一种抗原特异性T细胞的培养方法和一种DC细胞抗原递呈能力检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于生物技术及医学检验领域，具体地说，涉及一种抗原特异性T细胞培养方法、一种DC抗原递呈能力检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

树突状细胞（DC）是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原递呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。因此，研发有效的DC疫苗已经成为是肿瘤细胞免疫治疗的研究热点。目前研究发现，不同种类的抗原递呈细胞对肿瘤抗原的递呈和诱导T细胞应答功能差异显著。DC疫苗在操作上具有很大的灵活性，包括DC的来源、分离方法、抗原引入方法、延长存活时间、提高活性等各个方面都有许多不同的操作方法，每种方法都各有优势，因此可以通过不同的优化、组合衍化出多种治疗方法，从而适应于不同条件的患者。因此，选择一种高效的体外筛选机制来直观检测抗原递呈系统的递呈能力进而提高肿瘤免疫治疗方案的筛选效率是目前需要解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，从而提供一种抗原特异性T细胞培养方法、一种DC抗原递呈能力检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案为：一种抗原特异性T细胞的培养方法，其特征在于，它按如下步骤制备：

（1）分离人外周血单核细胞既PBMC

从供体抽取10mL抗凝血，用2倍体积的PBS稀释，在稀释后的混合液体底部加入5mL人淋巴细胞分离液，离心后收集中间云雾层细胞既PBMC；

（2）用人CMV抗原肽诱导PBMC中的T细胞

将步骤（1）分离得到的PBMC计数，以2×10⁶/mL重悬于CMX培养基中，每孔2mL细胞悬液接种于6孔细胞培养板，将所述6孔细胞培养板放入 37℃、5%（V/V）CO₂的恒温培养箱中静置1-2h，然后取出未贴壁的细胞，再加入终浓度为20ng/mL的人CMV抗原肽多表位混合物，以5mL每孔细胞悬液接种于新的6孔细胞培养板，孵育48小时，所述CMX培养基为含10%（V/V）胎牛血清的混合培养基，所述混合培养基为RPMI 1640培养基与X-VIVO 15培养基以体积比1:1混和组成；

（3）扩增人CMV抗原肽特异性T细胞

孵育后，在步骤（2）中含人CMV抗原肽的PBMC培养体系中加入终浓度为1000U/mL的人白细胞介素2（hIL-2），收集PBMC，然后加入等体积的所述CMX培养基,本次添加的所述CMX培养基中含终浓度为1000U/mL的hIL-2，再将最终的PBMC培养体系扩增至2倍量的6孔细胞板培养，保持每孔5mL细胞悬液；

每隔2-3天，按同样方法将上述PBMC培养体系扩增至2倍量的6孔板培养，共培养2周。

一种用于检测DC抗原提呈能力的试剂盒，包括抗原蛋白、蛋白转运抑制剂Brefeldin A、流式抗体、权利要求1中的所述CMX培养基和扩增得到的人CMV抗原特异性T细胞，所述抗原蛋白是纯度为95%的人pp65蛋白，所述流式抗体为鼠抗人CD3-PerCP或鼠抗人CD4-FITC或鼠抗人CD8-PE或鼠抗人IFN-γ-APC。

一种利用权利要求2中所述检测试剂盒检测DC细胞抗原提呈能力的检测方法，包括如下步骤：

（1）用人pp65蛋白负载DC，所述人pp65蛋白终浓度为10ng/mL，置于细胞培养箱孵育6h；

（2）加入人CMV抗原特异性T细胞，每孔5×10⁵个细胞，继续孵育12h；

（3）加入终浓度为10μg/mL的蛋白转运抑制剂Brefeldin A，继续孵育12h；

（4）用流式细胞仪分析人CMV抗原特异性T细胞经诱导表达IFN-γ的水平，根据阳性反应率确定DC抗原递呈能力。

本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著地进步，具体的说，本发明所述的抗原特异性T细胞的培养方法在T细胞培养过程中采用更高浓度的IL-2，诱导T细胞在维持活性过程快速增殖，快速获得更多扩增倍数抗原特异性T细胞。本发明所述DC抗原递呈能力检测试剂盒以人CMV抗原特异性T细胞为传感检测平台，只需简单的共孵育即可完成反应，操作简单，以流式细胞术检测T细胞应答率高，敏感性高，特异性好，能够准确反应DC细胞抗原递呈能力。进一步说，本发明培养得到的抗原特异性T细胞可冻存后持续使用在同个体免疫治疗方案的筛选，实用性强。再一步说，本发明选择的CMV抗原在人群中感染广泛，故可以作为适用范围广泛的模式抗原，用于检测不同个体免疫状态的差别，适用性广。

附图说明

图1是培养14天后CD8+T细胞的扩增倍数的柱状图；

图2是流式细胞仪检测下观察培养的T细胞的表型图；

图3为#1、#2和#3三位供者体外培养的T细胞对CMV抗原肽的应答能力对比柱状图；

图4是用本本发明中的试剂盒检测不同免疫佐剂协助DC细胞抗原递呈的对比柱状图；

图5是用本发明中的试剂盒检测不同亚群DC抗原交叉递呈能力的对比柱状图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

实施例1

人CMV抗原特异性T细胞培养与扩增

1. 人外周血单核细胞（PBMC）的分离：

从受试供者抽取10mL抗凝血，转移至50mL离心管，用2倍体积的PBS稀释，在所述离心管底部缓慢加入5mL人淋巴细胞分离液，以密度剃度离心法离心后收集中间云雾层细胞即为PBMC。

2．用人CMV抗原肽诱导PBMC中的T细胞：

将步骤1分离得到的PBMC计数，以2×10⁶/mL重悬于CMX培养基中，每孔2mL细胞悬液接种于6孔细胞培养板。CMX为含10%（V/V）胎牛血清的混合培养基，所述混合培养基是RPMI 1640培养基与X-VIVO 15培养基以体积比1:1混匀。将所述6孔细胞培养板放入 37℃、5%（V/V）CO₂的恒温培养箱中静置2h。2h后，取出未贴壁的细胞，计数，同时加入终浓度为20ng/mL的人CMV抗原肽多表位混合物，以5mL每孔细胞悬液接种于新的6孔细胞培养板，孵育48小时。

3．扩增人CMV抗原肽特异性T细胞：

在步骤2孵育后的含抗原肽的PBMC培养体系中加入终浓度为1000U/mL的人白细胞介素2（IL-2）。培养2天后，收集人CMV抗原肽特异性T细胞，并加入等体积的所述CMX培养基，所述CMX培养基还含有1000U/mL的人IL-2；将人CMV抗原肽特异性T细胞扩增至2倍量的6孔细胞板培养，保持每孔大约5mL细胞悬液。每隔2天，按同样方法扩增至2倍量的6孔板培养，共培养2周，得到扩增的人CMV抗原肽特异性T细胞。

4、扩增人CMV抗原肽特异性T细胞的保存：

将扩增得到的人CMV抗原肽特异性T细胞按每管1mL冻存液含50×10⁶细胞量冻存在液氮中，冻存液为含10%（V/V）DMSO的胎牛血清溶液，经检验复苏后细胞存活率大于70%。

5、人CMV抗原肽特异性T细胞扩增效率检测：

（a）扩增倍数：收集扩增得到的细胞并计数，计算扩增倍数，结果显示，T细胞扩增倍数约1000倍，结果如图1。

（b）表型鉴定：取出部分扩增后得到的细胞，做流式细胞术检测，检测扩增体系中CD3、CD4、CD8分子的表达。如图2显示，T细胞扩增后纯度达95%以上。

6、用人CMV抗原肽刺激上述方法培养得到的T细胞

将培养得到的T细胞重悬于新的不含IL-2的CMX培养基，以每孔1×10⁵接种于圆底96孔细胞培养板，每孔终体积200μL。每孔加入终浓度为20ng/mL的CMV抗原肽及终浓度为10μg/mL的蛋白转运抑制剂Brefeldin A共培养6h。6h后用流式细胞术细胞内染色方法，标记鼠抗人CD3-PerCP、鼠抗人CD4-FITC、鼠抗人CD8-PE及鼠抗人IFN-γ-APC，其中先用live/dead染料标记出死细胞，观察不同T细胞表达IFN-γ的水平。如图3所示，扩增的T细胞反应率达60%以上。

实施例2

用本发明的试剂盒检测不同免疫佐剂协助抗原递呈细胞交叉递呈效率的能力：

1.培养DC:

（1）分离PBMC，按时间梯度贴壁法分离外周血中的单个核细胞。将PBMC以2×10⁶/mL重悬于CMX培养基中，细胞悬液每孔2mL接种于6孔细胞培养板，再将所述6孔细胞培养板放入 37℃、5%（V/V）CO₂的恒温培养箱中静置2h。

（2）将步骤（1）培养后的细胞板吸出悬浮细胞，并用PBS洗涤培养板，完全去除未贴壁细胞。每孔加2mL含人GM-CSF（100ng/mL）和人IL-4（10ng/mL）的CMX培养基。放入 37℃、5%（V/V）CO₂的恒温培养箱中培养，每3天半量换含细胞因子的培养液。7天后，收集DC。

2. 抗原递呈反应体外实验：

（1）将培养得到的DC以每孔5×104重悬于50μL培养液接种于圆底96孔细胞培养板。

（2）分别为每孔加终体积为10μL的不同免疫佐剂与抗原递呈细胞孵育2h，佐剂包括：

a. 不加任何佐剂；

b. Pam3CSK4，反应终浓度10ng/mL；

c. Poly(I:C)，反应终浓度25μg/mL；

d. MPL，反应终浓度10ng/mL；

e. Imiquimod，反应终浓度10ng/mL；

f. R848，反应终浓度10ng/mL;

g. ODN 2395，反应终浓度10ng/mL；

h. ODN M326，反应终浓度10ng/mL。

（3）2h后，分别往各组加入40μL溶于CMX培养基中的人pp65抗原蛋白，抗原终浓度为10ng/mL。置于细胞培养箱孵育6h，包括：

a. 不含任何抗原组；

b. 人pp65抗原蛋白组。

（4）抗原与抗原递呈细胞孵育6h后，加入实施例1培养得到的T细胞，每孔5×10⁵重悬于100μL所述CMX培养基中，并加入之前的反应体系中，继续孵育12h。

（5）12h后，往混合的反应体系中加入50μL含Brefeldin A（终浓度10μg/mL）的CMX培养基，继续孵育12h。

（6）反应完全后，取出96孔细胞培养板，流式细胞术细胞内染色，检测各组T细胞经诱导表达IFN-γ的水平。染色抗体为：

a．CD3-PerCP

b．CD4-FITC

c．CD8-PE

d．IFN-γ-APC

（7）FlowJo软件分析流式数据。如图4所示，在人体系中Poly(I:C)是很有效的协助树突状细胞将抗原交叉递呈至T细胞的免疫佐剂。

实施例3

用本发明的试剂盒检测体外扩增的不同DC亚群抗原交叉递呈效率的能力：

本申请人前期研究从造血干细胞培养的人DC亚群，包括经CD14⁺单核细胞诱导的DC（moDC）、CD1c⁺ cDC、BDCA2⁺ pDC以及CD141高表达且CLEC9A⁺ xDC。我们用本发明的试剂盒可以有效地鉴别不同亚群DC抗原交叉递呈的能力。

1. 具体APC分组包括，APC每孔1×10⁴：

a．没有APC

b．moDC

c．cDC

d．pDC

e．xDC

2.抗原负载DC，每种DC分为两组：

a.不含任何抗原组

b.人pp65抗原蛋白组

3. 抗原与抗原递呈细胞孵育6h后，加入人CMV抗原特异性T细胞，每孔1×10⁵重悬于100μL CMX培养基中加入之前的反应体系中，继续孵育12h。

4. 12h后，往混合的反应体系中加入50μL含Brefeldin A（终浓度10μg/mL）的CMX培养基，继续孵育12小时。

5. 反应完全后，取出96孔细胞培养板，流式细胞术细胞内染色，检测各组T细胞经诱导表达IFN-γ的水平。染色抗体为

a．CD3-PerCP

b．CD4-FITC

c．CD8-PE

d．IFN-γ-APC

6. FlowJo软件分析流式数据。如图5所示，xDC较其他亚群可更好将抗原交叉递呈至T细胞，且证明我们新型方法培养出来的各亚群DC细胞在抗原递呈功能上表现出了与其他小组研究的一致性。

最后应当说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。