一种单细胞转移方法和转移系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明生物检测领域，尤其涉及一种单细胞转移方法和转移系统。
【背景技术】
[0002] 单细胞水平分析是细胞生物学、神经生物学和胚胎植入前遗传学诊断中不可缺少 的一项，需要通过对单细胞进行操作，来实现单细胞水平的基因检测、神经电生理检测、免 疫学检测、蛋白检测等。其中单细胞转移操作是实现各类检测首要的一步。
[0003] 目前单细胞转移的方法主要有：①以显微操作系统作为转移装置的单细胞转移方 法和②以口吸式吸管作为转移装置的单细胞转移方法。此类方法存在诸多不足，如：显微操 作系统作为转移装置的过于依赖仪器，操作过程繁琐，细胞转移效率低下；口吸式吸管作为 转移装置的不能精确控制转移液体体积，常常携带的液体过多而影响检测结果；此外，这些 方法特别不适用于单细胞基因检测，包括单细胞基因组检测、单细胞转录组检测、单细胞基 因突变检测、单细胞染色质（体）检测等，所以难以推广应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有的单细胞转移装置操作过程复杂，细胞转移效率低，不 能精确控制转移液体体积的不足，提供一种单细胞转移方法和转移系统，从而能够准确地 转移单细胞，并且能够方便、快捷地转移单细胞，转移的单细胞转移效率、存活率高。
[0005] 针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
[0006] -方面，本发明提供一种单细胞转移方法，所述方法包括以下步骤：
[0007] 1)高温烘烤吸管，然后将所述吸管的一段封闭为封闭端，另一端作为吸入端，用于 转移单细胞的吸管，所述吸入端的直径适合所述单细胞；
[0008] 2)将所述吸管的吸入端置于粘稠的矿物油中，所述矿物油在毛细管力作用下进入 吸管内，再将所述吸管取出，挤压所述吸管的封闭端，挤出微量矿物油，得到载有矿物油的 吸管；
[0009] 3)然后于倒置显微镜或体视镜下，将所述载有矿物油的吸管的吸入端的端口对准 溶液的单细胞，将所述单细胞吸入吸管，得到载有单细胞的吸管，并通过所述倒置显微镜或 体视镜控制进入所述吸管中溶液的体积；
[0010] 4)再将所述载有单细胞的吸管转移至目的位置后，加压引导吸管形变，将所述单 细胞从吸管中排出，即得。
[0011] 优选地，所述吸管中溶液的体积为3~15nl (纳升），在该体积下转移细胞时携带 能够尽可能少液体成分，以避免携带液体成分对后续细胞操作带来的负面影响。
[0012] 优选地,在步骤1)中,所述吸管为玻璃管或巴氏德吸管。
[0013] 更优选地，当所述吸管为玻璃管时，所述吸入端通过高温烘烤后拉伸至适合所述 单细胞的直径。
[0014] 优选地，在步骤1)中，用酒精灯或电阻仪高温烘烤吸管。
[0015] 优选地，所述单细胞为动植物细胞或动物卵子、极早期动物胚胎。
[0016] 另一方面，本发明还提供一种单细胞转移系统，所述系统包括用于转移单细胞的 吸管和倒置显微镜或体视镜，所述吸管中载有矿物油，所述吸管包括封闭端和吸入端，所述 吸入端的直径适合所述单细胞；所述倒置显微镜或体视镜用于控制进入所述吸管中液体的 体积。
[0017] 优选地，所述吸管中溶液的体积为3~15nl (纳升）。
[0018] 优选地，所述吸管通过酒精灯或电阻仪高温烘烤。
[0019] 优选地，所述单细胞为动植物细胞或动物卵子、极早期动物胚胎。
[0020] 本发明的单细胞转移方法和系统结合了矿物油的粘稠性能、半封闭玻璃管，能够 在挤压下发生形变，来实现单细胞转移的方便快捷准确、携带液体微量的目的，并通过在倒 置显微镜或体视镜更准确控制进入玻璃管中液体的体积，便于进一步单细胞水平的基因检 测、细胞功能检测等操作，转移的单细胞转移效率、存活率高。对于动物卵子与早期胚胎转 移，每分钟可转移30-100个，对于动植物细胞或卵裂球每分钟可转移20-60个，转移的细 胞、卵子、胚胎、卵裂球的存活率接近100%，能够得到广泛地推广应用。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明所述的用于转移单细胞的吸管的结构示意图，其中，A为吸入端为 直通型的吸管的结构示意图；B为吸入端为弯折型的吸管的结构示意图；C为吸入端为直通 型，中间为球形的吸管的结构示意图；D为吸入端为弯折型，中间为球形的吸管的结构示意 图；
[0022] 图中，1为吸入立而，2为封闭立而。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0024] 除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。
[0025] 除非特别指明，以下实施例中所用的小鼠为ICR品系小鼠，购自同济大学动物中 心；小鼠骨髓间充质干细胞购自同济大学干细胞中心；小麦细胞由试验田种植，品系为"中 13"。
[0026] 除非特别指明，以下实施例中所用的细胞裂解液如果为20μ 1，则配方如下20% ΝΡ-40,1 μ 1、RNA酶抑制剂（40单位/微升），0. 25 μ 1、20单位/微升的RNA抑制剂抑制剂 (SUPERase 抑制剂），0· 25 μ 1、无 RNA 酶水 18. 5 μ 1。
[0027] 实施例1用于转移单细胞的的吸管的制备
[0028] 1)挑选长度为15-30厘米长，内径为2-4毫米，厚度为0· 2-0. 5毫米的玻璃管（可 以用5寸-9寸长的巴氏德吸管代替）；
[0029] 2)用酒精灯作为高温煅烧设备，也可以采用高温电阻仪代替；
[0030] 3)将玻璃管的一端置于酒精灯火焰外焰部分，如为巴氏德管，则将管子粗的一端 进行煅烧，直至末端融化并封闭，作为封闭端；
[0031] 4)待末端冷却后，用左右手分别抓住玻璃管的两段，并将玻璃管的未封闭的一端 靠内部分置于酒精灯火焰上，待玻璃管烧红变软后，左右手沿相反方向快速拉扯，用砂轮刮 擦拉细得中间处，轻轻折断，该拉长的一端作为吸入端，得到具有封闭端和吸入端的用于转 移单细胞的吸管（玻璃管），结果如图1中的A所示；
[0032] 5)观察吸入端断口的大小，如：转移细胞的大小为10微米，则断口大小以12-15 微米为佳；而动物早期胚胎的卵裂球一般较大，可达50微米，则玻璃管断口开小以60-70微 米为佳。
[0033] 此外，按照前述相同的方法制备具有封闭端和吸入端的用于转移单细胞的吸管， 不通过的为将吸管的吸入端折成弯折的形式，则形成的用于转移单细胞吸管如图1中的B 所示；不同的为吸管中间为球形，吸入端为直通型，则形成的用于转移单细胞吸管如图1中 的C所示；不同的为吸管中间为球形，并将吸管的吸入端折成弯折的形式，则形成的用于转 移单细胞吸管如图1中的D所示。
[0034] 实施例2单细胞小鼠胚胎卵裂球的转移
[0035] 利用实施例1制备的，如图1中的A所示的用于转移单细胞的吸管进行单个小鼠 胚胎卵裂球的转移，并应用于单细胞基因检测。
[0036] 1)将ICR品系小鼠的极早期（体外培养第三天）胚胎转移至台式液（Tyrode液） 中处理1分钟（冷冻胚胎可为1-3分钟）去除透明带；
[0037] 2)将裸露的胚胎转移至磷酸缓冲液中洗涤两次；
[0038] 3)再将胚胎转移至15μ 1(可为10-20微升）0.05%胰酶液中，37摄氏度消化3-5 分钟，反复吸入排出动作，将胚胎消化成单个卵裂球；
[0039] 4)将单个卵裂球转移至磷酸缓冲液中洗涤两次；
[0040] 5)将实施例1制得的用于转移单细胞的吸管置于在矿物油中，利用毛细管作用让 矿物油在毛细管力作用下进入吸管内；
[0041] 6)待毛细管作用压力平衡后，将玻璃管退出矿物油，用手轻轻挤压玻璃管封闭的 一端，引导玻璃管发生形变，进而挤出微量矿物油，控制挤出的液体量；
[0042] 7)在体视镜下，将所述吸管的吸入端对准磷酸缓冲液中的单个卵裂球，降低挤压 玻璃管的压力，将卵裂球吸入玻璃管，控制进入玻璃管中磷酸缓冲液的体积为9nl (尽量携 带少的磷酸缓冲液）；
[0043] 8)将玻璃管插入含有细胞裂解液的基因扩增管中，轻轻加压引导玻璃管形变，细 胞从管中排