一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法与流程

本发明涉及细胞培养领域，特别是涉及一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法。

背景技术：

自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）是机体重要的免疫细胞，主要分布在外周血中。NK细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。

NK细胞在外周血中的含量远不能满足临床需要，目前主要利用细胞因子的刺激来扩增NK细胞，但上述方法扩增的NK细胞与临床需求仍存在一定的差距。如何提供一种可扩增出大量且高活性的NK细胞的培养基，是NK细胞体外扩增领域亟待解决的问题之一。

技术实现要素：

本发明主要解决的技术问题是提供一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，可扩增出数量大、活性高、杀伤性强的NK细胞。

为解决上述技术问题，本发明提供一种NK细胞培养基，包括基础培养基和添加物，添加物各组分及浓度为：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L来那度胺、8-16mmol/L HEPES。

其中，基础培养基为MEM-alpha培养基。

其中，添加物各组分及浓度为：9-11g/L人血清白蛋白、3.5-6.5mmol/L尼克酰胺、0.8-1.5μmol/L来那度胺、9-15mmol/L HEPES。

其中，添加物各组分及浓度为：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L来那度胺、10mmol/L HEPES。

为解决上述技术问题，本发明提供一种体外扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：将制备的NK细胞悬于NK细胞培养基中，并将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中，NK细胞的密度为4.5×10⁶-5.5×10⁶个/20ml；在细胞培养瓶中加入体积比为15%-25%的自体血浆及5-15μg/ml抗Her-2单克隆抗体、950-1050U/ml重组人IL-2、25-35ng/ml重组人IL-15、5-15ng/ml重组人IL-21，并将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；间隔预定时间补加NK细胞培养基及950-1050U/ml重组人IL-2、25-35ng/ml重组人IL-15、5-15ng/ml重组人IL-21，当培养体系为90-110ml时，将细胞悬液转移至细胞培养袋中培养；培养预定天数后，获得扩增的NK细胞；其中，NK细胞培养基包括基础培养基和添加物，添加物各组分及浓度为：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L来那度胺、8-16mmol/L HEPES。

其中，初始悬于NK细胞培养基中的NK细胞的密度为5×10⁶个/20ml。

其中，自体血浆的浓度为体积比20%，抗Her-2单克隆抗体的浓度为10μg/ml，重组人IL-2的浓度为1000U/ml，重组人IL-15的浓度为30ng/ml，重组人IL-21的浓度为10ng/ml。

其中，基础培养基为MEM-alpha培养基。

其中，添加物各组分及浓度为：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L来那度胺、10mmol/L HEPES。

其中，细胞培养袋为透气细胞培养袋。

本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明的NK细胞培养基包括基础培养基和添加物，基础培养基为MEM-alpha培养基，添加物各组分及浓度为：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L来那度胺、8-16mmol/L HEPES。通过上述培养基体外扩增NK细胞，可扩增出数量大、活性高、杀伤性强的NK细胞。

附图说明

图1是本发明体外扩增的NK细胞流式结果图一；

图2是本发明体外扩增的NK细胞流式结果图二。

具体实施方式

实施例1

体外扩增NK细胞的方法如下：将制备的NK细胞悬于NK细胞培养基中，NK细胞的密度为5×10⁶个/20ml，然后将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中；在细胞培养瓶中加入体积比为20%的自体血浆及10μg/ml抗Her-2单克隆抗体、1000U/ml重组人IL-2、30ng/ml重组人IL-15、10ng/ml重组人IL-21，然后将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；每隔3天补加NK细胞培养基及1000U/ml重组人IL-2、30ng/ml重组人IL-15、10ng/ml重组人IL-21，当培养体系为100ml时，将细胞悬液转移到1.9L细胞培养袋中继续培养；培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得扩增的NK细胞。其中，细胞培养袋为透气细胞培养袋。

在本实施例中，NK细胞培养基包括基础培养基和添加物，基础培养基为MEM-alpha培养基，添加物各组分及浓度为：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L来那度胺、10mmol/L HEPES。

在本实施例中，细胞培养瓶为T75培养瓶。

请参阅图1，图1是本实施例体外扩增的NK细胞流式结果图，如图1所示，由于制备的NK细胞纯度没有100%，因此还存在其他细胞的扩增。图1分为4个象限：左上，CD（16+56）阳性、CD3阴性，此细胞即为NK细胞，占84.7%；右上，CD3阳性、CD（16+56）阳性，此细胞即为NKT细胞（既有T细胞表型，又有NK细胞表型），占10.8%；右下，CD3阳性、CD（16+56）阴性，此细胞即为T细胞，占4.27%；左下，杂细胞，占0.161%。由图1可以看出，本实施例的扩增效果非常可观。

实施例2

体外扩增NK细胞的方法如下：将制备的NK细胞悬于NK细胞培养基中，NK细胞的密度为5×10⁶个/20ml，然后将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中；在细胞培养瓶中加入体积比为20%的自体血浆及10μg/ml抗Her-2单克隆抗体、1000U/ml重组人IL-2、30ng/ml重组人IL-15、10ng/ml重组人IL-21，然后将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；每隔3天补加NK细胞培养基及1000U/ml重组人IL-2、30ng/ml重组人IL-15、10ng/ml重组人IL-21，当培养体系为100ml时，将细胞悬液转移到1.9L细胞培养袋中继续培养；培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得扩增的NK细胞。其中，细胞培养袋为透气细胞培养袋。

在本实施例中，NK细胞培养基包括基础培养基和添加物，基础培养基为MEM-alpha培养基，添加物各组分及浓度为：11g/L人血清白蛋白、6mmol/L尼克酰胺、1.2μmol/L来那度胺、12mmol/L HEPES。

在本实施例中，细胞培养瓶为T75培养瓶。

请参阅图2，图2是本实施例体外扩增的NK细胞流式结果图，如图2所示，由于制备的NK细胞纯度没有100%，因此还存在其他细胞的扩增。图2分为4个象限：左上，CD（16+56）阳性、CD3阴性，此细胞即为NK细胞，占84.9%；右上，CD3阳性、CD（16+56）阳性，此细胞即为NKT细胞（既有T细胞表型，又有NK细胞表型），占10.9%；右下，CD3阳性、CD（16+56）阴性，此细胞即为T细胞，占4.05%；左下，杂细胞，占0.159%。由图2可以看出，本实施例的扩增效果非常可观。

对比例1

体外扩增NK细胞的方法如下：将制备的NK细胞悬于NK细胞培养基中，NK细胞的密度为5×10⁶个/20ml，然后将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中；将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；每隔3天补加NK细胞培养基，当培养体系为100ml时，将细胞悬液转移到1.9L细胞培养袋中继续培养；培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得扩增的NK细胞。

其中，NK细胞培养基包括1000U/ml重组人IL-2、30ng/ml重组人IL-15、10ng/ml重组人IL-21。

对比例2

扩增方法与实施例1相同，扩增所使用的NK细胞培养基，包括基础培养基和添加物，基础培养基为MEM-alpha培养基，添加物各组分及浓度为：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、10mmol/L HEPES。

对比例3

扩增方法与实施例2相同，扩增所使用的NK细胞培养基，包括基础培养基和添加物，基础培养基为MEM-alpha培养基，添加物各组分及浓度为：11g/L人血清白蛋白、6mmol/L尼克酰胺、12mmol/L HEPES。

实验例1

分别在0、7、14天取实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3培养的细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以第0天的细胞数，得到扩增倍数。

表1 NK细胞扩增倍数

根据表1所示，实施例1、实施例2扩增的NK细胞数量明显大于对比例1、对比例2、对比例3扩增的NK细胞数量。

实验例2

以处于对数生长期的人白血病细胞K562为靶细胞，将实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3扩增的NK细胞作为效应细胞，采用LDH法检测NK细胞的杀伤活性。具体为：按1:1、10:1、20:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设置效应细胞孔、靶细胞孔，用酶标仪检测450nm时的OD值。其中，杀伤率计算公式为：杀伤率=[1-（实验孔OD值-效应细胞孔OD值/靶细胞孔OD值）]×100%，实验孔为含有效应细胞和靶细胞的孔。

表2 NK细胞杀伤率

根据表2所示，在不同效靶比的情况下，实施例1、实施例2扩增的NK细胞对K562的杀伤活性均高于对比例1、对比例2、对比例3扩增的NK细胞的杀伤活性。

综上所述，利用本发明的NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，可扩增出数量大、活性高、杀伤性强的NK细胞。需要指出的是，本发明的NK细胞培养基为用于体外扩增NK细胞的无血清细胞培养基。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。