本发明属于组织工程领域，具体涉及一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法。
背景技术：
白癜风是一种常见的原发性局限或泛发的皮肤色素脱失性疾病，由皮肤的黑色素细胞功能消失引起，目前机制尚不清楚。其发病率约为1%。白癜风患者可能在社会上遭到歧视，给患者带来巨大的心理压力，严重影响了患者的正常生活。
目前对于白癜风的治疗，多种多样，例如药物治疗、光化学治疗、紫外线治疗、激光治疗、外科皮肤移植治疗、细胞移植治疗等。但上述方法对局部小面积症状患者疗效较好，而对于四肢、躯干等大面积症状则疗效不理想。
新近开发出来的自体黑色素细胞培养移植是一种有效的治疗方法，其通过外科手术获得患者正常皮肤或毛囊组织，分出其中的黑色素细胞，体外大量培养，之后再移植至患处。其对于较大面积的皮损具有较好的疗效。然而这种方法需要通过手术获取患者正常组织的皮肤或毛囊，给患者增加了额外的痛苦，同时由于种子细胞的来源受限，自体表皮黑色素细胞培养移植也具有一定局限性。
另一方面，近年来，人脂肪组织间充质干细胞（adscs）引起科学工作者广泛的关注。其易于获得，对正常组织无影响，产率高，易培养；具有多能性，可分化成各种组织细胞，在组织工程学中，常被用来作为种子细胞。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中的产率低、不易培养的缺陷，提供一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法来解决上述问题。
本发明公开了一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法，具体步骤为：
一、黑色素细胞条件培养基制备：
（1）、取第五代人表皮黑色素细胞株接种于含有30ml黑素细胞完全培养基的t75细胞培养瓶，接种密度为5×103/ml；
（2）、观察细胞生长状态，进入快速生长期后，予以低剂量窄谱紫外线照射（nb-uvb）,强度为0.5j/cm2，时间为26-34s；
（3）、24h后收集上清，离心5min；
（4）、将上清用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，即制得黑素细胞条件培养基，4℃避光保存，备用；
二、脂肪间充质干细胞的制备：
（5）、通过外科方式获得脂肪组织；
（6）、用外科手术剪把脂肪组织剪碎成1mm3的小块；
（7）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型胶原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培养基10ml，在37℃的条件下，消化55-65min；
（8）、吹打上述细胞悬液4-5次，在室温条件下，以860×g的转速，离心10min；
（9）、吸弃上层悬浮脂肪颗粒和成熟脂肪细胞，获取底部细胞团，采用pbs溶液重悬细胞，并用100μm孔径滤膜过滤；
（10）、对细胞滤液计数，加入过量的1×bdimag™buffer，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清；
（11）、把cd31磁珠彻底涡旋均匀，然后每1×107个细胞加50μlcd31磁珠，混合均匀后，在30℃的条件下孵育25-35min；
（12）、用bdimag™buffer把体系调整到1-8×107个/ml细胞之后，迅速把标记好的体系放到磁力架上孵育8-10分钟；
（13）、吸出磁力架上的流式管里面的液体上清，上清细胞为cd31-细胞，此时即为去除了内皮细胞后，纯化的脂肪干细胞；
（14）、在1500rpm条件下，将上清液离心2-8min，弃上清；
（15）、将上述细胞置于37℃，5%co2培养箱中，用10mldmem培养基进行培养，每周换液2次；
（16）、细胞融合度达到80%以上后，吸干培养液，加入pbs液，在1500rpm条件下离心2-8min，弃上清，再加入pbs液，在1500rpm条件下离心2-8min，弃上清；
（17）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml高糖dmem培养基终止消化；
（18）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用高糖dmem培养基洗3次；
（19）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸庆大霉素的dmem培养基进行培养；
三、黑色素细胞定向分化
（20）、第4代脂肪间充质干细胞，以5×104/ml密度接种于t75细胞培养瓶；
（21）、细胞生长至80%融合度后，吸干细胞培养液，加入等体积的黑素细胞诱导培养基置于37℃，5%的co2温箱进行培养；
（22）、细胞生长至90%融合度时，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml黑色素细胞诱导培养基培养基终止消化；
（23）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用黑色素细胞诱导培养基洗3次；
（24）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用黑色素细胞诱导培养继续培养；
（25）、培养至第6周，予以低剂量nb-uvb照射，强度为0.5j/cm2，时间为30s，每周一次，至第10周为止，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的人表皮黑色素细胞株和黑素细胞完全培养基均购自上海拜沃生物公司。
作为优选，所述的步骤（3）中，离心速度为1500rpm。
作为优选，所述的步骤（5）中，所述的脂肪组织的体积为20cm3。
作为优选，所述的步骤（15）中，所述的dmem培养基中含10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸庆大霉素。
作为优选，所述的步骤（21）中，所述的黑素细胞诱导培养基配方为：基础培养基为m254，含10%（v/v）fbs、10%（v/v）黑素细胞条件培养基、5ng/mlwnt-3a、0.05μm地塞米松、1×胰岛素铁硒传递蛋白、1mg/mlla-bsa（亚油酸-牛血清白蛋白）、10-4m抗坏血酸、100nmet-3（内皮素-3）、50ng/mlscf（干细胞因子）、20pmct(霍乱毒素)、50nmtpa(佛波醇酯)、4ng/mlbfgf（碱性成纤维细胞生长因子），以及40u/ml硫酸庆大霉素。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、选取自体脂肪间充质干细胞作为种子细胞的来源，来源广泛，不受限制；
2、本发明通过bdimag™系统获得高纯度的adscs细胞；
3、本发明应用黑色素细胞条件培养基，其中含有大量的黑色素细胞分泌物，可作为诱导因子，
4、诱导过程中，采用窄谱紫外线低剂量照射培养细胞，促进黑色素细胞成熟，提高了adscs向黑色素细胞分化率。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明公开了一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法，具体步骤为：
一、黑色素细胞条件培养基制备：
（1）、取第五代人表皮黑色素细胞株接种于含有30ml黑素细胞完全培养基的t75细胞培养瓶，接种密度为5×103/ml；
（2）、观察细胞生长状态，进入快速生长期后，予以低剂量窄谱紫外线照射（nb-uvb）,强度为0.5j/cm2，时间为26-34s；
（3）、24h后收集上清，离心5min；
（4）、将上清用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，即制得黑素细胞条件培养基，4℃避光保存，备用；
二、脂肪间充质干细胞的制备：
（5）、通过外科方式获得脂肪组织；
（6）、用外科手术剪把脂肪组织剪碎成1mm3的小块；
（7）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型胶原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培养基10ml，在37℃的条件下，消化55-65min；
（8）、吹打上述细胞悬液4-5次，在室温条件下，以860×g的转速，离心10min；
（9）、吸弃上层悬浮脂肪颗粒和成熟脂肪细胞，获取底部细胞团，采用pbs溶液重悬细胞，并用100μm孔径滤膜过滤；
（10）、对细胞滤液计数，加入过量的1×bdimag™buffer，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清；
（11）、把cd31磁珠彻底涡旋均匀，然后每1×107个细胞加50μlcd31磁珠，混合均匀后，在30℃的条件下孵育25-35min；
（12）、用bdimag™buffer把体系调整到1-8×107个/ml细胞之后，迅速把标记好的体系放到磁力架上孵育8-10分钟；
（13）、吸出磁力架上的流式管里面的液体上清，上清细胞为cd31-细胞，此时即为去除了内皮细胞后，纯化的脂肪干细胞；
（14）、在1500rpm条件下，将上清液离心2-8min，弃上清；
（15）、将上述细胞置于37℃，5%co2培养箱中，用10mldmem培养基进行培养，每周换液2次；
（16）、细胞融合度达到80%以上后，吸干培养液，加入pbs液，在1500rpm条件下离心2-8min，弃上清，再加入pbs液，在1500rpm条件下离心2-8min，弃上清；
（17）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml高糖dmem培养基终止消化；
（18）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用高糖dmem培养基洗3次；
（19）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸庆大霉素的dmem培养基进行培养；
三、黑色素细胞定向分化
（20）、第4代脂肪间充质干细胞，以5×104/ml密度接种于t75细胞培养瓶；
（21）、细胞生长至80%融合度后，吸干细胞培养液，加入等体积的黑素细胞诱导培养基置于37℃，5%的co2温箱进行培养；
（22）、细胞生长至90%融合度时，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml黑色素细胞诱导培养基培养基终止消化；
（23）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用黑色素细胞诱导培养基洗3次；
（24）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用黑色素细胞诱导培养继续培养；
（25）、培养至第6周，予以低剂量nb-uvb照射，强度为0.5j/cm2，时间为30s，每周一次，至第10周为止，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的人表皮黑色素细胞株和黑素细胞完全培养基均购自上海拜沃生物公司。
作为优选，所述的步骤（3）中，离心速度为1500rpm。
作为优选，所述的步骤（5）中，所述的脂肪组织的体积为20cm3。
作为优选，所述的步骤（15）中，所述的dmem培养基中含10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸庆大霉素。
作为优选，所述的步骤（21）中，所述的黑素细胞诱导培养基配方为：基础培养基为m254，含10%（v/v）fbs、10%（v/v）黑素细胞条件培养基、5ng/mlwnt-3a、0.05μm地塞米松、1×胰岛素铁硒传递蛋白、1mg/mlla-bsa（亚油酸-牛血清白蛋白）、10-4m抗坏血酸、100nmet-3（内皮素-3）、50ng/mlscf（干细胞因子）、20pmct(霍乱毒素)、50nmtpa(佛波醇酯)、4ng/mlbfgf（碱性成纤维细胞生长因子），以及40u/ml硫酸庆大霉素。
实施例1
本发明公开了一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法，具体步骤为：
一、黑色素细胞条件培养基制备：
（1）、取第五代人表皮黑色素细胞株接种于含有30ml黑素细胞完全培养基的t75细胞培养瓶，接种密度为5×103/ml；
（2）、观察细胞生长状态，进入快速生长期后，予以低剂量窄谱紫外线照射（nb-uvb）,强度为0.5j/cm2，时间为30s；
（3）、24h后收集上清，离心5min；
（4）、将上清用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，即制得黑素细胞条件培养基，4℃避光保存，备用；
二、脂肪间充质干细胞的制备：
（5）、通过外科方式获得脂肪组织；
（6）、用外科手术剪把脂肪组织剪碎成1mm3的小块；
（7）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型胶原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培养基10ml，在37℃的条件下，消化60min；
（8）、吹打上述细胞悬液4次，在室温条件下，以860×g的转速，离心10min；
（9）、吸弃上层悬浮脂肪颗粒和成熟脂肪细胞，获取底部细胞团，采用pbs溶液重悬细胞，并用100μm孔径滤膜过滤；
（10）、对细胞滤液计数，加入过量的1×bdimag™buffer，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清；
（11）、把cd31磁珠彻底涡旋均匀，然后每1×107个细胞加50μlcd31磁珠，混合均匀后，在30℃的条件下孵育30min；
（12）、用bdimag™buffer把体系调整到1-8×107个/ml细胞之后，迅速把标记好的体系放到磁力架上孵育10分钟；
（13）、吸出磁力架上的流式管里面的液体上清，上清细胞为cd31-细胞，此时即为去除了内皮细胞后，纯化的脂肪干细胞；
（14）、在1500rpm条件下，将上清液离心5min，弃上清；
（15）、将上述细胞置于37℃，5%co2培养箱中，用10mldmem培养基进行培养，每周换液2次；
（16）、细胞融合度达到80%以上后，吸干培养液，加入pbs液，在1500rpm条件下离心5min，弃上清，再加入pbs液，在1500rpm条件下离心5min，弃上清；
（17）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml高糖dmem培养基终止消化；
（18）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用高糖dmem培养基洗3次；
（19）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸庆大霉素的dmem培养基进行培养；
三、黑色素细胞定向分化
（20）、第4代脂肪间充质干细胞，以5×104/ml密度接种于t75细胞培养瓶；
（21）、细胞生长至80%融合度后，吸干细胞培养液，加入等体积的黑素细胞诱导培养基置于37℃，5%的co2温箱进行培养；
（22）、细胞生长至90%融合度时，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml黑色素细胞诱导培养基培养基终止消化；
（23）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用黑色素细胞诱导培养基洗3次；
（24）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用黑色素细胞诱导培养继续培养；
（25）、培养至第6周，予以低剂量nb-uvb照射，强度为0.5j/cm2，时间为30s，每周一次，至第10周为止，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的人表皮黑色素细胞株和黑素细胞完全培养基均购自上海拜沃生物公司。
作为优选，所述的步骤（3）中，离心速度为1500rpm。
作为优选，所述的步骤（5）中，所述的脂肪组织的体积为20cm3。
作为优选，所述的步骤（15）中，所述的dmem培养基中含10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸庆大霉素。
作为优选，所述的步骤（21）中，所述的黑素细胞诱导培养基配方为：基础培养基为m254，含10%（v/v）fbs、10%（v/v）黑素细胞条件培养基、5ng/mlwnt-3a、0.05μm地塞米松、1×胰岛素铁硒传递蛋白、1mg/mlla-bsa（亚油酸-牛血清白蛋白）、10-4m抗坏血酸、100nmet-3（内皮素-3）、50ng/mlscf（干细胞因子）、20pmct(霍乱毒素)、50nmtpa(佛波醇酯)、4ng/mlbfgf（碱性成纤维细胞生长因子），以及40u/ml硫酸庆大霉素。
实施例2
本发明公开了一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法，具体步骤为：
一、黑色素细胞条件培养基制备：
（1）、取第五代人表皮黑色素细胞株接种于含有30ml黑素细胞完全培养基的t75细胞培养瓶，接种密度为5×103/ml；
（2）、观察细胞生长状态，进入快速生长期后，予以低剂量窄谱紫外线照射（nb-uvb）,强度为0.5j/cm2，时间为32s；
（3）、24h后收集上清，离心5min；
（4）、将上清用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，即制得黑素细胞条件培养基，4℃避光保存，备用；
二、脂肪间充质干细胞的制备：
（5）、通过外科方式获得脂肪组织；
（6）、用外科手术剪把脂肪组织剪碎成1mm3的小块；
（7）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型胶原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培养基10ml，在37℃的条件下，消化57min；
（8）、吹打上述细胞悬液4次，在室温条件下，以860×g的转速，离心10min；
（9）、吸弃上层悬浮脂肪颗粒和成熟脂肪细胞，获取底部细胞团，采用pbs溶液重悬细胞，并用100μm孔径滤膜过滤；
（10）、对细胞滤液计数，加入过量的1×bdimag™buffer，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清；
（11）、把cd31磁珠彻底涡旋均匀，然后每1×107个细胞加50μlcd31磁珠，混合均匀后，在30℃的条件下孵育28min；
（12）、用bdimag™buffer把体系调整到7×107个/ml细胞之后，迅速把标记好的体系放到磁力架上孵育9分钟；
（13）、吸出磁力架上的流式管里面的液体上清，上清细胞为cd31-细胞，此时即为去除了内皮细胞后，纯化的脂肪干细胞；
（14）、在1500rpm条件下，将上清液离心6min，弃上清；
（15）、将上述细胞置于37℃，5%co2培养箱中，用10mldmem培养基进行培养，每周换液2次；
（16）、细胞融合度达到80%以上后，吸干培养液，加入pbs液，在1500rpm条件下离心3min，弃上清，再加入pbs液，在1500rpm条件下离心3min，弃上清；
（17）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml高糖dmem培养基终止消化；
（18）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用高糖dmem培养基洗3次；
（19）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸庆大霉素的dmem培养基进行培养；
三、黑色素细胞定向分化
（20）、第4代脂肪间充质干细胞，以5×104/ml密度接种于t75细胞培养瓶；
（21）、细胞生长至80%融合度后，吸干细胞培养液，加入等体积的黑素细胞诱导培养基置于37℃，5%的co2温箱进行培养；
（22）、细胞生长至90%融合度时，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml黑色素细胞诱导培养基培养基终止消化；
（23）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用黑色素细胞诱导培养基洗3次；
（24）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用黑色素细胞诱导培养继续培养；
（25）、培养至第6周，予以低剂量nb-uvb照射，强度为0.5j/cm2，时间为30s，每周一次，至第10周为止，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的人表皮黑色素细胞株和黑素细胞完全培养基均购自上海拜沃生物公司。
作为优选，所述的步骤（3）中，离心速度为1500rpm。
作为优选，所述的步骤（5）中，所述的脂肪组织的体积为20cm3。
作为优选，所述的步骤（15）中，所述的dmem培养基中含10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸庆大霉素。
作为优选，所述的步骤（21）中，所述的黑素细胞诱导培养基配方为：基础培养基为m254，含10%（v/v）fbs、10%（v/v）黑素细胞条件培养基、5ng/mlwnt-3a、0.05μm地塞米松、1×胰岛素铁硒传递蛋白、1mg/mlla-bsa（亚油酸-牛血清白蛋白）、10-4m抗坏血酸、100nmet-3（内皮素-3）、50ng/mlscf（干细胞因子）、20pmct(霍乱毒素)、50nmtpa(佛波醇酯)、4ng/mlbfgf（碱性成纤维细胞生长因子），以及40u/ml硫酸庆大霉素。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。