本发明属于体外细胞培养
技术领域：
，涉及一种淋巴细胞培养基。
背景技术：
：淋巴细胞是用于细胞免疫治疗的重要载体，而淋巴细胞的体外培养、扩增和活化离不开优良的培养基。培养基为淋巴细胞的生长提供了基本的环境，包括为淋巴细胞存活提供适宜的渗透压，pH值，为淋巴细胞的生长提供了一切所需的营养因子，包括无机盐、氨基酸、功能性的蛋白、维生素等，也是淋巴细胞各种代谢产物的排放场所。传统的培养基为了提供这些营养因子，大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，比较常见的有新生牛血清、胎牛血清、人AB血清、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人转铁蛋白等。使用动物血清的优点是有足够的量供应，价格便宜，但是使用动物血清的缺点是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，而且动物血清并不能很好的支持人淋巴细胞的生长。而使用人AB血清的好处是可以很好的支持人淋巴细胞的生长，但是人AB血清来源困难，供应量有限，而且也存在传播传染病的风险。现有商品化淋巴细胞培养基大都添加有人血白蛋白、人转铁蛋白等人源性组分。由于这些组分来源于人的血清，虽然有各种病原体的检测技术和消毒技术，但仍然避免不了传播疾病的风险；由于来源于不同的供者，造成批次间差异，不利于质量的控制。中国专利(CN102352343B)公布了一种淋巴细胞培养基及其使用方法，该淋巴细胞培养基包括基础培养基以及血清替代物，所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白以及重组人胰岛素，用以解决现有淋巴细胞培养基大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，增加了传播疾病的风险，同时不同批次，质量无法统一的问题。但是在使用培养基时依旧需要加入2％的淋巴细胞自体血清才能有更好的效果，未能从根本上解决上述问题。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种淋巴细胞培养基。本发明培养基培养的淋巴细胞的扩增能力和杀瘤活性增强，并且有效解决了现有淋巴细胞培养基中存在的传播疾病的风险和同时不同批次质量无法统一的问题。本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：一种淋巴细胞培养基，包括以下组分及其浓度：基础培养基干粉10-20g/L，胰岛素5-7mg/L，人转铁蛋白10-20mg/L，氢化可的松20-30mg/mL，酪蛋白磷酸肽25-35mg/L，表皮生长因子20-40ng/mL，L-谷氨酰胺0.1-1.5g/L，乙醇胺2-4mg/L，大豆多肽10-20g/L，卵磷脂1-3g/L，亚硒酸钠0.1-1mg/L，柠檬酸铁1-5mg/L，硫酸锌1-5mg/L，维生素E1-50mg/L和庆大霉素1-15IU/mL。优选地，所述淋巴细胞培养基由以下组分及其浓度组成：RPMI1640干粉15g/L，胰岛素6.5mg/L，人转铁蛋白13.75mg/L，氢化可的松18.25mg/mL，酪蛋白磷酸肽33.5mg/L，表皮生长因子27.5ng/mL，L-谷氨酰胺1.32g/L，乙醇胺3.8mg/L，大豆多肽15g/L，卵磷脂2.5g/L，亚硒酸钠0.58mg/L，柠檬酸铁4.5mg/L，硫酸锌3.25mg/L，维生素E12.5mg/L和庆大霉素7.5IU/mL。优选地，所述基础培养基为RPMI1640或DMEM培养基。胰岛素能与细胞上的胰岛素受体结合形成复合物，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是重要的细胞存活因子。转铁蛋白与Fe3+复合物结合，为细胞提供必需的微量元素铁。氢化可的松是人工合成也是天然存在的糖皮质激素，对细胞生长具有调控作用。酪蛋白磷酸肽(CAS号：691364-49-5)是一类含有磷酸丝氨酰和谷氨酰族的短肽，将抵抗各种酶的水解，有效防止钙离子在中性或偏硷性环境中形成磷酸钙沉淀，从而通过丝裂原最佳浓度的选择，达到增加细胞培养后的分裂增值能力和更多的有丝分裂细胞。表皮生长因子是最早发现的生长因子，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。卵磷脂(CAS号：8002-43-5)是一种与蛋白质、维生素并列的营养补充剂，能够控制物质进入细胞，维持细胞的代谢。大豆多肽即肽基大豆蛋白水解物的总称，是大豆蛋白质经酶水解而制成的多种低分子肽混合物，其主要分子量在300-700的范围内，通常由3-6个氨基酸组成，而其氨基酸组成与大豆蛋白质十分相似，必需氨基酸平衡良好，含量丰富，而且具有极佳的生理功能和加工特性。优选地，所述的淋巴细胞培养基的制备方法，分为以下步骤：S1准确称取基础培养基干粉，酪蛋白磷酸肽，L-谷氨酰胺，乙醇胺，亚硒酸钠，柠檬酸铁和硫酸锌，将其溶于40-45℃超纯水中，搅拌均匀，得溶液I；S2将溶液I冷却至15-20℃时，加入相应重量的胰岛素，人转铁蛋白，氢化可的松，表皮生长因子，卵磷脂，维生素A和庆大霉素，搅拌均匀，得溶液II；S3利用2mol/LNa2CO3或HEPES调整溶液IIpH为7.2，过膜除菌即得。本发明淋巴细胞培养基与现有淋巴细胞培养基相比，具有以下优点：(1)本发明提供的淋巴细胞培养基，有效解决了现有淋巴细胞培养基大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，具有传播疾病的风险，不同批次质量无法统一的问题；(2)实验证明，本发明培养基与对比例培养基相比，淋巴细胞的扩增能力和杀瘤活性更强，分别提高了24.4％，36.1％，证明使用本发明所述淋巴细胞培养基用于培养人淋巴细胞的效果优于现有的血清替代物的淋巴细胞培养基。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。大豆多肽，产品规格25/1，购于河北发多利生物科技有限公司。实施例1一种淋巴细胞培养基一种淋巴细胞培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基干粉10g/L，胰岛素5mg/L，人转铁蛋白10mg/L，氢化可的松20mg/mL，酪蛋白磷酸肽25mg/L，表皮生长因子20ng/mL，L-谷氨酰胺0.1g/L，乙醇胺2mg/L，大豆多肽10g/L，卵磷脂1g/L，亚硒酸钠0.1mg/L，柠檬酸铁1mg/L，硫酸锌1mg/L，维生素E1mg/L和庆大霉素1IU/mL。制备方法，分为以下步骤：S1准确称取基础培养基干粉，酪蛋白磷酸肽，L-谷氨酰胺，乙醇胺，亚硒酸钠，柠檬酸铁和硫酸锌，将其溶于40-45℃超纯水中，搅拌均匀，得溶液I；S2将溶液I冷却至15-20℃时，加入相应重量的胰岛素，人转铁蛋白，氢化可的松，表皮生长因子，卵磷脂，维生素A和庆大霉素，搅拌均匀，得溶液II；S3利用2mol/LNa2CO3或HEPES调整溶液IIpH为7.2，过膜除菌即得。实施例2一种淋巴细胞培养基一种淋巴细胞培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基干粉20g/L，胰岛素7mg/L，人转铁蛋白20mg/L，氢化可的松30mg/mL，酪蛋白磷酸肽35mg/L，表皮生长因子40ng/mL，L-谷氨酰胺1.5g/L，乙醇胺4mg/L，卵磷脂3g/L，大豆多肽20g/L，亚硒酸钠1mg/L，柠檬酸铁5mg/L，硫酸锌5mg/L，维生素E50mg/L和庆大霉素15IU/mL。制备方法与实施例1类似。实施例3一种淋巴细胞培养基一种淋巴细胞培养基，由下组分及其浓度组成：RPMI1640干粉15g/L，胰岛素6.5mg/L，人转铁蛋白13.75mg/L，氢化可的松18.25mg/mL，酪蛋白磷酸肽33.5mg/L，表皮生长因子27.5ng/mL，L-谷氨酰胺1.32g/L，乙醇胺3.8mg/L，大豆多肽15g/L，卵磷脂2.5g/L，亚硒酸钠0.58mg/L，柠檬酸铁4.5mg/L，硫酸锌3.25mg/L，维生素E12.5mg/L和庆大霉素7.5IU/mL。制备方法与实施例1类似。对比例1一种淋巴细胞培养基一种淋巴细胞培养基，由下组分及其浓度组成：RPMI1640干粉15g/L，胰岛素6.5mg/L，人转铁蛋白13.75mg/L，氢化可的松18.25mg/mL，酪蛋白磷酸肽33.5mg/L，表皮生长因子27.5ng/mL，L-谷氨酰胺1.32g/L，乙醇胺3.8mg/L，大豆多肽15g/L，卵磷脂2.5g/L，亚硒酸钠0.58mg/L，柠檬酸铁4.5mg/L，硫酸锌3.25mg/L，维生素E12.5mg/L和庆大霉素7.5IU/mL。制备方法与实施例1类似。与实施例3区别在于，将大豆多肽替换为精氨酸。试验一、淋巴细胞增殖实验和存活率1.试验对象：实施例1-3制备得到的无血清添加的淋巴培养基与对比例1制备得到的淋巴细胞培养基。2.试验方法：使用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞，或者复苏冻存的单个核细胞。加入含5％热灭活胎牛血清(FBS)生理盐水300g离心10分钟，去除上清液。计数细胞，用相应的培养基配成1*106/mL细胞悬液，培养基使用前加入谷氨酰胺300mg。分为6组，各组所用培养基如表1所示。按每孔加入2mL培养基接入6孔板，每组3个复孔。第1天加入1000IU/mLIFN-r，培养24小时后加入50ng/mLCD3单抗(OKT3)300IU/mLIL-2，100IU/mLIL-1a。以后每3天计数，补加含300IU/mLIL-2培养液至1*106/mL。培养15天，台酚蓝染色计算细胞增殖倍数和存活率。3.试验结果：结果如表1所示：表1淋巴细胞增殖倍数和存活率培养基增殖倍数存活率(％)实施例12595实施例22896实施例33697对比例12078由表1可知，实施例1-3培养基效果明显好于对比例1培养基，其中实施例3培养基效果最好，与对比例1培养基相比，淋巴细胞的扩增能力提高了24.4％。试验二、淋巴细胞毒性实验1.试验对象：实施例1-3配制得到的无血清添加的淋巴培养基与对比例1配制得到的淋巴细胞培养基。2.试验方法：取培养15天的CIK细胞为效应细胞，以K562细胞为靶细胞，按效靶比10∶1接种到96孔板内，每个孔板内加有不同的培养基，37℃，5％CO2培养24小时。用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率。杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/靶细胞孔3.试验结果：淋巴细胞毒性实验结果如下表2所示：表2淋巴细胞毒性实验结果培养基杀瘤率(％)实施例175实施例278实施例383对比例161由表2可知，实施例1-3培养基淋巴细胞毒性试验效果明显好于对比例1培养基，其中实施例3培养基效果最好，与对比例1培养基相比，淋巴细胞的杀瘤率提高了36.1％。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
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中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页1 2 3