRKQNKRGGNEGSIMWLASLAVVIACAGA/MKLSNFQGK(SEQ ID NO35) 0.7910.1990.623imx1/100％
pcDNA3prM-E MSKKRGGSETSVLMVIFMLIGFAAA/LKLSNFQGK(SEQ ID NO36) 0.7210.2770.622imx4/部分
ggx2-4/100％
pCBWN MGKRSAGSIMWLASLAVVIACAGA/VTLSNFQGK(SEQ ID NO37)0.9760.0240.526imx1/100％
p1012D2ME MNVLRGFRKEIGRMLNILNRRRRTAGMIIMLIPTVMA/FHLTTRNGE(SEQ ID NO38) 0.1650.7780.164idx2/无
SV-PE MVGLQKRGKRRSATDWMSWLLVITLLGMTLA/ATVRKERGD(SEQ ID NO39) 0.9430.0560.899im或ggx2/100％
pWRG7077-RSSE MGWLLVVVLLGVTLA/ATVRKERGD(SEQ ID NO40) 1.0000.0000.912ggx2/100％
pWRG7077-CEE MSWLLVITLLGMTIA/ATVRLERGD(SEQ ID NO41) 0.9990.0000.821ggx2/100％
a使用SignalP HMM程序计算信号肽(SP)。锚定肽(AP)及信号酶切割位点(C位点)的概率。
使用单字母氨基酸密码子，带电荷的氨基酸用下划线和粗体字进行强调。信号酶切割将SP和prM分开的位点以“/”表示。DNA疫苗通过肌内(im)，皮内(id)，或者基因枪(gg)的方法接种。
表8.用不同剂量的联合WN和JE病毒DNA疫苗免疫小鼠产生的中和抗体(Nt)反应
pCBWN+pCBJE1-14 pCB对照
每种质粒的剂量(μg)100+100 40+40 20+20 10+10 100
含有Nt的小鼠的百分数
WN病毒/JE病毒100/100 100/70070/0 60/00/0
PRNT90滴度的范围
WN病毒 1∶320-1∶801∶80-1∶201∶80-＜1∶10 1∶20-＜1∶10 ＜1∶10
JE病毒 1∶40-1∶10 1∶10-＜1∶10 ＜1∶10＜1∶10＜1∶10
每组10只三周龄雌性ICR远交小鼠通过i.m.注射单剂量所显示的联合质粒DNA。免疫12周后收集的血清样品通过噬斑减少中和试验(PRNT)进行检测。使用JE病毒(SA-14毒株)和西尼罗病毒
(NY-6480毒株)，基于90％噬斑减少的百分比分别计算抗JE和WN病毒的终点滴度。
表9.用来构建DEN-2病毒prM-E表达质粒的寡核苷酸，以及显示的嵌合DEN-2和JE E的接合区域。
100％ DEN-2 prM-E
D2KasI-438a 5TGTGCAGGCGCCTTCCATTTAACCACACGTAACG(SEQ ID NO48)
CD2NotI-2402 5TCGAGCGGCCGCTCAACTAATTAGGCCTGCACCATGACTC(SEQ ID
NO49)
90％DEN-2E & 10％ JEE
T75＇CTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO50)
CD2BstXI-2244 5＇ATAGATTGCTCCAAACACTTGGTGG(SEQ D NO51)
JE-2281 5＇ACTCCATAGGAAAAGCCGTTCACC(SEQ ID NO52)
CSP6 5＇GCGAGCTCTAGCATTTAGGTGACACTATAG(SEQ D NO53)
DEN-2←→JE
90-10接合区Leu His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr(SEQ ID NO55)
CTC CAC CAA GTG TTT GGT GGT GCC TTC AGA ACA(SEQ ID
NO54)
80％DEN-2E&20％ JEE
T7 5＇CTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO56)
CD2BsmBI-2097 5＇GAATTCGTCTCACTTCCTTTCTTAAACCAGTTGAGCTTC(SEQ ID
NO57)
JEBsmBI-2175 5＇GGAATTCGTCTCGGAAGCACGTGGGCAAGG(SEQ ID NO58)
CSP6 5＇GCGAGCTCTAGCATTTAGGTGACACTATAG 3＇(SEQ ID NO59)
DEN-2← →JE
80-20接合区Asn Trp Lys Lys Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala(SEQ ID
NO61)
AAC TGG TTT AAG AAA GGA AGC ACG CTG GGC GCC(SEQ ID
NO60)
a寡核苷酸中编码的限制性酶切位点用黑体，斜体，和下划线表示
表10.通过间接荧光抗体试验(IFA)测定的重组DEN-2质粒表达的DEN-2E糖蛋白表位的特性
抗体对照a质粒构建体a
MAb(表位)b 抗原结构域c PRNTdDEN-2 正常 pCBD2-14-6 pCB9D2-1J-4-3 pCB8D2-2J-2-9-1
感染的细胞细胞
4G2(A1) 2 +/- 4+-4+ 4+ 4+
4E5(A2) 2 是 3+-3-4+ 3-4+ 2-3+
1B7(A5) 2 是 3-4+ -4+ 4+ 2-3+
1B4C-2(C1) 1 否 3-4+(8000)-2-3+(4000) 2-3+(4000) 2-3+(8000)
2B3A-1(C3) 1 否 3-4+(≥3200) -3+(100) 2+(100) 2-3+(≥3200)
9A4D-1(C4) 1 否 3-4+ -2-3+(400)1-3+(400)3+(12800)
3H5(B2) 3 是 4+-4+ 4+ 4+
10A4D-2(B3) 3 是 2-3+ -3-4+ 3-4+ 2-3+
1A1D-2(B4) 3 是 4+-3-4+ 4+ 3-4+
9D12-6是 2-4+ -2-3+ 2-3+ 3-4+
2H2prM否 4+-4+ 3-4+ 3-4+
1A2A-1衣壳否 2-3+ -1+ 2+ 1-2+
aIFA底物为丙酮-固定的COS-1细胞，其用DEN-2 16681感染，或者不感染作为对照，或者用DEN-2重组质粒转化。
b基于和DEN-2 16681病毒的反应，单克隆抗体以预定的最佳稀释比使用。对于一些MAbs，用括号表示的终点滴度被报道，其它的只报道了定性的值，范围是从1+到4+，3-4+为阳性，2+模棱两可，以及1+为阴性。
c基于TBE病毒的E-糖蛋白的抗原结构域(Mandl等，“使用壁虱性脑炎病毒作为模型的黄病毒包膜蛋白E分子水平的抗原结构”(″Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level，using tick-bome encephalitisvirus as a model，″)J.Virol.63564-571(1989)；Rey等，“2A分辨率的来自壁虱性脑炎病毒的包膜糖蛋白”(″The envelopeglycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution，″)Nature 375291-298(1995)。
d腹水1∶100稀释比的噬斑减少中和活性，使用90％的噬斑减少终点，除了4G2和9D12-6，对其报道了50％的中和终点(Henchal等，“使用单克隆抗体表位分析登革-2病毒粒子表面上的抗原决定簇”(″Epitopic analysis of antigenicdeterminants on the surface of dengue-2 virions using monoclonal antibodies，″)Am.J.Trop.Med.Hyg.34162-169(1985)；Roehrig等，“牙买加登革-2病毒包膜糖蛋白的单克隆抗体图谱”(″Monoclonal antibody mapping of the envelopeglycoprotein ofthe dengue 2 virus，Jamaica，″)Virology 246317-328(1998))。
表11.通过抗原捕捉ELISA检测分泌型和膜结合型DEN-2重组蛋白
质粒 样品类型终点ELISA滴度
PCBD2-14-6 PEG-沉淀的培养液 a＜1∶10
PCBD2-14-6 PEG-沉淀、乙醇提取＜1∶20
的培养液b
PCBD2-14-6 疏水膜蛋白制备物c1∶160
pCB9D2-1J-4-3 PEG-沉淀的培养液a＜1∶10
pCB9D2-1J-4-3 PEG-沉淀、乙醇提取＜1∶20
的培养液b
pCB9D2-1J-4-3 疏水膜蛋白制备物c1∶80
pCB8D2-2J-2-9-1PEG-沉淀的培养液a1∶640
pCB8D2-2J-2-9-1PEG-沉淀、乙醇提取1∶80
的培养液b
pCB8D2-2J-2-9-1疏水膜蛋白制备物c1∶80
PEGFP PEG-沉淀的培养液a＜1∶10
PEGFP PEG-沉淀、乙醇提取＜1∶10
的培养液b
PEGFP 疏水膜蛋白制备物c＜1∶10
a来自质粒转化细胞的培养上清液用10％聚乙二醇(PEG)沉淀并重悬浮在1/100的原始体积中。
bPEG-沉淀的培养上清液用4％乙醇提取除去PEG，沉淀重悬浮在1/5提取的体积中。
c疏水膜部分按材料和方法所述进行制备。
表12.ICR小鼠中三种DEN-2重组质粒的免疫原性
aPRNT，噬斑减少中和试验，90％中和终点。
b小鼠用100μ的质粒DNA在第0周和第3周进行肌内免疫。
cELISA筛选采用1∶100和1∶400的稀释比血清。
dND，没做
e合并1，2，4，5，7，8。
f合并2，3，6-10。
g合并1-3，6-10。
表13.三种DEN-2重组质粒的特征概述
a间接荧光抗体测定(IFA)的染色特征，+或者-，分散或者球状。
b来自用重组质粒免疫小鼠的血清的抗-DEN-2 ELISA滴度。血清收集自免疫后9周(第0周和第3周)。显示了总小鼠数中滴度≥1∶100的小鼠数，包括合并血清样品的终点ELISA滴度。
c噬斑减少中和滴度(PRNT，减少90％)≥1∶10的小鼠数/小鼠总数。免疫9周后，收集血清。
d在具有中和抗体的7只小鼠中，有3只PRNT滴度＞1∶1000，3只滴度≥1∶100但＜1∶1000，1只滴度为1∶40。
序列表
<110>美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心
(The Government of the United States of America，as represented by the
Secretary，Department of Health and Human Services，c/o Centers for
Disease Control and Prevention)
张光正(Chang，Gwong-Jen J)
<120>预防黄病毒感染的核酸疫苗
(Nucleic Acid Vaccines for Prevention of Flavivirus Infection)
<130>SCT032688-47
<150>PCT/US/10764
<151>2002-04-04
<150>09/826,115
<151>2001-04-04
<150>09/701,536
<151>2000-11-29
<150>PCT/US99/12298
<151>1999-06-03
<150>60/087,908
<151>1998-06-04
<160>61
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(25)...(48)
<221>misc_特征
<222>1-48
<223>扩增引物14DV389
<400>1
cttggtacct ctagagccgc cgcc atg ggc aga aag caa aac aaa aga48
Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg
1 5
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>2
Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg
1 5
<210>3
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>misc_特征
<222>1-50
<223>扩增引物c14DV2453
<400>3
ttttcttttg cggccgctca aacttaagca tgcacattgg tcgctaagaa 50
<210>4
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(25)...(48)
<221>misc_特征
<222>(1)...(48)
<223>扩增引物YFDV389
<400>4
cttggtacct ctagagccgc cgcc atg cgt tcc cat gat gtt ctg act48
Met Arg Ser His Asp Val Leu Thr
1 5
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>5
Met Arg Ser His Asp Val Leu Thr
1 5
<210>6
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>misc_特征
<222>1-41
<223>扩增引物cYFDV2452
<400>6
ttttcttttg cggccgctca cgccccaact cctagagaaa c 41
<210>7
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(25)...(54)
<221>misc_特征
<222>1-54
<223>扩增引物SLEDV410
<400>7
cttggtacct ctagagccgc cgcc atg tct aaa aaa aga gga ggg acc aga51
Met Ser Lys Lys Arg Gly Gly Thr Arg
1 5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>8
Met Ser Lys Lys Arg Gly Gly Thr Arg
1 5
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>misc_特征
<222>1-38
<223>扩增引物cSLEDV2449
<400>9
ttttcttttg cggccgctta ggcttgcacg ctggttgc 38
<210>10
<211>7500
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(916)...(3009)
<221>misc_特征
<222>1-7500
<223>pCDJE 2-7
<400>10
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc 900
gagctcgccg ccgcc atg ggc aga aag caa aac aaa aga gga gga aat gaa 951
Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg Gly Gly Asn Glu
1 5 10
ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc ttg gca gtt gtc ata gct tgt gcg999
Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala
15 20 25
gga gcc atg aag ttg tcg aat ttc cag ggg aag ctt ttg atg acc atc1047
Gly Ala Met Lys Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met Thr Ile
30 35 40
aac aac acg gac att gca gac gtt atc gtg att ccc acc tca aaa gga 1095
Asn Asn Thr Asp Ile Ala Asp Val Ile Val Ile Pro Thr Ser Lys Gly
45 50 55 60
gag aac aga tgc tgg gtc cgg gca atc gac gtc ggc tac atg tgt gag 1143
Glu Asn Arg Cys Trp Val Arg Ala Ile Asp Val Gly Tyr Met Cys Glu
65 70 75
gac act atc acg tac gaa tgt cct aag ctt acc atg ggc aat gat cca 1191
Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Lys Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro
80 85 90
gag gat gtg gat tgc tgg tgt gac aac caa gaa gtc tac gtc caa tat 1239
Glu Asp Val Asp Cys Trp Cys Asp Asn Gln Glu Val Tyr Val Gln Tyr
95 100 105
gga cgg tgc acg cgg acc agg cat tcc aag cga agc agg aga tcc gtg 1287
Gly Arg Cys Thr Arg Thr Arg His Ser Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val
110 115 120
tcg gtc caa aca cat ggg gag agt tca cta gtg aat aaa aaa gag gct 1335
Ser Val Gln Thr His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys Glu Ala
125 130 135 140
tgg ctg gat tca acg aaa gcc aca cga tat ctc atg aaa act gag aac 1383
Trp Leu Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr Glu Asn
145 150 155
tgg atc ata agg aat cct ggc tat gct ttc ctg gcg gcg gta ctt ggc 1431
Trp Ile Ile Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Phe Leu Ala Ala Val Leu Gly
160 165 170
tgg atg ctt ggc agt aac aac ggt caa cgc gtg gta ttt acc atc ctc 1479
Trp Met Leu Gly Ser Asn Asn Gly Gln Arg Val Val Phe Thr Ile Leu
175 180 185
ctg ctg ttg gtc gct ccg gct tac agt ttt aat tgt ctg gga atg ggc 1527
Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly
190 195 200
aat cgt gac ttc ata gaa gga gcc agt gga gcc act tgg gtg gac ttg 1575
Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu
205 210 215 220
gtg ctg gaa gga gat agc tgc ttg aca atc atg gca aac gac aaa cca 1623
Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro
225 230 235
aca ttg gac gtc cgc atg att aac atc gaa gct agc caa ctt gct gag 1671
Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu
240 245 250
gtc aga agt tac tgc tat cat gct tca gtc act gac atc tcg acg gtg 1719
Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val
255 260 265
gct cgg tgc ccc acg act gga gaa gcc cac aac gag aag cga gct gat 1767
Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp
270 275 280
agt agc tat gtg tgc aaa caa ggc ttc act gac cgt ggg tgg ggc aac 1815
Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn
285 290 295 300
gga tgt gga ctt ttc ggg aag gga agc att gac aca tgt gca aaa ttc 1863
Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe
305 310 315
tcc tgc acc agt aaa gcg att ggg aga aca atc cag cca gaa aac atc 1911
Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile
320 325 330
aaa tac gaa gtt ggc att ttt gtg cat gga acc acc act tcg gaa aac 1959
Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn
335 340 345
cat ggg aat tat tca gcg caa gtt ggg gcg tcc cag gcg gca aag ttt 2007
His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe
350 355360
aca gta aca ccc aat gct cct tcg ata acc ctc aaa ctt ggt gac tac 2055
Thr Val Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr
365 370 375 380
gga gaa gtc aca ctg gac tgt gag cca agg agt gga ctg aac act gaa 2103
Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu
385 390 395
gcg ttt tac gtc atg acc gtg ggg tca aag tca ttt ctg gtc cat agg 2151
Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg
400 405 410
gag tgg ttt cat gac ctc gct ctc ccc tgg acg tcc cct tcg agc aca 2199
Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr
415 420 425
gcg tgg aga aac aga gaa ctc ctc atg gaa ttt gaa gag gcg cac gcc 2247
Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala
430 435 440
aca aaa cag tcc gtt gtt gct ctt ggg tca cag gaa gga ggc ctc cat 2295
Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His
445 450 455 460
cag gcg ttg gca gga gcc atc gtg gtg gag tac tca agc tca gtg aag 2343
Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys
465 470 475
tta aca tca ggc cac ctg aaa tgt agg ctg aaa atg gac aaa ctg gct 2391
Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala
480 485 490
ctg aaa ggc aca acc tat ggc atg tgt aca gaa aaa ttc tcg ttc gcg 2439
Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala
495 500 505
aaa aat ccg gcg gac act ggt cac gga aca gtt gtc att gaa ctc tcc 2487
Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser
510 515 520
tac tct ggg agt gat ggc ccc tgc aaa att ccg att gct tcc gtt gcg 2535
Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Ala Ser Val Ala
525 530 535 540
agc ctc aat gac atg acc ccc gtt ggg cgg ctg gtg aca gtg aac ccc 2583
Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro
545 550 555
ttc gtc gcg act tcc agt gcc agc tca aag gtg ctg gtc gag atg gaa 2631
Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Ser Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu
560 565 570
ccc ccc ttc gga gac tcc tac atc gta gtt gga agg gga gac aag cag 2679
Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln
575 580 585
atc aac cac cat tgg cac aaa gct gga agc acg ctg ggc aag gcc ttt 2727
Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe
590 595 600
tca aca act ttg aag gga gct caa aga ctg gca gcg ttg ggc gac aca 2775
Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr
605 610 615 620
gcc tgg gac ttt ggc tct att gga ggg gtc ttc aac tcc ata gga aaa 2823
Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys
625 630 635
gcc gtt cac caa gtg ttt ggt ggt gcc ttc aga aca ctc ttt ggg gga 2871
Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly
640 645 650
atg tct tgg atc aca caa ggg cta atg ggt gcc cta ctg ctc tgg atg 2919
Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met
655 660 665
ggc gtc aac gca cga gac cga tca att gct ttg gcc ttc tta gcc aca 2967
Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr
670 675 680
ggg ggt gtg ctc gtg ttc tta gcg acc aat gtg cat gct taa 3009
Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala *
685 690 695
ttagtttgag cggccgctcg agcatgcatc tagagggccc tattctatag tgtcacctaa 3069
atgctagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 3129
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 3189
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 3249
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 3309
tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg 3369
cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 3429
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 3489
tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc ggggcatccc tttagggttc cgatttagtg 3549
ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 3609
cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 3669
tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 3729
ggattttggg gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 3789
cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagg 3849
caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc 3909
caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 3969
tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 4029
cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc 4089
tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg 4149
gagcttgtat atccattttc ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga 4209
ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 4269
atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 4329
aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg 4389
acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 4449
acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 4509
tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 4569
ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 4629
agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 4689
atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg 4749
aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 4809
gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 4869
cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 4929
tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg 4989
agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc 5049
atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt 5109
ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca 5169
ccccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 5229
cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 5289
atcttatcat gtctgtatac cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata 5349
gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 5409
cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 5469
ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 5529
acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 5589
gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 5649
gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 5709
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 5769
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 5829
ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 5889
taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg 5949
ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 6009
ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 6069
aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 6129
tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 6189
agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 6249
ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 6309
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 6369
tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 6429
cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 6489
aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 6549
atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 6609
cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 6669
tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 6729
atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 6789
taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 6849
tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 6909
gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 6969
cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 7029
cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 7089
gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 7149
aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 7209
accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 7269
ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 7329
gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 7389
aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 7449
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg t 7500
<210>11
<211>697
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<223>pCDJE 2-7
<400>11
Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg Gly Gly Asn Glu Gly Ser Ile Met
1 5 10 15
Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Met Lys
20 25 30
Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met Thr Ile Asn Asn Thr Asp
35 40 45
Ile Ala Asp Val Ile Val Ile Pro Thr Ser Lys Gly Glu Asn Arg Cys
50 55 60
Trp Val Arg Ala Ile Asp Val Gly Tyr Met Cys Glu Asp Thr Ile Thr
65 70 75 80
Tyr Glu Cys Pro Lys Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro Glu Asp Val Asp
85 90 95
Cys Trp Cys Asp Asn Gln Glu Val Tyr Val Gln Tyr Gly Arg Cys Thr
100 105 110
Arg Thr Arg His Ser Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val Ser Val Gln Thr
115 120 125
His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys Glu Ala Trp Leu Asp Ser
130 135 140
Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr Glu Asn Trp Ile Ile Arg
145 150 155 160
Asn Pro Gly Tyr Ala Phe Leu Ala Ala Val Leu Gly Trp Met Leu Gly
165 170 175
Ser Asn Asn Gly Gln Arg Val Val Phe Thr Ile Leu Leu Leu Leu Val
180 185 190
Ala Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe
195 200 205
Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly
210 215 220
Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val
225 230 235 240
Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr
245 250 255
Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro
260 265 270
Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val
275 280 285
Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Ash Gly Cys Gly Leu
290 295 300
Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser
305 310 315 320
Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val
325 330 335
Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr
340 345 350
Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Val Thr Pro
355 360 365
Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr
370 375 380
Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val
385 390 395 400
Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His
405 410 415
Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn
420 425 430
Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln Ser
435 440 445
Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala
450 455 460
Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly
465 470 475 480
His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr
485 490 495
Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala
500 505 510
Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser
515 520 525
Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Ala Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp
530 535 540
Mer Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr
545 550 555 560
Ser Ser Ala Ser Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly
565 570 575
Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His
580 585 590
Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu
595 600 605
Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe
610 615 620
Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln
625 630 635 640
Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile
645 650 655
Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala
660 665 670
Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu
675 680 685
Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
690 695
<210>12
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>misc_特征
<222>1-46
<223>WN 466
<400>12
cttggtaccc gtctcggcgc cgtgaccctc tcgaacttcc agggca 46
<210>13
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>misc_特征
<222>1-43
<223>CWN2444
<400>13
agaggcactt gcacgtgcgg acttccgccg gcgaaaaaga aaa43
<210>14
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<223>JE信号
<400>14
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala
20
<210>15
<211>5308
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(911)...(2987)
<221>misc_特征
<222>(1)...(5308)
<223>pCBWN
<400>15
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggtttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt 660
gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 720
caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc 780
ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc 840
actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agcttggtac 900
cgccgccgcc atg ggc aag agg tcc gcc ggc tca atc atg tgg ctc gcg 949
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala
1 5 10
agc ttg gca gtt gtc ata gct tgt gca ggc gcc gtg acc ctc tcg aac997
Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Val Thr Leu Ser Asn
15 20 25
ttc cag ggc aag gtg atg atg acg gta aat gct act gac gtc aca gat1045
Phe Gln Gly Lys Val Met Met Thr Val Asn Ala Thr Asp Val Thr Asp
30 35 40 45
gtc atc acg att cca aca gct gct gga aag aac cta tgc att gtc aga1093
Val Ile Thr Ile Pro Thr Ala Ala Gly Lys Asn Leu Cys Ile Val Arg
50 55 60
gca atg gat gtg gga tac atg tgc gat gat act atc act tat gaa tgc1141
Ala Met Asp Val Gly Tyr Met Cys Asp Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys
65 70 75
cca gtg ctg tcg gct ggt aat gat cca gaa gac atc gac tgt tgg tgc1189
Pro Val Leu Ser Ala Gly Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys
80 85 90
aca aag tca gca gtc tac gtc agg tat gga aga tgc acc aag aca cgc 1237
Thr Lys Ser Ala Val Tyr Val Arg Tyr Gly Arg Cys Thr Lys Thr Arg
95 100 105
cac tca aga cgc agt cgg agg tca ctg aca gtg cag aca cac gga gaa 1285
His Ser Arg Arg Ser Arg Arg Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu
110 115 120 125
agc act cta gcg aac aag aag ggg gct tgg atg gac agc acc aag gcc 1333
Ser Thr Leu Ala Asn Lys Lys Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala
130 135 140
aca agg tat ttg gta aaa aca gaa tca tgg atc ttg agg aac cct gga 1381
Thr Arg Tyr Leu Val Lys Thr Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly
145 150 155
tat gcc ctg gtg gca gcc gtc att ggt tgg atg ctt ggg agc aac acc 1429
Tyr Ala Leu Val Ala Ala Val Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr
160 165 170
atg cag aga gtt gtg ttt gtc gtg cta ttg ctt ttg gtg gcc cca gct 1477
Met Gln Arg Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala
175 180 185
tac agc ttc aac tgc ctt gga atg agc aac aga gac ttc ttg gaa gga 1525
Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly
190 195 200 205
gtg tct gga gca aca tgg gtg gat ttg gtt ctc gaa ggc gac agc tgc 1573
Val Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys
210 215 220
gtg act atc atg tct aag gac aag cct acc atc gat gtg aag atg atg 1621
Val Thr Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met
225 230 235
aat atg gag gcg gcc aac ctg gca gag gtc cgc agt tat tgc tat ttg 1669
Asn Met Glu Ala Ala Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu
240 245 250
gct acc gtc agc gat ctc tcc acc aaa gct gcg tgc ccg acc atg gga 1717
Ala Thr Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly
255 260 265
gaa gct cac aat gac aaa cgt gct gac cca gct ttt gtg tgc aga caa 1765
Glu Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln
270 275 280 285
gga gtg gtg gac agg ggc tgg ggc aac ggc tgc gga cta ttt ggc aaa 1813
Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys
290 295 300
gga agc att gac aca tgc gcc aaa ttt gcc tgc tct acc aag gca ata 1861
Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile
305 310 315
gga aga acc atc ttg aaa gag aat atc aag tac gaa gtg gcc att ttt 1909
Gly Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe
320 325 330
gtc cat gga cca act act gtg gag tcg cac gga aac tac tcc aca cag 1957
Val His Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln
335 340 345
gtt gga gcc act cag gca ggg aga ttc agc atc act cct gcg gcg cct 2005
Val Gly Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro
350 355 360 365
tca tac aca cta aag ctt gga gaa tat gga gag gtg aca gtg gac tgt 2053
Ser Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys
370 375 380
gaa cca cgg tca ggg att gac acc aat gca tac tac gtg atg act gtt 2101
Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val
385 390 395
gga aca aag acg ttc ttg gtc cat cgt gag tgg ttc atg gac ctc aac 2149
Gly Thr Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn
400 405 410
ctc cct tgg agc agt gct gga agt act gtg tgg agg aac aga gag acg 2197
Leu Pro Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr
415 420 425
tta atg gag ttt gag gaa cca cac gcc acg aag cag tct gtg ata gca 2245
Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala
430 435 440 445
ttg ggc tca caa gag gga gct ctg cat caa gct ttg gct gga gcc att 2293
Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile
450 455 460
cct gtg gaa ttt tca agc aac act gtc aag ttg acg tcg ggt cat ttg 2341
Pro ValGlu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu
465 470 475
aag tgt aga gtg aag atg gaa aaa ttg cag ttg aag gga aca acc tat 2389
Lys Cys Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr
480 485 490
ggc gtc tgt tca aag gct ttc aag ttt ctt ggg act ccc gcg gac aca 2437
Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr
495 500 505
ggt cac ggc act gtg gtg ttg gaa ttg cag tac act ggc acg gat gga 2485
Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly
510 515 520 525
cct tgc aaa gtt cct atc tcg tca gtg gct tca ttg aac gac cta acg 2533
Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr
530 535 540
cca gtg ggc aga ttg gtc act gtc aac cct ttt gtt tca gtg gcc acg 2581
Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr
545 550 555
gcc aac gct aag gtc ctg att gaa ttg gaa cca ccc ttt gga gac tca 2629
Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser
560 565 570
tac ata gtg gtg ggc aga gga gaa caa cag atc aat cac cat tgg cac 2677
Tyr Ile Val ValGly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His
575580 585
aag tct gga agc agc att ggc aaa gcc ttt aca acc acc ctc aaa gga 2725
Lys Ser Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly
590 595 600 605
gcg cag aga cta gcc gct cta gga gac aca gct tgg gac ttt gga tca 2773
Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser
610 615 620
gtt gga ggg gtg ttc acc tca gtt ggg aag gct gtc cat caa gtg ttc2821
Val Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe
625 630 635
gga gga gca ttc cgc tca ctg ttc gga ggc atg tcc tgg ata acg caa 2869
Gly Gly Ala Phe Arg Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln
640 645 650
gga ttg ctg ggg gct ctc ctg ttg tgg atg ggc atc aat gct cgt gat 2917
Gly Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala Arg Asp
655 660 665
agg tcc ata gct ctc acg ttt ctc gca gtt gga gga gtt ctg ctc ttc 2965
Arg Ser Ile Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe
670 675 680 685
ctc tcc gtg aac gtg cac gcc t gaaggcggcc gctcgagcat gcatctagag 3017
Leu Ser Val Ash Val His Ala
690
ggccctattc tatagtgtca cctaaatgct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct 3077
tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 3137
gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 3197
tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 3257
aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc 3317
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 3377
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 3437
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 3497
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 3557
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 3617
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 3677
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 3737
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 3797
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 3857
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 3917
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 3977
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 4037
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 4097
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 4157
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 4217
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 4277
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 4337
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 4397
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 4457
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 4517
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 4577
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 4637
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 4697
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 4757
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 4817
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 4877
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 4937
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 4997
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 5057
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 5117
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 5177
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 5237
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 5297
cacctgacgt c 5308
<210>16
<211>692
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<223>pCBWN
<400>16
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Val Thr Leu Ser Asn Phe Gln Gly
20 25 30
Lys Val Met Met Thr Val Asn Ala Thr Asp Val Thr Asp Val Ile Thr
35 40 45
Ile Pro Thr Ala Ala Gly Lys Asn Leu Cys Ile Val Arg Ala Met Asp
50 55 60
Val Gly Tyr Met Cys Asp Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Val Leu
65 70 75 80
Ser Ala Gly Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Thr Lys Ser
85 90 95
Ala Val Tyr Val Arg Tyr Gly Arg Cys Thr Lys Thr Arg His Ser Arg
100 105 110
Arg Ser Arg Arg Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr Leu
115 120 125
Ala Asn Lys Lys Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr
130 135 140
Leu Val Lys Thr Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Leu
145 150 155 160
Val Ala Ala Val Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gln Arg
165 170 175
Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Phe
180 185 190
Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val Ser Gly
195 200 205
Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val Thr Ile
210 215 220
Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn Met Glu
225 230 235 240
Ala Ala Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala Thr Val
245 250 255
Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala His
260 265 270
Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly Val Val
275 280 285
Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile
290 295 300
Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly Arg Thr
305 310 315 320
Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His Gly
325 330 335
Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val Gly Ala
340 345 350
Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro Ser Tyr Thr
355 360 365
Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu Pro Arg
370 375 380
Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly Thr Lys
385 390 395 400
Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn Leu Pro Trp
405 410 415
Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu Met Glu
420 425 430
Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala Leu Gly Ser
435 440 445
Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro Val Glu
450 455 460
Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg
465 470 475 480
Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys
485 490 495
Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly
500 505 510
Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys
515 520 525
Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly
530 535 540
Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala
545 550 555 560
Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val
565 570 575
Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly
580 585 590
Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg
595 600 605
Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly
610 615 620
Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala
625 630 635 640
Phe Arg Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Leu
645 650 655
Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile
660 665 670
Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe Leu Ser Val
675 680 685
Asn Val His Ala
690
<210>17
<211>5334
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<22l>CDS
<222>(916)...(3007)
<221>misc_特征
<222>(1)...(5334)
<223>pCBJE 1-14
<400>17
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc900
tctagagccg ccgcc atg ggc aga aag caa aac aaa aga gga gga aat gaa 951
Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg Gly Gly Asn Glu
1 5 10
ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc ttg gca gtt gtc ata gct tgt gcg 999
Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala
15 20 25
gga gcc atg aag ttg tcg aat ttc cag ggg aag ctt ttg atg acc atc 1047
Gly Ala Met Lys Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met Thr Ile
30 35 40
aac aac acg gac att gca gac gtt atc gtg att ccc acc tca aaa gga 1095
Asn Asn Thr Asp Ile Ala Asp Val Ile Val Ile Pro Thr Ser Lys Gly
45 50 55 60
gag aac aga tgc tgg gtc cgg gca atc gac gtc ggc tac atg tgt gag 1143
Glu Asn Arg Cys Trp Val Arg Ala Ile Asp Val Gly Tyr Met Cys Glu
65 70 75
gac act atc acg tac gaa tgt cct aag ctt acc atg ggc aat gat cca 1191
Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Lys Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro
80 85 90
gag gat gtg gat tgc tgg tgt gac aac caa gaa gtc tac gtc caa tat 1239
Glu Asp Val Asp Cys Trp Cys Asp Asn Gln Glu Val Tyr Val Gln Tyr
95 100 105
gga cgg tgc acg cgg acc agg cat tcc aag cga agc agg aga tcc gtg 1287
Gly Arg Cys Thr Arg Thr Arg His Ser Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val
110 115 120
tcg gtc caa aca cat ggg gag agt tca cta gtg aat aaa aaa gag gct 1335
Ser Val Gln Thr His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys Glu Ala
125 130 135 140
tgg ctg gat tca acg aaa gcc aca cga tat ctc atg aaa act gag aac 1383
Trp Leu Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr Glu Asn
145 150 155
tgg atc ata agg aat cct ggc tat gct ttc ctg gcg gcg gta ctt ggc 1431
Trp Ile Ile Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Phe Leu Ala Ala Val Leu Gly
160 165 170
tgg atg ctt ggc agt aac aac ggt caa cgc gtg gta ttt acc atc ctc 1479
Trp Met Leu Gly Ser Asn Asn Gly Gln Arg Val Val Phe Thr Ile Leu
175 180 185
ctg ctg ttg gtc gct ccg gct tac agt ttt aat tgt ctg gga atg ggc 1527
Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly
190 195 200
aat cgt gac ttc ata gaa gga gcc agt gga gcc act tgg gtg gac ttg 1575
Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu
205 210 215 220
gtg ctg gaa gga gat agc tgc ttg aca atc atg gca aac gac aaa cca 1623
Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro
225 230 235
aca ttg gac gtc cgc atg att aac atc gaa gct agc caa ctt gct gag 1671
Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu
240 245 250
gtc aga agt tac tgc tat cat gct tca gtc act gac atc tcg acg gtg 1719
Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val
255 260 265
gct cgg tgc ccc acg act gga gaa gcc cac aac gag aag cga gct gat 1767
Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp
270 275 280
agt agc tat gtg tgc aaa caa ggc ttc act gac cgt ggg tgg ggc aac 1815
Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn
285 290 295 300
gga tgt gga ctt ttc ggg aag gga agc att gac aca tgt gca aaa ttc 1863
Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe
305 310 315
tcc tgc acc agt aaa gcg att ggg aga aca atc cag cca gaa aac atc 1911
Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile
320 325 330
aaa tac gaa gtt ggc att ttt gtg cat gga acc acc act tcg gaa aac 1959
Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn
335 340 345
cat ggg aat tat tca gcg caa gtt ggg gcg tcc cag gcg gca aag ttt 2007
His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe
350 355 360
aca gta aca ccc aat gct cct tcg ata acc ctc aaa ctt ggt gac tac 2055
Thr Val Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr
365 370 375 380
gga gaa gtc aca ctg gac tgt gag cca agg agt gga ctg aac act gaa 2103
Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu
385 390 395
gcg ttt tac gtc atg acc gtg ggg tca aag tca ttt ctg gtc cat agg 2151
Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg
400 405 410
gag tgg ttt cat gac ctc gct ctc ccc tgg acg tcc cct tcg agc aca 2199
Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr
415 420 425
gcg tgg aga aac aga gaa ctc ctc atg gaa ttt gaa gag gcg cac gcc 2247
Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala
430 435 440
aca aaa cag tcc gtt gtt gct ctt ggg tca cag gaa gga ggc ctc cat 2295
Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His
445 450 455 460
cag gcg ttg gca gga gcc atc gtg gtg gag tac tca agc tca gtg aag 2343
Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys
465 470 475
tta aca tca ggc cac ctg aaa tgt agg ctg aaa atg gac aaa ctg gct 2391
Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala
480 485 490
ctg aaa ggc aca acc tat ggc atg tgt aca gaa aaa ttc tcg ttc gcg2439
Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala
495 500 505
aaa aat ccg gcg gac act ggt cac gga aca gtt gtc att gaa ctc tcc 2487
Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser
510 515 520
tac tct ggg agt gat ggc ccc tgc aaa att ccg att gct tcc gtt gcg 2535
Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Ala Ser Val Ala
525 530 535 540
agc ctc aat gac atg acc ccc gtt ggg cgg ctg gtg aca gtg aac ccc 2583
Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro
545 550 555
ttc gtc gcg act tcc agt gcc agc tca aag gtg ctg gtc gag atg gaa 2631
Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Ser Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu
560 565 570
ccc ccc ttc gga gac tcc tac atc gta gtt gga agg gga gac aag cag 2679
Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile ValVal Gly Arg Gly Asp Lys Gln
575 580 585
atc aac cac cat tgg cac aaa gct gga agc acg ctg ggc aag gcc ttt 2727
Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe
590 595 600
tca aca act ttg aag gga gct caa aga ctg gca gcg ttg ggc gac aca 2775
Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr
605 610 615 620
gcc tgg gac ttt ggc tct att gga ggg gtc ttc aac tcc ata gga aaa 2823
Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys
625 630 635
gcc gtt cac caa gtg ttt ggt ggt gcc ttc aga aca ctc ttt ggg gga 2871
Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly
640 645 650
atg tct tgg atc aca caa ggg cta atg ggt gcc cta ctg ctc tgg atg 2919
Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met
655 660 665
ggc gtc aac gca cga gac cga tca att gct ttg gcc ttc tta gcc aca 2967
Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr
670 675 680
ggg ggt gtg ctc gtg ttc tta gcg acc aat gtg cat gct t aattagtttg3017
Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
685 690 695
agcggccgct cgagcatgca tctagagggc cctattctat agtgtcacct aaatgctaga 3077
gctcgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 3137
cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 3197
gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 3257
gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 3317
atggcttctg aggcggaaag aaccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3377
gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 3437
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 3497
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 3557
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 3617
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 3677
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 3737
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 3797
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 3857
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 3917
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 3977
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 4037
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 4097
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 4157
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 4217
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 4277
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 4337
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 4397
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 4457
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 4517
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 4577
agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 4637
acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 4697
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 4757
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 4817
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 4877
ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 4937
gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 4997
tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 5057
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 5117
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 5177
cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 5237
gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 5297
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgt 5334
<210>18
<211>697
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<223>pCBJE 1-14
<400>18
Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg Gly Gly Asn Glu Gly Ser Ile Met
1 5 10 15
Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Met Lys
20 25 30
Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met Thr Ile Asn Asn Thr Asp
35 40 45
Ile Ala Asp Val Ile Val Ile Pro Thr Ser Lys Gly Glu Asn Arg Cys
50 55 60
Trp Val Arg Ala Ile Asp Val Gly Tyr Met Cys Glu Asp Thr Ile Thr
65 70 75 80
Tyr Glu Cys Pro Lys Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro Glu Asp Val Asp
85 90 95
Cys Trp Cys Asp Asn Gln Glu Val Tyr Val Gln Tyr Gly Arg Cys Thr
100 105 110
Arg Thr Arg His Ser Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val Ser Val Gln Thr
115 120 125
His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys Glu Ala Trp Leu Asp Ser
130 135 140
Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr Glu Asn Trp Ile Ile Arg
145 150 155 160
Asn Pro Gly Tyr Ala Phe Leu Ala Ma Val Leu Gly Trp Met Leu Gly
165170 175
Ser Asn Asn Gly Gln Arg Val Val Phe Thr Ile Leu Leu Leu Leu Val
180 185 190
Ala Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe
195 200 205
Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly
210 215 220
Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val
225 230 235 240
Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr
245 250 255
Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro
260 265 270
Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val
275 280 285
Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu
290 295 300
Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser
305 310 315 320
Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val
325 330 335
Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr
340 345 350
Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Val Thr Pro
355 360 365
Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr
370 375 380
Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val
385 390 395 400
Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His
405 410 415
Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn
420 425 430
Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln Ser
435 440 445
Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala
450 455 460
Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly
465 470 475 480
His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr
485 490 495
Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala
500 505 510
Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser
515 520 525
Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Ala Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp
530 535 540
Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr
545 550 555 560
Ser Ser Ala Ser Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly
565 570 575
Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His
580 585 590
Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu
595 600 605
Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe
610 615 620
Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln
625 630 635 640
Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile
645 650 655
Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala
660 665 670
Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu
675 680 685
Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
690 695
<210>19
<211>5283
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(910)...(2965)
<400>19
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc900
gccgccgcc atg ggc aag agg tcc gcc ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc951
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser
1 5 10
ttg gca gtt gtc ata gct ggt aca agc gct acc acc atc cac cgg gac 999
Leu Ala Val Val Ile Ala Gly Thr Ser Ala Thr Thr Ile His Arg Asp
15 20 25 30
agg gaa gga tac atg gtt atg cgg gcc agt gga agg gac gct gca agc 1047
Arg Glu Gly Tyr Met Val Met Arg Ala Ser Gly Arg Asp Ala Ala Ser
35 40 45
cag gtc agg gta caa aac gga acg tgc gtc atc ctg gca aca gac atg 1095
Gln Val Arg Val Gln Asn Gly Thr Cys Val Ile Leu Ala Thr Asp Met
50 55 60
gga gag tgg tgt gaa gat tca atc acc tac tct tgc gtc acg att gac 1143
Gly Glu Trp Cys Glu Asp Ser Ile Thr Tyr Ser Cys Val Thr Ile Asp
65 70 75
cag gag gaa gaa ccc gtt gac gtg gac tgc ttc tgc cga ggt gtt gat 1191
Gln Glu Glu Glu Pro Val Asp Val Asp Cys Phe Cys Arg Gly Val Asp
80 85 90
agg gtt aag tta gag tat gga cgc tgt gga agg caa gct gga tct agg 1239
Arg Val Lys Leu Glu Tyr Gly Arg Cys Gly Arg Gln Ala Gly Ser Arg
95 100 105 110
ggg aaa agg tct gtg gtc att cca aca cat gca caa aaa gac atg gtc 1287
Gly Lys Arg Ser Val Val Ile Pro Thr His Ala Gln Lys Asp Met Val
115 120 125
ggg cga ggt cat gca tgg ctt aaa ggt gac aat att cga gat cat gtc 1335
Gly Arg Gly His Ala Trp Leu Lys Gly Asp Asn Ile Arg Asp His Val
130 135 140
acc cga gtc gag ggc tgg atg tgg aag aac aag ctt cta act gcc gcc 1383
Thr Arg Val Glu Gly Trp Met Trp Lys Asn Lys Leu Leu Thr Ala Ala
145 150 155
att gtg gcc ttg gct tgg ctc atg gtt gat agt tgg atg gcc aga gtg 1431
Ile Val Ala Leu Ala Trp Leu Met Val Asp Ser Trp Met Ala Arg Val
160 165 170
act gtc atc ctc ttg gcg ttg agt cta ggg cca gtg tac gcc acg agg 1479
Thr Val Ile Leu Leu Ala Leu Ser Leu Gly Pro Val Tyr Ala Thr Arg
175 180 185 190
tgc acg cat ctt gag aac aga gat ttt gtg aca gga act caa ggg acc 1527
Cys Thr His Leu Glu Asn Arg Asp Phe Val Thr Gly Thr Gln Gly Thr
195 200 205
acc aga gtg tcc cta gtt ttg gaa ctt gga ggc tgc gtg acc atc aca 1575
Thr Arg Val Ser Leu Val Leu Glu Leu Gly Gly Cys Val Thr Ile Thr
210 215 220
gct gag ggc aag cca tcc att gat gta tgg ctc gaa gac att ttt cag 1623
Ala Glu Gly Lys Pro Ser Ile Asp Val Trp Leu Glu Asp Ile Phe Gln
225 230 235
gaa agc ccg gct gaa acc aga gaa tac tgc ctg cac gcc aaa ttg acc 1671
Glu Ser Pro Ala Glu Thr Arg Glu Tyr Cys Leu His Ala Lys Leu Thr
240 245 250
aac aca aaa gtg gag gct cgc tgt cca acc act gga ccg gcg aca ctt 1719
Asn Thr Lys Val Glu Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Pro Ala Thr Leu
255 260 265 270
ccg gag gag cat cag gct aat atg gtg tgc aag aga gac caa agc gac 1767
Pro Glu Glu His Gln Ala Asn Met Val Cys Lys Arg Asp Gln Ser Asp
275 280 285
cgt gga tgg gga aac cac tgc ggg ttt ttt ggg aag ggc agt ata gtg 1815
Arg Gly Trp Gly Asn His Cys Gly Phe Phe Gly Lys Gly Ser Ile Val
290 295 300
gct tgt gca aag ttt gaa tgc gag gaa gca aaa aaa gct gtg ggc cac 1863
Ala Cys Ala Lys Phe Glu Cys Glu Glu Ala Lys Lys Ala Val Gly His
305 310 315
gtc tat gac tcc aca aag atc acg tat gtt gtc aag gtt gag ccc cac 1911
Val Tyr Asp Ser Thr Lys Ile Thr Tyr Val Val Lys Val Glu Pro His
320 325 330
aca ggg gat tac ttg gct gca aat gag acc aat tca aac agg aaa tca 1959
Thr Gly Asp Tyr Leu Ala Ala Asn Glu Thr Asn Ser Asn Arg Lys Ser
335 340 345 350
gca cag ttt acg gtg gca tcc gag aaa gtg atc ctg cgg ctc ggc gac 2007
Ala Gln Phe Thr Val Ala Ser Glu Lys Val Ile Leu Arg Leu Gly Asp
355 360 365
tat gga gat gtg tcg ctg acg tgt aaa gtg gca agt ggg att gat gtc 2055
Tyr Gly Asp Val Ser Leu Thr Cys Lys Val Ala Ser Gly Ile Asp Val
370 375 380
gcc caa act gtg gtg atg tca ctc gac agc agc aag gac cac ctg cct 2103
Ala Gln Thr Val Val Met Ser Leu Asp Ser Ser Lys Asp His Leu Pro
385 390 395
tct gca tgg caa gtg cac cgt gac tgg ttt gag gac ttg gcg ctg ccc 2151
Ser Ala Trp Gln Val His Arg Asp Trp Phe Glu Asp Leu Ala Leu Pro
400 405 410
tgg aaa cac aag gac aac caa gat tgg aac agt gtg gag aaa ctt gtg 2199
Trp Lys His Lys Asp Asn Gln Asp Trp Asn Ser Val Glu Lys Leu Val
415 420 425 430
gaa ttt gga cca cca cat gct gtg aaa atg gat gtt ttc aat ctg ggg 2247
Glu Phe Gly Pro Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Phe Asn Leu Gly
435 440 445
gac cag acg gct gtg ctg ctc aaa tca ctg gca gga gtt ccg ctg gcc 2295
Asp Gln Thr Ala Val Leu Leu Lys Ser Leu Ala Gly Val Pro Leu Ala
450 455 460
agt gtg gag ggc cag aaa tac cac ctg aaa agc ggc cat gtt act tgt 2343
Ser Val Glu Gly Gln Lys Tyr His Leu Lys Ser Gly His Val Thr Cys
465 470 475
gat gtg gga ctg gaa aag ctg aaa ctg aaa ggc aca acc tac tcc atg 2391
Asp Val Gly Leu Glu Lys Leu Lys Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Ser Met
480 485 490
tgt gac aaa gca aag ttc aaa tgg aag aga gtt cct gtg gac agc ggc 2439
Cys Asp Lys Ala Lys Phe Lys Trp Lys Arg Val Pro Val Asp Ser Gly
495 500 505 510
cat gac aca gta gtc atg gag gta tca tac aca gga agc gac aag cca 2487
His Asp Thr Val Val Met Glu Val Ser Tyr Thr Gly Ser Asp Lys Pro
515 520 525
tgt cgg atc ccg gtg cgg gct gtg gca cat ggt gtc cca gcg gtt aat 2535
Cys Arg Ile Pro Val Arg Ala Val Ala His Gly Val Pro Ala Val Asn
530 535 540
gta gcc atg ctc ata acc ccc aat cca acc att gaa aca aat ggt ggc 2583
Val Ala Met Leu Ile Thr Pro Asn Pro Thr Ile Glu Thr Asn Gly Gly
545 550 555
gga ttc ata gaa atg cag ctg cca cca ggg gat aac atc atc tat gtg 2631
Gly Phe Ile Glu Met Gln Leu Pro Pro Gly Asp Asn Ile Ile Tyr Val
560 565 570
gga gac ctt agc cag cag tgg ttt cag aaa ggc agt acc att ggt aga 2679
Gly Asp Leu Ser Gln Gln Trp Phe Gln Lys Gly Ser Thr Ile Gly Arg
575 580 585 590
atg ttt gaa aaa acc cgc agg gga ttg gaa agg ctc tct gtg gtt gga 2727
Met Phe Glu Lys Thr Arg Arg Gly Leu Glu Arg Leu Ser Val Val Gly
595 600 605
gaa cat gca tgg gac ttt ggc tca gta ggc ggg gta ctg tct tct gtg 2775
Glu His Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Val Leu Ser Ser Val
610 615 620
ggg aag gca atc cac acg gtg ctg ggg gga gct ttc aac acc ctt ttt 2823
Gly Lys Ala Ile His Thr Val Leu Gly Gly Ala Phe Asn Thr Leu Phe
625 630 635
ggg ggg gtt gga ttc atc cct aag atg ctg ctg ggg gtt gct ctg gtc 2871
Gly Gly Val Gly Phe Ile Pro Lys Met Leu Leu Gly Val Ala Leu Val
640 645 650
tgg ttg gga cta aat gcc agg aat cca acg atg tcc atg acg ttt ctt 2919
Trp Leu Gly Leu Asn Ala Arg Asn Pro Thr Met Ser Met Thr Phe Leu
655 660 665 670
gct gtg ggg gct ttg aca ctg atg atg aca atg gga gtt ggg gca t 2965
Ala Val Gly Ala Leu Thr Leu Met Met Thr Met Gly Val Gly Ala
675 680 685
gagcggccgc tcgagcatgc atctagaggg ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag 3025
agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 3085
ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 3145
ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 3205
ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 3265
tatggcttct gaggcggaaa gaacagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3325
gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 3385
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 3445
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 3505
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 3565
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 3625
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 3685
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca 3745
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 3805
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 3865
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 3925
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 3985
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 4045
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 4105
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 4165
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 4225
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 4285
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 4345
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 4405
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 4465
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 4525
agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 4585
acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 4645
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 4705
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 4765
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 4825
ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 4885
gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 4945
tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 5005
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 5065
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 5125
cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 5185
gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 5245
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 5283
<210>20
<211>681
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>20
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Gly Thr Ser Ala Val Thr Leu Val Arg Lys Asn Arg
20 25 30
Trp Leu Leu Leu Asn Val Thr Ser Glu Asp Leu Gly Lys Thr Phe Ser
35 40 45
Val Gly Thr Gly Asn Cys Thr Thr Asn Ile Leu Glu Ala Lys Tyr Trp
50 55 60
Cys Pro Asp Ser Met Glu Tyr Asn Cys Pro Asn Leu Ser Pro Arg Glu
65 70 75 80
Glu Pro Asp Asp Ile Asp Cys Trp Cys Tyr Gly Val Glu Asn Val Arg
85 90 95
Val Ala Tyr Gly Lys Cys Asp Ser Ala Gly Arg Ser Arg Arg Ser Arg
100 105 110
Arg Ala Ile Asp Leu Pro Thr His Glu Asn His Gly Leu Lys Thr Arg
115 120 125
Gln Glu Lys Trp Met Thr Gly Arg Met Gly Glu Arg Gln Leu Gln Lys
130 135 140
Ile Glu Arg Trp Phe Val Arg Asn Pro Phe Phe Ala Val Thr Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ile Ala Tyr Leu Val Gly Ser Asn Met Thr Gln Arg Val Val Ile
165 170 175
Ala Leu Leu Val Leu Ala Val Gly Pro Ala Tyr Ser Ala His Cys Ile
180 185 190
Gly Ile Thr Asp Arg Asp Phe Ile Glu Gly Val His Gly Gly Thr Trp
195 200 205
Val Ser Ala Thr Leu Glu Gln Asp Lys Cys Val Thr Val Met Ala Pro
210 215 220
Asp Lys Pro Ser Leu Asp Ile Ser Leu Glu Thr Val Ala Ile Asp Arg
225 230 235 240
Pro Ala Glu Val Arg Lys Val Cys Tyr Asn Ala Val Leu Thr His Val
245 250 255
Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr Gly Glu Ala His Leu Ala Glu
260 265 270
Glu Asn Glu Gly Asp Asn Ala Cys Lys Arg Thr Tyr Ser Asp Arg Gly
275 280 285
Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Val Ala Cys
290 295 300
Ala Lys Phe Thr Cys Ala Lys Ser Met Ser Leu Phe Glu Val Asp Gln
305 310 315 320
Thr Lys Ile Gln Tyr Val Ile Arg Ala Gln Leu His Val Gly Ala Lys
325 330 335
Gln Glu Asn Trp Thr Thr Asp Ile Lys Thr Leu Lys Phe Asp Ala Leu
340 345 350
Ser Gly Ser Gln Glu Val Glu Phe Ile Gly Tyr Gly Lys Ala Thr Leu
355 360 365
Glu Cys Gln Val Gln Thr Ala Val Asp Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ala
370 375 380
Glu Met Glu Thr Glu Ser Trp Ile Val Asp Arg Gln Trp Ala Gln Asp
385 390 395 400
Leu Thr Leu Pro Trp Gln Ser Gly Ser Gly Gly Val Trp Arg Glu Met
405 410 415
His His Leu Val Glu Phe Glu Pro Pro His Ala Ala Thr Ile Arg Val
420 425430
Leu Ala Leu Gly Asn Gln Glu Gly Ser Leu Lys Thr Ala Leu Thr Gly
435 440 445
Ala Met Arg Val Thr Lys Asp Thr Asn Asp Asn Asn Leu Tyr Lys Leu
450 455 460
His Gly Gly His Val Ser Cys Arg Val Lys Leu Ser Ala Leu Thr Leu
465 470 475 480
Lys Gly Thr Ser Tyr Lys Ile Cys Thr Asp Lys Met Phe Phe Val Lys
485 490 495
Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met Gln Val Lys Val
500 505 510
Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile Val Ala Asp Asp Leu
515 520 525
Thr Ala Ala Ile Asn Lys Gly Ile Leu Val Thr Val Asn Pro Ile Ala
530 535 540
Ser Thr Asn Asp Asp Glu Val Leu Ile Glu Val Asn Pro Pro Phe Gly
545 550 555 560
Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly Arg Gly Asp Ser Arg Leu Thr Tyr Gln
565 570 575
Trp His Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met
580 585 590
Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe
595 600 605
Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr
610 615 620
Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile
625 630 635 640
Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr
645 650 655
Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met
660 665 670
Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala
675 680
<210>21
<211>5304
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(910)...(2986)
<400>21
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc 900
gccgccgcc atg ggc aag agg tcc gcc ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc 951
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser
1 5 10
ttg gca gtt gtc ata gct ggt aca agc gct ttg cag tta tca acc tat 999
Leu Ala Val Val Ile Ala Gly Thr Ser Ala Leu Gln Leu Ser Thr Tyr
15 20 25 30
cag ggg aaa gtg tta atg tca atc aac aag act gac gct caa agc gcc1047
Gln Gly Lys Val Leu Met Ser Ile Asn Lys Thr Asp Ala Gln Ser Ala
35 40 45
ata aac att cct agt gcc aac gga gca aac act tgc att gtg agg gct 1095
Ile Asn Ile Pro Ser Ala Asn Gly Ala Asn Thr Cys Ile Val Arg Ala
50 55 60
cta gat gtg ggg gtc atg tgc aaa gat gac atc aca tac ctg tgc cca 1143
Leu Asp Val Gly Val Met Cys Lys Asp Asp Ile Thr Tyr Leu Cys Pro
65 70 75
gtg ctt tca gcg gga aat gat ccc gag gac att gac tgt tgg tgt gac 1191
Val Leu Ser Ala Gly Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asp
80 85 90
gtc gaa gag gtg tgg gtg cac tac ggc aga tgc acg cgc atg gga cat 1239
Val Glu Glu Val Trp Val His Tyr Gly Arg Cys Thr Arg Met Gly His
95 100 105 110
tcg agg cgt agc cga cgg tca atc tct gtg cag cat cat gga gat tcc 1287
Ser Arg Arg Ser Arg Arg Ser Ile Ser Val Gln His His Gly Asp Ser
115 120 125
aca ctg gca aca aag aac acg cca tgg ttg gac acc gtg aaa acc acc 1335
Thr Leu Ala Thr Lys Asn Thr Pro Trp Leu Asp Thr Val Lys Thr Thr
130 135 140
aaa tac ttg aca aaa gta gaa aac tgg gtt ttg cgc aat cct gga tat 1383
Lys Tyr Leu Thr Lys Val Glu Asn Trp Val Leu Arg Asn Pro Gly Tyr
145 150 155
gcc cta gtt gcg ctg gcg att gga tgg atg ctc ggt agc aac aac aca 1431
Ala Leu Val Ala Leu Ala Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Asn Thr
160 165 170
cag aga gtg gtt ttt gtg atc atg ctg atg ctg att gct ccg gca tac 1479
Gln Arg Val Val Phe Val Ile Met Leu Met Leu Ile Ala Pro Ala Tyr
175 180 185 190
agc ttc aac tgt ctg gga aca tca aac agg gac ttt gtc gag gga gcc 1527
Ser Phe Asn Cys Leu Gly Thr Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Ala
195 200 205
agt ggg gca aca tgg att gac ttg gta ctt gaa ggg gga agc tgt gtc 1575
Ser Gly Ala Thr Trp Ile Asp Leu Val Leu Glu Gly Gly Ser Cys Val
210 215 220
aca gtg atg gca cca gag aaa cca aca ctg gac ttc aaa gtg atg aag 1623
Thr Val Met Ala Pro Glu Lys Pro Thr Leu Asp Phe Lys Val Met Lys
225 230 235
atg gag gct acc gag tta gcc act gtg cgt gag tat tgt tac gaa gca 1671
Met Glu Ala Thr Glu Leu Ala Thr Val Arg Glu Tyr Cys Tyr Glu Ala
240 245 250
acc ttg gac acg ctg tca aca gtg gca agg tgc ccc aca aca gga gaa 1719
Thr Leu Asp Thr Leu Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu
255 260 265 270
gct cac aac acc aaa agg agt gac cca aca ttt gtc tgc aaa aga gat 1767
Ala His Asn Thr Lys Arg Ser Asp Pro Thr Phe Val Cys Lys Arg Asp
275 280 285
gtt gtg gac cgc gga tgg ggt aac gga tgt ggt ctg ttt gga aaa ggg 1815
Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly
290 295 300
agc att gac aca tgc gct aag ttc aca tgc aaa aac aag gca aca ggg 1863
Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Thr Cys Lys Asn Lys Ala Thr Gly
305 310 315
aag acg atc ttg aga gaa aac atc aag tat gag gtt gca atc ttt gtg 1911
Lys Thr Ile Leu Arg Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val
320 325 330
cat ggt tca acg gac tct acg tca cat ggc aat tac tct gag cag att 1959
His Gly Ser Thr Asp Ser Thr Ser His Gly Asn Tyr Ser Glu Gln Ile
335 340 345 350
gga aaa aac caa gcg gct aga ttc acc ata agc ccg caa gca ccg tcc 2007
Gly Lys Asn Gln Ala Ala Arg Phe Thr Ile Ser Pro Gln Ala Pro Ser
355 360 365
ttt acg gcc aac atg ggc gag tat gga aca gtt acc att gat tgt gaa 2055
Phe Thr Ala Asn Met Gly Glu Tyr Gly Thr Val Thr Ile Asp Cys Glu
370 375 380
gca aga tca gga atc aac acg gag gat tat tat gtt ttc act gtc aag 2103
Ala Arg Ser Gly Ile Asn Thr Glu Asp Tyr Tyr Val Phe Thr Val Lys
385 390 395
gag aag tca tgg cta gtg aac agg gac tgg ttt cac gac ttg aac ctt 2151
Glu Lys Ser Trp Leu Val Asn Arg Asp Trp Phe His Asp Leu Asn Leu
400 405 410
cca tgg acg agc cct gcc aca act gat tgg cgc aac aga gaa aca ctg 2199
Pro Trp Thr Ser Pro Ala Thr Thr Asp Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu
415 420 425 430
gtg gaa ttt gag gaa ccg cat gcc acc aag caa act gta gta gcc cta 2247
Val Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Thr Val Val Ala Leu
435 440 445
gga tcg caa gaa ggt gcc ctg cac aca gca ttg gct gga gcc att cca 2295
Gly Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro
450 455 460
gcc act gtt agc agc tca acc cta acc ttg caa tca ggg cat ttg aaa 2343
Ala Thr Val Ser Ser Ser Thr Leu Thr Leu Gln Ser Gly His Leu Lys
465 470 475
tgc aga gct aag ctt gac aag gtc aaa atc aag gga acg aca tat ggc 2391
Cys Arg Ala Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Lys Gly Thr Thr Tyr Gly
480 485 490
atg tgt gac tct gcc ttc acc ttc agc aag aac cca act gac aca ggg 2439
Met Cys Asp Ser Ala Phe Thr Phe Ser Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly
495 500 505 510
cac ggg aca gtg att gtg gaa ctg cag tat act gga agc aac gga ccc 2487
His Gly Thr Val Ile Val Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Ser Asn Gly Pro
515 520 525
tgc cga gtt ccc atc tcc gtg act gca aac ctc atg gat ttg aca ccg 2535
Cys Arg Val Pro Ile Ser Val Thr Ala Asn Leu Met Asp Leu Thr Pro
530 535 540
gtt gga aga ttg gtc acg gtc aat ccc ttt ata agc aca ggg gga gcg 2583
Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Ile Ser Thr Gly Gly Ala
545 550 555
aac aac aag gtc atg atc gaa gtt gaa cca ccc ttt ggc gat tct tac 2631
Asn Asn Lys Val Met Ile Glu Val Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr
560 565 570
atc gtc gtc gga aga ggc acc acc cag att aac tac cac tgg cac aaa 2679
Ile Val Val Gly Arg Gly Thr Thr Gln Ile Asn Tyr His Trp His Lys
575 580 585 590
gag gga agc agc att ggg aag gct ttg gcg acc aca tgg aaa gga gcc2727
Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Leu Ala Thr Thr Trp Lys Gly Ala
595 600 605
caa cgg cta gcc gtc tta ggg gac aca gcg tgg gac ttt gga tct att 2775
Gln Arg Leu Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile
610 615 620
gga gga gtt ttc aat tca att ggc aaa gct gtc cac caa gtt ttc gga 2823
Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly
625 630 635
gga gcg ttc agg act ctg ttc ggg gga atg tcc tgg atc aca cag ggg 2871
Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly
640 645 650
cta ctt gga gct ctt ctc ctg tgg atg ggg ttg cag gcc cgc gac agg 2919
Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Leu Gln Ala Arg Asp Arg
655 660 665 670
agc atc tcg ctg act cta ctg gct gtc gga ggg att ctc atc ttt ctg 2967
Ser Ile Ser Leu Thr Leu Leu Ala Va lGly Gly Ile Leu Ile Phe Leu
675 680 685
gca acc agc gtg caa gcc t gagcggccgc tcgagcatgc atctagaggg 3016
Ala Thr Ser Val Gln Ala
690
ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc 3076
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 3136
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 3196
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 3256
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaacagctgc 3316
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 3376
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 3436
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 3496
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 3556
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 3616
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 3676
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 3736
tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 3796
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 3856
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 3916
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 3976
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 4036
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 4096
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 4156
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 4216
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 4276
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 4336
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 4396
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 4456
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 4516
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 4576
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 4636
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 4696
ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 4756
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 4816
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 4876
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 4936
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 4996
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 5056
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 5116
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 5176
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 5236
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 5296
ctgacgtc 5304
<210>22
<211>692
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>22
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Gly Thr Ser Ala Leu Gln Leu Ser Thr Tyr Gln Gly
20 25 30
Lys Val Leu Met Ser Ile Asn Lys Thr Asp Ala Gln Ser Ala Ile Asn
35 40 45
Ile Pro Ser Ala Asn Gly Ala Asn Thr Cys Ile Val Arg Ala Leu Asp
50 55 60
Val Gly Val Met Cys Lys Asp Asp Ile Thr Tyr Leu Cys Pro Val Leu
65 70 75 80
Ser Ala Gly Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asp Val Glu
85 90 95
Glu Val Trp Val His Tyr Gly Arg Cys Thr Arg Met Gly His Ser Arg
100 105 110
Arg Ser Arg Arg Ser Ile Ser Val Gln His His Gly Asp Ser Thr Leu
115 120 125
Ala Thr Lys Asn Thr Pro Trp Leu Asp Thr Val Lys Thr Thr Lys Tyr
130 135 140
Leu Thr Lys Val Glu Asn Trp Val Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Leu
145 150 155 160
Val Ala Leu Ala Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Asn Thr Gln Arg
165 170 175
Val Val Phe Val Ile Met Leu Met Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser Phe
180 185 190
Asn Cys Leu Gly Thr Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Ala Ser Gly
195 200 205
Ala Thr Trp Ile Asp Leu Val Leu Glu Gly Gly Ser Cys Val Thr Val
210 215 220
Met Ala Pro Glu Lys Pro Thr Leu Asp Phe Lys Val Met Lys Met Glu
225 230 235 240
Ala Thr Glu Leu Ala Thr Val Arg Glu Tyr Cys Tyr Glu Ala Thr Leu
245 250 255
Asp Thr Leu Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His
260 265 270
Asn Thr Lys Arg Ser Asp Pro Thr Phe Val Cys Lys Arg Asp Val Val
275 280 285
Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile
290 295 300
Asp Thr Cys Ala Lys Phe Thr Cys Lys Asn Lys Ala Thr Gly Lys Thr
305 310 315 320
Ile Leu Arg Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His Gly
325 330 335
Ser Thr Asp Ser Thr Ser His Gly Asn Tyr Ser Glu Gln Ile Gly Lys
340 345 350
Asn Gln Ala Ala Arg Phe Thr Ile Ser Pro Gln Ala Pro Ser Phe Thr
355 360 365
Ala Asn Met Gly Glu Tyr Gly Thr Val Thr Ile Asp Cys Glu Ala Arg
370 375 380
Ser Gly Ile Asn Thr Glu Asp Tyr Tyr Val Phe Thr Val Lys Glu Lys
385 390 395 400
Ser Trp Leu Val Asn Arg Asp Trp Phe His Asp Leu Asn Leu Pro Trp
405 410 415
Thr Ser Pro Ala Thr Thr Asp Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu Val Glu
420 425 430
Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Thr Val Val Ala Leu Gly Ser
435 440 445
Gln Glu Gly Ala Leu His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro Ala Thr
450 455 460
Val Ser Ser Ser Thr Leu Thr Leu Gln Ser Gly His Leu Lys Cys Arg
465 470 475 480
Ala Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys
485 490 495
Asp Ser Ala Phe Thr Phe Ser Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly
500 505 510
Thr Val Ile Val Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Ser Asn Gly Pro Cys Arg
515 520 525
Val Pro Ile Ser Val Thr Ala Asn Leu Met Asp Leu Thr Pro Val Gly
530 535 540
Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Ile Ser Thr Gly Gly Ala Asn Asn
545 550 555 560
Lys Val Met Ile Glu Val Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val
565 570 575
Val Gly Arg Gly Thr Thr Gln Ile Asn Tyr His Trp His Lys Glu Gly
580 585 590
Ser Ser Ile Gly Lys Ala Leu Ala Thr Thr Trp Lys Gly Ala Gln Arg
595 600 605
Leu Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly
610 615 620
Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala
625 630 635 640
Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Leu
645 650 655
Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Leu Gln Ala Arg Asp Arg Ser Ile
660 665 670
Ser Leu Thr Leu Leu Ala Val Gly Gly Ile Leu Ile Phe Leu Ala Thr
675 680 685
Ser Val Gln Ala
690
<210>23
<211>5271
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(910)...(2953)
<400>23
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc 900
gccgccgcc atg ggc aag agg tcc gcc ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc 951
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser
1 5 10
ttg gca gtt gtc ata gct ggt aca agc gct gtg acc ttg gtg cgg aaa999
Leu Ala Val Val Ile Ala Gly Thr Ser Ala Val Thr Leu Val Arg Lys
15 20 25 30
aac aga tgg ttg ctc cta aat gtg aca tct gag gac ctc ggg aaa aca1047
Asn Arg Trp Leu Leu Leu Asn Val Thr Ser Glu Asp Leu Gly Lys Thr
35 40 45
ttc tct gtg ggc aca ggc aac tgc aca aca aac att ttg gaa gcc aag1095
Phe Ser Val Gly Thr Gly Asn Cys Thr Thr Asn Ile Leu Glu Ala Lys
50 55 60
tac tgg tgc cca gac tca atg gaa tac aac tgt ccc aat ctc agt cca1143
Tyr Trp Cys Pro Asp Ser Met Glu Tyr Asn Cys Pro Asn Leu Ser Pro
65 70 75
aga gag gag cca gat gac att gat tgc tgg tgc tat ggg gtg gaa aac 1191
Arg Glu Glu Pro Asp Asp Ile Asp Cys Trp Cys Tyr Gly Val Glu Asn
80 85 90
gtt aga gtc gca tat ggt aag tgt gac tca gca ggc agg tct agg agg 1239
Val Arg Val Ala Tyr Gly Lys Cys Asp Set Ala Gly Arg Ser Arg Arg
95 100 105 110
tca aga agg gcc att gac ttg cct acg cat gaa aac cat ggt ttg aag 1287
Ser Arg Arg Ala Ile Asp Leu Pro Thr His Glu Asn His Gly Leu Lys
115 120 125
acc cgg caa gaa aaa tgg atg act gga aga atg ggt gaa agg caa ctc 1335
Thr Arg Gln Glu Lys Trp Met Thr Gly Arg Met Gly Glu Arg Gln Leu
130 135 140
caa aag att gag aga tgg ttc gtg agg aac ccc ttt ttt gca gtg acg 1383
Gln Lys Ile Glu Arg Trp Phe Val Arg Asn Pro Phe Phe Ala Val Thr
145 150 155
gct ctg acc att gcc tac ctt gtg gga agc aac atg acg caa cga gtc 1431
Ala Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Val Gly Ser Asn Met Thr Gln Arg Val
160 165 170
gtg att gcc cta ctg gtc ttg gct gtt ggt ccg gcc tac tca gct cac 1479
Val Ile Ala Leu Leu Val Leu Ala Val Gly Pro Ala Tyr Ser Ala His
175 180 185 190
tgc att gga att act gac agg gat ttc att gag ggg gtg cat gga gga 1527
Cys Ile Gly Ile Thr Asp Arg Asp Phe Ile Glu Gly Val His Gly Gly
195 200 205
act tgg gtt tca gct acc ctg gag caa gac aag tgt gtc act gtt atg 1575
Thr Trp Val Ser Ala Thr Leu Glu Gln Asp Lys Cys Val Thr Val Met
210 215 220
gcc cct gac aag cct tca ttg gac atc tca cta gag aca gta gcc att 1623
Ala Pro Asp Lys Pro Ser Leu Asp Ile Ser Leu Glu Thr Val Ala Ile
225 230 235
gat aga cct gct gag gtg agg aaa gtg tgt tac aat gca gtt ctc act 1671
Asp Arg Pro Ala Glu Val Arg Lys Val Cys Tyr Asn Ala Val Leu Thr
240 245 250
cat gtg aag att aat gac aag tgc ccc agc act gga gag gcc cac cta 1719
His Val Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr Gly Glu Ala His Leu
255 260 265 270
gct gaa gag aac gaa ggg gac aat gcg tgc aag cgc act tat tct gat 1767
Ala Glu Glu Asn Glu Gly Asp Asn Ala Cys Lys Arg Thr Tyr Ser Asp
275 280 285
aga ggc tgg ggc aat ggc tgt ggc cta ttt ggg aaa ggg agc att gtg 1815
Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Val
290 295 300
gca tgc gcc aaa ttc act tgt gcc aaa tcc atg agt ttg ttt gag gtt 1863
Ala Cys Ala Lys Phe Thr Cys Ala Lys Ser Met Ser Leu Phe Glu Val
305 310 315
gat cag acc aaa att cag tat gtc atc aga gca caa ttg cat gta ggg 1911
Asp Gln Thr Lys Ile Gln Tyr Val Ile Arg Ala Gln Leu His Val Gly
320 325 330
gcc aag cag gaa aat tgg act acc gac att aag act ctc aag ttt gat 1959
Ala Lys Gln Glu Asn Trp Thr Thr Asp Ile Lys Thr Leu Lys Phe Asp
335 340 345 350
gcc ctg tca ggc tcc cag gaa gtc gag ttc att ggg tat gga aaa gct 2007
Ala Leu Ser Gly Ser Gln Glu Val Glu Phe Ile Gly Tyr Gly Lys Ala
355 360 365
aca ctg gaa tgc cag gtg caa act gcg gtg gac ttt ggt aac agt tac 2055
Thr Leu Glu Cys Gln Val Gln Thr Ala Val Asp Phe Gly Asn Ser Tyr
370 375 380
atc gct gag atg gaa aca gag agc tgg ata gtg gac aga cag tgg gcc 2103
Ile Ala Glu Met Glu Thr Glu Ser Trp Ile Val Asp Arg Gln Trp Ala
385 390 395
cag gac ttg acc ctg cca tgg cag agt gga agt ggc ggg gtg tgg aga 2151
Gln Asp Leu Thr Leu Pro Trp Gln Ser Gly Ser Gly Gly Val Trp Arg
400 405 410
gag atg cat cat ctt gtc gaa ttt gaa cct ccg cat gcc gcc act atc 2199
Glu Met His His Leu Val Glu Phe Glu Pro Pro His Ala Ala Thr Ile
415 420 425 430
aga gta ctg gcc ctg gga aac cag gaa ggc tcc ttg aaa aca gct ctt 2247
Arg Val Leu Ala Leu Gly Asn Gln Glu Gly Ser Leu Lys Thr Ala Leu
435 440 445
act ggc gca atg agg gtt aca aag gac aca aat gac aac aac ctt tac 2295
Thr Gly Ala Met Arg Val Thr Lys Asp Thr Asn Asp Asn Asn Leu Tyr
450 455 460
aaa cta cat ggt gga cat gtt tct tgc aga gtg aaa ttg tca gct ttg 2343
Lys Leu His Gly Gly His Val Ser Cys Arg Val Lys Leu Ser Ala Leu
465 470 475
aca ctc aag ggg aca tcc tac aaa ata tgc act gac aaa atg ttt ttt 2391
Thr Leu Lys Gly Thr Ser Tyr Lys Ile Cys Thr Asp Lys Met Phe Phe
480 485 490
gtc aag aac cca act gac act ggc cat ggc act gtt gtg atg cag gtg 2439
Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met Gln Val
495 500 505 510
aaa gtg tca aaa gga gcc ccc tgc agg att cca gtg ata gta gct gat 2487
Lys Val Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile Val Ala Asp
515 520 525
gat ctt aca gcg gca atc aat aaa ggc att ttg gtt aca gtt aac ccc 2535
Asp Leu Thr Ala Ala Ile Asn Lys Gly Ile Leu Val Thr Val Asn Pro
530 535 540
atc gcc tca acc aat gat gat gaa gtg ctg att gag gtg aac cca cct 2583
Ile Ala Ser Thr Asn Asp Asp Glu Val Leu Ile Glu Val Asn Pro Pro
545 550 555
ttt gga gac agc tac att atc gtt ggg aga gga gat tca cgt ctc act 2631
Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly Arg Gly Asp Ser Arg Leu Thr
560 565 570
tac cag tgg cac aaa gag gga agc tca ata gga aag ttg ttc act cag 2679
Tyr Gln Trp His Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys Leu Phe Thr Gln
575 580 585 590
acc atg aaa ggc gtg gaa cgc ctg gcc gtc atg gga gac acc gcc tgg 2727
Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val Met Gly Asp Thr Ala Trp
595 600 605
gat ttc agc tcc gct gga ggg ttc ttc act tcg gtt ggg aaa gga att 2775
Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr Ser Val Gly Lys Gly Ile
610 615 620
cat acg gtg ttt ggc tct gcc ttt cag ggg cta ttt ggc ggc ttg aac 2823
His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly Leu Phe Gly Gly Leu Asn
625 630 635
tgg ata aca aag gtc atc atg ggg gcg gta ctt ata tgg gtt ggc atc 2871
Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile Trp Val Gly Ile
640 645 650
aac aca aga aac atg aca atg tcc atg agc atg atc ttg gta gga gtg 2919
Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Val Gly Val
655 660 665 670
atc atg atg ttt ttg tct cta gga gtt ggg gcg t gagcggccgc2963
Ile Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala
675 680
tcgagcatgc atctagaggg ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag agctcgctga 3023
tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 3083
tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 3143
tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 3203
ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct 3263
gaggcggaaa gaacagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 3323
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 3383
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 3443
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 3503
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 3563
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 3623
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 3683
cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 3743
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 3803
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 3863
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 3923
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 3983
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 4043
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 4103
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 4163
agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 4223
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 4283
cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 4343
actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 4403
aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 4463
cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 4523
ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 4583
cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 4643
ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 4703
cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 4763
ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 4823
tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 4883
ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 4943
aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 5003
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 5063
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 5123
ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 5183
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 5243
atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 5271
<210>24
<211>681
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>24
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Gly Thr Ser Ala Val Thr Leu Val Arg Lys Asn Arg
20 25 30
Trp Leu Leu Leu Asn Val Thr Ser Glu Asp Leu Gly Lys Thr Phe Ser
35 40 45
Val Gly Thr Gly Asn Cys Thr Thr Asn Ile Leu Glu Ala Lys Tyr Trp
50 55 60
Cys Pro Asp Ser Met Glu Tyr Asn Cys Pro Asn Leu Ser Pro Arg Glu
65 70 75 80
Glu Pro Asp Asp Ile Asp Cys Trp Cys Tyr Gly Val Glu Asn Val Arg
85 90 95
Val Ala Tyr Gly Lys Cys Asp Ser Ala Gly Arg Ser Arg Arg Ser Arg
100 105 110
Arg Ala Ile Asp Leu Pro Thr His Glu Asn His Gly Leu Lys Thr Arg
115 120 125
Gln Glu Lys Trp Met Thr Gly Arg Met Gly Glu Arg Gln Leu Gln Lys
130 135 140
Ile Glu Arg Trp Phe Val Arg Asn Pro Phe Phe Ala Val Thr Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ile Ala Tyr Leu Val Gly Ser ASn Met Thr Gln Arg Val Val Ile
165 170 175
Ala Leu Leu Val Leu Ala Val Gly Pro Ala Tyr Ser Ala His Cys Ile
180 185 190
Gly Ile Thr Asp Arg Asp Phe Ile Glu Gly Val His Gly Gly Thr Trp
195 200 205
Val Ser Ala Thr Leu Glu Gln Asp Lys Cys Val Thr Val Met Ala Pro
210 215 220
Asp Lys Pro Ser Leu Asp Ile Ser Leu Glu Thr Val Ala Ile Asp Arg
225 230 235 240
Pro Ala Glu Val Arg Lys Val Cys Tyr Asn Ala Val Leu Thr His Val
245 250 255
Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr Gly Glu Ala His Leu Ala Glu
260 265 270
Glu Asn Glu Gly Asp Asn Ala Cys Lys Arg Thr Tyr Ser Asp Arg Gly
275 280 285
Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Val Ala Cys
290 295 300
Ala Lys Phe Thr Cys Ala Lys Ser Met Ser Leu Phe Glu Val Asp Gln
305 310 315 320
Thr Lys Ile Gln Tyr Val Ile Arg Ala Gln Leu His Val Gly Ala Lys
325 330 335
Gln Glu Asn Trp Thr Thr Asp Ile Lys Thr Leu Lys Phe Asp Ala Leu
340 345 350
Ser Gly Ser Gln Glu Val Glu Phe Ile Gly Tyr Gly Lys Ala Thr Leu
355 360 365
Glu Cys Gln Val Gln Thr Ala Val Asp Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ala
370 375 380
Glu Met Glu Thr Glu Ser Trp Ile Val Asp Arg Gln Trp Ala Gln Asp
385 390 395 400
Leu Thr Leu Pro Trp Gln Ser Gly Ser Gly Gly Val Trp Arg Glu Met
405 410 415
His His Leu Val Glu Phe Glu Pro Pro His Ala Ala Thr Ile Arg Val
420 425 430
Leu Ala Leu Gly Asn Gln Glu Gly Ser Leu Lys Thr Ala Leu Thr Gly
435 440 445
Ala Met Arg Val Thr Lys Asp Thr Asn Asp Asn Asn Leu Tyr Lys Leu
450 455 460
His Gly Gly His Val Ser Cys Arg Val Lys Leu Ser Ala Leu Thr Leu
465 470 475 480
Lys Gly Thr Ser Tyr Lys Ile Cys Thr Asp Lys Met Phe Phe Val Lys
485 490 495
Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met Gln Val Lys Val
500 505 510
Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile Val Ala Asp Asp Leu
515 520 525
Thr Ala Ala Ile Asn Lys Gly Ile Leu Val Thr Val Asn Pro Ile Ala
530 535 540
Ser Thr Asn Asp Asp Glu Val Leu Ile Glu Val Asn Pro Pro Phe Gly
545 550 555 560
Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly Arg Gly Asp Ser Arg Leu Thr Tyr Gln
565 570 575
Trp His Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met
580 585 590
Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe
595 600 605
Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr
610 615 620
Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile
625 630 635 640
Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr
645 650 655
Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met
660 665 670
Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala
675 680
<210>25
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<22l>misc_特征
<222>1-35
<223>POW 454
<400>25
aaaagaaaaa gcgctaccac catccaccgg gacag35
<210>26
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<22l>misc_特征
<222>1-41
<223>CPOW 2417
<400>26
actgttaccc tcaaccccgt actcgccggc gaaaaagaaa a 41
<210>27
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<223>修饰的JE信号
<400>27
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
l 5 10 15
Val Val Ile Ala Gly Thr Ser Ala
20
<210>28
<21l>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>misc_特征
<222>1-36
<223>YF 482
<400>28
aaaagaaaaa gcgctgtgac cttggtgcgg aaaaac36
<210>29
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>misc_特征
<222>1-41
<223>CYF 2433
<400>29
acagagatcc tcaaccccgc actcgccggc gaaaaagaaa a 41
<210>30
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>misc_特征
<222>1-41
<223>SLE 463
<400>30
aaaagaaaaa gcgctttgca gttatcaacc tatcagggga a 41
<210>31
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>misc_特征
<222>1-40
<223>CSLE 2477
<400>3l
accgttggtc gcacgttcgg actcgccggc gaaaaagaaa40
<210>32
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>32
Leu Asp Thr Ile Asn Arg Arg Pro Ser Lys Lys Arg Gly Gly Thr Arg
1 5 10 15
Ser Leu Leu Gly Leu Ala Ala Leu Ile Gly Leu Ala Ser Ser Leu Gln
20 25 30
Leu Leu Ser Thr Tyr Gln Gly
35
<210>33
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>33
Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Met
l 5 10 15
Lys Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys
20
<210>34
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>34
Met Asn Glu Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile
1 5 10 15
Ala Cys Ala Gly Ala Met Lys Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys
20 25 30
<210>35
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>35
Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg Gly Gly Asn Glu Gly Ser Ile Met
1 5 10 15
Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Met Lys
20 25 30
Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys
35
<210>36
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>36
Met Ser Lys Lys Arg Gly Gly Ser Glu Thr Ser Val Leu Met Val Ile
1 5 10 15
Phe Met Leu Ile Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Leu Ser Asn Phe Gln
20 25 30
Gly Lys
<210>37
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>37
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Val Thr Leu Ser Asn Phe Gln Gly
20 25 30
Lys
<210>38
<211>46
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>38
Met Asn Val Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn
1 5 10 15
Ile Leu Asn Arg Arg Arg Arg Thr Ala Gly Met Ile Ile Met Leu Ile
20 25 30
Pro Thr Val Met Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu
35 40 45
<210>39
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>39
Met Val Gly Leu Gln Lys Arg Gly Lys Arg Arg Ser Ala Thr Asp Trp
1 5 10 15
Met Ser Trp Leu Leu Val Ile Thr Leu Leu Gly Met Thr Leu Ala Ala
20 25 30
Thr Val Arg Lys Glu Arg Gly Asp
35 40
<210>40
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>40
Met Gly Trp Leu Leu Val Val Val Leu Leu Gly Val Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Thr Val Arg Lys Glu Arg Gly Asp
20
<210>41
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>41
Met Ser Trp Leu Leu Val Ile Thr Leu Leu Gly Met Thr Ile Ala Ala
1 5 10 15
Thr Val Arg Lys Glu Arg Gly Asp
20
<210>42
<211>5292
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(910)...(2964)
<400>42
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc900
gccgccgcc atg ggc aag agg tcc gcc ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc951
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser
1 5 10
ttg gca gtt gtc ata gct tgt gca ggc gcc ttc cat tta acc aca cgt 999
Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Phe His Leu Thr Thr Arg
15 20 25 30
aac gga gaa cca cac atg atc gtc agc aga caa gag aaa ggg aaa agt 1047
Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser
35 40 45
ctt ctg ttt aaa aca gag gat ggc gtg aac atg tgt acc ctc atg gcc 1095
Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala
50 55 60
atg gac ctt ggt gaa ttg tgt gaa gac aca atc acg tac aag tgt ccc 1143
Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro
65 70 75
ctt ctc agg cag aat gag cca gaa gac ata gac tgt tgg tgc aac tct 1191
Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser
80 85 90
acg tcc acg tgg gta act tat ggg acg tgt acc acc atg gga gaa cat 1239
Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Met Gly Glu His
95 100 105 110
aga aga gaa aaa aga tca gtg gca ctc gtt cca cat gtg gga atg gga 1287
Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly
115 120 125
ctg gag aca cga act gaa aca tgg atg tca tca gaa ggg gcc tgg aaa 1335
Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys
130 135 140
cat gtc cag aga att gaa act tgg atc ttg aga cat cca ggc ttc acc 1383
His Val Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr
145 150 155
atg atg gca gca atc ctg gca tac acc ata gga acg aca cat ttc caa 1431
Met Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln
160 165 170
aga gcc ctg att ttc atc tta ctg aca gct gtc act cct tca atg aca 1479
Arg Ala Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr
175 180 185 190
atg cgt tgc ata gga atg tca aat aga gac ttt gtg gaa ggg gtt tca 1527
Met Arg Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser
195 200 205
gga gga agc tgg gtt gac ata gtc tta gaa cat gga agc tgt gtg acg 1575
Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr
210 215 220
acg atg gca aaa aac aaa cca aca ttg gat ttt gaa ctg ata aaa aca 1623
Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr
225 230 235
gaa gcc aaa cag cct gcc acc cta agg aag tac tgt ata gag gca aag 1671
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys
240 245 250
cta acc aac aca aca aca gaa tct cgc tgc cca aca caa ggg gaa ccc 1719
Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro
255 260 265 270
agc cta aat gaa gag cag gac aaa agg ttc gtc tgc aaa cac tcc atg 1767
Ser Leu Ash Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met
275 280 285
gta gac aga gga tgg gga aat gga tgt gga cta ttt gga aag gga ggc 1815
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly
290 295 300
att gtg acc tgt gct atg ttc aga tgc aaa aag aac atg gaa gga aaa 1863
Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys
305 310 315
gtt gtg caa cca gaa aac ttg gaa tac acc att gtg ata aca cct cac 1911
Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His
320 325 330
tca ggg gaa gag cat gca gtc gga aat gac aca gga aaa cat ggc aag 1959
Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys
335 340 345 350
gaa atc aaa ata aca cca cag agt tcc atc aca gaa gca gaa ttg aca 2007
Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr
355 360 365
ggt tat ggc act gtc aca atg gag tgc tct cca aga acg ggc ctc gac 2055
Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp
370 375 380
ttc aat gag atg gtg ttg ttg cag atg gaa aat aaa gct tgg ctg gtg 2103
Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val
385 390 395
cac agg caa tgg ttc cta gac ctg ccg tta cca tgg ttg ccc gga gcg 2151
His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala
400 405 410
gac aca caa ggg tca aat tgg ata cag aaa gag aca ttg gtc act ttc 2199
Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe
415 420 425 430
aaa aat ccc cat gcg aag aaa cag gat gtt gtt gtt tta gga tcc caa 2247
Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln
435 440 445
gaa ggg gcc atg cac aca gca ctt aca ggg gcc aca gaa atc caa atg 2295
Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met
450 455 460
tca tca gga aac tta ctc ttc aca gga cat ctc aag tgc agg ctg aga 2343
Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg
465 470 475
atg gac aag cta cag ctc aaa gga atg tca tac tct atg tgc aca gga 2391
Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly
480 485 490
aag ttt aaa gtt gtg aag gaa ata gca gaa aca caa cat gga aca ata 2439
Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile
495 500 505 510
gtt atc aga gtg caa tat gaa ggg gac ggc tct cca tgc aag atc cct 2487
Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro
515 520 525
ttt gag ata atg gat ttg gaa aaa aga cat gtc tta ggt cgc ctg att 2535
Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile
530 535 540
aca gtc aac cca att gtg aca gaa aaa gat agc cca gtc aac ata gaa 2583
Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu
545 550 555
gca gaa cct cca ttc gga gac agc tac atc atc ata gga gta gag ccg 2631
Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro
560 565 570
gga caa ctg aag ctc aac tgg ttt aag aaa gga agt tct atc ggc caa 2679
Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln
575 580 585 590
atg ttt gag aca aca atg agg ggg gcg aag aga atg gcc att tta ggt 2727
Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly
595 600 605
gac aca gcc tgg gat ttt gga tcc ttg gga gga gtg ttt aca tct ata 2775
Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser Ile
610 615 620
gga aag gct ctc cac caa gtc ttt gga gca atc tat gga gct gcc ttc 2823
Gly Lys Ala Leu His Gln Val Phe Gly Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Phe
625 630 635
agt ggg gtt tca tgg act atg aaa atc ctc ata gga gtc att atc aca 2871
Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Leu Ile Gly Val Ile Ile Thr
640 645 650
tgg ata gga atg aat tca cgc agc acc tca ctg tct gtg aca cta gta 2919
Trp Ile Gly Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Thr Leu Val
655 660 665 670
ttg gtg gga att gtg aca ctg tat ttg gga gtc atg gtg cag gcc 2964
Leu Val Gly Ile Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala
675680 685
taattagttg agcggccgct cgagcatgca tctagagggc cctattctat agtgtcacct 3024
aaatgctaga gctcgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt 3084
ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta 3144
ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg 3204
ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc 3264
ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagctgc attaatgaat cggccaacgc 3324
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 3384
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 3444
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 3504
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 3564
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 3624
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 3684
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 3744
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 3804
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 3864
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 3924
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 3984
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 4044
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 4104
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 4164
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 4224
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 4284
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 4344
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 4404
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 4464
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 4524
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 4584
agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 4644
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 4704
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 4764
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 4824
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 4884
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 4944
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 5004
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 5064
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 5124
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 5184
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 5244
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 5292
<210>43
<211>685
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400> 43
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly
20 25 30
Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu
65 70 75 80
Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Met Gly Glu His Arg Arg
100 105 110
Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu
115 120 125
Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Val
130 135 140
Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr Met Met
145 150 155 160
Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Ala
165 170 175
Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr Met Arg
180 185 190
Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly
195 200 205
Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met
210 215 220
Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr Glu Ala
225 230 235 240
Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys Leu Thr
245250 255
Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro Ser Leu
260 265 270
Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met Val Asp
275 280 285
Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile Val
290 295 300
Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys Val Val
305 310 315 320
Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His Ser Gly
325 330 335
Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile
340 345 350
Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr
355 360 365
Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn
370 375 380
Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val His Arg
385 390 395 400
Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr
405 410 415
Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn
420 425 430
Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly
435 440 445
Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met Ser Ser
450 455460
Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp
465 470 475 480
Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe
485 490 495
Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile
500 505 510
Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu
515 520 525
Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val
530 535 540
Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu
545 550 555 560
Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln
565 570 575
Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe
580 585 590
Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr
595 600 605
Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser Ile Gly Lys
610 615 620
Ala Leu His Gln Val Phe Gly Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Phe Ser Gly
625 630 635 640
Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Leu Ile Gly Val Ile Ile Thr Trp Ile
645 650 655
Gly Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Thr Leu Val Leu Val
660 665 670
Gly Ile Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala
675 680 685
<210>44
<211>5293
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(910)...(2964)
<400>44
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc900
gccgccgcc atg ggc aag agg tcc gcc ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc951
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser
l 5 10
ttg gca gtt gtc ata gct tgt gca ggc gcc ttc cat tta acc aca cgt 999
Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Phe His Leu Thr Thr Arg
15 20 25 30
aac gga gaa cca cac atg atc gtc agc aga caa gag aaa ggg aaa agt 1047
Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser
35 40 45
ctt ctg ttt aaa aca gag gat ggc gtg aac atg tgt acc ctc atg gcc 1095
Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala
50 55 60
atg gac ctt ggt gaa ttg tgt gaa gac aca atc acg tac aag tgt ccc 1143
Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro
65 70 75
ctt ctc agg cag aat gag cca gaa gac ata gac tgt tgg tgc aac tct 1191
Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser
80 85 90
acg tcc acg tgg gta act tat ggg acg tgt acc acc atg gga gaa cat 1239
Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Met Gly Glu His
95 100 105 110
aga aga gaa aaa aga tca gtg gca ctc gtt cca cat gtg gga atg gga 1287
Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly
115 120 125
ctg gag aca cga act gaa aca tgg atg tca tca gaa ggg gcc tgg aaa 1335
Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys
130 135 140
cat gtc cag aga att gaa act tgg atc ttg aga cat cca ggc ttc acc 1383
His Val Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr
145 150 155
atg atg gca gca atc ctg gca tac acc ata gga acg aca cat ttc caa 1431
Met Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln
160 165 170
aga gcc ctg att ttc atc tta ctg aca gct gtc act cct tca atg aca 1479
Arg Ala Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr
175 180 185 190
atg cgt tgc ata gga atg tca aat aga gac ttt gtg gaa ggg gtt tca 1527
Met Arg Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser
195 200 205
gga gga agc tgg gtt gac ata gtc tta gaa cat gga agc tgt gtg acg 1575
Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr
210 215 220
acg atg gca aaa aac aaa cca aca ttg gat ttt gaa ctg ata aaa aca 1623
Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr
225 230235
gaa gcc aaa cag cct gcc acc cta agg aag tac tgt ata gag gca aag 1671
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys
240 245 250
cta acc aac aca aca aca gaa tct cgc tgc cca aca caa ggg gaa ccc 1719
Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro
255 260 265 270
agc cta aat gaa gag cag gac aaa agg ttc gtc tgc aaa cac tcc atg 1767
Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met
275 280 285
gta gac aga gga tgg gga aat gga tgt gga cta ttt gga aag gga ggc 1815
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly
290 295 300
att gtg acc tgt gct atg ttc aga tgc aaa aag aac atg gaa gga aaa 1863
Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys
305 310 315
gtt gtg caa cca gaa aac ttg gaa tac acc att gtg ata aca cct cac 1911
Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His
320 325 330
tca ggg gaa gag cat gca gtc gga aat gac aca gga aaa cat ggc aag 1959
Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys
335 340 345 350
gaa atc aaa ata aca cca cag agt tcc atc aca gaa gca gaa ttg aca 2007
Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr
355 360 365
ggt tat ggc act gtc aca atg gag tgc tct cca aga acg ggc ctc gac 2055
Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp
370 375 380
ttc aat gag atg gtg ttg ttg cag atg gaa aat aaa gct tgg ctg gtg 2103
Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val
385 390 395
cac agg caa tgg ttc cta gac ctg ccg tta cca tgg ttg ccc gga gcg 2151
His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala
400 405 410
gac aca caa ggg tca aat tgg ata cag aaa gag aca ttg gtc act ttc 2199
Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe
415 420 425 430
aaa aat ccc cat gcg aag aaa cag gat gtt gtt gtt tta gga tcc caa 2247
Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln
435 440 445
gaa ggg gcc atg cac aca gca ctt aca ggg gcc aca gaa atc caa atg 2295
Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met
450 455 460
tca tca gga aac tta ctc ttc aca gga cat ctc aag tgc agg ctg aga 2343
Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg
465 470 475
atg gac aag cta cag ctc aaa gga atg tca tac tct atg tgc aca gga 2391
Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly
480 485 490
aag ttt aaa gtt gtg aag gaa ata gca gaa aca caa cat gga aca ata 2439
Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile
495 500 505 510
gtt atc aga gtg caa tat gaa ggg gac ggc tct cca tgc aag atc cct 2487
Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro
515 520 525
ttt gag ata atg gat ttg gaa aaa aga cat gtc tta ggt cgc ctg att 2535
Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile
530 535 540
aca gtc aac cca att gtg aca gaa aaa gat agc cca gtc aac ata gaa 2583
Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu
545 550 555
gca gaa cct cca ttc gga gac agc cac atc atc ata gga gta gag ccg 2631
Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser His Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro
560 565 570
gga caa ctg aag ctc aac tgg ttt aag aaa gga agt tct atc ggc caa 2679
Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln
575 580 585 590
atg ttt gag aca aca atg agg ggg gcg aag aga atg gcc att tta ggt 2727
Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly
595 600 605
gac aca gcc tgg gat ttt gga tcc ttg gga gga gtg ttt aca tct ata 2775
Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser Ile
610 615 620
gga aag gct ctc cac caa gtg ttt ggt ggt gcc ttc aga aca ctc ttt 2823
Gly Lys Ala Leu His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe
625 630 635
ggg gga atg tct tgg atc aca caa ggg cta atg ggt gcc cta ctg ctc 2871
Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu
640 645 650
tgg atg ggc gtc aac gca cga gac cga tca att gct ttg gcc ttc tta 2919
Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu
655 660 665 670
gcc aca ggg ggt gtg ctc gtg ttc tta gcg acc aat gtg cat gct 2964
Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
675 680 685
taattagttt gggcggccgc tcgagcatgc atctagaggg ccctattcta tagtgtcacc 3024
taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 3084
tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 3144
aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 3204
gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 3264
cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg cattaatgaa tcggccaacg 3324
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3384
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 3444
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3504
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 3564
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 3624
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 3684
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 3744
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 3804
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 3864
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 3924
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 3984
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4044
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4104
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 4164
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 4224
ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4284
ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 4344
tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 4404
accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 4464
atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 4524
cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 4584
tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 4644
tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 4704
gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 4764
agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 4824
aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 4884
gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 4944
tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 5004
gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 5064
tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 5124
aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 5184
catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 5244
acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 5293
<210>45
<211>685
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>45
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly
20 25 30
Glu Pro His Met IIe Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu
65 70 75 80
Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Met Gly Glu His Arg Arg
100 105 110
Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu
115 120 125
Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Val
130 135 140
Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr Met Met
145 150 155 160
Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Ala
165 170 175
Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr Met Arg
180 185 190
Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly
195 200 205
Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met
210 215 220
Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr Glu Ala
225 230 235 240
Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys Leu Thr
245 250 255
Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro Ser Leu
260 265 270
Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met Val Asp
275 280 285
Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile Val
290 295 300
Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys Val Val
305 310 315 320
Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His Ser Gly
325 330 335
Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile
340 345 350
Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr
355 360 365
Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn
370 375 380
Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val His Arg
385 390 395 400
Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr
405 410 415
Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn
420 425 430
Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly
435 440 445
Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met Ser Ser
450 455 460
Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp
465 470 475 480
Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe
485 490 495
Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile
500 505 510
Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu
515 520 525
Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val
530 535 540
Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu
545 550 555 560
Pro Pro Phe Gly Asp Ser His Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln
565 570 575
Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe
580 585 590
Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr
595 600 605
Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser Ile Gly Lys
610 615 620
Ala Leu His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly
625 630 635 640
Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met
645 650 655
Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr
660 665 670
Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
675 680 685
<210>46
<211>5293
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<221>CDS
<222>(910)...(2964)
<400>46
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc900
gccgccgcc atg ggc aag agg tcc gcc ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc951
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser
1 5 10
ttg gca gtt gtc ata gct tgt gca ggc gcc ttc cat tta acc aca cgt 999
Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Phe His Leu Thr Thr Arg
15 20 25 30
aac gga gaa cca cac atg atc gtc agc aga caa gag aaa ggg aaa agt 1047
Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser
35 40 45
ctt ctg ttt aaa aca gag gat ggc gtg aac atg tgt acc ctc atg gcc 1095
Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala
50 55 60
atg gac ctt ggt gaa ttg tgt gaa gac aca atc acg tac aag tgt ccc 1143
Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro
65 70 75
ctt ctc agg cag aat gag cca gaa gac ata gac tgt tgg tgc aac tct 1191
Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser
80 85 90
acg tcc acg tgg gta act tat ggg acg tgt acc acc atg gga gaa cat 1239
Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Met Gly Glu His
95 100 105 110
aga aga gaa aaa aga tca gtg gca ctc gtt cca cat gtg gga atg gga 1287
Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly
115 120 125
ctg gag aca cga act gaa aca tgg atg tca tca gaa ggg gcc tgg aaa 1335
Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys
130 135 140
cat gtc cag aga att gaa act tgg atc ttg aga cat cca ggc ttc acc 1383
His Val Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr
145 150 155
atg atg gca gca atc ctg gca tac acc ata gga acg aca cat ttc caa 1431
Met Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln
160 165 170
aga gcc ctg att ttc atc tta ctg aca gct gtc act cct tca atg aca 1479
Arg Ala Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr
175 180 185 190
atg cgt tgc ata gga atg tca aat aga gac ttt gtg gaa ggg gtt tca 1527
Met Arg Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser
195 200 205
gga gga agc tgg gtt gac ata gtc tta gaa cat ggg agc tgt gtg acg 1575
Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr
210 215 220
acg atg gca aaa aac aaa cca aca ttg gat ttt gaa ctg ata aaa aca 1623
Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr
225 230 235
gaa gcc aaa cag cct gcc acc cta agg aag tac tgt ata gag gca aag 1671
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys
240 245 250
cta acc aac aca aca aca gaa tct cgc tgc cca aca caa ggg gaa ccc 1719
Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro
255 260 265 270
agc cta aat gaa gag cag gac aaa agg ttc gtc tgc aaa cac tcc atg 1767
Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met
275 280 285
gta gac aga gga tgg gga aat gga tgt gga cta ttt gga aag gga ggc 1815
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly
290 295 300
att gtg acc tgt gct atg ttc aga tgc aaa aag aac atg gaa gga aaa 1863
Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys
305 310 315
gtt gtg caa cca gaa aac ttg gaa tac acc att gtg ata aca cct cac 1911
Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His
320 325 330
tca ggg gaa gag cat gca gtc gga aat gac aca gga aaa cat ggc aag 1959
Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys
335 340 345 350
gaa atc aaa ata aca cca cag agt tcc atc aca gaa gca gaa ttg aca 2007
Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr
355 360 365
ggt tat ggc act gtc aca atg gag tgc tct cca aga acg ggc ctc gac 2055
Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp
370 375 380
ttc aat gag atg gtg ttg ttg cag atg gaa aat aaa gct tgg ctg gtg 2103
Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val
385 390 395
cac agg caa tgg ttc cta gac ctg ccg tta cca tgg ttg ccc gga gcg 2151
His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala
400 405 410
gac aca caa ggg tca aat tgg ata cag aaa gag aca ttg gtc act ttc 2199
Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe
415 420 425 430
aaa aat ccc cat gcg aag aaa cag gat gtt gtt gtt tta gga tcc caa 2247
Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln
435 440 445
gaa ggg gcc atg cac aca gca ctt aca ggg gcc aca gaa atc caa atg 2295
Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met
450 455 460
tca tca gga aac tta ctc ttc aca gga cat ctc aag tgc agg ctg aga 2343
Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg
465 470 475
atg gac aag cta cag ctc aaa gga atg tca tac tct atg tgc aca gga 2391
Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly
480 485 490
aag ttt aaa gtt gtg aag gaa ata gca gaa aca caa cat gga aca ata 2439
Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile
495 500 505 510
gtt atc aga gtg caa tat gaa ggg gac ggc tct cca tgc aag atc cct 2487
Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro
515 520 525
ttt gag ata atg gat ttg gaa aaa aga cat gtc tta ggt cgc ctg att 2535
Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile
530 535 540
aca gtc aac cca att gtg aca gaa aaa gat agc cca gtc aac ata gaa 2583
Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu
545 550 555
gca gaa cct cca ttc gga gac agc tac atc atc ata gga gta gag ccg 2631
Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro
560 565 570
gga caa ctg aag ctc aac tgg ttt aag aaa gga agc acg ctg ggc aag 2679
Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Thr Leu Gly Lys
575 580 585 590
gcc ttt tca aca act ttg aag gga gct caa aga ctg gca gcg ttg ggc 2727
Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly
595 600 605
gac aca gcc tgg gac ttt ggc tct att gga ggg gtc ttc aac tcc ata 2775
Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile
610 615 620
gga aaa gcc gtt cac caa gtg ttt ggt ggt gcc ttc aga aca ctc ttt 2823
Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe
625 630 635
ggg gga atg tct tgg atc aca caa ggg cta atg ggt gcc cta ctg ctc 2871
Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu
640 645 650
tgg atg ggc gtc aac gca cga gac cga tca att gct ttg gcc ttc tta 2919
Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu
655 660 665 670
gcc aca ggg ggt gtg ctc gtg ttc tta gcg acc aat gtg cat gct 2964
Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
675 680 685
taattagttt gagcggccgc tcgagcatgc atctagaggg ccctattcta tagtgtcacc 3024
taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 3084
tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 3144
aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 3204
gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 3264
cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg cattaatgaa tcggccaacg 3324
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3384
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 3444
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3504
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 3564
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 3624
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 3684
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg 3744
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 3804
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 3864
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 3924
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 3984
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4044
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4104
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 4164
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 4224
ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4284
ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 4344
tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 4404
accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 4464
atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 4524
cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 4584
tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 4644
tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 4704
gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 4764
agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 4824
aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 4884
gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 4944
tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 5004
gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 5064
tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 5124
aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 5184
catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 5244
acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 5293
<210>47
<211>685
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>47
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly
20 25 30
Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu
65 70 75 80
Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Met Gly Glu His Arg Arg
100 105 110
Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu
115 120 125
Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Val
130 135 140
Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr Met Met
145 150 155 160
Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Ala
165 170 175
Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr Met Arg
180 185 190
Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly
195 200 205
Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met
210 215 220
Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr Glu Ala
225 230 235 240
Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys Leu Thr
245 250 255
Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro Ser Leu
260 265 270
Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met Val Asp
275 280 285
Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile Val
290 295 300
Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys Val Val
305 310 315 320
Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His Ser Gly
325 330 335
Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile
340 345 350
Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr
355 360 365
Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn
370 375 380
Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val His Arg
385 390 395 400
Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr
405 410 415
Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn
420 425 430
Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly
435 440 445
Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met Ser Ser
450 455 460
Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp
465 470 475 480
Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe
485 490 495
Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile
500 505 510
Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu
515 520 525
Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val
530 535 540
Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu
545 550 555 560
Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln
565 570 575
Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe
580 585 590
Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr
595 600 605
Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys
610 615 620
Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly
625 630 635 640
Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met
645 650 655
Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr
660 665 670
Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
675 680 685
<210>48
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>48
tgtgcaggcg ccttccattt aaccacacgt aacg 34
<210>49
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>49
tcgagcggcc gctcaactaa ttaggcctgc accatgactc40
<210>50
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>50
cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg 30
<210>51
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>51
atagattgct ccaaacactt ggtgg 25
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>52
actccatagg aaaagccgtt cacc 24
<210>53
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>53
gcgagctcta gcatttaggt gacactatag 30
<210>54
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>54
ctccaccaag tgtttggtgg tgccttcaga aca 33
<210>55
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>55
Leu His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr
1 5 10
<210>56
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>56
cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg30
<210>57
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>57
gaattcgtct cacttccttt cttaaaccag ttgagcttc 39
<210>58
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>58
ggaattcgtc tcggaagcac gctgggcaag g 31
<210>59
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>59
gcgagctcta gcatttaggt gacactatag 30
<210>60
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>60
aactggttta agaaaggaag cacgctgggc gcc 33
<210>61
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；备注＝合成构建体
<400>61
Asn Trp Lys Lys Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala
1 5 10
权利要求
1.一种含有转录单位的分离的核酸，所述转录单位编码第一种黄病毒结构蛋白质的信号序列和第二种黄病毒的免疫原性黄病毒抗原，其中转录单位指导抗原的合成。
2.如权利要求1所述的核酸，其中信号序列是日本脑炎病毒信号序列。
3.如权利要求1所述的核酸，其中免疫原性黄病毒抗原属于一种选自黄热病毒、登革血清型1病毒、登革血清型2病毒、登革血清型3病毒、登革血清型4病毒、日本脑炎病毒、玻瓦桑病毒和西尼罗病毒的黄病毒。
4.如权利要求1所述的核酸，其中转录单位编码日本脑炎病毒的信号序列和西尼罗病毒的E蛋白和M蛋白质。
5.如权利要求1所述的核酸，其中转录单位编码日本脑炎病毒的信号序列和黄热病毒的E蛋白和M蛋白质。
6.如权利要求1所述的核酸，其中转录单位编码日本脑炎病毒的信号序列和圣路易斯脑炎病毒的E蛋白和M蛋白质。
7.如权利要求1所述的核酸，其中转录单位编码日本脑炎病毒的信号序列和玻瓦桑病毒的E蛋白和M蛋白质。
8.如权利要求1所述的核酸，其中抗原选自黄病毒的M蛋白，黄病毒的E蛋白质，黄病毒的M蛋白和E蛋白质，黄病毒的部分M蛋白，黄病毒的部分E蛋白质以及黄病毒的部分M蛋白和黄病毒的部分E蛋白质或其任意组合。
9.如权利要求8所述的核酸，其中抗原是黄病毒的M蛋白和E蛋白质。
10.如权利要求1所述的核酸，其中核酸是DNA。
11.如权利要求10所述的核酸，其包含一个选自SEQ ID NO15，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21和SEQ ID NO23的核苷酸序列。
12.如权利要求1所述的核酸，其中转录单位包含一个适当排列的控制序列，从而其可操作地控制抗原的合成。
13.如权利要求12所述的核酸，其中控制序列是巨细胞病毒立即早期启动子。
14.如权利要求1所述的核酸，其包含一个位于多肽的翻译起始位点的Kozak共有序列，所述多肽含有由TU编码的抗原。
15.如权利要求1所述的核酸，其中转录单位包含一个poly-A终止子。
16.一种细胞，其含有如权利要求1所述的核酸。
17.一种组合物，其含有如权利要求1所述的核酸和一种可药用的载体。
18.一种免疫受试者抗黄病毒感染的方法，其包括给受试者施用有效量的如权利要求17所述的组合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中黄病毒抗原属于一种选自黄热病毒、登革血清1型病毒、登革血清2型病毒、登革血清3型病毒、登革血清4型病毒、日本脑炎病毒、玻瓦桑病毒和西尼罗病毒的黄病毒。
20.如权利要求18所述的方法，其中抗原选自黄病毒的M蛋白，黄病毒的E蛋白质，黄病毒的M蛋白和E蛋白质，黄病毒的部分M蛋白，黄病毒的部分E蛋白质以及黄病毒的部分M蛋白和黄病毒的部分E蛋白质或其任意组合。
21.如权利要求20所述的方法，其中抗原是黄病毒的M蛋白和E蛋白质，以及其中受试者体内的细胞在其内整合核酸之后，分泌含有M蛋白和E蛋白的亚病毒颗粒。
22.如权利要求18所述的方法，其中转录单位编码日本脑炎病毒的信号序列和尼罗河病毒M蛋白和E蛋白质。
23.如权利要求18所述的方法，其中转录单位编码日本脑炎病毒的信号序列和黄热病毒的E蛋白和M蛋白质。
24.如权利要求18所述的方法，其中转录单位编码日本脑炎病毒的信号序列和圣路易斯脑炎病毒的E蛋白和M蛋白质。
25.如权利要求18所述的方法，其中转录单位编码日本脑炎病毒的信号序列和玻瓦桑病毒的E蛋白和M蛋白质。
26.如权利要求18所述的方法，其包括给受试者以单剂量施用组合物。
27.如权利要求18所述的方法，其中组合物通过肠胃外途径给药。
28.如权利要求1所述的核酸，其中抗原是圣路易斯脑炎病毒抗原。
29.如权利要求18所述的方法，其中抗原是圣路易斯脑炎病毒抗原。
30.如权利要求1所述的核酸，其中抗原是日本脑炎病毒抗原。
31.如权利要求18所述的方法，其中抗原是日本脑炎病毒抗原。
32.如权利要求1所述的核酸，其中抗原是黄热病毒抗原。
33.如权利要求18所述的方法，其中抗原是黄热病毒抗原。
34.如权利要求1所述的核酸，其中抗原是登革病毒抗原。
35.如权利要求18所述的方法，其中抗原是登革病毒抗原。
36.如权利要求1所述的核酸，其中抗原是西尼罗病毒抗原。
37.如权利要求18所述的方法，其中抗原是西尼罗病毒抗原。
38.一种抗原，其由如权利要求1所述的核酸产生。
39.一种检测样品中的黄病毒抗体的方法，其包括
(a)在可形成抗原/抗体复合物的条件下将样品与如权利要求38所述的抗原接触；和
(b)检测抗原/抗体复合物的形成，由此检测样品中的黄病毒抗体。
40.一种抗体，其通过如权利要求38所述的抗原免疫应答产生。
41.一种检测样品中的黄病毒抗原的方法，其包括
(a)在可形成抗原/抗体复合物的条件下将样品与如权利要求40所述的抗体接触；和
(b)检测抗原/抗体复合物的形成，由此检测样品中的黄病毒抗原。
42.一种诊断受试者黄病毒感染的方法，其包括
(a)在可形成抗原/抗体复合物的条件下将来自受试者的样品与如权利要求38所述的抗原接触；和
(b)检测抗原/抗体复合物的形成，由此诊断受试者的黄病毒感染。
43.一种诊断受试者黄病毒感染的方法，其包括
(a)在可形成抗原/抗体复合物的条件下将来自受试者的样品与如权利要求40所述的抗体接触；和
(b)检测抗原/抗体复合物的形成，由此诊断受试者的黄病毒感染。
全文摘要
本发明包括含有转录单位的分离核酸，该转录单位编码第一种黄病毒的信号序列和第二种黄病毒的免疫原性黄病毒抗原或者含有来自多种黄病毒序列的嵌合免疫原性黄病毒抗原。本发明进一步包括核酸和蛋白疫苗以及该疫苗免疫受试者抗黄病毒感染的应用。本发明还提供了由本发明的核酸编码的抗原，响应于抗原引发产生的抗体以及抗原和/或抗体在检测黄病毒或诊断黄病毒感染中的应用。
文档编号A61K48/00GK1500152SQ02807758
公开日2004年5月26日 申请日期2002年4月4日 优先权日2001年4月4日
发明者张光正 申请人:美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心, 美国政府健康及人类服务部,疾病控制和