一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法与流程

本发明属于间充质干细胞的制备技术领域，具体涉及一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法。

背景技术：

脂肪组织大量存在于人体，是一种容易获得的良好的组织工程材料，对软组织缺损填充、丰胸、除皱具有较好的美容医学治疗效果，但脂肪组织移植的存活率较低，容易被吸收，脂肪液化及坏死等缺点极大地限制了脂肪组织的应用。研究表明，脂肪间充质干细胞能够显著促进脂肪组织移植的存活率。

脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)是一类存在于脂肪组织且具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。脂肪间充质干细胞作为一种理想的种子细胞具有以下优势：1)脂肪组织中含有大量的间充质干细胞，而且脂肪组织的获取容易，来源丰富，给患者带来的痛苦较小；2)脂肪间充质干细胞具有较强的免疫调节能力，即使进行异体移植也不会引起强烈的抑制抗宿主疾病；3)脂肪间充质干细胞在增殖活性、细胞因子分泌能力、归巢能力、遗传背景稳定等方面都具有较强的生物学特性，这些特性有助于促进组织再生和疤痕修复，在医学美容都具有广阔的应用前景。

目前，脂肪间充质干细胞的提取及建库方法存在诸多缺点，如中国专利CN103074298A公开了一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法，该方法包括以下步骤：1)无菌采集人体脂肪；2)油脂去除；3)胶原酶消化；4)红细胞的裂解；5)扩大培养；6)冻存。中国专利CN104357387A公开了一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法，首先用含低分子肝素钙的生理盐水反复冲洗脂肪组织，然后用Ⅰ型胶原酶溶液消化脂肪组织提取脂肪间充质干细胞。

上述两种方法都采用了胶原酶消化法提取间充质干细胞，使得间充质干细胞提取的操作时间较长、工艺变复杂；胶原酶消化获得的细胞悬液存在大量的红细胞，上述第一种方法采用红细胞裂解液去除红细胞，第二种方法采用低分子肝素钙去除红细胞，这些方法不仅会对间充质干细胞的质量造成潜在的危险，而且还增加了生产成本，也不适合于临床级脂肪间充质干细胞的应用。

综上所述，现有技术中提取人脂肪间充质干细胞存在以下缺点：细胞纯度不高、操作繁琐、耗时耗力、生产成本较高等。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法，可有效解决现有技术中操作过程复杂，细胞纯度低以及红细胞去除繁琐的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：

(1)采集供者的脂肪组织，将其剪成1-5mm³大小，装于离心管(Corning)中，然后加入3倍体积的无菌生理盐水(科伦药业)，于20℃、2000-5000r/min条件下离心10-20min；其中，供者年龄为18-30岁，脂肪组织采集部位为腹部、臀部、大腿两侧；

(2)离心完毕后，去除上层的油层，然后将处于中间层的脂肪组织转入新的离心管，加入生理盐水清洗1-2次；

(3)将清洗后的脂肪组织接种于完全培养基中，置于37℃、5％CO₂条件下进行培养；其中完全培养基成分为：无血清培养基(Cellgenix)、30ng/mL bFGF(Cellgenix)、10ng/mL胰岛素(Gibco)和体积浓度为2％的GlutaMAX(Gibco)；

(4)每隔5-8天更换一次培养基，待细胞融合度为70-80％时，用TrypLE^TM Select(Gibco)消化细胞；

(5)传代培养：消化后进行离心处理，2000r/min离心3-5min，收集细胞，按照1×10⁴-2×10⁴个细胞/cm²的密度(此处密度为细胞个数与培养瓶底表面积的比计算得来)接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基传代培养，得脂肪间充质干细胞；

(6)针对步骤(5)所得的脂肪间充质干细胞，检测以下项目中的至少一项：细胞活性、无菌检测、细胞表面标志物检测、核型检测、HLA-ABC/DR配型、遗传病检测、支原体检测、内毒素检测；

(7)冻存：将传代培养后符合检测指标的脂肪间充质干细胞按照4×10⁶-8×10⁶个细胞/mL密度冻存于1mL冻存液中，冻存细胞经程序降温至-80℃后转入液氮罐中长期保存；

(8)建立包含以上信息的脂肪间充质干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(7)的冻存细胞进行关联。

进一步地，步骤(1)中对脂肪组织的处理需要在采集后48h内进行。

进一步地，步骤(3)中脂肪组织块与完全培养基的重量体积比为(1-2:10-15)g/mL。

进一步地，步骤(7)中冻存时细胞密度为4×10⁶个细胞/mL。

进一步地，步骤(7)中冻存液由以下组分组成且各组分的质量分数为：80％无血清培养基(Cellgenix)、10％人血白蛋白(Sigma)和10％二甲基砜(Origen)。

本发明提供的一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法，具有以下有益效果：

(1)本发明使用的提取方法，步骤简单，脂肪组织没有使用胶原酶消化，只需直接贴壁培养即可得到纯度高的脂肪间充质干细胞，不仅简化了工艺流程，而且避免引入较多的外援干扰因素，使得工艺稳定性较易控制。

(2)本发明采用离心法去除油脂和红细胞，不会产生大量红细胞，不需要采用红细胞裂解液或低分子肝素钙去除红细胞，不会对人脂肪间充质干细胞造成潜在风险，同时还节约了成本。

(3)本发明方法采用完全无血清培养技术，避免了动物源血清成分的干扰，安全性高，达到临床级别建库工艺，有利于后期的临床应用。

(4)该库为健康成年人储存脂肪间充质干细胞，为其本人及家庭成员或许可第三方在需要采用脂肪间充质干细胞移植治疗各种疾病或进行医疗美容时，提供临床适用的脂肪间充质干细胞和干细胞制剂。

附图说明

图1为脂肪组织冻存2个月、6个月、12个月后复苏培养的细胞生长情况；其中图1-1至1-4分别为未经冻存的脂肪组织培养的P0代细胞生长情况，脂肪组织冻存2个月后复苏培养的P0代细胞生长情况，脂肪组织冻存6个月后复苏培养的P0代细胞生长情况，脂肪组织冻存12个月后复苏培养的P0代细胞生长情况；图1-5至1-8分别为未经冻存的脂肪组织培养的P3代细胞生长情况，脂肪组织冻存2个月后复苏培养的P3代细胞生长情况，脂肪组织冻存6个月后复苏培养的P3代细胞生长情况，脂肪组织冻存12个月后复苏培养的P3代细胞生长情况。

图2为脂肪间充质干细胞多向诱导分化图；其中图2-1为对照图；其中图2-2为成脂诱导分化；图2-3为成软骨诱导分化；图2-4为成骨诱导分化。

图3为脂肪间充质干细胞阴性细胞表面标志物检测结果图；其中图3-1至3-5为未经冻存的脂肪组织培养的P3代细胞表面标志物检测结果；图3-6至3-10为脂肪组织冻存2个月后复苏培养的P3代细胞表面标志物检测结果；图3-11至3-15为脂肪组织冻存6个月后复苏培养的P3代细胞表面标志物检测结果；图3-16至3-20为脂肪组织冻存12个月后复苏培养的P3代细胞表面标志物检测结果。

图4为脂肪间充质干细胞阳性细胞表面标志物检测结果图；其中图4-1至4-3为未经冻存的脂肪组织培养的P3代细胞表面标志物检测结果；图4-4至4-6为脂肪组织冻存2个月后复苏培养的P3代细胞表面标志物检测结果；图4-7至4-9为脂肪组织冻存6个月后复苏培养的P3代细胞表面标志物检测结果；图4-10至4-12为脂肪组织冻存12个月后复苏培养的P3代细胞表面标志物检测结果。

图5为脂肪间充质干细胞核型分析图；其中图5-1为未经冻存的脂肪组织培养的P3代细胞核型分析；图5-2为脂肪组织冻存2个月后复苏培养的P3代细胞核型分析；图5-3为脂肪组织冻存6个月后复苏培养的P3代细胞核型分析；图5-4为脂肪组织冻存12个月后复苏培养的P3代细胞核型分析。

图6为脂肪间充质干细胞分泌的细胞因子检测结果图。

具体实施方式

实施例1脂肪间充质干细胞的分离

(1)与供者签订知情同意书，采集30mL女性(25岁)腹部脂肪组织，同时采集10mL供者血样并检测供者血型、HLA-ABC/DR配型、传染病(乙肝两对半、丙肝、巨细胞病毒、EB病毒、梅毒、艾滋病病毒)，保证其各项指标正常，然后将供者的脂肪组织剪成1-5mm³大小并将其平均分成3份，分别装于50mL离心管中，加入30mL无菌生理盐水，于20℃、4000r/min条件下离心15min，目的是进行脂肪组织脱油和去除脂肪组织中的红细胞；

(2)离心完毕后，去除上层的油层，然后将处于中间层的脂肪组织转入新的离心管，加入生理盐水清洗1-2次；

(3)收集步骤(2)中的脂肪组织块，称取2g接种于T175培养瓶(Corning)中，加入12mL完全培养基，然后置于37℃、5％CO₂潮湿培养箱中培养；其中完全培养基成分为：无血清培养基(Cellgenix)、30ng/mL bFGF(Cellgenix)、10ng/mL胰岛素(Gibco)和体积浓度为2％的GlutaMAX(Gibco)；细胞生长情况见图1-1；

(4)收集步骤(2)中的脂肪组织块，称取6g冻存于6mL冻存液中，冻存液由以下组分组成且各组分的质量分数为：80％无血清培养基(Cellgenix)、10％人血白蛋白(Sigma)和10％二甲基砜(Origen)，冻存的脂肪组织经程序降温至-80℃后转入液氮罐中，冻存时间分别为2个月、6个月、12个月。

实施例2脂肪组织的复苏、传代培养及冻存

(1)将冻存时间达到2个月、6个月、12个月的脂肪组织分别经37℃水浴复苏；

(2)取出脂肪组织加入到50mL离心管中，加入30mL无菌生理盐水，于4℃、1200r/min条件下离心3min；

(3)收集步骤(2)中的脂肪组织块，称取2g接种于T175培养瓶(Corning)中，加入12mL完全培养基，然后置于37℃、5％CO₂潮湿培养箱中培养，每7天更换一次培养基；冻存2个月、6个月、12个月的脂肪组织经复苏培养的P0代细胞生长情况见图1-2、1-3、1-4；

(4)待细胞融合度为70％时，用TrypLE^TM Select(Gibco)消化细胞，消化后进行离心处理，1200r/min离心3min，收集细胞，按照1×10⁴个细胞/cm²的密度接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基传代培养，培养至细胞融合度达到70％～90％。未经冻存、冻存2个月、冻存6个月、冻存12个月的脂肪组织培养的P3代细胞生长情况见图1-5、1-6、1-7、1-8；

(5)将P3代细胞按密度4×10⁶个细胞/mL重悬于冻存液(成分及质量分数：80％无血清培养基(Cellgenix)、10％人血白蛋白(Sigma)、10％二甲基砜(Origen))中，冻存体积为1mL，然后经程序降温到-80℃后放置于液氮罐中长期保存。

由图1可得，未经冻存、冻存2个月、冻存6个月、冻存12个月的脂肪组织培养的P0代细胞培养物中均含有脂肪油滴，呈圆形发亮斑点，当细胞传代培养至P3代时，细胞培养物中的脂肪油滴消失。

实施例3脂肪间充质干细胞生物学特性鉴定

1、多向诱导分化潜能的鉴定

将P3代脂肪间充质干细胞接种于六孔板中，每孔接种1×10⁵个细胞，每孔加入2mL完全培养基，每个样本设置3个重复，每两天更换一次培养基，待细胞融合度为70％时分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基(Cyagen)各2mL，以添加完全培养基作为空白对照，每2-3天更换一次诱导培养基，持续培养2-3周后，去除诱导培养基并用PBS清洗一次，加入2mL多聚甲醛溶液(4％，v/v)固定30min，然后去除多聚甲醛溶液并用PBS清洗两次，采用染色液染色，成骨诱导、成软骨诱导染色时间为2-3min；成脂诱导染色时间为30min，然后移除染色液并加入1mL PBS溶液清洗一次，最后置于倒置显微镜下观察、拍摄照片，结果见图2。

由图2可知，经过2-3周的诱导培养，脂肪间充质干细胞能够进行成脂、成骨、成软骨诱导分化。

2、表面标志物检测

将融合度为90％的P3代脂肪间充质干细胞用TrypLE^TMSelect消化处理后，计数并调节密度为1×10⁶个细胞/mL的细胞悬浮液，100μm细胞筛网过滤后，分别加入10μL荧光标记的细胞表面标志物抗体于1mL细胞悬液中，置于4℃、避光条件下孵育20min，并以未进行抗体标记的等量细胞悬液作为空白对照；所使用的抗体有：CD11b-FITC、CD19-ECD、CD34-PE、CD45-PC7、CD73-PE、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-PC7；孵育完成后，用冷的生理盐水(4℃)清洗一次，1200r/min离心5min，弃上清，加入250μL生理盐水混匀，并加入250μL的1％多聚甲醛固定，标记后的细胞采用Beckman公司的流式细胞分析仪进行检测分析，检测的细胞分4种：未经冻存的脂肪组织培养的P3代细胞；冻存2个月后复苏的脂肪组织培养的P3代细胞；冻存6个月后复苏的脂肪组织培养的P3代细胞；冻存12个月后复苏的脂肪组织培养的P3代细胞；结果见图3和4。

由图3和4可知，表面含标志物的细胞率分别为：

未冻存：CD11b：0.03％；CD19：0.90％；CD34：1.98％；CD45：0.42％；HLA-DR：0.16％；CD73：99.39％；CD90：99.98％；CD105：83.63％；

冻存2个月：CD11b：1.29％；CD19：0.98％；CD34：0.40％；CD45：0.87％；HLA-DR：1.06％；CD73：97.51％；CD90：99.99％；CD105：99.91％；

冻存6个月：CD11b：0.41％；CD19：1.15％；CD34：1.38％；CD45：0.41％；HLA-DR：0.59％；CD73：97.44％；CD90：99.91％；CD105：99.92％；

冻存12个月：CD11b：0.44％；CD19：1.91％；CD34：1.40％；CD45：0.38％；HLA-DR：0.54％；CD73：99.39％；CD90：99.89％；CD105：98.78％。

经流式检测分析发现脂肪间充质干细胞几乎不表达造血细胞表面标志如CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR；表达间充质干细胞阳性标志物如CD73、CD90、CD105。

3、脂肪间充质干细胞核型分析

将1×10⁶个P3代细胞分别接种于T75培养瓶中，然后加入10mL完全培养基，放置于37℃、5％CO₂培养箱内，培养48-72小时后收获，收获前加入0.2％浓度的秋水仙素，37℃，孵育4小时后收获，收获后通过离心、弃上清、低渗、固定、滴片，最后染色显带；此外将收获的细胞冻存2个月、6个月、12个月后分别复苏，进行核型分析，分析结果见图5。

经核型分析，脂肪间充质干细胞在传代后均未出现明显的染色体异常。

4、脂肪间充质干细胞分泌的细胞因子检测

按每个T175培养瓶接种2×10⁶个P3代脂肪间充质干细胞，加入20mL完全培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞融合度达到80％时去除培养基，加入10mL DMEM(Hyclone)并放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，收集培养液，20℃、4000r/min离心20min，吸取上清液，参照ELISA检测试剂盒说明书(R&D)检测各个细胞因子(IGF-1、PDGF、HGF、EGF、FGF、VEGF)的表达量，结果见图6。

由结果可知，脂肪间充质干细胞分泌较高的VEGF(血管内皮生长因子)、HGF(肝细胞因子)，FGF(成纤维细胞生长因子)，分泌少量PDGF(血小板生长因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子)和EGF(表皮生长因子)。

实施例4脂肪间充质干细胞数据库的建立

1、细胞活性的检测

利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。

2、细胞感染的检测

利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。利用病原学方法，检测细胞是否受到乙肝两对半(HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb)、丙肝(HCVAb)、艾滋(HIV-1/2Ab)、巨细胞病毒(CMV-IgA)、EB病毒和梅毒感染。

3、遗传病的检测

利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。

4、HLA-ABC/DR配型

检测细胞HLA-ABC/DR表型，并记录在案。

5、细胞来源的调查

记录供者详细资料，并记录在案。

6、脂肪间充质干细胞数据库的建立

在保存正常的脂肪间充质干细胞后，建立脂肪间充质干细胞的数据库，其中包括前五项资料，并建立与冻存细胞的关联。