一株具有富磷、降解有机磷及抑制植物病原真菌的沙雷氏菌的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及到沙雷氏菌MEW06及其该菌株在富磷、降解有机磷以及抑制植物病原真菌方面的应用。

背景技术：

有机磷农药是当今农药中的一大类别，占农药产品的80％左右，因其对防治农业病虫草害具有经济、高效、快速等特点，一直在国内外大量生产和广泛使用。但是，由于有机磷农药化工厂的扩大生产，其生产过程中排出的废水量大，COD含量极高，污染物成分复杂，毒性大，难生物降解，对环境造成极大的危害。而且农药施用后会从施药区向四周扩散，在土壤中积累迁移，进入水体或植物等，并通过食物链的富集，对人类安全产生隐患。有机磷农药多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类，可抑制胆碱酯酶活性，使其无法分解已酰胆碱，造成神经功能紊乱，严重者可能引起死亡；其次，部分有机磷农药被环境中微生物矿化成CO₂和无机磷后，引起水体中无机磷含量升高，造成水体的富营养化。农药化工厂的无节制生产以及农药不合理的广泛使用，给人类及生态环境造成了越来越严重的后果，农药的污染问题已成为全球关注的热点。国内外科学家进行了许多相关研究工作，对农药的降解技术有了较大发展，包括各种物理、化学、生物方法等。与传统的物理方法和化学方法处理成本高，可能产生新的污染物相比，利用微生物及其生物产品来降解污染物的生物修复方法具有无毒、无残留、无二次污染等优点，是消除和解毒农药废水的一种安全、有效、廉价的方法。

乐果是内吸性有机磷杀虫、杀螨剂，适用于防治刺吸式口器害虫，用途广、产量大，但乐果易挥发到空气、水体以及沉降聚集在土壤中，污染农畜渔副产品，并通过食物链转移到人体，对人产生危害。草甘膦是一种高效低毒、内吸传导型的灭生性除草剂，由于不具有选择性，其应用范围正在逐步扩大。但草甘膦生产废水中化学残留大，对环境污染极为严重。因此，研究乐果和草甘膦的生物处理方法显得极为必要。

目前分离到的乐果降解菌主要有不动杆菌、蜡状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、芽孢杆菌等；草甘膦降解菌主要有假单胞菌、摩根氏菌等；现有的农药降解菌对 有机磷杀虫剂乐果和草甘膦的降解效率低，菌株功能单一，实际应用有限。本发明的沙雷氏菌可以高效降解草甘膦和乐果，并可以吸附废水中无机磷，将其应用于污染环境的治理具有重要的现实意义和应用前景。目前，关于粘质沙雷氏菌高产几丁质酶及其分泌的红色非扩散性色素-灵杆菌素具有抗菌，调节免疫功能，抑癌等功能国内外报道较多，但具有乐果和草甘膦降解效果的沙雷氏菌未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是根据目前有机磷农药污染的实际问题和需要，提供一株具有富磷、降解有机磷农药及抑制植物病原真菌的沙雷氏菌。

本发明具有富磷、降解有机磷农药及抑制植物病原真菌的沙雷氏菌Serratia sp.MEW06已在中国典型培养物保藏中心保藏(中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO.M 2015779，保藏日期为2015年12月25日。

本发明菌株的菌落及菌体特征为：在LB固体培养基培养，菌落呈鲜红色，表面光滑，湿润，不透明，边缘不规则，大小为0.9-1.2μm×1.5-2.0μm，28℃培养时菌液呈现鲜红色，37℃培养时不显色。经过SEM观察和芽孢染色、鞭毛染色、荚膜染色以及革兰氏染色，发现MEW06菌株为近球形短杆菌，不产芽孢、周生鞭毛、无荚膜、革兰氏阴性。

本发明菌株的分子生物学鉴定方法为：以Serratia sp.MEW06基因组为模板，使用通用引物(27F和1492R)，扩增16S rDNA序列(见序列表)，MEW06 16S rDNA PCR扩增序列经NCBI Blast进行同源比对分析，发现菌株MEW06与Serratia marcescens(GenBank:KT894728)的序列相似性为99％，与Serratia nematodiphila(GenBank:KC172028)的序列相似性也为99％。Serratia sp.MEW06 16S rDNA序列在进化上和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)与嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)相近。

本发明提供的具有富磷、降解有机磷农药及抑制植物病原真菌沙雷氏菌通过驯化方法获得，包括以下步骤：采集武汉沙湖及其周边的水样，取5-10mL接种于LB培养液，富集培养；然后将菌悬液按5％-10％的接种量(V/V)接种于含农药的发酵培养基，传代驯化5次后，划线于LB固体培养基，根据平板上菌落的生成情况，挑取生长良好的菌落，接种于含农药的发酵培养基，采用乙酰胆碱 酯酶抑制率法(GB/T5009.199-2003)测定有机磷农药含量，筛选出对农药降解效率较高的菌株Serratia sp.MEW06，并通过钼蓝比色法，平板对峙法分别测定富磷能力和抑制植物病原真菌能力。

对分离筛选的菌株Serratia sp.MEW06进行性能测试：

a.菌株降解有机磷农药能力的测定

为探讨目标菌株Serratia sp.MEW06对有机磷农药的降解能力，选取目前农业生产上常用的有机磷农药乐果和草甘膦作为目标农药。将筛选纯化后的Serratia sp.MEW06菌株，过夜活化，调节菌液OD₆₀₀＝1.0，按4％的接种量转接至含50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L草甘膦或乐果的发酵培养液，150rpm，28℃培养，于1d、3d、5d、7d取样测定降解率。

b.菌株富磷能力的测定

将筛选纯化后的Serratia sp.MEW06菌株，按2％的接种量分别接种于含磷量为10mg/L、20mg/L的PAM培养基中，于0h、6h、12h、24h取样测定聚磷率。经6000r/min离心10min后，取上清液测定无机磷含量(GB 11893-89-钼锑抗比色法)，与接入菌株前的富集培养液的无机磷浓度作对照，计算聚磷率。

c.MEW06菌株抑真菌能力的测定

取直径为5mm的生长旺盛的尖刀镰孢菌、苹果轮纹菌、花生叶霉、水稻纹枯菌、草莓灰霉和灰葡萄孢菌菌块接种于PDA平板的中央，28℃培养2d。在距离菌丝边缘2cm的位置放置灭过菌的滤纸片(D＝6mm)，将60μL的菌液和PBS(空白对照)分别滴在滤纸片上。28℃继续培养2天后，观察测试样品对真菌菌丝生长的抑制情况。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、本发明的菌株Serratia sp.MEW06对乐果、草甘膦的降解能力强，且不造成溶液中磷含量升高，能在极低的营养环境下生长，抗逆性能力高，因此可应用于农药废水的生物处理，同时该菌株具有抑病原真菌能力，对尖刀镰孢菌、苹果轮纹菌、花生叶霉、水稻纹枯菌、草莓灰霉和灰葡萄孢菌具有较好的有抑制效果，Serratia sp.MEW06可在生物防治、微生物肥料、水治理等领域应用，具有广阔的市场前景。

2、该菌株Serratia sp.MEW06扩大培养方法简单，培养成本低，可以大规 模培养，制备成生物肥料或者微生物菌剂降解土壤中残留农药或去除磷化工企业有机磷和无机磷污染。

附图说明

图1为Serratia sp.MEW06菌落形态(A)、芽孢染色(B)和扫描电镜(C)图。

图2为Serratia sp.MEW06的有机磷降解率随时间的变化((A)：乐果，(B)：草甘膦)。

图3为Serratia sp.MEW06抑真菌实验图，(A)尖刀镰孢菌；(B)苹果轮纹菌；(C)花生叶霉；(D)水稻纹枯菌；(E)草莓灰霉；(F)灰葡萄孢菌；(a)、(c)、(e)、(g)、(i)和(k)空白对照PBS；(b)、(d)、(f)、(h)、(j)和(l)MEW06发酵液。

具体实施案例

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1

采集武汉沙湖及其周边的水样加到LB培养基，28℃ 150r/min富集培养24h。将上述菌悬液按5％-10％的接种量接种于含草甘膦200mg/L的发酵培养基，28℃ 150r/min富集培养3d后，转接至相同培养基，在相同条件下继续培养，传代驯化过程中草甘膦含量逐步提高到为1000mg/L；将传代5次的菌液划线于LB固体培养基，28℃，培养24-48h，根据培养基上菌落的生成情况，挑取生长良好的菌落接种于含草甘膦50mg/L的LB培养液(稀释5倍)，28℃ 150r/min培养72h，采用乙酰胆碱酶抑制率法(GB/T5009.199-2003)测定有机磷农药含量，计算菌株对有机磷农药的降解率；并通过钼蓝比色法，平板对峙法分别测定富磷能力和抑制植物病原真菌能力，得到菌株MEW06。以MEW06基因组为模板，使用通用引物(27F和1492R)，扩增16S rDNA序列(见序列表)。MEW0616S rDNA PCR扩增序列经NCBI Blast进行同源比对分析，发现菌株MEW06与Serratia marcescens(GenBank:KT894728)的序列相似性为99％，与Serratia nematodiphila(GenBank:KC172028)的序列相似性也为99％。使用MEGA6进行进化树分析可知，Serratia sp.MEW06 16S rDNA序列在进化上和粘质沙雷氏 菌(Serratia marcescens)与嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)相近。

本发明菌株Serratia sp.MEW06为G^-，兼性厌氧，呈近球形短杆状，不产芽孢、周生鞭毛、无荚膜。在LB平板上，28℃培养24h，菌落呈鲜红色，凸状，表面光滑，湿润，不透明，边缘不规则，大小为0.9-1.2μm×1.5-2.0μm。28℃培养时菌液呈现鲜红色，37℃培养时不显色，结果见图1。生理生化性能为：鸟氨酸脱羧酶、酯酶和DNA酶阳性，而阿拉伯糖发酵阴性。结合形态、生理生化指标以及16S rDNA序列分析(见序列表)，将其初步鉴定为粘质沙雷氏菌。

实施案例2

将纯化的Serratia sp.MEW06菌株，过夜活化后，调节菌液OD₆₀₀＝1.0，按4％的接种量转接至含一定浓度含量草甘膦或乐果的发酵培养液中培养，于1d、3d、5d取样测定降解率。发酵培养基配方如下：蛋白胨2g/L，酵母提取物1g/L，NaCl 2g/L，pH7.0-7.2。结果表明，Serratia sp.MEW06对乐果的降解效果极好，处理低浓度乐果(50mg/L)时，培养5d，上清液已经基本检测不到乐果浓度，降解率几乎达到100％。处理高浓度乐果(200mg/L)，培养7d后，测定降解率达到90.12％。MEW06处理草甘膦能力弱于乐果，但在50mg/L草甘膦浓度下，培养7d，降解率在95％左右。综上，对于不同浓度的乐果，本实施方式的沙雷氏菌均有较好的降解效果，对于低浓度草甘膦，本实施方式的沙雷氏菌有较好的降解效果，结果见图2。

实施案例3

取实施例1中沙雷氏菌单菌落接种于LB培养基中过夜活化，LB培养基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0-7.2，按2％的接种量分别接种于含磷量(以P计)为10mg/L、20mg/L的PAM培养基中，于0、12、24、48、72h取样测定聚磷率，PAM培养基配方为：CH₃COONa 5g/L，NH₄Cl2g/L，KH₂PO₄ 0.022～0.0878g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂0.2g/L，去离子水1000mL，pH7.0～7.2。结果如表1所示，当溶液中磷含量为10mg/L，经过24h的富集，溶液中已基本检测不到无机磷含量，富磷率达到99.94％，溶液中磷含量为20mg/L，经过24h的富集，富磷率达到63.79％，具体结果见表1。本实施方式的沙雷氏菌能在短时高效聚磷，有望应用于生物磷肥的制备和含磷废水的处理。

表1 Serratia sp.MEW06在PAM培养基培养时聚磷率(％)随时间变化

实施案例4

取直径为5mm的生长旺盛的尖刀镰孢菌、苹果轮纹菌、花生叶霉、水稻纹枯菌、草莓灰霉和灰葡萄孢菌菌块接种于PDA 平板的中央，28℃培养2d。在距离菌丝边缘2cm的位置放置灭菌的滤纸片(D＝6mm)，将60μL的菌液和PBS(空白对照)分别滴在滤纸片上。28℃继续培养2天后，观察测试样品对真菌菌丝生长的抑制情况。从图3可以看出，Serratia sp.MEW06的发酵液可以明显抑制尖刀镰孢菌、苹果轮纹菌、花生叶霉和草莓灰霉菌丝的生长，对水稻纹枯菌和灰葡萄孢菌具有一定的抑制作用。

<110>湖北大学

<120>一株具有富磷、降解有机磷及抑制植物病原真菌的沙雷氏菌

<160>1

<210>1

<211>1400

<212>DNA

<213>沙雷氏菌(Serratia sp.)

<400>1

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