本发明涉及细胞分选及细胞体外激活技术领域，具体涉及一种用于人外周血T细胞的分离及激活的方法。
背景技术：
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T淋巴细胞是参与机体免疫应答的关键成员，对T淋巴细胞表型特征及其功能的深入研究，在基础理论与临床实践中均有重大意义。稳定而高效地分出高纯度且生理功能与结构不受影响的T淋巴细胞是进行一系列免疫学研究的前提与基础。
Julius等最早建立了一种快速分离T细胞的方法：T细胞表面较光滑，而B细胞表面绒毛较多，混合的淋巴细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，需用冷洗脱和挤压尼龙棉方法才可获得，而多数T细胞则通过尼龙毛柱从尼龙毛上洗脱下来。虽然采用尼龙毛分离T细胞的方法操作简便易行，无需特殊仪器，对细胞损伤小，适用在基层单位、临床开展的科研工作和学生的实验教学。但是分离得到T细胞的纯度仅达(48.3±11.2)％，随着单克隆抗体的问世，为了提高细胞纯化效率，采用特异性的单抗结合其它技术来分选细胞(免疫分选，immune selection)。补体细胞毒法是用Lympho-kwik T是一种类似鸡尾酒的混合试剂，含有单克隆抗体和补体，并能形成密度梯度，通过抗原-抗体复合物活化补体来去除B细胞和单核细胞。此方法简单易行，显著缩短了操作时间，但所获T细胞的纯度为(82.8±3.2)％，仍不够理想，可能与抗体反复冻融，融解后的抗体未及时使用导致抗体活性降低有关。为进一步提高分离效果，出现了免疫磁珠法，T细胞经CD2抗体介导与直径50nm的磁性微珠结合，在强磁场下，T细胞被吸引而滞留在阳选柱内，将阳选柱移出磁场后，再将T细胞洗脱下来，这样能稳定、快速和高效地分离出了纯度高于95％的T细胞，结果明显优于以上两种方法。但磁珠抗体有效期较短，需及时使用。放置时间较长的抗体，使用时可适当延长孵育时间，同样能达到良好的分离效果，但孵育时间过长会引起非靶细胞的非特异性标记。经过磁性分离的T细胞是否已被活化，阳选T细胞结合微珠后是否影响其功能检测尚有争议。
技术实现要素：
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针对现有技术存在的不足，本发明提供一种用于人外周血T细胞的分离及激活的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种用于人外周血T细胞的分离及激活的方法，该方法是利用CD4和CD8抗体磁珠分离人外周血T细胞，然后将获得的T细胞用T细胞激活试剂激活，从而用于慢病毒转化做准备。
上述利用CD4和CD8抗体磁珠分离人外周血T细胞是将人外周血白细胞与CD4和CD8抗体磁珠共孵育，然后将孵育后的T细胞置于磁场内的分离柱中，使其与抗体磁珠结合,通过磁场的作用,未与抗体磁珠结合的阴性细胞能够用缓冲液洗出分离柱；与抗体磁珠结合的T细胞滞留于分离柱内，将滞留有T细胞的分离柱移离磁场，即分离获得人外周血T细胞。
上述T细胞激活试剂采用TransAct CD3/28，TransAct CD3/28是将人源化的CD3和CD28抗体偶联与聚合的纳米基质，可通过离心便利地清除，经该试剂激活后的细胞可有效的被慢病毒转化。
进一步地，本发明用于人外周血T细胞的分离及激活的方法，包括以下步骤：
S1：用外周血单个核细胞分离液Ficoll-Paque分离外周血单个核细胞；
S2：将外周血单个核细胞与CD4和CD8抗体磁珠孵育结合；
S3：孵育后的T细胞通过置于磁场内的分离柱，分离获得人外周血T细胞；
S4：将分离获得的人外周血T细胞悬浮于T细胞培养基CTSTM OpTmizerTM(ThermoFisher Scientific)，加入T细胞激活试剂TransAct CD3/28(Miltenyi Biotech)进行激活。
通过本发明用于人外周血T细胞的分离及激活的方法可同时获得CD4和CD8T细胞，为生产表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的T细胞同时含有CD4和CD8T细胞提供了保证，因此，在应用表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的T细胞进行治疗时，同时含有CD4和CD8T细胞可有效地保证治疗效果。
本发明用于人外周血T细胞的分离及激活的方法简单易行，重复性好，可获得纯度高于90％的T细胞。
具体实施方式：
下面对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明用于人外周血T细胞的分离及激活的方法，包括以下步骤：
(1)将外周血用pH7.2的磷酸盐缓冲液作5X体积稀释；
(2)在50mL离心管中加入15mL外周血单个核细胞分离液Ficoll-Paque；
(3)缓慢地将稀释后的外周血逐层加于Ficoll-Paque上，室温离心400g,30min；
(4)小心地吸去上层血浆，注意不要搅动中间单个核细胞层；
(5)轻轻地将中间层转移到新的50mL离心管中，然后在该离心管中补加磷酸盐缓冲液至50mL，室温离心300g,10min，移弃上清；
(6)将细胞沉淀悬浮于50mL磷酸盐缓冲液，室温离心200g,10min，移弃上清；
(7)重复步骤(6)，以除去大部分血小板，将细胞沉淀悬浮于50mL 0.5％人血白蛋白/PBS/EDTA缓冲液中；
(8)取少量细胞计数，用流式细胞仪分析单个核细胞中CD4和CD8细胞组分的含量；
(9)将细胞室温离心300g,10min，移弃上清；
(10)按照80μL/107总外周血单个核细胞的体积将细胞沉淀悬浮于0.5％人血白蛋白/PBS/EDTA缓冲液中；
(11)按照40μL/107外周血单个核细胞中CD4和CD8细胞组分的量加入CD4微磁珠和CD8微磁珠(CliniMACS CD4和CD8微磁珠)；
(12)混合均匀，置室温旋转孵育30min；
(13)按照2mL/107总外周血单个核细胞的体积加入0.5％人血白蛋白/PBS/EDTA缓冲液，室温离心300g,10min，移弃上清；
(14)按照500μL/108总外周血单个核细胞的体积将细胞沉淀悬浮于0.5％人血白蛋白/PBS/EDTA缓冲液中；
(15)将MACS LS分离柱置于MACS分离器磁场内，用0.5％人血白蛋白/PBS/EDTA缓冲液3mL冲洗；
(16)将与磁珠孵育过的外周血单个核细胞悬液加到分离柱上(视待分离的细胞数选择多个分离柱，LS分离柱最大分离载荷量为108阳性细胞/分离柱)，收集流出的细胞悬液；
(17)用0.5％人血白蛋白/PBS/EDTA缓冲液3mL冲洗分离柱三次，收集流出的细胞悬液，与步骤(16)收集的细胞混合即为CD4和CD8阴性细胞组分；
(18)将分离柱移离分离器磁场并置于一个收集管上，加入0.5％人血白蛋白/PBS/EDTA缓冲液5mL，并迅即用活塞将滞留在分离柱中的阳性细胞推出，此细胞组分即为CD4和CD8阳性T细胞；
(19)取少量细胞计数，用流式细胞仪分析单个核细胞中CD4和CD8细胞组分的含量，评估分离效果；
(20)将获得的CD4和CD8阳性T细胞室温离心300g,10min，移弃上清；
(21)将细胞沉淀悬浮于含2％人血清AB的OpTmizer中洗涤，室温离心300g,10min，移弃上清；
(22)按照1X06/mL细胞浓度将细胞沉淀悬浮于含2％人血清AB，200单位/mL细胞介素-2(IL-2)的T细胞培养基中，按照1:17.5稀释度加入TransActCD3/28T细胞激活剂；
(23)将细胞转移至T75培养瓶中，置于37℃，5％CO2孵育箱中培养。
通过上述方法同时分离获得CD4和CD8阳性T细胞，其结果如下表1：
由表1可知：该方法分离获得的CD4和CD8阳性T细胞的纯度为92.8％，回收率为60.7％，因此，应用含有CD4和CD8T细胞表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的T细胞进行治疗时，可有效地保证治疗效果。