一种抗原特异性T细胞的培养方法和一种DC细胞抗原递呈能力检测试剂盒及其检测方法与流程

文档序号:12411446阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种抗原特异性T细胞的培养方法,其特征在于,它按如下步骤制备:

(1)分离人外周血单核细胞既PBMC

从供体抽取10mL抗凝血,用2倍体积的PBS稀释,在稀释后的混合液体底部加入5mL人淋巴细胞分离液,离心后收集中间云雾层细胞既PBMC;

(2)用人CMV抗原肽诱导PBMC中的T细胞

将步骤(1)分离得到的PBMC计数,以2×106/mL重悬于CMX培养基中,每孔2mL细胞悬液接种于6孔细胞培养板,将所述6孔细胞培养板放入 37℃、5%(V/V)CO2的恒温培养箱中静置1-2h,然后取出未贴壁的细胞,再加入终浓度为20ng/mL的人CMV抗原肽多表位混合物,以5mL每孔细胞悬液接种于新的6孔细胞培养板,孵育48小时,所述CMX培养基为含10%(V/V)胎牛血清的混合培养基,所述混合培养基为RPMI 1640培养基与X-VIVO 15培养基以体积比1:1混和组成;

(3)扩增人CMV抗原肽特异性T细胞

孵育后,在步骤(2)中含人CMV抗原肽的PBMC培养体系中加入终浓度为1000U/mL的人白细胞介素2(hIL-2),收集PBMC,然后加入等体积的所述CMX培养基,本次添加的所述CMX培养基中含终浓度为1000U/mL的hIL-2,再将最终的PBMC培养体系扩增至2倍量的6孔板培养,保持每孔5mL细胞悬液;

每隔2-3天,按同样方法将上述PBMC培养体系扩增至2倍量的6孔板培养,共培养2周。

2.一种用于检测DC抗原提呈能力的试剂盒,其特征在于:它包括抗原蛋白、蛋白转运抑制剂Brefeldin A、流式抗体、权利要求1中的所述CMX培养基和扩增得到的人CMV抗原特异性T细胞,所述抗原蛋白是纯度为95%的人pp65蛋白,所述流式抗体为鼠抗人CD3-PerCP或鼠抗人CD4-FITC或鼠抗人CD8-PE或鼠抗人IFN-γ-APC。

3.一种利用权利要求2中所述检测试剂盒检测DC细胞抗原提呈能力的检测方法,包括如下步骤:

(1)用人pp65蛋白负载DC,所述人pp65蛋白终浓度为10ng/mL,置于细胞培养箱孵育6h;

(2)加入人CMV抗原特异性T细胞,每孔5×105个细胞,继续孵育12h;

(3)加入终浓度为10μg/mL的蛋白转运抑制剂Brefeldin A,继续孵育12h;

(4)用流式细胞仪分析人CMV抗原特异性T细胞经诱导表达IFN-γ的水平,根据阳性反应率确定DC抗原递呈能力。

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