一种抗PD‑L1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物与流程

本发明涉及生物检测和治疗
技术领域：
，具体而言，涉及一种抗pd-l1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物。
背景技术：
：程序性细胞死亡因子配体1(programmedcelldeath1ligand1，pd-l1)是一个由290个氨基酸组成的跨膜糖蛋白。pd-l1属于b7家族，具有igv和igc样区、跨膜区及胞浆区尾部，pd-l1与其t细胞上的程序性细胞死亡因子1(programmedcelldeath1，pd-1)相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用(rileyjl.pd-1signalinginprimarytcells[j].immunolrev.2009，229(1):114-1125.)，广泛的低表达在正常免疫和非免疫细胞的表面，过表达于部分肿瘤细胞。在正常免疫系统中，pd-l1在免疫耐受方面，起着极其重要的作用。研究表明pd-l1表达在牙周膜细胞表面，促进t细胞的凋亡并抑制炎症细胞对牙周膜细胞的损伤作用(张杰华.炎性诱导牙周膜细胞表面表达的pd-l1是对抗牙周炎的一种保护性机制.第九届全国免疫学学术大会论文集.2014)。在肿瘤方面，在淋巴瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、食管癌等大多数肿瘤细胞系都检测到了pd-l1的表达，致使t细胞的凋亡，清除活化的t细胞(dongh.tumor-associatedb7-h1promotest-cellapoptosis:apotentialmechanismofimmuneevasion[j].natmed,2002,8(8):793-800.)。pd-l1在乳腺癌(muensts.expressionofprogrammeddeathligand1(pd-l1)isassociatedwithpoorprognosisinhumanbreastcancer[j].breastcancerrestreat,2014,146(1):15-24.)、胃癌(kimjw,prognosticimplicationsofimmnosuppressiveproteinexpressionintumorsaswellasimmunecellinfiltrationwithinthetumormicroenvironmentingastriccancer[j/ol].gastriccancer,2014.)、肾癌(choueiritk.pd-l1expressioninnon-clear-cellrenalcellcarcinoma[j].annoncol,2014,25(11):2178-2184)等多种肿瘤中表达上调，而在正常组织中低表达或不表达。肿瘤细胞免疫逃逸是肿瘤躲避免疫系统清除的重要原因之一。表达于肿瘤细胞表面的pd-l1与pd-1结合抑制t细胞的激活，使其不能发现肿瘤。抗pd-l1单抗能有效结合癌细胞表面的pd-l1，阻断信号通路，激活t细胞，并杀死肿瘤细胞。阻断pd-l1/pd-1通路能提高t细胞的反应(blankc.blockadeofpd-l1(b7-h1)augmentshumantumor-specifictcellresponsesinvitro[j].intjcancer,2006,119(2):317-327.)研究发现(刘志华.负性共刺激分子pd-l1在非肌层浸润性膀胱癌的表达及其对术后膀胱灌注治疗的影响.中山大学学报(医学科学版).2015,36(2):221-225.))，pd-l1在非肌层浸润性膀胱癌细胞表达水平与肿瘤病理分期相关，根据pd-l1的表达选择药物，可以提高治疗效果。下调肺腺癌a549细胞pd-l1的mrna表达，可以增强杀伤细胞对a549细胞的杀伤作用(蒋涛.cik细胞对rnai沉默pd-l1基因的肺腺癌a549细胞的体外抑制作用.现代肿瘤医学.2015.23(12):1641-1643)pd-l1蛋白是非小细胞肺癌中预测肿瘤术后进展的重要指标(刘明东.pd-l1、ki67预测非小细胞肺癌术后进展的研究.现代肿瘤医学.2017.885-889)。pd-l1的预后指标作用在其他肿瘤的研究中也有相关报道。在慢性病毒感染性疾病方面，研究结果显示，在pd-l1基因敲除小鼠中，大量cd8+t细胞聚集在肝内，使活化t细胞的清除率下降，导致自身免疫性肝炎的发病率上升(dongh.b7-h1determinesaccumulationanddeletionofintrahepaticcd8+tlymphocytes[j].immunity,2004,20(3):327-336.)。研究发现，在活化的t细胞或者在病毒感染期，干扰素上调pd-l1在肝细胞上的表达，并与与表达在t细胞上pd-1共同作用，诱导t细胞凋亡(mühlbauerm.pd-l1isinducedinhepatocytesbyviralinfectionandbyinterferon-αand-γandmediatestcellapoptosis[j].jhepatol,2006,45(4):520-528.)研究慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染小鼠(daniellbarber.restoringfunctioninexhaustedcd8tcellsduringchronicviralinfection[j].nature，2006，439(7077):682-687.)结果表明，对功能受损病毒特异性cd8+t细胞进行基因表达分析比较，发现pd-l1在感染的细胞上也高表达，对pd-1/pd-l1信号通路进行阻断，可以增强t细胞的反应性，恢复cd8+t细胞部分功能。此机制有助于为慢性感染性疾病制定治疗策略。抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高，机制明确，疗效显著，毒副作用少等优点，在各种疾病治疗、特别是对肿瘤治疗有非常广阔的前景。目前美国fda已经批准使用的抗pd-l1的单抗药物为罗氏(roche/genentech)的atezolizumab(tecentriq)，在临床上用于治疗膀胱癌和非小细胞肺癌。基于基因的检测方法只能在核酸水平上反映样品中基因含量，不能检测其是处于沉默还是表达，因此，其检测结果与蛋白的实际含量并无直接关联。加之，基因在加工过程中会因降解掉而难以检测，而核酸检测方法必须经过专门的核酸提取和纯化过程，增加了额外的工作量。基于蛋白的免疫学分析方法，采用高度特异性的抗原抗体反应，实现样本快速、准确、高效的检测，其技术关键是制备具有高度特异性的抗体。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种抗pd-l1抗体，其可特异性结合pd-l1蛋白，具有较高的特异性，可用于免疫印迹(westernblot)、酶联免疫吸附(elisa)、免疫组织化学(ihc)以及流式细胞术(facs)检测，也可以用于肿瘤、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病等疾病的治疗。本发明的另一目的在于提供一种抗pd-l1的抗体片段，其具有与上述抗pd-l1抗体等同的效果，可特异性结合pd-l1蛋白，具有较高的特异性。本发明的另一目的在于提供上述抗pd-l1抗体以及抗pd-l1的抗体片段的在检测和治疗中的应用。本发明的另一目的在于提供上述抗pd-l1抗体的制备方法，所制得的抗pd-l1抗体效价高，特异性好。本发明的另一目的在于提供一种检测pd-l1蛋白的试剂盒。本发明的另一目的在于提供一种药物。本发明是这样实现的：一种抗pd-l1抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.6所示。一种抗pd-l1的抗体片段，所述抗体片段是由上述的抗pd-l1抗体的抗体片段形成的fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。上述的抗pd-l1抗体或上述的抗pd-l1的抗体片段在检测生物样品中pd-l1蛋白中的应用。上述的抗pd-l1抗体或上述的抗pd-l1的抗体片段在制备用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病或慢性感染性疾病的药物中的应用。上述的抗pd-l1抗体的制备方法，其包括：用氨基酸序列如seqidno.2中的第29-290位所示的抗原肽免疫动物。一种检测pd-l1蛋白的试剂盒，其含有上述的抗pd-l1抗体或上述的抗pd-l1的抗体片段。一种药物，其含有上述的抗pd-l1抗体或上述的抗pd-l1的抗体片段。本发明具有以下有益效果：本发明提供的抗pd-l1抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区的氨基酸序列如seqidno.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.6所示。该抗pd-l1抗体可以特异性识别结合pd-l1重组蛋白、以及表达pd-l1分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于免疫印迹(westernblot)、酶联免疫吸附(elisa)、免疫组织化学(ihc)以及流式细胞术(facs)检测，也可以用于肿瘤、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病等疾病的治疗。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实施例1提供的pd-l1重组蛋白纯化结果；图2为本发明实施例5提供的鼠单克隆抗体3a7对重组pd-l1蛋白的免疫印迹检测结果；图3为本发明实施例6提供的鼠单克隆抗体3a7对a549(人肺癌细胞)细胞的免疫印迹检测结果。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的一种抗pd-l1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物进行具体说明。本发明应用生物信息学分析，来自于genebank中(gi:20070268)核酸序列，编码的uniprot中q9nzq7的蛋白序列，基因合成pd-l1蛋白的29位到290位氨基酸对应的核苷酸，克隆至表达载体质粒pet41a中，进行低温可溶表达，超声破碎后，ni2+亲和纯化作为免疫原，免疫balb/c小鼠。经细胞融合、重组pd-l1的elisa筛选，并测定亚类为igg1型单克隆抗体，阳性克隆细胞注射小鼠腹腔诱导产生腹水，经过proteina/g亲和纯化，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，免疫印记(westernblot)实验显示该抗体能特异识别重组的pd-l1蛋白以及表达pd-l1分子的肿瘤细胞系。基于上述结果，一方面，本发明提供了抗pd-l1抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.6所示。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗pd-l1抗体由小鼠杂交瘤细胞系3a7分泌得到。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述小鼠杂交瘤细胞系3a7由抗原肽免疫小鼠得到的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到，所述抗原肽的氨基酸序列如seqidno.2中的第29-290位所示。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述抗pd-l1抗体为小鼠igg1亚型单克隆抗体。本发明提供的抗pd-l1抗体可以特异性识别结合pd-l1重组蛋白、以及表达pd-l1分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于免疫印迹(westernblot)、酶联免疫吸附(elisa)、免疫组织化学(ihc)以及流式细胞术(facs)检测，也可以用于肿瘤(例如淋巴瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、食管癌)、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病等疾病的治疗。另一方面，本发明提供了一种抗pd-l1的抗体片段，所述抗体片段是由上述的抗pd-l1抗体的抗体片段形成的fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。另一方面，本发明提供了上述抗pd-l1抗体或上述的抗pd-l1的抗体片段在检测生物样品中pd-l1蛋白中的应用。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述生物样品为肿瘤组织或细胞；或者，所述生物样品为炎症组织或细胞。进一步地，在本发明的一些实施方案中，肿瘤组织或细胞选自淋巴瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、食管癌、乳腺癌、胃癌、肾癌等癌症组织或细胞。另一方面，本发明提供了上述抗pd-l1抗体或上述的抗pd-l1的抗体片段在制备用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病或慢性感染性疾病的药物中的应用。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述肿瘤选自淋巴瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、食管癌、乳腺癌、胃癌、肾癌等癌症。另一方面，本发明提供了上述抗pd-l1抗体的制备方法，其包括：用氨基酸序列如seqidno.2中的第29-290位所示的抗原肽免疫动物。本发明通过生物信息学分析显示pd-l1的29-290位抗原性好，含有b细胞表位，以pd-l1的29-290区为重组蛋白(抗原肽)免疫小鼠，制备鼠单克隆抗pd-l1抗体，得到的抗pd-l1抗体可以识别pd-l1且具有较好的特异性。当然，需要说明的是，也可以选用其他动物例如兔、大鼠、猪等哺乳动物进行免疫制备抗体。进一步地，本发明的一些实施方案中，在免疫前，该制备方法还包括：将含有可编码上述抗原的经过密码子优化的核苷酸序列的表达载体转化大肠杆菌，经表达纯化得到免疫蛋白，将该免疫蛋白作为抗原肽免疫动物。其中，核苷酸序列如seqidno.1所示，其编码得到的蛋白包括有pd-l1分子的第29-290位片段蛋白，该核苷酸序列易于大肠杆菌可溶表达。进一步地，本发明的一些实施方案中，在免疫后，该制备方法还包括：取免疫后的动物例如小鼠的脾脏细胞，将其与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得可分泌抗pd-l1抗体的小鼠杂交瘤细胞系3a7，培养该杂交瘤细胞系3a7，获得抗pd-l1抗体。另一方面，本发明提供了一种检测pd-l1蛋白的试剂盒，其含有上述的抗pd-l1抗体或上述的抗pd-l1的抗体片段。本发明提供的试剂盒可通过免疫印迹(westernblot)、酶联免疫吸附(elisa)、免疫组织化学(ihc)以及流式细胞术(facs)检测样品中pd-l1蛋白情况，具有较好的特异性。另一方面，本发明提供了药物，其上述的抗pd-l1抗体或上述的抗pd-l1的抗体片段，以及医药学上可接受的载体。本发明提供的药物可以用于治疗pd-l1过表达的疾病例如淋巴瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、食管癌、乳腺癌、胃癌、肾癌等癌症或是慢性病毒感染性疾病。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1pd-l1重组蛋白表达质粒的构建pd-l1单克隆按照genebank中(gi:20070268)核酸序列，编码的q9nzq7的蛋白序列，采用基因合成的方式合成pd-l1蛋白(seqidno.2)第29位到290位氨基酸序列对应的dna序列((seqidno.1)，引入酶切位点ecori和xhoi，克隆到表达载体pet41a(novagen公司)上，进行测序分析，选取测序正确的克隆进行蛋白表达纯化。实施例2pd-l1重组蛋白表达和纯化将含有pd-l1正确序列的质粒的大肠杆菌培养至od600为0.5，加入10μmol/l的iptg，16℃过夜培养，收菌后超声破碎，进行ni2+亲和纯化。并进行12％sds-page检测，考马斯亮蓝染色，结果如图1所示，重组pd-l1蛋白分子量约为57kda，图1结果(图中：marker为分子量标记)显示在55kd的位置附件有条带，说明本实施例得到pd-l1重组蛋白表达正确。实施例31.动物免疫取7周龄雌性balb/c小鼠用实施例2中纯化的重组蛋白进行腹部皮下多位点免疫注射。初次免疫，使用弗氏完全佐剂，免疫剂量为100μg/只。每3周加强免疫一次，连续加强3次，使用弗氏不完全佐剂，免疫剂量为100μg/只。第四次免疫日开始眼眶采血，每周一次，连续采血4次，分离血清，采用间接elisa法进行血清效价检测。选取效价最高的小鼠进行肌肉注射冲击免疫，剂量为100μg/只。2.细胞融合在无菌条件下，取冲击免疫3天以后的小鼠脾脏，于平皿中用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数，细胞数为1×108，同时制备腹腔悬液(巨噬细胞)作为饲养细胞备用。将以上脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(购自atcc)以10:1比例混合，离心1500rpm，5min，弃上清。在60s加入1ml的peg1500(sigma公司)，37℃静置60s后，加入10ml的dmem(hyclone公司)，离心1000rpm，5min，弃上清。加入10ml血清(gibco公司)、5ml混合10×hat(gibco公司)的胸腺细胞和含有羧甲基纤维素(终浓度1.3％)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％co2培养箱中培养。3.单克隆细胞株鉴定3.1elisa筛选融合后10天克隆细胞团清晰可见，将克隆团置于事先准备好含有15％血清培养基的96孔培养板中，于37℃、5％co2培养箱中培养。3天后换液。2天后，取100μl上清，使用重组蛋白进行间接elisa检测抗原和抗体特异性反应能力，并将阳性克隆转入24孔板培养。3天后再次进行间接elisa检测，然后转入6孔板进行扩大培养。3.2亚类鉴定根据亚类测定试剂(sigma公司)对间接elisa筛选出的阳性鼠单克隆细胞株进行亚类测定。结果显示，本发明的单克隆抗体为igg1型鼠单克隆抗体，编号3a7，命名为小鼠杂交瘤细胞系3a7。使用冻存液(10％dmso、20％血清、70％dmem)进行冻存。4单克隆抗体的获得4.1细胞复苏和扩大培养从液氮中取出3a7细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm，5min离心去除冻存液，于37℃、5％co2培养至对数生长期，期间注意观察细胞状态。4.2腹水制备小鼠腹腔诱生腹水法：注射降植烷致敏小鼠，使用0.01mpbs洗涤并悬起对数生长期细胞，计数1×106个细胞/ml，注射入腹腔。观察小鼠状态，8天后收集腹水。脊椎脱臼法处死腹部隆起的小鼠，用75％酒精浸泡消毒，用手术剪刀剪开腹部上皮，剪开腹膜，将注射器插入吸取腹水，3000rpm，10min离心，于-20℃保存。4.3单克隆抗体的纯化用proteina/g(ge公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体，得到鼠单克隆抗体3a7即抗pd-l1抗体。sds-page胶考马斯亮蓝染色鉴定纯度，bca法测定浓度。实施例4单克隆抗体可变区序列测定1.总rna的获取从液氮中取出3a7杂交瘤细胞细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm，5min离心去除冻存液，置于100mm孔板，培养至占培养板约80％，加入1mltrizol试剂(thermo公司)，并依据说明书提取杂交瘤细胞总rna。2.cdna第一链的获取取2.5μg上述总rna，加入decp水，使体积达到11μl，加入1.0μloligo(dt)(10μm)，加入1μldntps(10mm)，混合均匀，65℃孵育5分钟后置冰上1分钟，然后加入4μlrtbuffer(5×)，1.0μldtt(100mm)，1μlribonucleaseinhibitor及1μl逆转录酶(takara公司)，50℃反应10min。80℃孵育10分钟以终止反应，获得的cdna保存在-20℃。3基因扩增取上述2μlcdna进行pcr扩增，5μl10×pcr缓冲液，1μldntps(10mm)，2μlmgso4(50mm)，1μl上游引物，1μl下游引物，0.2μltaqdna聚合酶，decp水定容至50μl。pcr扩增程序为94℃，5min；30个循环(94℃，30s；55℃，40s；68℃，40s)；72℃，10min。扩增出的片段进行测序。其中，物序列的设计按照文献(bodobrocks.species-crossreactivescfvagainstthetumorstromamarker“fibroblastactivationprotein”selectedbyphagedisplayfromanimmunizedfap-/-knock-outmouse)进行。用于扩增重链可变区的引物如表1所示，其中mhv.b1直至mhv.b12的12条引物为上游引物，可分别与重链下游引物mhc.f组合用于扩增重链可变区基因。用于扩增轻链可变区的引物如表1下，其中mkv.b1直至mkv.b10的10条引物为上游引物，可分别与轻链下游引物组合用于扩增kappa轻链的可变区基因。表1引物序列引物名称核苷酸序列mhv.b15’-gatgtgaagcttcaggagtc-3’mhv.b25’-caggtgcagctgaaggagtc-3’mhv.b35’-caggtgcagctgaagcagtc-3’mhv.b45’-caggttactctgaaagagtc-3’mhv.b55’-gaggtccagctgcaacaatct-3’mhv.b65’-gaggtccagctgcagcagc-3’mhv.b75’-caggtccaactgcagcagcct-3’mhv.b85’-gaggtgaagctggtggagtc-3’mhv.b95’-gaggtgaagctggtggaatc-3’mhv.b105’-gatgtgaacttggaagtgtc-3’mhv.b115’-gaggtccagctgcaacagtc-3’mhv.b125’-gaggtgcagctggaggagtc-3’mhc.f5’-gccagtggatagtcagatgggggtgtcgttttggc-3’mkv.b15’-gatgttttgatgacccaaact-3’mkv.b25’-gatattgtgatgacgcaggct-3’mkv.b35’-gatattgtgataacccag-3’mkv.b45’-gacattgtgctgacccaatct-3’mkv.b55’-gacattgtgatgacccagtct-3’mkv.b65’-gatattgtgctaactcagtct-3’mkv.b75’-gatatccagatgacacagact-3’mkv.b85’-gacatccagctgactcagtct-3’mkv.b95’-caaattgttctcacccagtct-3’mkv.b105’-gacattctgatgacccagtct-3’mkc.f5’-ggatacagttggtgcagcatc-3’测序结果显示，鼠杂交瘤细胞株3a7分泌的单克隆抗体3a7的重链和轻链可变区的dna序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示，其对应的重链和轻链的可变区氨基酸序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示。实施例5鼠单克隆抗体3a7对重组pd-l1蛋白特异性反应选择pd-l1重组蛋白，用免疫印迹法检测本发明实施例3的单克隆抗体的识别特异性，蛋白上样5ng，进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用电转移系统(湿转，tanon公司)将凝胶蛋白带转移到0.45μm的pvdf膜上(millipore公司)。将膜置于封闭液(含1％bsa的tbs-t)中4℃过夜。加入单克隆抗体3a7，室温孵育1h。用tbs-t洗膜后，加入1：10000稀释的羊抗鼠二抗(hrp标记，北京全式金生物技术有限公司)，室温孵育0.5h。tbs-t洗膜，加入ecl显色液(thermo公司)，westernblot凝胶成像分析系统(tanon公司)采集图像数据。结果如图2所示(图中：marker为分子量标记，3a7代表鼠单克隆抗体3a7)，鼠单克隆抗体3a7可特异性识别重组pd-l1蛋白，分子量大小约为57kd的条带，具有很高的特异性。实施例6鼠单克隆抗体3a7对表达pd-l1蛋白的a549细胞系特异性反应选择a549细胞系，用免疫印迹法检测本发明的鼠单克隆抗体的识别特异性。蛋白上样100μg，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用电转移系统(湿转，tanon公司)将凝胶蛋白带转移到0.22μm的pvdf膜上(millipore公司)。将膜置于封闭液(含1％bsa的tbs-t)中4℃12h。加入单克隆抗体3a7，4℃孵育12h。用tbs-t洗膜后，加入1：10000稀释的羊抗鼠二抗(hrp标记，北京全式金生物技术有限公司)，室温孵育1h。tbs-t洗膜，加入ecl显色液(thermo公司)，westernblot凝胶成像分析系统(tanon公司)采集图像数据。结果图3所示(图中：marker为分子量标记，3a7代表鼠单克隆抗体3a7)，鼠单克隆抗体3a7可特异性识别a549中分子量大小约为31kda的条带，具有很高的特异性。综上，本发明提供的抗pd-l1抗体(即上述的鼠单克隆抗体3a7)，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区的氨基酸序列如seqidno.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.6所示。该抗pd-l1抗体可以特异性识别结合pd-l1重组蛋白、以及表达pd-l1分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于免疫印迹(westernblot)、酶联免疫吸附(elisa)、免疫组织化学(ihc)以及流式细胞术(facs)检测，也可以用于肿瘤、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病等疾病的治疗。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>联合益康（北京）生物科技有限公司<120>一种抗pd-l1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>873<212>dna<213>人工序列<400>1atgaggatatttgctgtctttatattcatgacctactggcatttgctgaacgcatttact60gtcacggttcccaaggacctatatgtggtagagtatggtagcaatatgacaattgaatgc120aaattcccagtagaaaaacaattagacctggctgcactaattgtctattgggaaatggag180gataagaacattattcaatttgtgcatggagaggaagacctgaaggttcagcatagtagc240tacagacagagggcccggctgttgaaggaccagctctccctgggaaatgctgcacttcag300atcacagatgtgaaattgcaggatgcaggggtgtaccgctgcatgatcagctatggtggt360gccgactacaagcgaattactgtgaaagtcaatgccccatacaacaaaatcaaccaaaga420attttggttgtggatccagtcacctctgaacatgaactgacatgtcaggctgagggctac480cccaaggccgaagtcatctggacaagcagtgaccatcaagtcctgagtggtaagaccacc540accaccaattccaagagagaggagaagcttttcaatgtgaccagcacactgagaatcaac600acaacaactaatgagattttctactgcacttttaggagattagatcctgaggaaaaccat660acagctgaattggtcatcccagaactacctctggcacatcctccaaatgaaaggactcac720ttggtaattctgggagccatcttattatgccttggtgtagcactgacattcatcttccgt780ttaagaaaagggagaatgatggatgtgaaaaaatgtggcatccaagatacaaactcaaag840aagcaaagtgatacacatttggaggagacgtaa873<210>2<211>290<212>prt<213>人工序列<400>2metargilephealavalpheilephemetthrtyrtrphisleuleu151015asnalaphethrvalthrvalprolysaspleutyrvalvalglutyr202530glyserasnmetthrileglucyslyspheprovalglulysglnleu354045aspleualaalaleuilevaltyrtrpglumetgluasplysasnile505560ileglnphevalhisglyglugluaspleulysvalglnhisserser65707580tyrargglnargalaargleuleulysaspglnleuserleuglyasn859095alaalaleuglnilethraspvallysleuglnaspalaglyvaltyr100105110argcysmetilesertyrglyglyalaasptyrlysargilethrval115120125lysvalasnalaprotyrasnlysileasnglnargileleuvalval130135140aspprovalthrsergluhisgluleuthrcysglnalagluglytyr145150155160prolysalagluvaliletrpthrserserasphisglnvalleuser165170175glylysthrthrthrthrasnserlysarggluglulysleupheasn180185190valthrserthrleuargileasnthrthrthrasngluilephetyr195200205cysthrpheargargleuaspproglugluasnhisthralagluleu210215220valileprogluleuproleualahisproproasngluargthrhis225230235240leuvalileleuglyalaileleuleucysleuglyvalalaleuthr245250255pheilepheargleuarglysglyargmetmetaspvallyslyscys260265270glyileglnaspthrasnserlyslysglnseraspthrhisleuglu275280285gluthr290<210>3<211>333<212>dna<213>人工序列<400>3ctgcagcagtctggggctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatttcctgcaag60gcttctggctacaccttcactagctattctatgcactggatcaggcagtggcctggaaag120aggctggaatggatcggagctattaaaccaagctatagtggttattcaatacatttagcg180gtttgtgtgaaagggagggccaccatgacaagagacaaatccaaaagtagtgtctacatg240caaatgaacagtttgacatctgaggattctgccgtctattactgtgcaaggtcggactac300tggggccaaggcaccactctcacagtctcctca333<210>4<211>321<212>dna<213>人工序列<400>4gatatcgtgctcactcaatctccagctctccctgctgtcagtcctggagatcaagtcact60ttttcttgcaggtctagtcagagccttaacacctatttacattggtacctcgagaagcca120ggccagtctcctaatctccttatctacaaagtttccaacctgttttctggaattccagac180aggttcagtggcagtggatctggtacagatttcactctcaagatcagtagagtggaggct240gaagatcttggaatatattactgtctcaagctacataattatccttggacgttcggtgga300ggcaccaagctggaaatcaaa321<210>5<211>111<212>prt<213>人工序列<400>5metglnglnserglyalagluleuvallysproglyalaservallys151015ilesercyslysalaserglytyrthrphethrsertyrsermethis202530trpileargglntrpproglylysargleuglutrpileglyalaile354045lysprosertyrserglytyrserilehisleualavalcysvallys505560glyargalathrmetthrargasplysserlysserservaltyrmet65707580glnmetasnserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcysala859095argserasptyrtrpglyglnglythrthrleuthrvalserser100105110<210>6<211>107<212>prt<213>人工序列<400>6aspilevalleuthrglnserproalaleuproalavalserprogly151015aspglnvalthrphesercysargserserglnserleuasnthrtyr202530leuhistrptyrleuglulysproglyglnserproasnleuleuile354045tyrlysvalserasnleupheserglyileproaspargphesergly505560serglyserglythraspphethrleulysileserargvalgluala65707580gluaspleuglyiletyrtyrcysleulysleuhisasntyrprotrp859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105当前第1页12