本发明涉及一种降解烟碱的解淀粉芽孢杆菌DGY18(Bacillus amyloliquefaciens DGY18)以及利用该菌降解烟丝浸提液和烟株上部烟叶中烟碱的方法，属于微生物应用技术领域。
背景技术：
烟碱又名尼古丁，是存在于烟草中的主要生物碱，占生物碱量95％以上，也是卷烟和烟叶中的主要危害成分之一。目前的烟草生产需要烟叶中的烟碱含量达到适中即可，而我国烟草种植过程中由于大量施加化肥，导致上部烟叶中烟碱含量过高，部分上部烟叶中的烟碱含量达到5％以上；造成了该部分烟叶丢失了可利用的价值。据估算，每株烟草的上部烟叶的丢弃达到了3-5片之多，即有近20％以上的烟叶无法利用，这对于农业生产来说，是巨大的资源浪费。因此，本发明的目的是最大限度的利用上部烟叶，同时寻找一种适合普通烟碱降解的微生物。
目前控制或降低烟草中烟碱含量的方法主要有三种：第一种是对烟草种植进行调控：调控的方向主要从烟草的选育、烟草的栽培、烟草的生态、烟草的管理等各个方面来控制或降低烟草中烟碱含量；第二种是运用化学处理法：处理的方向是使用热水、有机溶剂等对烟叶进行漂洗、萃取、蒸馏等操作，从而将烟叶上部分烟碱洗脱掉；第三种是利用微生物和酶降解烟碱。前两种办法不仅费时费力、经济成本高，而且降烟碱效果欠佳，而利用微生物降低卷烟烟碱含量、提高烟叶品质、提高资源利用率等具有重大意义。因此，利用微生物降解烟株烟碱是最大限度利用上部烟叶，同时降低烟草中烟碱对人体、烟草生产带来危害的有效途径之一。
技术实现要素：
本发明要解决的问题是控制或降低现有的烟草生长过程中上部烟叶的烟碱含量，提供一种能降解上部烟叶烟碱的解淀粉芽孢杆菌DGY18，并利用该解淀粉芽孢杆菌DGY18降低上部烟叶、烟丝浸提液的烟碱含量、提高烟叶可利用性。
为解决上述技术问题，本发明使用以下技术方案：
一种降解烟碱的解淀粉芽孢杆菌DGY18(Bacillus amyloliquefaciens DGY18)，保藏编号为CGMCC NO.11900。
所述的解淀粉芽孢杆菌DGY18的应用方法：将解淀粉芽孢杆菌DGY18配制成菌悬液，接种至烟丝浸提液，或者直接在健康烟株叶面喷洒。
应用于烟丝浸提液接种的解淀粉芽孢杆菌DGY18菌悬液的制备方法为：纯菌株接入5mL液体烟碱培养基中,30℃,200r/min摇床震荡培养2d，然后将培养液10000r/min离心10min，收集菌体，用0.9％生理盐水将离心后的菌体配制成菌体浓度为107-108CFU/mL的菌悬液。
所述的烟碱培养基配方:K2HPO4 13.3g，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量元素溶液0.5mL，调pH至7.0，定容至1000mL，灭菌后以滤菌法加入1g纯烟碱，混匀；所述的微量元素溶液是用0.1mol/L盐酸将MnSO4·7H2O 0.4g，CaCl2·2H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.2g溶解并定容至100mL。
按烟丝浸提液体积5-10％接种解淀粉芽孢杆菌DGY18后，在30℃条件下120r/min摇床培养4-8天。
所述的烟丝浸提液配方：称取10g烟丝粉，13.3g K2HPO4·3H2O，4g KH2PO4·3H2O，0.2g MgSO4·7H2O，1g麦芽糖，1g蛋白胨，量取0.5mL微量元素溶液加入到500mL的蒸馏水中，用蒸馏水定容至1000mL，分装，杀菌；所述的微量元素溶液是用0.1mol/L盐酸将MnSO4·7H2O 0.4g，CaCl2·2H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.2g溶解并定容至100mL。
应用于烟株叶面喷洒的解淀粉芽孢杆菌DGY18菌悬液的制备方法为：纯菌株接入100mL液体营养培养基30℃，120r/min的摇床振荡培养过夜，按体积百分比取5％-10％培养液加入到2.5L的液体营养培养基培养48小时。
所述的液体营养基配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL，调节pH为7.0-7.2。
每株健康烟株喷洒25mL菌悬液。
所述的内生菌的解淀粉芽孢杆菌DGY18获得方法为：
取生长性状良好、无病虫害症状的、有代表性的健康烟草整株烟草植株，于超净工作台下分别取其叶脉、茎、根，用无菌水处理干净，分别取其前中后三段，分别放入75％的酒精中浸泡5min，用无菌滤纸擦干；去除外表皮切成薄片；用无菌镊子将薄片放到三种培养基的表面，每个平板放3片。将平板分别放置于37℃与28℃的培养箱中培养1-3天，将生长出来的烟草内生菌放在烟碱培养基中，观察其生长情况。将初筛得到的降烟碱纯菌株分别接入装有5mL液体烟碱培养基的试管中,摇床震荡培养2d,然后将培养液10000r/min离心10min，用0.9％生理盐水将离心后的菌体配制成菌悬液，再将5mL菌悬液加入装有45mL液体烟碱培养基的三角瓶中,每种降烟碱株3个平行,于30℃,200r/min的摇床振荡培养,以50mL未加烟碱的液体培养基作为空白,每2d测1次培养液中的烟碱含量,判定菌株降解烟碱的能力。
菌株DGY18在牛肉膏琼脂平板上生长良好，菌落周围不整齐，呈现锯齿状，菌落白色、表面不湿润、干燥而有皱褶，边缘凸起，不透明。在光学显微镜下观察，DGY18菌株为规则的长杆菌，两段钝圆而平整，往往成对分布，中生芽孢，菌体周围无夹膜或粘液层。营养琼脂平板生长情况很好，菌落形状不规则，边缘齿轮型，呈乳白色，表面粗糙、褶皱，凹起，不透明。菌株DGY18是一种杆菌，成对生长，两端钝圆，在48小时后有芽孢产生，无荚膜。
根据16SrDNA序列分析，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为Bacillus amyloliquefaciens DGY18。
本发明的有益效果：
本发明从烟草植株中分离一株降解烟碱的内生解淀粉芽孢杆菌DGY18，利用该内生菌可使上部烟叶中的烟碱降解30％-40％；烟丝浸提液中的烟碱降解98％。本发明比使用烟草种植、化学处理法等调控措施来降低烟草中烟碱含量的方法更省时省力，而且成本低、降烟碱效果更佳，不仅降低了烟碱的含量，还提高了烟草的可利用性，因而内生解淀粉芽孢杆菌DGY18在降低上部烟叶烟碱含量方面具有良好的应用前景。
解淀粉芽孢杆菌DGY18(Bacillus amyloliquefaciens DGY18)
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏编号为：CGMCC No.11900
保藏日期：2015年12月22日
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式：
下面结合实施例证进一步说明本发明，而非限制本发明。
烟丝浸提液中烟碱降解率的测定：
配制一系列浓度梯度的含有烟碱的溶液，在紫外可见分光光度计上测烟碱的吸光度值，得到吸光度值和烟碱浓度的线性相关曲线。
烟碱降解率的计算过程：
烟碱降解率＝100％×(C0－C1)/C0
C0：接入菌株解淀粉芽孢杆菌DGY18前液体烟碱培养基中烟碱浓度；
C1：接入解淀粉芽孢杆菌DGY18后某天液体烟碱培养基中烟碱浓度。
烟叶中烟碱含量的测定：
准确称取烟叶样品0.1g到100ml三角瓶中，再称取样品两倍的活性炭粉末加入25ml，0.5mol/L的HCl溶液摇匀，在沸水中加热5min，取出定容至250ml容量瓶中，用滤纸过滤，去掉开始的10ml滤液，再过滤大约30ml进行比色，分光光度计测定滤液，236nm、259nm、282nm波长处的吸光度。
计算公式：
游离烟碱(mg/g)＝1.059×[A259—0.5(A236+A282)]×V×1 000/样品重×(1-含水率)×34.3×1 000
1.059为校正系数，V为定容体积，34.3为烟碱的比吸收系数。
实施例1
烟丝浸提液配方：称取10g烟丝粉，13.3g K2HPO4·3H2O，4g KH2PO4·3H2O，0.2g MgSO4·7H2O，1g麦芽糖，1g蛋白胨，量取0.5mL微量元素溶液(微量元素溶液是用0.1mol/L盐酸将MnSO4·7H2O 0.4g，CaCl2·2H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.2g溶解并定容至100mL。)加入到500mL的蒸馏水中，用蒸馏水定容至1000mL，分装，杀菌。
应用于烟丝浸提液接种的解淀粉芽孢杆菌DGY18菌悬液的制备：纯菌株接入5mL液体烟碱培养基中,30℃,200r/min摇床震荡培养2d，然后将培养液10000r/min离心10min，收集菌体，用0.9％生理盐水将离心后的菌体配制成菌悬液(菌体浓度为107-108CFU/mL)。
烟碱培养基配方:K2HPO4 13.3g，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量元素溶液0.5mL，调pH至7.0，定容至1000mL，灭菌后以滤菌法加入1g纯烟碱，混匀；所述的微量元素溶液是用0.1mol/L盐酸将MnSO4·7H2O 0.4g，CaCl2·2H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.2g溶解并定容至100mL。
按烟丝浸提液体积5-10％接种解淀粉芽孢杆菌DGY18后，在30℃条件下120r/min摇床培养4-8天；最后烟碱降解率达98％。
实施例2
应用于烟株叶面喷洒的解淀粉芽孢杆菌DGY18菌悬液的制备：纯菌株接入100mL液体营养培养基30℃，120r/min的摇床振荡培养过夜，按体积百分比取5％-10％培养液加入到2.5L的液体营养培养基培养48小时。液体营养基配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL，调节pH为7.0-7.2。在烟草生长进入成熟期，每株烟重点喷洒上部的6片烟叶，每株烟株喷洒25mL菌液，处理20天(每隔2天处理一次，即第1、4、7、10、13、16、19天各处理一次，于当天的傍晚进行处理)，第0、3、6、9、12、15、18天(于当天早晨取样)对各处理烟株的烟叶各取样一次，采用所述的烟碱测定方法对烟株的烟碱含量进行测定，在试验期间，烟碱含量下降了30％-40％。