一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基及其制备方法与流程

本发明涉及无血清培养基制备领域，具体涉及一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基及其制备方法。

背景技术：

犬肾脏上皮细胞(Madin-Darby canine kidney cell,MDCK)被视为最适用于甲、乙型流感病毒疫苗生产的细胞系之一，可被用于代替鸡胚培养流感病毒。目前已经开发了利用MDCK细胞系代替鸡胚培养流感病毒的微载体贴壁培养生产工艺方法，虽然此工艺方法以可达到的一定的生产规模，然而还是存在一定的缺陷：1、微载体难以多次重复使用，造成生产成本提高；2、贴壁细胞的培养密度受到贴壁面积的限制，致使病毒产量的下降；3、贴壁培养通常需添加血清以帮助细胞贴附和生长，需要进行换液，工艺复杂，并且会引入支原体、衣原体或动物蛋白的污染，对疫苗产品的安全性造成潜在威胁。人们越来越关注大规模无血清全悬浮培养MDCK细胞的技术。有关MDCK细胞在无血清培养基中全悬浮培养的报道较少。目前，国内极少商品化的适于MDCK细胞大规模全悬浮培养的无血清培养基。现有的技术当中，该无血清培养基均含有转铁蛋白等比较昂贵的动物源性蛋白等成分，不利于兽用生物制品的开发。因此，有必要开发组分明确、配制和使用方便、成本更低、适用于大规模生产兽用生物制品的MDCK单细胞悬浮培养的无血清培养基，使得MDCK细胞能简单快速从有血清贴壁生长状态驯化到无血清悬浮生长状态，建立更加先进的MDCK细胞无血清高密度悬浮培养工艺。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，该培养基支持MDCK单细胞高密度全悬浮培养，大大缩短了MDCK细胞由需血清贴壁培养细胞驯化成无血清的全悬浮细胞驯化时间，适用于生物制品特别是兽用生物制品的大规模生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 1000～3000mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 5～15mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

作为本发明的一种优选的方案：所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 2200mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 8mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

作为本发明的一种优选的方案：所述剪切力保护剂为嵌段式聚醚F68。

作为本发明的一种优选的方案：所述抗细胞结团剂为硫酸葡聚糖。

本发明的另一个目的在于提供一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基的制备方法，该方法简单快捷效率高，有利于大规模生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：上述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)制备混合液：采用以下其中之一的方法将原料溶解并混合：

Ⅰ)将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；

Ⅱ)将原料分别溶解于溶剂中，获得原料溶液；然后将所得原料溶液在温度为10～30℃的条件下混合，得到混合液；

2)调节pH：调节混合液的pH至6.3～6.7，定容后得到用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基。

作为本发明的一种优选的方案，步骤1)中，所述溶剂为无热源超纯水。

作为本发明的一种优选的方案，所述步骤2)中，加入氢氧化钠调节所得混合液的pH值。

本发明的有益效果在于：

1、本发明所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基不含动物血清、成本低；支持MDCK单细胞高密度全悬浮培养，其成分明确、容易配制并且使用方便；

2、本发明所述的培养基有效地缩短了MDCK细胞由需血清贴壁培养细胞驯化成无血清的全悬浮细胞驯化时间，提高了生产的效率，获得了高质量的全悬浮细胞；

3、本发明的制备方法，简单快捷效率高，有利于大规模生产。

附图说明：

图1为实施例4中活细胞密度和细胞活性曲线图；

图2为实施例5中需血清贴壁培养状态下MDCK细胞形态图；

图3为实施例5中经本发明无血清培养基驯化下的MDCK细胞形态图；

图4为实施例5中采用Hyclone公司无血清培养基SFM4 Mega Vir通过直接驯化法得到的悬浮培养的MDCKS细胞形态图；

图5为实施例5中采用Gibco公司开发的商业无血清培养基SMI F8间接法驯化得到的MDCK.SUS2细胞形态图。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：

具体实施方式：

一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 500～2500mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 20～150mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 1000～3000mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 5～15mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

其中，核苷酸中选用次黄嘌呤和胸苷，能促进MDCK细胞的核苷酸合成，保证细胞的生长；次黄嘌呤和胸苷成分太高，会抑制细胞生长；

其中，其他添加物中选用柠檬酸铁铵，用以替代转铁蛋白发挥其原有作用，不影响细胞生长与铁代谢，且能减少无血清培养基中的动物蛋白成分，降低培养基成本和对生产的不确定性和不安全性；柠檬酸铁铵依靠二价金属离子通道DMT1吸收铁，转铁蛋白通过转铁蛋白受体吸收铁，前者比后者提高了MDCK细胞对铁的吸收速率；柠檬酸铁铵成分浓度过高会抑制MDCK细胞生长；浓度太低，MD CK细胞对铁的吸收不足；

其中，其它添加物中胰岛素的浓度在2～15mg/L，能促进葡萄糖代谢，保证MDCK细胞的生长和维持MDCK细胞的活性；

其中，其它添加物中大豆水解物的浓度在1000～5000mg/mL，能保证维生素、金属离子、氨基酸等其他辅因子的供给，提高MDC K细胞对氨基酸的摄取；

上述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)制备混合液：采用以下其中之一的方法将原料溶解并混合：

Ⅰ)将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃无热源超纯水中溶解，得到混合液；

Ⅱ)将原料分别溶解于无热源超纯水中，获得原料溶液；然后将所得原料溶液在温度为10～30℃的条件下混合，得到混合液；

2)调节pH：加入氢氧化钠调节混合液的pH至6.3～6.7，定容后得到用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基。

具体实施例：

实施例1

本实施例公开了一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 1000mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 25mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 2200mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 8mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

根据以下步骤制备用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基：

1)将上述原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃无热源超纯水中溶解，使得各原料的浓度如上，得到混合液；

2)加入氢氧化钠调节混合液的pH至6.4，定容后得到用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基DHN-1。

实施例2

本实施例所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 1600mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 50mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 2200mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 8mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

根据以下步骤制备用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基：

1)将上述原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃无热源超纯水中溶解，使得各原料的浓度如上，得到混合液；

2)加入氢氧化钠调节混合液的pH至6.5，定容后得到用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基DHN-2。

实施例3

本实施例所述用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 2200mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 100mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 2200mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 8mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

根据以下步骤制备用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基：

1)将上述原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃无热源超纯水中溶解，使得各原料的浓度如上，得到混合液；

2)加入氢氧化钠调节混合液的pH至6.7，定容后得到用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基DHN-3。

将实施例1-3获得的培养基进行特性试验：

1、仪器：Bio-Bundle生物反应器(购自荷兰Applikon Biotechno logy公司)，罐体体积为3L；

2、细胞：适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系，由华东理工大学提供；

3、用于对照的无血清培养基：商品化无血清培养基SFM4 Meg a Vir(购自Hyclone公司)；

4、培养方法：以0.5×10⁶cells/mL的细胞密度接种细胞至生物反应器中，在37℃、5％CO₂的条件下进行批培养，每24h取样进行活细胞计数，并计算细胞生长速率；结果如表1、表2所示：

表1不同时间的活细胞密度(10⁶cells/mL)

表2细胞生长速率及倍增时间

与对照组商业化无血清培养基SFM4Mega Vir悬浮培养MDCK细胞相比，采用本发明所提供的无血清培养基，在培养过程中支持的活细胞密度有大幅度的增长；此外，在非指数生长期细胞的比生长速率从对照的0.57d^-1最大增长到实施例2DHN-2中的0.91d^-1，细胞倍增时间则从对照的0.79d最大缩短至实施例2DHN-2中的0.32d。可见采用本发明无血清培养基培养MDCK细胞，在细胞生长速率和细胞活性均有较大的提高。

实施例4

运用通过实施例2制得的无血清培养基DHN-2对需血清贴壁培养MDCK细胞进行无血清全悬浮培养驯化。细胞驯化过程如下：

1)含10％新生牛血清DMEM培养的贴壁MDCK细胞培养至细胞汇合度达到80～90％时，将原有培养基弃去，用胰酶清洗两次细胞层，中和残留的血清，弃去液体；继续加入胰酶溶液以覆盖MDCK细胞，进行消化5-15min，直至细胞都变圆后加入约消化液4倍体积的含10％胎牛血清的培养基终止消化；用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来，收集细胞悬液，1000rpm离心5min后弃上清，获得细胞团；

2)将细胞团用无血清培养基DHN-2进行重悬至细胞密度约1.5×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

3)将细胞重悬液加到方瓶中，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入125mL的摇瓶，转速提升至120rpm。每24h取样，进行细胞计数和细胞活性分析，每48h用新鲜培养基DHN-2稀释细胞密度至约1.5×10⁶cells/mL，在摇床上继续培养传代，获得适应无血清全悬浮培养MDCK细胞。

4)活细胞密度和细胞活性如图1所示:MDCK贴壁细胞在无血清培养基DHN-2中驯化6代以后(驯化后第13d)，细胞生长逐渐稳定，细胞活性保持在95％以上。由此可以证明，在本发明的无血清培养基中使MDCK贴壁细胞适应悬浮培养并稳定生长只需2周，大大缩短了MDCK细胞由贴壁细胞驯化成无血清的全悬浮细胞驯化时间。

实施例5

采用本发明培养基驯化得到的无血清全悬浮培养的MDCK细胞形态与贴壁培养细胞、其他无血清培养基培养的细胞相对比，结果如图2-5所示：

图2为需血清贴壁培养状态下MDCK细胞贴附于培养介质表面，呈铺路石状；

图3为在本发明无血清培养基驯化得到的全悬浮培养的MDCK细胞的形态，细胞呈单个分散状，无结团现象，细胞形态完整，边界光滑清晰，大小均一；

图4为采用Hyclone公司无血清培养基SFM4Mega Vir通过直接驯化法得到的悬浮培养的MDCKS细胞，图片来源：张良艳,姚志东,等.MDCK细胞的悬浮驯化及初步应用.生物技术通讯.2013,24(3):382-384；图中可见，多个细胞聚集成团，少见单个细胞，细胞大小不均一。

图5为采用Gibco公司开发的商业无血清培养基SMIF8间接法驯化得到的MDCK.SUS2细胞；图片来源：V.Lohr,Y.Genzel,et al.A new MDCK suspension line cultivated in a fully defined med ium in stirred-tank and wave bioreactor.Vaccine.2010,28(3):6256-6264；图中所见，在该无血清培养基中悬浮培养时细胞形态也呈聚集状，但聚团较小，细胞大小不均一，状态略欠。

因此，在本发明所述的无血清培养基中将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养状态，该细胞呈单个分散生长，细胞形态饱满，大小均一；细胞质量高。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。