一种兼有NK细胞特质的抗原特异性T细胞的制备方法与流程

技术领域：
本发明属于免疫治疗领域，尤其是免疫细胞体外扩增的培养方法。
背景技术：
：免疫疗法作为一类新型抗癌疗法，和传统的手术、化疗、放疗构成了治疗癌症的四大支柱。在免疫疗法里，细胞免疫疗法更是体现出极大的发展潜力。根据所采用的免疫细胞，细胞免疫疗法可分为两大类型。一类采用非特异性的免疫细胞，比如NK细胞和CIK（CD3+CD56+）细胞，这两种细胞杀伤癌细胞是非MHC限制性的，所识别的癌细胞表面靶点不是由MHC所呈递出的抗原片段，而是NKG2D、DNAM-1、NKp30这类NK细胞所识别的靶点（PievaniA,BorleriG,etal.Blood.2011,118(12):3301-3310）。另一类疗法采用特异性的免疫细胞，比如嵌合抗原受体修饰的T细胞，TCR修饰的T细胞，或者由肿瘤组织里分离出的TIL进一步在体外扩增，以及由外周血直接在体外与抗原呈递细胞共培养扩增出的针对特定抗原的特异性T细胞（StraathofKC,BollardCM,etal.Blood.2005，105(5):1898-1904），后两类扩增方法培养出的免疫细胞通过识别由MHC所呈递出来的特定抗原而杀伤癌细胞。虽然利用特异性或非特异性的免疫疗法治疗癌症都取得了一定疗效（LeeJH,LeeJH，etal.Gastroenterology.2015,148(7):1383-1391.ChiaWK,TeoM,etal.MolTher.2014,22(1):132-139），但由于癌组织里癌细胞的异质性，即不同的癌细胞在其细胞表明表达的特异性分子不同，单独采用非特异性或特异性的细胞免疫疗法很容易因肿瘤细胞的免疫逃逸而使治疗失效（GarridoF,AptsiauriN,etal.CurrOpinImmunol.2016,39:44-51)。如果所用的免疫细胞同时具有非特异性及特异性的杀伤能力，则将有效降低因对癌细胞识别范围不足所导致的免疫逃逸。采用目前常规方法培养出的抗原特异性T细胞存在增殖能力低下的问题：每轮7天与抗原呈递细胞共培养后T细胞的扩增倍数不到4倍（RamosCA,NaralaN,etal.JImmunother.2013，36(1):66–76），要达到治疗所需的几十亿的回输细胞数目，需要经过多达5轮的共刺激培养，耗时超过1个月。另一方面，常规方法培养出的特异性T细胞在经过长时间的体外培养后，细胞表面大量表达PD-1。这些T细胞在回输入患者体内后，其活性会被患者的癌细胞表面的PD-L1所抑制，从而降低其疗效（WeiF,ZhongS,etal.ProcNatlAcadSciUSA.2013,110(27):E2480-2489）。本发明所述的抗原特异性T细胞培养方法克服了常规培养方法的局限，细胞增殖速度可达每7天20倍，培养出的T细胞表面只表达极低的PD-1，但大量表达CD56，同时具有对癌细胞特异性及非特异性杀伤力。技术实现要素：为了克服目前常规方法培养出的抗原特异性T细胞对癌细胞识别范围不够广、增殖缓慢、大量表达PD-1分子的缺点，本发明提供一种抗原特异性T细胞的高效制备方法，所培养出的T细胞大量表达CD56，既保持了对具备抗原呈递能力的癌细胞的杀伤力，还兼有非MHC限制性杀伤力。本发明的技术方案是：(1)通过大幅提高抗原呈递细胞对抗原特异性T细胞的比例，充分激活T细胞的TCR／MHC-抗原肽及共刺激途径，从而提高T细胞增殖速度，促进T细胞表达NK细胞类的受体；(2)在培养基里加入高浓度的IL-15，以抵消T细胞被激活后所分泌的IL-2的AICD（活化诱导的细胞死亡）效应（WaldmannT.ArthritisRes.2002，4(Suppl3):S161–S167），以进一步提高细胞增殖速度，降低PD-1的表达。(3)控制每一轮共培养的时间，避免因培养时间过长导致抗原呈递细胞数目不足的问题。本发明的培养方法如图1所示，具体包括以下步骤：(1)将分离出的外周血单个核细胞（PBMC）与抗原呈递细胞以10:1至40:1的比例共培养，抗原呈递细胞可为表达并呈递EB病毒抗原的B淋巴母细胞（LCL），也可为已负载抗原的DC细胞，gamma-deltaT细胞，或被CD40L（CD154）激活的B细胞，这些细胞都为专职抗原呈递细胞。此次共培养时间为8-12天，目的是为了激活并富集针对特定抗原的特异性T细胞，只用少量抗原呈细胞是为了避免非特异性的细胞如NK细胞的扩增。(2)将上述富集过的抗原特异性T细胞与抗原呈递细胞以1:2至1:6的比例共培养，同时在培养基里加入终浓度为30ng/ml至120ng/ml的IL-15。所用的抗原呈递细胞可为B淋巴母细胞，也可为已负载抗原的gamma-deltaT细胞，或被CD40L激活的B细胞，抗原呈递细胞在共培养前可用40-80Gy的伽马射线辐照处理。此次共培养时间为6-8天,超过这天数后细胞增殖速度会下降。(3)重复步骤2进一步扩增T细胞，直至达到所需的细胞数目。本发明的有益效果是：抗原特异性T细胞增殖速度快，步骤简单，不需要繁琐的磁珠分离纯化步骤。所得的抗原特异性T细胞PD-1表达量低，但大量表达CD56，同时具有特异性及非特异性杀伤力，能有效杀伤通过MHC在细胞表面呈递抗原的肿瘤细胞，也具有非MHC限制性的杀伤力，杀伤不表达MHC的肿瘤细胞。附图说明图1是本发明的细胞制备流程图。图2是EB病毒特异性T细胞对LCL细胞的杀伤活力图。图3是EB病毒特异性T细胞对K562细胞的杀伤活力图。图4是LMP2特异性T细胞对负载了LMP2的PHA细胞及K562细胞的杀伤活力图。图5是WT-1特异性T细胞对负载了WT-1的PHA细胞及K562细胞的杀伤活力图。具体实施方式下面用实例具体说明本发明，但本发明并不以此为限。在下面的具体步骤里未注明具体条件的实验方法，则按照常规条件，或制造厂商所建议的条件进行。一、使用本发明进行具有NK细胞特质的EB病毒特异性T细胞的制备。（1）抽取志愿者100毫升外周血，用淋巴细胞分离液Ficoll-PlaquePlus通过密度梯度离心分离出单个核细胞（PBMC），用PBS洗涤2次后将所得的细胞冻存。（2）取1×106的外周血单个核细胞用EB病毒感染，置于37°C，5%的CO2培养箱里培养4周后，得到由B细胞转化来的B淋巴母细胞系（LCL）。LCL能通过MHC-I在其细胞表面呈递EB病毒相关的抗原。另外LCL作为被EB病毒激活的B细胞，与被CD40L激活的B细胞类似，都还在其表面大量表达CD86、4-1BBL（CD137L）等共刺激分子，成为专职抗原呈递细胞（ZhuF,RamadanG,etal.ClinExpImmunol.2008,151(2):284-96）。当LCL与外周血单个核细胞共培养时，其中EB病毒特异性的T细胞将被激活扩增，经过几轮的共培养，扩增所得的细胞即为EB病毒特异性T细胞。（3）将B淋巴母细胞以40Gy的伽马射线辐照后，与外周血单个核细胞以1:40的比例置于24孔板里开始第一轮12天的共培养。（4）将第一轮富集过的EB病毒特异性T细胞与B淋巴母细胞以不同比例以及不同的细胞因子进行第二轮的共培养（表1），培养时间为7天，培养3天后换新鲜的培养基，同时补充细胞因子。表1.不同培养条件下各类免疫细胞的比例。（4）按第二轮共培养的条件再进行一轮的共培养。（5）收集所得的EB病毒特异性T细胞，以台盼兰染色法在显微镜下检测并计算出所收获的总细胞数。取一部分细胞用流式细胞仪检测其细胞类型。结果如表1所示。可见相比于常规培养方法（T细胞与LCL的比例为4:1），在共培养时使用较多的LCL抗原呈递细胞（T细胞:LCL为1:3），能将T细胞的增殖速度提高两倍，同时PD-1表达下降，表达CD56的T细胞比例也有所增加；再进一步将所用的细胞因子由IL-2换为IL-15，细胞增殖速度达到每7天19倍，表达PD-1的T细胞只有1%，超过50%的T细胞同时表达CD56。（6）另取一部份所得的T细胞，以B淋巴母细胞（LCL）作为靶细胞，测试其特异性杀伤活性。检测杀伤活性所用的试剂盒为PerkinElmer所产的DELFIA细胞毒性检测试剂盒。结果如图2所示，使用常规培养方法与本发明的培养方法所培养出的T细胞在同一效靶比下具有类似的特异性杀伤力，当效靶比在2:1至40:1时，对LCL的特异性的裂解率都在40%至90%之间。（7）以不表达MHC-I的K562细胞作为靶细胞，使用常规培养方法培养出的T细胞只有很低的非特异杀伤活力，即使在效靶高达40:1的情况下，也只有20%的裂解率；但利用本发明方法所培养出的T细胞，当效靶比在2:1至40:1时，对K562的裂解率在50%至90%之间（如图3所示）。这表明用本发明培养出的细胞同时具有很强的非MHC限制性杀伤力。（8）为了进一步确定共培养时T细胞与抗原呈递细胞的最佳比例，将在不同细胞比例下所培养出的T细胞以流式细胞仪检测其中的CD3+CD56+双阳性细胞的比例。结果如表2所示，随着LCL细胞量的增加，CD56+的T细胞比例也在不断增加，在比例为1:2时接近50%，1:4时到最高53％，再增加至1:6也依旧接近50%，但若继续增加LCL细胞数目，则所收获的细胞里含有较高比例的死亡LCL细胞，所以T细胞与抗原呈递细胞的比例应选在1:2至1:6之间。表2.不同T细胞与抗原呈递细胞的比例对所培养出的CD3+CD56+细胞量的影响。T细胞:LCL4:12:11:11:21:41:6CD3+CD56+（％）15.219.328.748.953.147.4（9）为了确定共培养时IL-15的最佳浓度，将在不同浓度下所培养出的细胞以流式细胞仪检测其中的CD3+CD56+双阳性细胞的比例。结果如表3所示，随着IL-15浓度的增加，CD56+的T细胞比例也不断增加，在浓度30ng/ml时接近50%，90ng/ml时达到最高51.3％，浓度再增加至120ng/ml也不再有增加，可见IL-15的最佳浓度应选在30ng/ml以上，结合成本考虑，则不需超过120ng/ml。表3.不同IL-15浓度对所培养出的CD3+CD56+细胞量的影响。IL-15(ng/ml)715306090120CD3+CD56+（％）18.226.346.749.951.350.8（10）为了确定每轮共培养的最佳时间，将T细胞与LCL以1:3的比例共培养，所用IL-15的浓度为40ng/ml，每隔2天取样检测所扩增出的细胞数目。结果如表4所示，共培养的前6天细胞增殖迅速，但在第8天后扩增速度明显下降。故每轮共培养的时间应控制在6-8天，此后应该加入更多的LCL开始新一轮的共培养。表4.不同共培养时间后的T细胞扩增倍数。共培养时间（天）246810细胞扩增倍数（与起始T细胞数目相比）2.77.816.324.226.9二、使用本发明进行具有NK细胞特质的LMP2特异性T细胞的制备。本实验的目的是为了验证本发明的方法能以被CD40L激活的B细胞为抗原负载细胞来培养具有高CD56表达的、针对LMP2病毒抗原的特异性T细胞。（1）抽取志愿者100毫升外周血，用淋巴细胞分离液Ficoll-PlaquePlus通过密度梯度离心分离出单个核细胞（PBMC），用PBS洗涤2次后将所得的细胞冻存备用。（2）以慢病毒转染U251人胶质瘤细胞系得到稳定表达CD40L（CD154）的U251-CD40L细胞。先于24孔板内培养U251-CD40L至细胞覆盖整个底部，再以80Gy的伽马射线辐照后加PBMC至1×105/ml进行共培养，培养基中加入终浓度为1ug/ml的环孢素A（CyclosporinA）及100U/ml的IL-4,置于37°C，5%的CO2培养箱里培养1周，所得的细胞再以4×105/ml的浓度与辐照过的U251-CD40L细胞进行多次共培养。PBMC里的B细胞能被CD40L激活并大量扩增，被激活的B细胞(Bblast)除了表达MHC-I外，还大量表达CD86、4-1BBL等共刺激分子，成为专职抗原呈递细胞（KondoE,GryschokL,etal.ClinExpImmunol.2009，155(2):249-256），负载抗原后能有效刺激并扩增特异性T细胞。（3）细胞所负载的抗原为覆盖EB病毒LMP2蛋白的多肽库（购于JPTTechnology的PepMix，每个多肽长度为15个氨基酸，其中11个氨基酸与相邻的多肽重叠）。将多肽库以10ng/ml的终浓度加入被激活的B细胞1小时即可完成抗原负载。（4）将已负载了LMP2的B细胞与外周血单个核细胞以1:20的比例置于24孔板里开始第一轮10天的共培养。（5）将第一轮富集过的T细胞与负载了LMP2的B细胞以1:3比例进行第二轮的共培养，培养基里加IL-15至终浓度为40ng/ml，培养时间为7天，培养3天后换新鲜的培养基，同时补充IL-15。（6）按第二轮共培养的条件再进行一轮的共培养，收集所得的LMP2特异性的T细胞。以台盼兰染色法在显微镜下检测并计算出所收获的总细胞数。取一部分细胞用流式细胞仪检测其细胞类型，检测结果显示其中CD3+CD56+双阳性的细胞比例为46%，表达PD-1的细胞为2.3%。（7）制备PHA细胞（PHAblast)用于细胞杀伤力的检测，具体制备步骤如下：取5×105/ml的PBMC，于培养基中加入植物血凝素（PHA）至5μg/ml，培养2天后添加IL-2至100U/ml，2天后将已扩增的细胞分至新的24孔板里，重复以上PHA和IL-2的刺激过程，收取所得的PHA细胞，一部分按上述方法负载LMP2抗原，另一部分没有负载抗原作为对照组。（8）取所得的LMP2特异性T细胞，分别以负载了LMP2的PHA细胞、没负载抗原的PHA以及K562细胞作为靶细胞，测试对它们杀伤活性。检测杀伤活性所用的试剂盒为PerkinElmer所产的DELFIA细胞毒性检测试剂盒。结果如图4所示，使用本发明培养出的LMP2特异性T细胞对没有负载抗原的PHA细胞没有杀伤力，但对负载了抗原的PHA有很强的特异性杀伤力，当效靶比在2:1至40:1时，特异性的裂解率在40%至90%之间。所培养的T细胞对不表达MHC-I的K562细胞也有很强的杀伤力，当效靶比在2:1至40:1时，裂解率在40%至80%之间。这表明以被CD40L激活的B细胞作为抗原呈递细胞，用本发明培养出的LMP2特异性T细胞同时具有很强的特异性及非MHC限制性的非特异性杀伤力。三、使用本发明进行具有NK细胞特质的WT-1特异性T细胞的制备。本实验的目的是为了验证本发明的方法能以gamma-deltaT细胞为抗原负载细胞来培养具有高CD56表达的、针对WT-1癌症抗原的特异性T细胞。（1）抽取志愿者100毫升外周血，用淋巴细胞分离液Ficoll-PlaquePlus通过密度梯度离心分离出单个核细胞（PBMC），用PBS洗涤2次后将所得的细胞冻存备用。（2）取5×107的外周血单个核细胞，于培养基中加入终浓度为5uM的唑来膦酸（Zometa）及200U/ml的IL-2,置于37°C，5%的CO2培养箱里培养2周，PMBC里的gamma-deltaT细胞被激活并大量扩增，被激活的gamma-deltaT细胞除了表达MHC-I外，还大量表达CD86、4-1BBL等共刺激分子，成为专职抗原呈递细胞（ManiarA,ZhangX,etal.Blood.2010,116(10):1726-1733），负载抗原后能有效刺激并扩增特异性T细胞。（3）细胞所负载的抗原为覆盖癌症特异性蛋白WT-1的多肽库（购于JPTTechnology的PepMix，每个多肽长度为15个氨基酸，其中11个氨基酸与相邻的多肽重叠）。将多肽库以10ng/ml的终浓度加入被被激活的gamma-deltaT细胞1小时即可完成抗原负载。（4）将已负载了WT-1的gamma-deltaT细胞与外周血单个核细胞以1:20的比例置于24孔板里开始第一轮10天的共培养，同时加入IL-15至40ng/ml。（5）将第一轮富集过的T细胞与负载了WT-1的gamma-deltaT细胞以1:3比例进行第二轮的共培养，培养基里加IL-15至终浓度为40ng/ml，培养时间为7天，培养3天后换新鲜的培养基，同时补充IL-15。（6）按第二轮共培养的条件再进行一轮的共培养，收集所得的WT-1特异性的T细胞。以台盼兰染色法在显微镜下检测并计算出所收获的总细胞数。取一部分细胞用流式细胞仪检测其细胞类型，检测结果显示其中CD3+CD56+双阳性的细胞比例为58%，表达PD-1的细胞比例为1%。（7）制备PHA细胞用于细胞杀伤力的检测。具体步骤如下：取5×105/ml的PBMC，于培养基中加入植物血凝素(PHA)至5μg/ml，培养2天后添加IL-2至100U/ml，2天后将已扩增的细胞分至新的24孔板里，重复以上PHA和IL-2的刺激过程，收取所得的PHA细胞，一部分按上述方法负载WT-1抗原，另一部分没有负载抗原作为对照组。（8）取所得的WT-1特异性T细胞，分别以负载了WT-1的PHA细胞、没负载抗原的PHA以及K562细胞作为靶细胞，测试对它们杀伤活性。检测杀伤活性所用的试剂盒为PerkinElmer所产的DELFIA细胞毒性检测试剂盒。结果如图5所示，使用本发明培养出的WT-1特异性T细胞对没有负载抗原的PHA细胞没有杀伤力，但对负载了抗原的PHA有很强的特异性杀伤力，当效靶比在2:1至40:1时，特异性的裂解率在30%至75%之间。所培养的T细胞对不表达MHC-I的K562细胞也有很强的杀伤力，当效靶比在2:1至40:1时，裂解率在40%至80%之间。这表明以gamma-deltaT细胞作为抗原呈递细胞，用本发明培养出的WT-1特异性T细胞同时具有很强的特异性及非MHC限制性的非特异性杀伤力。当前第1页1 2 3