一种胎盘源性干细胞的分离方法及其应用与流程
本发明涉及胎盘源性干细胞的分离、基因修饰方法以及治疗缺血性疾病的领域。具体而言，本发明涉及一种新的胎盘源性干细胞分离方法及其基因修饰细胞在缺血性疾病治疗中的应用。
技术背景
缺血性疾病包括冠心病、下肢动脉缺血、糖尿病动脉硬化等。缺血性疾病较大动脉病变可采用血管搭桥和血管腔内介入等治疗，但末梢血管闭塞和不能耐受手术的患者，单纯药物治疗效果不佳。利用干细胞和基因治疗的方法相结合能够有效改善机体缺血组织。
干细胞移植为肢体缺血性疾病提供了新的治疗方法。胎盘中含有造血干细胞、间充质干细胞以及内皮祖细胞等多种细胞成分。胎盘源性干细胞(placenta-derived stem cells,PSCs)以取材方便、数量多、对供者无不利影响而成为研究重点。各种不同分离及培养方法获得的细胞数量和生物学特性各不相同。如利用分离采集胎盘血单个核干细胞的方法可以富集造血细胞，从而通过造血干细胞移植用于治疗白血病、各种免疫性疾病等。而通过切碎消化及培养等方法获得的细胞多为间充质干细胞，可以用于成骨及免疫性疾病的治疗。
胎盘源性干细胞PSCs有望成为骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的替代来源。目前研究表明PSCs具有分泌促血管生长因子及向其他组织细胞诱导分化的能力[Lu GH,Yong WS,Xu ZM,et al.Human placental decidua basalis-derived mesenchymal stem cells differentiate into dopamine neuron-like cells with no response to long-term culture in vitro.Neuroreport.2012,23(8):512-518]。因此，PSCs也在治疗缺血性疾病中具有很好的应用前景。
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种具有促血管生成活性的多功能生长因子。HGF基因治疗在缺血性疾病的前期动物实验及临床研究中取得了很好的效果。
HGF基因修饰的干细胞是促进血管新生的一种极具有临床应用前景的再生医学手段，与单纯的干细胞或基因治疗相比更有优越性。本发明在兔肢体缺血模型中评价了Ad-HGF修饰的胎盘源性干细胞(PSCs)移植的治疗作用，为将来其应用与临床提供实验依据。
技术实现要素：
本发明提供一种分离胎盘源性干细胞的方法，以及经HGF修饰的胎盘源性干细胞在治疗缺血性疾病中的应用。具体而言，在本发明中，利用一种新的复合酶液体组合物，有效地分离胎盘源性干细胞。胎盘源性干细胞经过体外基因修饰后，能够在动物模型中诱导血管新生，通过改善侧枝循环，起到治疗缺血的效果。
为了实现上述发明目的，本发明涉及如下技术方案。
在第一个方面，本发明涉及一种用于分离胎盘源性干细胞的复合酶液体组合物，其包含胰蛋白酶、胶原酶和分散酶。
在本发明的一个实施方案中，所述的复合酶液体组合物，胰蛋白酶0.01－0.1mg/mL、胶原酶0.1－5mg/mL和分散酶0.1－5mg/mL；优选地，其包含：胰蛋白酶0.03－0.1mg/mL、胶原酶0.5－3mg/mL和分散酶0.5－3mg/mL；优选地，其包含胰蛋白酶0.05mg/mL、胶原酶1mg/mL和分散酶1mg/mL.
在本发明的一个实施方案中，所述的复合酶液体组合物，其包含0.5-3重量％胰蛋白酶、0.5-3重量％胶原酶和0.5-3重量％分散酶；优选地，所述复合酶液体组合物包含1-3重量％胰蛋白酶、1-3重量％胶原酶和1-3重量％分散酶。
在本发明的一个实施方案中，所述胶原酶为I型胶原酶；
在本发明的一个实施方案中，所述分散酶为中性蛋白酶例如中性蛋白酶I。
在一个优选的实施方案中，所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。
在第二个方面，本发明涉及一种胎盘源性干细胞的分离方法，其包括将本发明的复合酶液体组合物通过泵入胎盘，以分离胎盘源性干细胞的步骤。
在一个优选的实施方案中，通过脐静脉和动脉密闭来将复合酶液体组合物通过泵入胎盘。
在一个优选的实施方案中，所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。
本发明的第三个方面涉及一种胎盘源性干细胞，其由本发明中任一权利要求所述的分离方法制得。在本发明的一个实施方案中，所述的胎盘源性干细胞，其为HGF修饰的胎盘源性干细胞。
在第四个方面，本发明涉及一种提高血管生长因子表达水平的方法，其包括用Ad-HGF感染胎盘源性干细胞。
在一个优选的实施方案中，所述血管生长因子包括HGF、VEGF和bFGF。在进一步优选的实施方案中，所述血管生长因子为HGF。
在第五个方面，本发明涉及HGF修饰的胎盘源性干细胞在制备用于治疗缺血性疾病的药物中的应用。优选地，所述缺血性疾病选自冠心病、下肢动脉缺血和糖尿病动脉硬化中的任意一种或多种；优选地，所述HGF修饰的胎盘源性干细胞为前面所述的HGF修饰的胎盘源性干细胞。
在一个优选的实施方案中，所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。
在第六个方面，本发明涉及一种治疗缺血性疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的HGF修饰的胎盘源性干细胞的步骤。优选地，所述缺血性疾病选自冠心病、下肢动脉缺血和糖尿病动脉硬化中的任意一种或多种；优选地，所述HGF修饰的胎盘源性干细胞为前面所述的HGF修饰的胎盘源性干细胞。
在一个优选的实施方案中，所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。
给药剂量取决于许多因素，例如所治疗病况的严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。本领域通常的做法是，剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
在第七个方面，本发明涉及分离的经基因修饰的胎盘源性干细胞，其用于治疗缺血性疾病。
在一个优选的实施方案中，所述胎盘源性干细胞为胎盘间充质干细胞。
本发明中，
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病和/或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
附图说明
图1胎盘干细胞经过分离和培养后的细胞形态。
图2通过流式细胞仪检测细胞表面标志的表达。其中，
2A，流式细胞仪检测细胞表面标志CD31的表达。
2B，流式细胞仪检测细胞表面标志HLA-DR的表达。
2C，流式细胞仪检测细胞表面标志CD34的表达。
2D，流式细胞仪检测细胞表面标志CD45的表达。
2E，流式细胞仪检测细胞表面标志CD11b的表达。
2F，流式细胞仪检测细胞表面标志CD90的表达。
2G，流式细胞仪检测细胞表面标志CD105的表达。
2H，流式细胞仪检测细胞表面标志CD44的表达。
2I流式细胞仪检测细胞表面标志CD73的表达。
图3显示HGF基因修饰PMSC移植缺血组织促血管生长因子表达。其中，
3A，Q-PCR测定细胞内HGF的表达。
3B，Q-PCR测定缺血组织局部VEGF,bFGF和HGF的表达。
图4评价血管新生和血液循环改善。其中，
4A，动脉造影法评价血管新生和血液循环改善的情况。
4B，HE染色法评价左侧治疗组血管新生和血液循环改善的情况。
4C，HE染色法评价右侧对照组血管新生和血液循环改善的情况。
具体实施方式
为进一步理解本发明，下面结合实施例对上述的技术方案做进一步的阐述和说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：胎盘间充质干细胞的分离培养
利用新的复合酶培养体系，包含0.05mg/mL胰蛋白酶、1mg/mL胶原酶和1mg/mL分散酶(中性酶)，将消化酶组合液通过脐静脉和动脉密闭泵入胎盘，速度为50mL/小时，达到消化和分离细胞的作用。在37℃消化2小时。收集冲出细胞，并洗涤后培养。培养条件为DMEM含15％FBS分离并培养胎盘间充质干细胞PSCs呈成纤维细胞状，细胞状态良好(图1)。
1.试剂配制
a)分散酶(中性蛋白酶Ⅰ)储存液(5mg/mL)
用超纯水溶解分散酶，冻干酶可以在2-8度储存至保质期，水溶液保存在-15到-25度，打开盖子是注意别把粉末弹出(如果在真空中保存)，尽量溶解已得到正确的浓度(包括附加在帽子上的)。
b)Ⅰ型胶原酶的储存液(5mg/mL)
100mL PBS加入0.5g胶原酶粉末，0.2μm滤膜过滤并分到50mL管中。不要反复冻融在-20度可保存数个月。
c)DNase储存液1:100(0.1mg/mL)
用1mL超纯水溶解DNaseⅠ，转移到50mL管中，加20mL超纯水并混匀。保存在-20度。
d)胰酶原液(2.5％w/v，约为2.5mg/mL)
在500mL无菌磷酸盐缓冲液中加入2.5g PVP粉制备PVP溶液。在用力摇动管完全溶解粉末获得清亮的溶液。在200mL 0.5％PVP溶液中加入5g胰酶粉，加一个无菌的电磁搅拌器，4度搅拌30min。30min后，溶液依然浑浊。分装1.5mL溶液到1.5mLEP管中，4度，15000g离心30min。收集上清到50mL管中，丢掉沉淀。水溶液保存在-20度。
e)PBS
NaCl 8g，KCl 0.2g,，Na2HPO4.12H2O 1.44g，KH2PO4 0.24g，加蒸馏水800mL，用盐酸调PH至7.4，加水定容至1000mL。0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
f)PBS/EDTA
PBS中加入EDTA，青霉素(100U/mL)，链霉素(100mg/mL)，4度保存1个月。每mL脐带血或胎盘细胞悬液添加1.5mgEDTA。该溶液用于胎盘和血液收集和清洗介质。
g)HBSS(withCa2+、Mg2+)
NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4.12H2O 1.26g，KH2PO4 0.06g，MgSO4 0.098g，CaCl20.14g，D-Glucose 1g，NaHCO3 0.35g，定容至1000mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
h)PBS/FBS
PBS加2％FBS，青霉素(100U/mL)，链霉素(100mg/mL)，4度保存1个月。该溶液用于胎盘和血液收集和清洗介质。
i)白蛋白(0.3％w/v，约为0.3mg/mL)
j)双抗
10万单位的青霉素粉末与10万单位的链霉素粉末共同溶于1mL PBS缓冲液中，使用时1:1000稀释。
k)RPMI1640培养基
RPMI1640干粉(Gibco)1袋，NaHCO3 2g，HEPES 2.38g/1L，pH 7.2，0.45μm，0.22μm微孔滤膜两次过滤。
l)Mix消化液
中性酶(又译为分散酶)，购买自罗氏公司。分散酶1mg/mL，Ⅰ型胶原酶1mg/mL，胰酶0.05mg/mL，白蛋白0.3mg/mL。
2.方法与步骤
2.1.Ad-HGF修饰的胎盘间充质干细胞的获取、体外培养、细胞悬液制备。
间充质干细胞分离与培养临床上取足月产妇的胎盘组织(经产妇及其家人同意)，准备胎盘收集储存器：无菌消毒或用一次性无菌罐。准备含25000万单位的肝素钠PBS溶液，50mL，注入胎盘内后结扎脐带，防止胎盘凝血。胎盘保护液：RPMI1640中加1％人血清白蛋白，1％双抗和庆大霉素以及两性霉素B，1％肝素钠。4℃保存备用。无菌收集胎盘，置于含胎盘保护液的储存器中。及时运送到实验室进行分离。
2.1.1.胎盘血冲洗
松开脐带，保持胎盘向下，将两根静脉导管分别插入两根脐动脉中，缝线固定，静脉插入另一根导管，同样缝合固定。将一根脐动脉连接蠕动泵，另一根脐动脉断流，通过脐动脉管缓慢冲入FBS/PBS，冲洗1000mL，通过静脉管收集胎盘血。同样冲洗另一根脐动脉，通过静脉口收集胎盘血。冲洗约4000mL，直到胎盘脉管系统出现白色。
2.1.2胎盘干细胞收集
将蠕动泵连接脐动脉，通过蠕动将mix消化液泵入脐动脉，灌注200mL后断流静置消化2小时，将蠕动泵连接PBS，将PBS泵入脐动脉，冲洗约500mL，以彻底收集附着在胎盘血管内的干细胞。注入的体积要充满整个血管。滤网过滤收集单细胞，将收集的细胞悬浮于MSC培养基中，置37℃、5％CO2湿度培养箱培养。
实验结果：显微镜下观察胎盘间充质干细胞，PMSCs呈成纤维细胞状，细胞形态及生长状态良好，见图1。
2.2流式检测细胞表面标志
材料与方法：
CD34/FITC，CD73/PE，CD105/PE，CD90/PE，HLA-DR/PE，CD44/PE，CD11b/PE，CD45/PE，CD31/FITC单克隆抗体均购自BD公司，FACS流式细胞仪(BD Calibur美国)，
方法与步骤
1)PSC经培养4代后，用胰酶消化收集细胞后用PBS洗涤2遍后(预热到室温)制成5x105/0.1mL的细胞悬液；
2)加入1μl不同的抗体，小鼠FITC和PE标记的同型抗体标记细胞作为阴性对照，抗体包括CD105、CD90、CD73，CD44、CD45、CD11b、CD34、CD31、HLA-DR避光37℃孵育20min；
3)加4到5倍体积的低温含2％FBS的DMEM培养基重悬洗涤细胞；
4)400μlPBS重悬细胞，用流式细胞仪收集、分析数据。
流式细胞仪测定结果：PSCs阳性细胞表面分子包括CD105、CD90、CD73，CD44其阳性率大于95％。而造血细胞相关的分子CD45、CD11b、CD34、CD31、HLA-DR等均<1％，符合间充质干细胞(MSCs)的鉴定标准，见图2(2A-2I)。
实施例2：Ad-HGF修饰的PSC促进HGF表达
利用感染复数(multiplicity of infection,MOI)的Ad-HGF感染PSCs,感染48H后，收集细胞，然后通过QPCR的方法测定HGF的表达水平。并且，造影结束后，取兔缺血后肢肌组织，然后通过QPCR的方法测定肢肌肉组织中VEGF、bFGF、HGF的表达。
材料：DMEM培养基和Ad-HGF由本室生产制备，VEGF、bFGF、HGF引物由奥科公司合成。QPCR仪7500(ABI公司，美国)，Green Real-time PCR Master Mix(TAKARA公司,日本)。
方法与步骤
1).组织RNA的提取：造影结束后，取兔缺血后肢肌组织加入液氮冷冻研磨后加入TRIZOL裂解提取组织总RNA，步骤如下：
①刀片切取0.3*0.3*0.3cm大小-80度冰箱冻存的大鼠股四头肌组织块，加入液氮在研钵内研碎，加入0.5mLTrizol裂解液裂解后将溶液吸入EP管内4度静置10min。
②加入200μL三氯甲烷，混匀，4度静置2-3min。
③12000rpm，4度离心15分钟后取上清加入另一EP管内。
④EP管内加入等体积(约500μL)异丙醇，4度静置10min，12000rpm，4度离心15分钟后吸弃上清。
⑤沉淀加1mL预冷的75％的乙醇(用1‰DEPC水配)1mL，10000rpm，4度离心10分钟。小心吸弃上清，晾干约10min，直至乙醇完全挥发完毕。
⑥小心倒掉上清，将管在空气中干燥5-10分钟，注意不能让RNA沉淀完全干燥(否则会极大地降低它的可溶性)。再在管中加30μL的DEPC水溶解。每管抽提的RNA样品各取1μL用核酸测定仪测定其RNA含量。
2).cDNA第一链的合成：
①取2μgRNA，加DEPC水定容至11μL，在无核酸EP管中加入、oligo(dT)primer 1μL
②65℃加热5分钟后迅速放置在冰上操作，并在无核酸EP管中加入如下个成分：5×reaction buffer 4μL、RiboockRnase Inhibitor(20u/μL)1μL、dNTP mix 2μL、Revert Aid M-MuLV Reverse Transcription(200u/μL)1μL。总反应体积为20μL；
③将以上混合物轻轻混匀；
④42℃温浴60分钟后终止反应。
Q-PCR
引物由北京奥科生物技术有限公司设计合成。
引物序列如下：
VEGF基因
正义引物:5'TAT TCA AGC CTT CCT GCG TG 3'(SEQ ID NO:1)
反义引物:5'TCA TCT CCC CTA TGT GCT GG 3'(SEQ ID NO:2)
bFGF基因
上游引物为5'CAA ACC GTT ACC TTG CTA TG 3'(SEQ ID NO:3)
下游引物为5'TTC GTT TCA GTG CCA CAT AC 3'(SEQ ID NO:4)
肝细胞生长因子(HGF)引物
上游引物5'GGA ACC AGA TGC TAG TAA GC 3'(SEQ ID NO:5)
下游引物5'CGA GCA AGA GGA CAA TAA TC 3'(SEQ ID NO:6)
内参照β-actin：
上游引物为：5’TGTTGTCCCTGTATGCCTCTG3’(SEQ ID NO:7)
下游引物为：5’ACCGCTCATTGCCGATAGTG3’(SEQ ID NO:8)
PCR扩增：
①PCR反应体系：
②PCR反应循环设置：Real-time PCR在ABI prism 7500系统上进行
反应参数均为：95℃5分钟(预变性)，94℃1分钟(变性)，55℃1分钟(退火)，72℃1分钟(延伸)，30个循环，最后72℃延伸10分钟。反应完成后进行溶解曲线的检测，以确保PCR反应的特异性。根据最后得出CT值结果进行数据分析。统计学处理采用SPSS 19.0统计软件进行t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。
实验结果：利用感染复数(multiplicity of infection,MOI)的Ad-HGF感染PSCs,然后通过Q-PCR的方法测定HGF的表达水平。如图3A所示，Ad-HGF基因修饰后明显提高了细胞内HGF的表达水平。Q-PCR检测后肢肌肉组织中VEGF、bFGF、HGF的表达，结果显示，在兔动物模型中也明显提高了各种血管生长因子的水平。治疗组VEGF\bFGF\HGF的表达明显高于对照组，见图3B。
实施例3：HGF基因修饰PSC移植促进血管新生
3.1动物模型的制作及干细胞移植术：
材料：新西兰大白兔10只，军事医学科学院实验动物中心订购(动物许可证号：SCXK(京)2015-0005)，体重在2-3kg，雌雄各半，年龄6周。
方法与步骤
3.1.1给兔经耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠(50mg/kg)全身麻醉，实验兔取左、右下肢造模。
3.1.2左、右后肢脱毛、消毒后自腹股沟韧带中点至膝上做长切口，自两侧腹股沟韧带至膝关节上下行一纵行切口行股动脉及其分支分离术，分别结扎并离断股动脉及分支，左侧下肢用1mL注射器将Ad-HGF修饰干细胞悬液1mL分10点注射于股动脉周围的大腿肌肉群内，右侧对照组则对照注射生理盐水。
3.2腹主动脉造影移植注射后14d，取兔自耳缘静脉注射戊巴比妥钠(50mg/kg)全身麻醉，打开腹腔，显露腹主动脉，行腹主动脉穿刺术后注入70％泛影葡胺连续摄片，进行双下肢动脉造影，观察侧支循环的形成情况。摄影速度为4帧/s。
3.3 HE染色
方法与步骤
3.3.1实验动物造影结束后取双侧下肢大腿中段肌肉，置于10％的中性甲醛固定24h。
3.3.2染色，整个染色过程包括五个内容：脱蜡，染色，脱水，透明和封固。
(1)脱蜡：
1.组织蜡块进行连续切片，厚度3μm；
2.将切片在温箱中烤干后，立即投入二甲苯中脱蜡10min；
3.移入无水酒精中，约2minx2次；
4.移入90％酒精中，约2minx2次；
5.移入80％酒精中，约2minx2次；
6.移入70％酒精中，约2min；
7.移入水中，洗去酒精，约2～3min；
8.移入蒸馏水中，约2min。
(2)染色：
1.移入苏木素中，浸染10min，以稍深染为宜；
2.移入水中，洗去苏木素和浮色，约1～2min；
3.移入分化液(1％盐酸酒精)中，分化几秒至30秒钟，使切片褪色至淡蓝红色即可；
4.移入流水中，洗涤30～60min，使组织呈鲜蓝色或天蓝色；
5.移入伊红液中，浸染2～5min；
6.移入水中，洗去伊红浮液，并用纱布擦净玻片上的多余染料。
(3)脱水：
1.吸去玻片上的水分后多入80％酒精中脱水约2minx2次；
2.移入90％酒精中脱水，约4minx2次；
3.移入无水酒精(100％酒精)彻底脱水，约5minx2次。
(4)透明
1.移入二甲苯Ⅰ中透明3－5min；
2.移入二甲苯Ⅱ中透明5－10min；
(5)封固
用树胶封固，先从二甲苯Ⅱ中取出切片，将组织外围的二甲苯迅速擦去，在滴上一滴树胶于组织片上，然后取干净的盖玻片，仔细加在封固剂上，慢慢压平，使盖片位置适中。切片封固后，放在温箱中烤干后观察。
实验结果：通过结扎方法建立了兔肢体缺血的动物模型，在结扎处移植经过Ad-HGF修饰的PSCs。治疗后第14天腹主动脉穿刺行DSA造影检查，可见左侧肢体缺血治疗后微血管生成数明显多于未治疗右侧肢体缺血的微血管数，血管形成能力明显增强。结果表明：Ad-HGF-PSCs治疗组侧支血管形成数明显高于对照组可见兔左侧下肢血管(标示1)较右侧肢体(标示2)明显代偿性增粗，周围分支明显增多(图4A)。常规HE染色，观察双侧下肢血管分布密度。随机选取400倍下10个视野，统计股直肌的毛细血管数和肌纤维数，以两者比值计算毛细血管密度。结果显示左侧治疗组(图4B)的股直肌的毛细血管数和肌纤维数明显多于右侧对照组(图4C)，差异统有计学意义(P<0.05)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
青岛奥克生物开发有限公司
<120> 一种胎盘源性干细胞的分离方法及其应用
<130> IDC150239
<150> 201511021411.X
<151> 2015-12-31
<160> 8
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<211> 20
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