用靶向性OX40激动剂的组合疗法的制作方法

发明领域本发明涉及采用肿瘤靶向性抗cd3双特异性抗体和靶向性ox40激动剂,特别是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体的组合疗法,这些组合疗法用于治疗癌症的用途和使用该组合疗法的方法。还包括的是采用包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的ox40激动剂,与肿瘤靶向性抗cd3双特异性抗体和与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂,特别是pd-l1抗体的组合疗法。发明背景癌症是全世界首要死因之一。尽管有治疗选项的进步,具有晚期癌症的患者的预后仍然较差。因此,对在不引起不可接受的毒性的情况下延长癌症患者的存活的最佳疗法存在持久且迫切的医学需要。最近来自临床试验的结果已经显示免疫疗法,特别是免疫检查点抑制剂能延长癌症患者的总体存活及引起持久的响应。尽管有这些有希望的结果,当前基于免疫的疗法仅仅在一部分患者中有效,而且需要组合策略来改善治疗益处。募集患者自己的免疫系统来抗击癌症的一种方式是使用t细胞双特异性抗体(tcb)。这些分子由对t细胞上的t细胞受体(tcr)特异性的激动性抗cd3单元和对独特癌症抗原特异性的靶向模块构成。例如,抗cea/抗cd3双特异性抗体是靶向在肿瘤细胞上表达的cea和t细胞上存在的cd3厄普西隆链(cd3ε)的分子。tcb重定向多克隆t细胞来裂解在它们的细胞表面上表达相应靶抗原的癌细胞。t细胞激活在此类靶抗原缺失下不发生。在cea阳性癌细胞存在下,无论正在循环或者驻留组织,药理学活性剂量会触发t细胞激活和相关的细胞因子释放。与肿瘤细胞消减平行,抗cea/抗cd3双特异性抗体导致在第一次施用后24小时内外周血中的t细胞的瞬时减少和细胞因子释放的峰,继以在72小时内快速t细胞恢复和细胞因子水平回到基线。如此,为了实现肿瘤细胞的完全消除,需要保留t细胞激活和针对癌细胞的免疫应答的另外的药剂。取决于这种主要刺激的强度和持续时间,tcr的触发提高共刺激性分子的表达,例如ox40,它是肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族的成员。它的相应配体对这种受体的伴随激动性接合继而促进标志性的t细胞效应器功能,像增殖,存活和某些促炎性细胞因子(ifn-γ,il-2,tnf-α)的分泌,同时它抑制遏制性机制,例如foxp3的表达和il-10的分泌(m.croftetal.,immunol.rev.2009,229(1),173-191；i.gramagliaetal.,j.immunol.1998,161(12),6510-6517；s.m.jensenetal.,seminarsinoncology2010,37(5),524-532)。需要这种共刺激来提高t细胞针对肿瘤细胞的全部潜能,尤其是在弱肿瘤抗原引发的背景中,及维持抗肿瘤应答超出第一次攻击,容许保护性记忆形成。然而,某些肿瘤中的免疫遏制性微环境的共抑制性信号较高,例如pd-l1,但是缺乏ox40配体的充分表达。在这种背景中t细胞的持久引发可导致t细胞激活的减弱,耗竭和逃避免疫监视(sharpeetal.,natrev2002)(keirmeetal.,2008annu.rev.immunol.26:677)。在肿瘤微环境中特异性恢复ox40共刺激的一种手段是由至少一个针对肿瘤基质中的肿瘤相关抗原,例如成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗原结合域和至少一个针对ox40的抗原结合域构成的双特异性抗体。例如,此类双特异性抗体已经描述于wo2017/055398a2和wo2017/060144a1。此类双特异性分子通过细胞表面fap的交联和表面固定化为ox40阳性t细胞创建高度激动性的基质,在那里它支持nfκb介导的效应器功能且能取代通过ox40配体的接合。关于多种人肿瘤适应症报告了高fap表达,或是在肿瘤细胞自身上或是在免疫遏制性癌症相关成纤维细胞(caf)上。在某些具有强免疫遏制或耗竭表型的患者,只有多克隆但肿瘤特异性的t细胞募集(信号1)和肿瘤局限性阳性共刺激的恢复(信号2)的组合可能推动足够的抗肿瘤功效和延长的适应性免疫保护。这能持久驱动肿瘤微环境朝向免疫激活更多和免疫遏制更少的状态。ox40的fap依赖性共刺激也可能以更低的肿瘤内浓度推动tcb介导的对肿瘤细胞的杀伤,这会容许降低系统暴露和相关副作用。另外,治疗间隔可能延长,因为更低的tcb浓度仍然可能是有活性的。在本专利申请中提供了tcb(抗cea/抗cd3双特异性抗体和抗folr/抗cd3双特异性抗体)与双特异性抗fap/抗ox40抗体的组合的体外和体内数据,其支持组合t细胞募集剂与肿瘤靶向性ox40激动剂来改善抗肿瘤应答的数量和质量的基本原理。发明概述本发明涉及包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗成纤维细胞激活蛋白(fap)/抗ox40双特异性抗体和它们与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合的用途,特别是它们在用于治疗癌症或延迟癌症进展,更加特别是用于治疗实体瘤或延迟实体瘤进展的方法中的用途。已经发现本文中描述的组合疗法在抑制肿瘤生长和消除肿瘤细胞方面比单独用该抗cd3双特异性抗体的治疗更加有效。在一个方面,本发明提供供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,其中该包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合使用。在一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,其中该包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体与对另一种肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合使用。在一个方面,该对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体。特别地,该对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体是抗cea/抗cd3双特异性抗体。在又一个方面,该包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体供如本文中之前描述的方法中使用,其中该包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体和该对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。在另一个方面,该包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体供如本文中之前描述的方法中使用,其中该包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体与该对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体协同作用。在另一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,其中该包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体与该对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体并行,在其之前,或在其之后施用。特别地,该包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体是抗成纤维细胞激活蛋白(fap)/抗ox40双特异性抗体。在一个方面,该抗fap/抗ox40抗体是ox40激动剂。在一个方面,该抗fap/抗ox40抗体是包含fc域的抗原结合分子。在一个特定方面,该抗fap/抗ox40抗体是包含具有降低fcγ受体结合和/或效应器功能的修饰的fc域的抗原结合分子。通过肿瘤相关抗原的交联使之有可能避免非特异性fcγr介导的交联和如此可以施用与常用ox40抗体相比更高和更加有效剂量的该抗fap/抗ox40抗体。在一个方面,本发明提供供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合使用且其中该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合fap的抗原结合域,其包含(a)重链可变区(vhfap),其包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),其包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhfap),其包含(i)包含seqidno:9的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:10的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:11的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),其包含(iv)包含seqidno:12的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-l3。在又一个方面,提供的是如本文中之前定义的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含至少一个包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区(vhfap)和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区(vlfap)的能够特异性结合fap的抗原结合域或包含包含seqidno:15的氨基酸序列的重链可变区(vhfap)和包含seqidno:16的氨基酸序列的轻链可变区(vlfap)的能够特异性结合fap的抗原结合域。在一个特定方面,该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合fap的抗原结合域,其包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区(vhfap)和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区(vlfap)。在另一个方面,该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合fap的抗原结合域,其包含包含seqidno:15的氨基酸序列的重链可变区(vhfap)和包含seqidno:16的氨基酸序列的轻链可变区(vlfap)。在又一个方面,提供的是如本文中之前定义的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域,其包含(a)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3,或(c)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-l3,或(d)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-l3,或(e)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l3,或(f)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l3,或(g)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:39的氨基酸序列的cdr-l3。更加特别地,该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域,其包含重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-l3。在又一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域,其包含(a)包含seqidno:40的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:41的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(b)包含seqidno:42的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:43的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(c)包含seqidno:44的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:45的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(d)包含seqidno:46的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:47的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(e)包含seqidno:48的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:49的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(f)包含seqidno:50的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:51的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(g)包含seqidno:52的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:53的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40)。在一个特定方面,该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域,其包含包含seqidno:40的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:41的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40)。在一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体是进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域的抗原结合分子。特别地,该双特异性ox40抗体是包含iggfc域,具体是igg1fc域或igg4fc域的抗原结合分子。更加特别地,该双特异性ox40抗体是包含包含一处或多处降低对fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的fc域的抗原结合分子。在一个特定方面,该双特异性ox40抗体包含包含氨基酸替代l234a,l235a和p329g的igg1fc域。在本发明的另一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的如本文中之前描述的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含对肿瘤相关靶物的单价结合和对ox40的至少二价结合。在一个方面,该抗fap/抗ox40双特异性抗体包含对肿瘤相关靶物的单价结合和对ox40的二价结合。在一个特定方面,该抗fap/抗ox40双特异性抗体包含对肿瘤相关靶物的单价结合和对ox40的四价结合。在另一个方面,本发明提供如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含能够特异性结合ox40的第一fab片段,其在ch1域的c端融合至能够特异性结合ox40的第二fab片段的vh域,和能够特异性结合ox40的第三fab片段,其在ch1域的c端融合至能够特异性结合ox40的第四fab片段的vh域。在一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的如本文中之前描述的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含(i)包含seqidno:54的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:55的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:56的氨基酸序列的四条轻链,或(ii)包含seqidno:57的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:58的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:56的氨基酸序列的四条轻链,或(iii)包含seqidno:59的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:60的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:56的氨基酸序列的四条轻链,或(iv)包含seqidno:61的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:62的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:56的氨基酸序列的四条轻链。在另一个方面,本发明提供供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合使用且其中该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体是抗cea/抗cd3双特异性抗体。在一个方面,提供的是如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含重链可变区(vhcd3)和轻链可变区(vlcd3),和第二抗原结合域,其包含重链可变区(vhcea)和轻链可变区(vlcea)。在另一个方面,本发明提供如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含包含seqidno:63的cdr-h1序列,seqidno:64的cdr-h2序列,和seqidno:65的cdr-h3序列的重链可变区(vhcd3)；和/或包含seqidno:66的cdr-l1序列,seqidno:67的cdr-l2序列,和seqidno:68的cdr-l3序列的轻链可变区(vlcd3)。在又一个方面,提供的是如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含包含seqidno:69的氨基酸序列的重链可变区(vhcd3)和/或包含seqidno:70的氨基酸序列的轻链可变区(vlcd3)。在一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,其中该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体包含第二抗原结合域,其包含(a)重链可变区(vhcea),其包含seqidno:71的cdr-h1序列,seqidno:72的cdr-h2序列,和seqidno:73的cdr-h3序列,和/或轻链可变区(vlcea),其包含seqidno:74的cdr-l1序列,seqidno:75的cdr-l2序列,和seqidno:76的cdr-l3序列,或(b)重链可变区(vhcea),其包含seqidno:79的cdr-h1序列,seqidno:80的cdr-h2序列,和seqidno:81的cdr-h3序列,和/或轻链可变区(vlcea),其包含seqidno:82的cdr-l1序列,seqidno:83的cdr-l2序列,和seqidno:84的cdr-l3序列。在一个特定方面,提供的是如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体包含如下第二抗原结合域,其包含包含seqidno:77的氨基酸序列的重链可变区(vhcea)和/或包含seqidno:78的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea),或如下第二抗原结合域,其包含包含seqidno:85的氨基酸序列的重链可变区(vhcea)和/或包含seqidno:86的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)。在另一个方面,本发明进一步提供如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该抗cea/抗cd3双特异性抗体进一步包含结合cea的第三抗原结合域。特别地,该第三抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcea),其包含seqidno:71的cdr-h1序列,seqidno:72的cdr-h2序列,和seqidno:73的cdr-h3序列,和/或轻链可变区(vlcea),其包含seqidno:74的cdr-l1序列,seqidno:75的cdr-l2序列,和seqidno:76的cdr-l3序列,或(b)重链可变区(vhcea),其包含seqidno:79的cdr-h1序列,seqidno:80的cdr-h2序列,和seqidno:81的cdr-h3序列,和/或轻链可变区(vlcea),其包含seqidno:82的cdr-l1序列,seqidno:83的cdr-l2序列,和seqidno:84的cdr-l3序列。更加特别地,该第三抗原结合域包含包含seqidno:77的氨基酸序列的重链可变区(vhcea)和/或包含seqidno:78的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)或其中该第二抗原结合域包含包含seqidno:85的氨基酸序列的重链可变区(vhcea)和/或包含seqidno:86的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)。在又一个方面,该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体是抗cea/抗cd3双特异性抗体,其中该第一抗原结合域是交叉fab分子,其中fab重和轻链的可变域或恒定域是交换的,且如果存在的话,该第二和第三抗原结合域是常规fab分子。在又一个方面,该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体是抗cea/抗cd3双特异性抗体,其中(i)该第二抗原结合域在fab重链的c端融合至该第一抗原结合域的fab重链的n端,该第一抗原结合域在fab重链的c端融合至该fc域的第一亚基的n端,且该第三抗原结合域在fab重链的c端融合至该fc域的第二亚基的n端,或(ii)该第一抗原结合域在fab重链的c端融合至该第二抗原结合域的fab重链的n端,该第二抗原结合域在fab重链的c端融合至该fc域的第一亚基的n端,且该第三抗原结合域在fab重链的c端融合至该fc域的第二亚基的n端。在一个方面,提供的是如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该抗cea/抗cd3双特异性抗体包含结合cea的第三抗原结合域。在又一个方面,该抗cea/抗cd3双特异性抗体包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。特别地,该抗cea/抗cd3双特异性抗体包含iggfc域,具体是igg1fc域或igg4fc域。更加特别地,该抗cea/抗cd3双特异性抗体包含包含一处或多处降低对fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的fc域。在一个特定方面,该抗cea/抗cd3双特异性抗体包含包含氨基酸替代l234a,l235a和p329g的igg1fc域。在另一个方面,本发明提供供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合使用且其中该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体是抗folr1/抗cd3双特异性抗体。在一个方面,本发明提供如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体包含包含重链可变区(vhcd3)的第一抗原结合域,包含重链可变区(vhfolr1)的第二抗原结合域和共同轻链可变区。在本发明的另一个方面,提供的是如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含包含seqidno:95的cdr-h1序列,seqidno:96的cdr-h2序列,和seqidno:97的cdr-h3序列的重链可变区(vhcd3)；第二抗原结合域,其包含包含seqidno:98的cdr-h1序列,seqidno:99的cdr-h2序列,和seqidno:100的cdr-h3序列的重链可变区(vhfolr1)；和共同轻链,其包含seqidno:101的cdr-l1序列,seqidno:102的cdr-l2序列,和seqidno:103的cdr-l3序列。在又一个方面,本发明提供如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该t细胞激活性抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含包含seqidno:104的序列的重链可变区(vhcd3),和第二抗原结合域,其包含包含seqidno:105的序列的重链可变区(vhfolr1)；且其中该共同轻链包含seqidno:106的序列。在一个方面,提供的是如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该抗folr1/抗cd3双特异性抗体包含结合folr1的第三抗原结合域。在又一个方面,提供的是如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该抗folr1/抗cd3双特异性抗体包含包含seqidno:107的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:108的氨基酸序列的第二重链和seqidno:109的共同轻链。在另一个方面,本发明提供如本文中之前描述的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合使用且其中该组合以约一周至三周的间隔施用。在还有另一个方面,本发明提供供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合且与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂组合使用。特别地,该阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体或抗pd1抗体。更加特别地,该阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂选自由阿特珠单抗(atezolizumab),度伐单抗(durvalumab),派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)组成的组。在一个具体方面,该阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是阿特珠单抗。在又一个方面,本发明提供一种药学产品,其包含(a)包含作为活性组分的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,和药学可接受赋形剂的第一组合物；和(b)包含作为活性组分的对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体,和药学可接受赋形剂的第二组合物,供组合,顺序或同时治疗疾病,特别是治疗癌症中使用。在另一个方面,提供的是药学组合物,其包含包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体。在一个方面,该药学组合物进一步包含阻断pd-l1/pd-1相互作用。特别地,该阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体或抗pd1抗体。更加特别地,该阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂选自由阿特珠单抗,度伐单抗,派姆单抗和纳武单抗组成的组。在一个具体方面,该阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是阿特珠单抗。在一个特定方面,该药学组合物供治疗实体瘤中使用。在一个另外的方面,本发明提供一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的试剂盒,其包含包装,包含(a)包含作为活性组分的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,和药学可接受赋形剂的第一组合物；(b)包含作为活性组分的对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体,和药学可接受赋形剂的第二组合物,和(c)关于在组合疗法中使用该组合物的用法说明书。在一个方面,提供的是用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的试剂盒,其包含包装,包含(a)包含作为活性组分的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,和药学可接受赋形剂的第一组合物；(b)包含作为活性组分的对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体,和药学可接受赋形剂的第二组合物,(c)包含作为活性组分的阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂,特别是阿特珠单抗,和药学可接受赋形剂的第三组合物,和(c)关于在组合疗法中使用该组合物的用法说明书。在又一个方面,本发明涉及包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体的组合在制造用于治疗增殖性疾病,特别是癌症或延迟增殖性疾病,特别是癌症进展的药物中的用途。特别地,提供的是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的t双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体的组合在制造用于治疗选自由结肠癌,肺癌,卵巢癌,胃癌,膀胱癌,胰腺癌,子宫内膜癌,乳腺癌,肾癌,食管癌,或前列腺癌组成的组的疾病的药物中的用途。在另一个方面,本发明提供一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包含对该受试者施用有效量的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的t双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体。在另一个方面,提供的是一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包含对该受试者施用有效量的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的t双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体,和阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂,特别是抗pd-l1抗体或抗pd1抗体。在又一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该抗fap/抗ox40双特异性抗体与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂组合使用。特别地,该阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体或抗pd1抗体。更加特别地,该阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂选自由阿特珠单抗,度伐单抗,派姆单抗和纳武单抗组成的组。在一个具体方面,该阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是阿特珠单抗。附图简述图1a和1b分别显示实施例中使用的具体抗fap/抗ox40双特异性抗体和具体抗cea/抗cd3双特异性抗体。分别在实施例1和2中更加详细地描述这些分子。深黑色点代表节-入-穴修饰。*象征ch1和cl域中的氨基酸修饰(所谓的带电荷的残基)。图1a显示具体的具有对ox40的四价结合和对fap的单价结合的抗fap/抗ox40双特异性抗体(4+1格式,fapvh和vl融合至fc域的c端)。该分子在本文中称作fapox40imab。在图1b中显示2+1格式的例示性双特异性抗cea/抗cd3抗体(命名为ceacam5cd3tcb)。另一种2+1格式的抗cea/抗cd3抗体(称作ceacd3tcb)在图1c中显示。在图2中显示多种人免疫细胞制备物所致tcb介导的mkn45nuclightred肿瘤细胞的裂解(实施例3)。将不同人免疫效应细胞制备物(静息的pbmc,cd4或cd8t细胞)与mkn-45nuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的ceacam5cd3tcb(ceacd3tcb(2))存在下共培养48小时。于37℃和5％co2使用incucytezoom系统(essenbioscience,hd相差,绿色荧光和红色荧光,10x物镜)通过荧光显微术高含量生命成像以3小时间隔对活的肿瘤细胞的量量化48小时。使用一式三份(中值)的健康肿瘤细胞的积分红色荧光(rcuxμm2/图像)计算比裂解,将其针对所使用的tcb浓度绘图以显示t细胞的溶胞潜力。图3a-3d显示tcb刺激后t细胞上ox40的表达。将不同人免疫效应细胞制备物(静息的pbmc,cd4或cd8t细胞)与mkn-45nuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的ceacam5cd3tcb(ceacd3tcb(2))存在下共培养48小时。通过流式细胞术测定cd4+和cd8+t细胞上ox40的表达。对于cd4阳性t细胞(图3a和3b)和cd8阳性t细胞(图3c和3d)将一式三份(中值)的阳性细胞的百分比(图3a和3c)和mfi(图3b和3d)针对所使用的tcb浓度绘图。误差棒指示sem。tcb介导剂量依赖性的cd4+t细胞和cd8+t细胞上的ox40的细胞表面表达,尽管cd4+t细胞上的程度较高。在图4a-4c中显示ox40共刺激并不影响folr1cd3tcb的溶胞潜力。将静息的cd4t细胞与helanuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的folr1cd3tcb存在下有(图4b)或无(图4a)固定浓度的fapox40imab的情况下共培养48小时。于37℃和5％co2使用incucytezoom系统(essenbioscience,hd相差,绿色荧光和红色荧光,10x物镜)通过荧光显微术高含量生命成像以3小时间隔对活的肿瘤细胞的量量化42小时。对于多个时间点将一式三份(中值)的健康肿瘤细胞的积分红色荧光(rcuxμm2/图像)针对所使用的tcb浓度绘图以显示t细胞的溶胞潜力。误差棒指示sem。计算每个时间点的曲线下面积作为细胞毒性的度量并针对时间点绘图。为了比较,在图4c中将单独的和与fapox40imab组合的folr1cd3tcb二者的auc值针对时间绘图,显示添加fapox40imab对folr1cd3tcb的溶胞潜力没有影响。图5a-5c显示ox40共刺激并不影响ceacam5cd3tcb(ceacd3tcb(2))的溶胞潜力。将不同人免疫效应细胞制备物(静息的pbmc在图5c中,cd4t细胞在图5a中,cd8t细胞在图5b中)与mkn-45nuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的ceacam5cd3tcb存在下有或无固定浓度的fapox40imab的情况下共培养48小时。于37℃和5％co2使用incucytezoom系统(essenbioscience,hd相差,绿色荧光和红色荧光,10x物镜)通过荧光显微术高含量生命成像对活的肿瘤细胞的量以3小时间隔量化48小时。使用一式三份(中值)的健康肿瘤细胞的积分红色荧光(rcuxμm2/图像)计算比裂解,将其针对所使用的tcb浓度绘图以显示t细胞的溶胞潜力。这里,例示性显示42小时时间点。误差棒指示sem。在图6a-6d中显示fapox40imab共刺激确实提高folr1cd3tcb介导tnf-α分泌且依赖于激动性tcr刺激。将静息的cd4t细胞与经照射的tnf-α传感细胞,nih/3t3hufap和helanuclightred细胞一起在一行连续稀释的folr1cd3tcb存在下有或无固定浓度的fapox40imab的情况下共培养48小时。于37℃和5％co2使用incucytezoom系统(essenbioscience,hd相差,绿色荧光和红色荧光,10x物镜)通过荧光显微术高含量生命成像以3小时间隔作为tnf-α传感细胞中的gfp诱导将tnf-α的量量化42小时。将一式三份(中值)的tnf-α传感细胞的积分的绿色荧光(gcuxμm2/图像)针对所使用的tcb浓度绘图以量化t细胞的tnf-α分泌。误差棒指示sem。folr1cd3tcb的结果在图6a(无共刺激)和图6c(有fapox40imab共刺激)中显示,而图6b和6d显示阴性对照cd3tcb的结果。在图7a-7d中显示fapox40imab共刺激确实提高ceacd3tcb和或ceacam5cd3tcb介导tnf-α分泌。分别将静息的cd4t细胞与经照射的tnf-α传感细胞,nih/3t3hufap和mkn-45nlr细胞一起在一行连续稀释的ceacd3tcb和ceacam5cd3tcb存在下分别在有或无固定浓度的fapox40imab的情况下共培养48小时。如上文所述通过荧光显微术高含量生命成像作为tnf-α传感细胞中的gfp诱导将tnf-α的量量化。将一式三份(中值)的tnf-α传感细胞的积分的绿色荧光(gcuxμm2/图像)针对所使用的tcb浓度绘图以量化t细胞的tnf-α分泌。误差棒指示sem。ceacam5cd3tcb(ceacd3tcb(2))的结果在图7a(无共刺激)和图7c(有fapox40imab共刺激)中显示。ceacd3tcb的结果在图7b(无共刺激)和图7d(有fapox40imab共刺激)中显示。图8a-8d分别汇总对不同tcb或不同细胞系看到的效果。将静息的cd4t细胞与tnf-α传感细胞,经照射的nih/3t3hufap和不同靶细胞系helanuclightred细胞(图8b),mkn-45nuclightred细胞(图8a和8c)或skov-3细胞(图8d)一起在一行连续稀释的folrcd3tcb(图8b和8d),ceacd3tcb(图8c)或ceacam5cd3tcb(图8a)存在下有或无固定浓度的fapox40imab的情况下共培养48小时。通过荧光显微术高含量生命成像2作为tnf-α传感细胞中的gfp诱导量化tnf-α的量。为每个条件和时间点计算gfp的auc并针对每个时间点绘图以量化t细胞的tnf-α分泌。ox40共刺激确实提高ceacd3tcb,ceacam5cd3tcb和folrcd3tcb介导的tnf-α释放。在图9a-9d中显示ox40共刺激确实调控ceacam5cd3tcb介导的细胞因子分泌。将静息的cd4t细胞与mkn-45nuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的ceacam5cd3tcb存在下有或无固定浓度的fapox40imab的情况下共培养48小时。使用细胞计量珠阵列技术在48小时结束点量化tnf-α,ifn-γ,il-2,il-10,il-9和il-17a的分泌量。将各自细胞因子浓度针对tcb浓度绘图。注释--促炎性细胞因子tnf-α(图9a),ifn-γ(图9c),和il-2(图9b)的分泌通过ox40共刺激得到增强,而免疫遏制性il-10的分泌(图9d)降低。在图10a-10d中显示ox40共刺激确实调控ceacd3tcb介导的细胞因子分泌。将静息的cd4t细胞与mkn-45nuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的ceacd3tcb存在下有或无固定浓度的fapox40imab的情况下共培养48小时。使用细胞计量珠阵列技术在48小时结束点量化tnf-α,ifn-γ,il-2,il-10(图10d),il-9和il-17a的分泌量。将各自细胞因子浓度针对tcb浓度绘图。注释--促炎性细胞因子tnf-α(图10a),ifn-γ(图10c),和il-2(图10b)的分泌通过ox40共刺激得到增强。在图11a-11d中显示ox40共刺激确实调控folr1cd3tcb介导的细胞因子分泌。将静息的cd4t细胞与helanuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的folr1cd3tcb存在下有或无固定浓度的fapox40imab的情况下共培养48小时。使用细胞计量珠阵列技术在48小时结束点量化tnf-α,ifn-γ,il-2,和il-10的分泌量。将各自细胞因子浓度针对tcb浓度绘图。注释--促炎性细胞因子tnf-α(图11a),ifn-γ(图11c)和il-2(图11b)的分泌通过ox40共刺激得到增强,而免疫遏制性il-10的分泌(图11d)强烈降低。图12a-12d显示与图11a-11d中所示相同的实验的结果,然而这里用skov-3细胞替换helanuclightred细胞。在这项实验中ox40共刺激没有太多改变促炎性细胞因子tnf-α(图12a),ifn-γ(图12c),il-2(图12b)和il-10(图12d)的分泌。在图13中呈现图9a-9d,图10a-10d,图11a-11d和图12a-12d中显示的结果的汇总。以百分比计算细胞因子浓度的变化,其中无fapox40imab共刺激的各自样品认为是100％。变化的程度取决于使用的肿瘤细胞系和各自tcb。比较fapox40imab共刺激调控静息的cd4t细胞(图14a-14h),静息的cd8t细胞(图15a-15h)和静息的人pmbc细胞(图16a-16h)中的ceacam5cd3tcb介导的细胞因子分泌的能力。图显示细胞因子il-2(图14a,15a和16a),ifn-γ(图14b,15b和16b),tnf-α(图14c,15c和16c),il-4(图14d,15d和16d),il-9(图14e,15e和16e),mip-1α(图14f,15f和16f),il-17a(图14g,15g和16g)和il-10(图14h,15h和16h)的分泌量。将静息的cd4或cd8t细胞或pbmc与mkn-45nuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的ceacam5cd3tcb(ceacd3tcb(2))存在下有或无固定浓度的fapox40imab的情况下共培养72小时。使用细胞计量珠阵列技术在48小时结束点量化tnf-α,ifn-γ,il-2,il-10,il-9,il-4,mip-1α和il-17a的分泌量。将各自细胞因子浓度针对tcb浓度绘图。在图17中对于tcb最高浓度显示由fapox40imab共刺激引起的细胞因子浓度升高的比较。图18a和18b显示如实施例4.4中描述的体内实验1中所注射的化合物在治疗第一周期间的药动学概况。在第一次治疗后10分钟,6小时,24小时,96小时和7天对每组2只小鼠采血并分析所注射的化合物的暴露。将血液加工成血清并实施夹心式elisa以测定第一周期间fapox40imab(图18a)和ceacam5cd3tcb(图18b)的暴露。接受单一疗法的小鼠或接受组合疗法的小鼠的系统暴露是相当的。图19a显示与所有其它组相比只有ceacam5cd3tcb与fap(4b9)ox40imab的组合介导皮下肿瘤消退。这可以从如图19b中显示的瀑布图清楚地看到。给干细胞人源化nog小鼠皮下注射matrigel中mkn45胃肿瘤细胞和3t3hufap成纤维细胞的混合物。在第10天将小鼠针对肿瘤尺寸和人t细胞计数随机化,平均t细胞计数/μl血液为140且平均肿瘤尺寸为170mm3。在随机化那天,给小鼠静脉内注射媒介,ceacam5cd3tcb(ceacd3tcb(2)),fapox40imab或其组合,每周一次,连续5周。一周三次测量肿瘤体积并针对研究时间绘图。误差棒显示6至8只动物每组的标准误差(图19a)。为每只动物计算实验第41天时的肿瘤体积与治疗开始时的肿瘤体积相比的百分比变化并作为瀑布图绘图(图19b)。图20a和20b显示如实施例4.5中描述的体内实验2中所注射的化合物在治疗第一周期间的药动学概况。在第一次治疗后10分钟,6小时,24小时,96小时和7天对每组2只小鼠采血并分析所注射的化合物的暴露。将血液加工成血清并实施夹心式elisa以测定第一周期间不同剂量的fapox40imab及其与ceacam5cd3tcb的组合(图20a)和ceacam5cd3tcb及其与不同剂量的fapox40imab的组合(图20b)的暴露。在图20a中能看到清楚的不同剂量的fapox40imab的剂量依赖性。接受单一疗法的小鼠或接受组合疗法的小鼠的ceacamcd3tcb暴露是相当的。图21a-21c显示只有ceacam5cd3tcb与最高剂量的fap(4b9)ox40imab(12.5mg/kg,图21c)的组合显示就肿瘤生长抑制而言与所有其它组相比改善的功效。给干细胞人源化nog小鼠皮下注射matrigel中mkn45胃肿瘤细胞和3t3hufap成纤维细胞的混合物。在第26天将小鼠针对肿瘤尺寸和人t细胞计数随机化,平均t细胞计数/μl血液为115且平均肿瘤尺寸为490mm3。在随机化后1天,给小鼠静脉内注射媒介,ceacam5cd3tcb(ceacd3tcb(2)),和不同剂量的fapox40imab(分别为12.5mg/kg,4.2mg/kg和1.4mg/kg)或ox40靶向性分子与ceacam5cd3tcb的组合达4周。一周三次测量肿瘤体积并针对研究时间绘图。误差棒显示8至10只动物每组的标准误差。图21a显示用fapox40imab1.4mg/kg获得的肿瘤消退,在图21b和21c中分别显示对fapox40imab4.2mg/kg或fapox40imab12.5mg/kg观察到的肿瘤消退。图22汇总ceacam5cd3tcb与不同量的fap(4b9)ox40imab的组合的抗肿瘤功效的剂量依赖性。为每只动物计算实验2的治疗第35天时的肿瘤体积与治疗开始时的肿瘤体积相比的百分比变化并作为瀑布图绘图。在图23a-23d中显示与所有单一疗法相比ceacam5cd3tcb和fap(4b9)ox40imab的组合显著提高肿瘤内白细胞的数目。在实施例4.5描述的实验2的第50天,分离肿瘤浸润性淋巴细胞并通过流式细胞术评估人白细胞和t细胞的存在。对活的人白细胞(dapi-,cd45+),非cd3白细胞(dapi-,cd45+,cd3-),cd4和cd8t细胞(dapi-,cd45+,cd3+,cd4或cd8+)设门,计算标准化计数(每或μg肿瘤),并为各个治疗组将值绘图:图23a是活的人白细胞,图23b是非cd3白细胞,图23c是cd4t细胞,而图23d是cd8t细胞。误差棒显示5至8只动物每组的标准误差。在图24a和24b中显示fapox40imab共刺激和ceacd3tcb(2)作用是肿瘤特异性的且并不改变脾(图24a)和血液(图24b)中的系统白细胞计数。与所有单一疗法相比ceacam5cd3tcb和fap(4b9)ox40imab的组合显著提高肿瘤内t细胞和cd8t细胞的数目。在图25a中显示如通过hucd3免疫组织化学检测的cd3阳性t细胞的数目,而在图25b中显示如通过hucd8免疫组织化学检测的cd8阳性t细胞的数目。在4μm石蜡切片上实施hucd8和hucd3免疫组织化学。在图26a-26c中显示与所有单一疗法相比ceacam5cd3tcb和fap(4b9)ox40imab的组合显著提高肿瘤内细胞因子的浓度。在外周中没有检测到显著变化。在实验2的第50天,对肿瘤,脾和血液取样并闪冻。使用bio-plexprotm人细胞因子17路测定法在匀浆物中测定细胞因子浓度。通过bca蛋白质测定法试剂盒分析全蛋白质含量并将浓度针对样品的蛋白质含量标准化。描绘4只动物每个治疗组的中值细胞因子浓度,图26a是肿瘤,图26b是脾,而图26c是血液。图27a-27f显示用fapox40imab和ceacam5cd3tcb的组合治疗的动物中肿瘤内细胞因子浓度,但非肿瘤内白细胞计数,与肿瘤生长的进展负相关。在用ceacam5cd3tcb单一疗法治疗的动物中没有观察到这一点。每个空心符号代表用ceacam5cd3tcb单一疗法治疗的一只动物个体,而每个实心符号代表用组合治疗的一只动物个体。在图27a中将t细胞的计数针对肿瘤体积的变化[％]绘图,也将tnf-α(图27b),ifn-γ(图27c),mcp-1(图27d),il-8(图27e)和il-6(图27f)的浓度针对肿瘤体积的变化[％]绘图。图28a和28b显示ceacd3tcb与抗pd-l1和与fapox40imab的组合介导就肿瘤生长抑制而言与所有其它疗法相比改善的功效(实施例5)。图28a和28b分别显示随时间的肿瘤生长,或是作为肿瘤体积的平均值或是作为肿瘤体积的平均倍数变化。图29a,29b和29c显示如实施例5中描述的体内实验中所注射的化合物在治疗第一周期间的药动学概况。在第一次和第三次治疗后1小时和72小时对每组2只小鼠采血并分析所注射的化合物的暴露。将血液加工成血清并实施夹心式elisa以测定与ceacam5cd3tcb组合的fapox40imab或三重组合(图29a),ceacd3tcb及其不同组合(图29b)和与抗pd-l1组合的ceacd3tcb或三重组合(图29c)的暴露。接受单一疗法的小鼠或接受组合疗法的小鼠的所有三种化合物的暴露是相当的。与所有单一或双重疗法相比ceacam5cd3tcb与抗pd-l1和fap(4b9)ox40imab的组合显著提高肿瘤内t细胞和cd8t细胞的数目。在图30a中显示如通过hucd3免疫组织化学检测的cd3阳性t细胞的数目,而在图30b中显示如通过hucd8免疫组织化学检测的cd8阳性t细胞的数目。在4μm石蜡切片上实施hucd8和hucd3免疫组织化学。图31至35涉及测试ceacd3tcb和fapox40imab的组合以及ceacd3tcb和fapox40imab与抗pd-l1抗体(阿特珠单抗)的三重组合的功效的体外测定法的结果。将pbmc在mkn45-pd-l1和nih/3t3-hufap细胞及t细胞激活剂ceacd3tcb,检查点抑制剂α-pd-l1(阿特珠单抗)和免疫调控剂fapox40imab的不同组合存在下温育4天。在第4天,实验的终点,将细胞针对表面或细胞内标志物染色并保存上清液用于细胞因子分析。每个符号指示一名供体个体(每个组测试一式三份),每种颜色/样式指示特定处理组合,柱指示均值及sem。为6名不同供体分别显示与单一成分及其组合相比组合对cd4(图31a)和cd8(图31b)t细胞上的cd25的表面表达,cd4(图32a)和cd8(图32b)t细胞上的增殖和cd4(图33a)和cd8(图33b)t细胞上的t-bet的细胞内表达,和cd4(图33c)和cd8(图33d)t细胞上的粒酶b的影响。使用双向anova(tukey氏多重比较检验)计算不同处理组之间的统计学显著性,其中计算每个组实验上一式三份的6名供体的平均值。图中显示的星(*)指示p值,*指示p值<0.05,**指示p值<0.01,***指示p值<0.001。图31a和31b显示用100nmceacd3tcb和2nmfapox40imab的组合治疗或用抗pd-l1抗体的三重组合治疗提高cd25表达性cd4(图31a)和cd8(图31b)t细胞的百分比。图32a和32b显示用100nmceacd3tcb和2nmfapox40imab的组合治疗或用80nm抗pd-l1抗体的三重组合治疗提高增殖性cd4t细胞(图32a)和cd8t细胞(图32b)的百分比。在实验开始前用增殖染料cfse标记pbmc并使用facs通过cfse染料的稀释来测量增殖。图33a和33b显示用100nmceacd3tcb和2nmfapox40imab的组合治疗或用80nm抗pd-l1抗体的三重组合治疗提高t-bet表达性cd4t细胞的百分比(图33a)和cd8t细胞上的t-bet的mfi(均值荧光强度)(图33b)。图33c和33d显示用100nmceacd3tcb和2nmfapox40imab的组合治疗提高粒酶b表达性cd4t细胞(图33c)和粒酶b表达性cd8t细胞(图33d)的百分比。与ceacd3tcb和fapox40imab组合治疗相比,用抗pd-l1抗体的三重组合进一步提高粒酶b表达性cd4和cd8t细胞的百分比,具有统计学显著性。温育4天后在上清液中依照制造商的说明书使用细胞计量珠阵列分析所分泌的细胞因子ifnγ,gm-csf,tnfα,il-2,il-8,粒酶b和il-10。每个符号指示一名供体(合并的实验一式三份每组),每种颜色/样式指示特定处理组合,柱指示均值及sem。图34a,34b和34c显示用100nmceacd3tcb和2nmfapox40imab的组合治疗提高ifnγ(图34a),粒酶b(图34b)和il-8(图34c)的分泌。抗pd-l1的三重组合显著提高上文所述所有三种细胞因子的分泌。图35a,35b和35c显示与作为基线的用ceacd3tcb和抗pd-l1组合治疗治疗后的细胞因子相比用ceacd3tcb,fapox40imab和a-pd-l1的三重组合治疗后6名供体中细胞因子的倍数升高。实心黑色线指示2倍变化。显示的是ifnγ(图35a),粒酶b(图35b)和il-8(图35c)的倍数升高。发明详述定义除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域中一般使用的相同的含义。出于解释此说明书的目的,会应用下述定义,而且在适宜时,以单数使用的术语还会包括复数,反之亦然。如本文中使用的,术语“抗原结合分子”以其最广义指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白。术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。如本文中使用的术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体群体获得的抗体,即构成该群体的抗体个体是同一的和/或结合相同表位,除了可能的抗体变体,例如,含有天然发生的突变的或在单克隆抗体制备物的生成期间产生的,此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比,单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体,每个该位点结合相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意味着抗原结合分子能够特异性结合至少两种截然不同的抗原性决定簇。典型地,双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点,其每个是对不同抗原性决定簇特异性的。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇,特别是在两种截然不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。如本申请内使用的术语“价”表示抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。照此,术语“二价”,“四价”,和“六价”分别表示抗原结合分子中两个结合位点,四个结合位点,和六个结合位点的存在。术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指具有与天然抗体结构实质性相似的结构的抗体。“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如,天然igg类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由成二硫键的两条轻链和两条重链构成。自n端至c端,每条重链具有一个可变区(vh),也称作可变重域或重链可变域,接着是三个恒定域(ch1,ch2,和ch3),也称作重链恒定区。类似地,自n端至c端,每条轻链具有一个可变区(vl),也称作可变轻域或轻链可变域,接着是一个轻链恒定域(cl),也称作轻链恒定区。抗体的重链可指派至五种型之一,称作α(iga),δ(igd),ε(ige),γ(igg),或μ(igm),其中一些可进一步分成亚型,例如γ1(igg1),γ2(igg2),γ3(igg3),γ4(igg4),α1(iga1)和α2(iga2)。基于其恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可指派至两种型之一,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。“抗体片段”指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于fv,fab,fab’,fab’-sh,f(ab’)2；双抗体,三抗体,四抗体,交叉fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和单域抗体。关于某些抗体片段的综述,参见hudsonetal.,natmed9,129-134(2003)。关于scfv片段的综述,参见例如plückthun,inthepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)；还参见wo93/16185；和美国专利no.5,571,894和5,587,458。关于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的fab和f(ab’)2片段的讨论,参见美国专利no.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的,参见例如ep404,097；wo1993/01161；hudsonetal.,natmed9,129-134(2003)；和hollingeretal.,procnatlacadsciusa90,6444-6448(1993)。hudsonetal.,natmed9,129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。单域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(domantis,inc.,waltham,ma；参见例如美国专利no.6,248,516b1)。可以通过各种技术来生成抗体片段,包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成,如本文中描述的。完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段,称作“fab”片段,每个含有重和轻链可变域,还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。如此,如本文中使用的,术语“fab片段”指包含包含轻链的vl域和恒定域(cl)的轻链片段,和重链的vh域和第一恒定域(ch1)的抗体片段。fab’片段因在重链ch1域的羧基末端增加少数残基而与fab片段不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab’-sh是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个fab片段)和fc区的一部分的f(ab’)2片段。术语“交叉fab片段”或“xfab片段”或“交换fab片段”指其中重和轻链的可变区或恒定区任一交换的fab片段。交换fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中:一方面,fab重和轻链的可变区交换,即交换fab分子包含由轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)构成的肽链,和由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的肽链。这种交换fab分子也称作crossfab(vlvh)。另一方面,当fab重和轻链的恒定区交换时,交换fab分子包含由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的肽链,和由轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)构成的肽链。这种交换fab分子也称作crossfab(clch1)。“单链fab片段”或“scfab”是由抗体重链可变域(vh),抗体恒定域1(ch1),抗体轻链可变域(vl),抗体轻链恒定域(cl)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以n端至c端方向具有下述次序之一:a)vh-ch1-接头-vl-cl,b)vl-cl-接头-vh-ch1,c)vh-cl-接头-vl-ch1或d)vl-ch1-接头-vh-cl；且其中所述接头是至少30个氨基酸,优选32至50个氨基酸的多肽。所述单链fab片段经由cl域和ch1域之间的天然二硫键而稳定化。另外,这些单链fab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。“交换单链fab片段”或“x-scfab”是由抗体重链可变域(vh),抗体恒定域1(ch1),抗体轻链可变域(vl),抗体轻链恒定域(cl)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以n端至c端方向具有下述次序之一:a)vh-cl-接头-vl-ch1和b)vl-ch1-接头-vh-cl；其中vh和vl一起形成特异性结合抗原的抗原结合位点,且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。另外,这些x-scfab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。“单链可变片段(scfv)”是以10至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重(vh)和轻(vl)链可变区的融合蛋白。接头经常富含出于柔性的甘氨酸,以及出于溶解性的丝氨酸或苏氨酸,而且可将vh的n端与vl的c端连接,或反之亦然。尽管去除恒定区并引入接头,此蛋白质保留原始抗体的特异性。scfv抗体描述于例如houston,j.s.,methodsinenzymol.203(1991)46-96。另外,抗体片段包含具有vh域的特征(即能够与vl域一起装配)或vl域的特征(即能够与vh域一起装配)的单链多肽,vh域与vl域一起装配成功能性抗原结合位点并由此提供全长抗体的抗原结合特性。“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的,例如,纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)已经用作抗原结合域的备选支架,参见例如gebauerandskerra,engineeredproteinscaffoldsasnext-generationantibodytherapeutics.curropinchembiol13:245-255(2009)和stumppetal.,darpins:anewgenerationofproteintherapeutics.drugdiscoverytoday13:695-701(2008)。在本发明的一个方面,支架抗原结合蛋白选自由ctla-4(evibody),脂质运载蛋白(anticalin),蛋白a衍生的分子,诸如蛋白a的z域(affibody),a域(avimer/maxibody),血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(darpin),抗体轻链或重链的可变域(单域抗体,sdab),抗体重链的可变域(纳米抗体,avh),vnar片段,纤连蛋白(adnectin),c型凝集素域(tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变域(vnar片段),人γ-晶体蛋白或泛素(affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型域,微体,诸如来自knottin家族的蛋白质,肽适体和纤连蛋白(adnectin)组成的组。脂质运载蛋白是一个细胞外蛋白质家族,其转运小的疏水性分子,诸如类固醇,胆红素,类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构,在锥形结构的开口端具有一些环,能改造成结合不同靶抗原。anticalin的尺寸介于160-180个氨基酸之间,而且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见biochimbiophysacta1482:337-350(2000),us7250297b1和us20070224633。设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)衍生自锚蛋白,锚蛋白是介导整合膜蛋白附着至细胞骨架的一个蛋白质家族。单个锚蛋白重复是一个33个残基的基序,由两个α-螺旋和一个β-转角组成。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基,它们能改造成结合不同靶抗原。通过增加模块的数目(亲和力成熟的一种方法)能增加它们的结合界面。进一步的详情参见j.mol.biol.332,489-503(2003),pnas100(4),1700-1705(2003)和j.mol.biol.369,1015-1028(2007)和us20040132028a1。单域抗体是由单个单体可变抗体域组成的抗体片段。第一种单域是自来自骆驼科动物(camelids)的抗体重链的可变域衍生的(纳米抗体或vhh片段)。而且,术语单域抗体包括自主的(autonomous)人重链可变域(avh)或自鲨鱼衍生的vnar片段。与参照分子“结合相同表位的抗原结合分子”指如下的抗原结合分子,抗原结合分子在竞争测定法中将参照分子对其抗原的结合阻断50％或更多,相反,参照分子在竞争测定法中将抗原结合分子对其抗原的结合阻断50％或更多。术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含与抗原的部分或全部特异性结合且互补的区域的部分。在抗原较大的情况中,抗原结合分子可仅仅结合抗原的特定部分,该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个可变域(也称作可变区)提供。优选地,抗原结合域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。如本文中使用的,术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义,而且指多肽大分子上的如下位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构造),抗原结合模块与该位点结合,形成抗原结合模块-抗原复合物。有用的抗原性决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上,在病毒感染的细胞的表面上,在其它患病细胞的表面上,在免疫细胞的表面上,游离在血清中,和/或在细胞外基质(ecm)中找到。作为本文中的抗原有用的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。在一个特定实施方案中,抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况中,该术语涵盖“全长”未加工的蛋白质以及源自细胞中的加工的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。“特异性结合”意味着结合对于抗原是选择性的且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子结合特定抗原的能力可经由酶联免疫吸附测定法(elisa)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振(spr)技术(在biacore仪器上分析)(liljebladetal.,glycoj17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。在一个实施方案中,抗原结合分子对无关蛋白质的结合的程度小于抗原结合分子对抗原的结合的约10％,如通过例如spr测量的。在某些实施方案中,结合抗原的分子具有≤1μm,≤100nm,≤10nm,≤1nm,≤0.1nm,≤0.01nm,或≤0.001nm(例如10-8m或更小,例如10-8m至10-13m,例如10-9m至10-13m)的解离常数(kd)。“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配偶(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶y的亲和力一般可以用解离常数(kd)来代表,它是解离和结合速率常数(分别是koff和kon)的比。如此,等同的亲和力可包含不同的速率常数,只要速率常数的比保持相同。可以通过本领域已知的常用方法来测量亲和力,包括本文中描述的那些。用于测量亲和力的一种特定方法是表面等离振子共振(spr)。术语“肿瘤相关抗原(taa)”意指任何由肿瘤细胞或在肿瘤基质中高度表达的抗原。术语肿瘤相关指示taa不是对肿瘤完全特异性的,而是在肿瘤或它的基质上过表达的。特定的肿瘤相关抗原是cea或fap,还有其它靶物,诸如叶酸受体(folr1),mcsp,egfr家族(her2,her3和egfr/her1),vegfr,cd20,cd19,cd22,cd33,pd1,pd-l1,tenc,epcam,psa,psma,steap1,muc1(ca15-3)muc16(ca125)和5t4(滋养层糖蛋白)。特定的taa包括fap,cea和folr1。术语“成纤维细胞激活蛋白(fap)”,也称作脯氨酰内肽酶fap或分离酶(seprase)(ec3.4.21),指来自任何脊椎动物来源的任何天然fap,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。该术语包括“全长”未加工的fap以及源自细胞中的加工的任何形式的fap。该术语还涵盖fap的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,本发明的抗原结合分子能够特异性结合人,小鼠和/或食蟹猴fap。人fap的氨基酸序列在uniprot(www.uniprot.org)登录号q12884(版本149,seqidno:120),或ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov/)refseqnp_004451.2中显示。人fap的细胞外结构域(ecd)自氨基酸位置26延伸至760。带his标签的人fapecd的氨基酸序列在seqidno:121中显示。小鼠fap的氨基酸序列在uniprot登录号p97321(版本126,seqidno:122),或ncbirefseqnp_032012.1中显示。小鼠fap的细胞外结构域(ecd)自氨基酸位置26延伸至761。seqidno:123显示带his标签的小鼠fapecd的氨基酸序列。seqidno:124显示带his标签的食蟹猴fapecd的氨基酸序列。优选地,本发明的抗fap结合分子结合fap的细胞外结构域。例示性抗fap结合分子在国际专利申请no.wo2012/020006a2中描述。术语“癌胚抗原(cea)”,也称作癌胚抗原相关细胞粘附分子5(ceacam5),指来自任何脊椎动物来源的任何天然cea,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人cea的氨基酸序列在uniprot登录号p06731(版本151,seqidno:125)中显示。cea早已鉴定为肿瘤相关抗原(goldandfreedman,jexpmed.,121:439-462,1965；berinsteinn.l.,jclinoncol.,20:2197-2207,2002)。最初归类为仅仅在胎儿组织中表达的蛋白质,现在已经在若干正常成体组织中鉴定cea。这些组织主要是上皮起源的,包括胃肠,呼吸,和泌尿生殖道的细胞,和结肠,子宫颈,汗腺,和前列腺的细胞(napetal.,tumourbiol.,9(2-3):145-53,1988；napetal.,cancerres.,52(8):2329-23339,1992)。上皮起源的肿瘤以及它们的转移含有cea作为肿瘤相关抗原。虽然cea本身的存在不指示转化成癌性细胞,但是cea的分布是指示性的。在正常组织中,cea一般在细胞的顶端表面上表达(s.,semincancerbiol.9(2):67-81(1999)),使得它对血流中的抗体不可及。与正常组织形成对比,cea趋于在癌性细胞的整个表面上表达(s.,semincancerbiol.9(2):67-81(1999))。这种表达模式的变化使得cea变成对于癌性细胞中的抗体结合是可及的。另外,cea表达在癌性细胞中升高。而且,升高的cea表达促进细胞间粘附增加,这可导致转移(marshallj.,seminoncol.,30(asuppl.8):30-6,2003)。cea表达在各种肿瘤实体中的流行度一般很高。与已发表的数据一致,自己在组织样品中实施的分析确认其高流行度,大约是结肠直肠癌(crc)中95％,胰腺癌中90％,胃癌中80％,非小细胞肺癌(nsclc,这种情况中它与her3共表达)中60％,和乳腺癌中40％；发现小细胞肺癌和成胶质细胞瘤中的低表达。cea容易自细胞表面切割并或是直接或是经由淋巴自肿瘤脱落入血流。由于这种特性,血清cea的水平已用作诊断癌症和筛选癌症,特别是结肠直肠癌复发的临床标志物(goldenbergdm.,theinternationaljournalofbiologicalmarkers,7:183-188,1992；chaui.etal.,jclinoncol.,22:1420-1429,2004；flaminietal.,clincancerres.,12(23):6985-6988,2006)。术语“folr1”指叶酸受体α且已经鉴定为一些癌症中的潜在的预后和治疗靶。它指来自任何脊椎动物来源的任何天然folr1,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人folr1的氨基酸序列在uniprot登录号p15328中显示(seqidno:126),鼠folr1具有uniprot登录号p35846的氨基酸序列(seqidno:127)而食蟹猴folr1具有如uniprot登录号g7pr14中显示的氨基酸序列(seqidno:128)。folr1是一种在细胞的质膜上表达的n-糖基化蛋白质。folr1具有对叶酸和数种还原的叶酸衍生物的高亲和力且介导将生理学叶酸,5-甲基四氢叶酸投递至细胞的内部。folr1是folr1定向癌症疗法的一种期望靶,因为它在绝大多数卵巢癌中,以及在许多子宫,子宫内膜,胰腺,肾,肺,和乳腺癌中过表达,而folr1在正常组织上的表达局限于甲状腺,脉络丛,睾丸,膀胱,肺的肺泡肺细胞,和肾近端小管中的上皮细胞的顶膜。最近的研究已经鉴定了folr1表达在三重阴性乳腺癌中特别高(necelaetal.,plosone2015,10(3),e0127133)。术语“mcsp”指黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖,也称作硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)。它指来自任何脊椎动物来源的任何天然mcsp,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人mcsp的氨基酸序列在uniprot登录号q6uvk1中显示(seqidno:129)。mcsp是一种高度糖基化的内在膜硫酸软骨素蛋白聚糖,由细胞膜上表达的450kda硫酸软骨素蛋白聚糖成分和n-连接的280kda糖蛋白成分组成(rossetal.,arch.biochem.biophys.1983,225:370-38)。mcsp在一些正常和转化细胞中更加广泛分布。特别地,在表皮的几乎所有基底细胞中找到mcsp。mcsp在黑素瘤细胞中差异表达,且发现在超过90％的所分析的良性痣和黑素瘤损害中表达。还已经发现mcsp在非黑色素细胞起源的肿瘤中表达,包括基底细胞癌,神经嵴起源的各种肿瘤,和乳腺癌。如本文中使用的“t细胞抗原”指在t淋巴细胞,特别是细胞毒性t淋巴细胞的表面上呈现的抗原性决定簇。如本文中使用的“t细胞激活性治疗剂”指能够在受试者中诱导t细胞激活的治疗剂,特别是为在受试者中诱导t细胞激活而设计的治疗剂。t细胞激活性治疗剂的例子包括特异性结合激活性t细胞抗原,诸如cd3,和靶细胞抗原,诸如cea或叶酸受体的双特异性抗体。如本文中使用的“激活性t细胞抗原”指由t淋巴细胞,特别是细胞毒性t淋巴细胞表达的抗原性决定簇,其在与抗原结合分子相互作用后能诱导或增强t细胞激活。特别地,抗原结合分子与激活性t细胞抗原的相互作用可诱导t细胞激活,其通过触发t细胞受体复合物的信号传导级联进行。一种例示性激活性t细胞抗原是cd3。术语“cd3”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人),非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然cd3,除非另外指明。该术语涵盖“全长”,未加工的cd3以及源自细胞中加工的任何形式的cd3。该术语还涵盖cd3的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,cd3是人cd3,特别是人cd3的ε亚基(cd3ε)。人cd3ε的氨基酸序列显示于uniprot(www.uniprot.org)登录号p07766(型式144),或ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov/)refseqnp_000724.1。还见seqidno:130。食蟹猴[macacafascicularis]cd3ε的氨基酸序列显示于ncbigenbankno.bab71849.1。还见seqidno:131。术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗原结合分子结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是vh和vl)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(fr)和三个高变区(hvr)。参见例如kindtetal.,kubyimmunology,6thed.,w.h.freemanandco.,p.91(2007)。单个vh或vl域可足以赋予抗原结合特异性。如本文中使用的,术语“高变区”或“hvr”指抗体可变域中在序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区域。一般地,天然四链抗体包含六个hvr:三个在vh中(h1,h2,h3),三个在vl中(l1,l2,l3)。hvr一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(cdr)的氨基酸残基,后者具有最高的序列变异性和/或牵涉抗原识别。例示性高变环发生于氨基酸残基26-32(l1),50-52(l2),91-96(l3),26-32(h1),53-55(h2),和96-101(h3)(chothiaandlesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))。例示性cdr(cdr-l1,cdr-l2,cdr-l3,cdr-h1,cdr-h2,和cdr-h3)发生于氨基酸残基24-34(l1),50-56(l2),89-97(l3),31-35b(h1),50-65(h2),和95-102(h3)(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))。高变区(hvr)也称作互补决定区(cdr),而且在提到可变区中形成抗原结合区的部分时,这些术语在本文中可互换使用。这个特定区域已经由kabatetal.,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest"(1983)和由chothiaetal.,j.mol.biol.196:901-917(1987)描述,其中定义包括在针对彼此比较时的氨基酸残基的交叠或子集。无论如何,应用任一定义来提及抗体的cdr或其变体意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每一篇参考文献定义的cdr的适宜氨基酸残基在下文表a中作为比较列出。涵盖特定cdr的确切残基编号会取决于cdr的序列和大小而变化。基于抗体的可变区氨基酸序列,本领域技术人员能例行确定哪些残基构成特定cdr。表a:cdr定义1cdrkabatchothiaabm2vhcdr131-3526-3226-35vhcdr250-6552-5850-58vhcdr395-10295-10295-102vlcdr124-3426-3224-34vlcdr250-5650-5250-56vlcdr389-9791-9689-971表a中的所有cdr定义的编号方式依照kabat等人(见下文)列出的编号规则。2如表a中使用的具有小写“b”的“abm”指如由oxfordmolecular的“abm”抗体建模软件定义的cdr。kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将“kabat编号方式”的这种系统指派给任何可变区序列,不依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中使用的,“kabat编号方式”是指由kabatetal.,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,"sequenceofproteinsofimmunologicalinterest"(1983)中列出的编号系统。除非另有规定,抗体可变区中具体氨基酸残基位置的编号的提及依照kabat编号系统。除了vh中的cdr1之外,cdr一般包含形成高变环的氨基酸残基。cdr还包含“特异性决定残基”或“sdr”,它们是接触抗原的残基。sdr包含在称作缩短cdr或a-cdr的cdr区域中。例示性a-cdr(a-cdr-l1,a-cdr-l2,a-cdr-l3,a-cdr-h1,a-cdr-h2,和a-cdr-h3)发生于氨基酸残基31-34(l1),50-55(l2),89-96(l3),31-35b(h1),50-58(h2),和95-102(h3)(参见almagroandfransson,front.biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外指明,hvr残基和可变域中的其它残基(例如fr残基)在本文中依照kabat等人,见上文编号。如本文中使用的,在抗原结合分子(例如抗体)的语境中术语“亲和力成熟的”指如下的抗原结合分子,其例如通过突变而自参照抗原结合分子衍生,与参照抗体结合相同抗原,优选结合相同表位；且对抗原具有比参照抗原结合分子要高的亲和力。亲和力成熟一般牵涉修饰抗原结合分子的一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸残基。典型地,亲和力成熟的抗原结合分子与初始参照抗原结合分子结合相同表位。“框架”或“fr”指除了高变区(hvr)残基之外的可变域残基。可变域的fr一般由四个fr域组成:fr1,fr2,fr3,和fr4。因而,hvr和fr序列一般在vh(或vl)中以下述顺序出现:fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。出于本文中的目的,“受体人框架”是包含自如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变域(vl)框架或重链可变域(vh)框架的氨基酸序列的框架。“自”人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列,或者它可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中,氨基酸变化的数目是10或更少,9或更少,8或更少,7或更少,6或更少,5或更少,4或更少,3或更少,或2或更少。在一些实施方案中,vl受体人框架在序列上与vl人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列同一。术语“嵌合”抗体指如下的抗体,其中重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生。抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:iga,igd,ige,igg,和igm,而且其中若干可进一步分为亚类(同种型),例如igg1,igg2,igg3,igg4,iga1,和iga2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。“人源化”抗体指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个实质性整个如下的可变域,其中整个或实质性整个hvr(例如cdr)对应于非人抗体的那些,而且整个或实质性整个fr对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可包含自人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指经历人源化的抗体。本发明涵盖的其它形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经自原始抗体的恒定区另外修饰或变化以生成依照本发明的特性,尤其是关于c1q结合和/或fc受体(fcr)结合的那些。“人”抗体是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义专门排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。本文中的术语“fc域”或“fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的c端区。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。iggfc区包含iggch2和iggch3域。人iggfc区的“ch2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于ch2域。本文中的ch2域可以是天然序列ch2域或变体ch2域。“ch3域”包含fc区中在ch2域c端的那段残基(即自igg的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的ch3区可以是天然序列ch3域或变体ch3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的ch3域；参见美国专利no.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的,此类变体ch3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。在一个实施方案中,人igg重链fc区自cys226或自pro230延伸至重链的羧基末端。然而,fc区的c末端赖氨酸(lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照eu编号系统,也称作eu索引,如kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中描述的。“节-入-穴”技术在例如us5,731,168；us7,695,936；ridgwayetal.,proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中描述。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得该隆起可放置在该空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与隆起相同或相似大小的补偿性空腔。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个具体实施方案中,节修饰包含fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代t366w,而穴修饰包含fc域的两个亚基之另一中的氨基酸替代t366s,l368a和y407v。在又一个具体实施方案中,fc域中包含节修饰的亚基另外包含氨基酸替代s354c,而fc域中包含穴修饰的亚基另外包含氨基酸替代y349c。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc区的两个亚基之间形成二硫桥,如此进一步稳定化二聚体(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。“与免疫球蛋白的fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的fc区的天然发生等位变体以及具有生成替代,添加,或删除的改变但并不实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如,可以自免疫球蛋白的fc区的n端或c端删除一个或多个氨基酸,生物学功能没有实质性损失。可以依照本领域已知的一般规则来选择此类变体,从而对活性具有最小限度影响(参见例如bowie,j.u.etal.,science247:1306-10(1990))。术语“效应器功能”指那些可归于抗体的fc区的生物学活性,其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括:c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc),fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc),抗体依赖性细胞吞噬(adcp),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,细胞表面受体(例如b细胞受体)的下调,和b细胞激活。“激活性fc受体”是在受到抗体的fc区啮合后引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的fc受体。激活性fc受体包括fcγriiia(cd16a),fcγri(cd64),fcγriia(cd32),和fcαri(cd89)。一种特定激活性fc受体是人fcγriiia(参见uniprot登录号p08637,版本141)。术语“肽接头”指包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或在本文中描述。合适的非免疫原性接头肽是例如(g4s)n,(sg4)n或g4(sg4)n肽接头,其中“n”一般是介于1和10之间,典型地介于2和4之间的数目,特别是2,即肽选自由ggggs(seqidno:132),ggggsggggs(seqidno:133),sggggsgggg(seqidno:134)和ggggsggggsgggg(seqidno:135)组成的组,但是还包括序列gspgssssgs(seqidno:136),(g4s)3(seqidno:137),(g4s)4(seqidno:138),gsgsgsgs(seqidno:139),gsgsgngs(seqidno:140),ggsgsgsg(seqidno:141),ggsgsg(seqidno:142),ggsg(seqidno:143),ggsgngsg(seqidno:144),ggngsgsg(seqidno:145)和ggngsg(seqidno:146)。特别感兴趣的肽接头是(g4s)(seqidno:132),(g4s)2(seqidno:133),(g4s)3(seqidno:137)和(g4s)4(seqidno:138)。如此申请内使用的术语“氨基酸”表示天然发生羧基α-氨基酸的组,包含丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:a),精氨酸(arg,r),天冬酰胺(asn,n),天冬氨酸(asp,d),半胱氨酸(cys,c),谷氨酰胺(gln,q),谷氨酸(glu,e),甘氨酸(gly,g),组氨酸(his,h),异亮氨酸(ile,i),亮氨酸(leu,l),赖氨酸(lys,k),甲硫氨酸(met,m),苯丙氨酸(phe,f),脯氨酸(pro,p),丝氨酸(ser,s),苏氨酸(thr,t),色氨酸(trp,w),酪氨酸(tyr,y),和缬氨酸(val,v)。“融合”或“连接”意味着各构件(例如多肽和4-1bbl的外域)通过肽键,或是直接地或是经由一个或多个肽接头连接。关于参照多肽(蛋白质)序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域的技能内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如blast,blast-2,align.sawi或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序align-2生成％氨基酸序列同一性值。align-2序列比较计算机程序由genentech公司编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(washingtond.c.,20559),以美国版权注册号txu510087注册。公众自genentech公司(southsanfrancisco,california)可得到align-2程序,或者可以自源代码编译。align-2程序应当编译成在unix操作系统,包括数码unixv4.0d上使用。所有序列比较参数由align-2程序设置且不变。在采用align-2进行氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列a相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列a具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列b的某一％氨基酸序列同一性)如下计算:100乘分数x/y其中x是由序列比对程序align-2在该程序的a和b的比对中打分为同一匹配的氨基酸残基的数目,且其中y是b中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况中,a相对于b的％氨基酸序列同一性会不等于b相对于a的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用align-2计算机程序获得的。在某些实施方案中,涵盖本文中提供的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如,可能想要改善抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗原结合分子的氨基酸序列变体可通过将适宜修饰引入编码该分子的核苷酸序列,或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的删除,和/或插入和/或替代。可进行删除,插入,和替代的任何组合来得到最终的构建物,前提是最终的构建物拥有想要的特征,例如抗原结合。替代诱变感兴趣的位点包括hvr和框架(fr)。保守替代在表b中在标题“优选替代”下提供且在下文中提及氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可将氨基酸替代引入感兴趣的分子并对产物筛选想要的活性,例如保留/改善的抗原结合,降低的免疫原性,或改善的adcc或cdc。表b氨基酸可以依照共同的侧链特性来分组:(1)疏水性的:正亮氨酸,met,ala,val,leu,ile；(2)中性亲水性的:cys,ser,thr,asn,gln；(3)酸性的:asp,glu；(4)碱性的:his,lys,arg；(5)影响链取向的残基:gly,pro；(6)芳香族的:trp,tyr,phe。非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类别。术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中有氨基酸替代的实质性变体。一般地,为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗原结合分子会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力,降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之,将一个或多个cdr残基突变并将变体抗原结合分子在噬菌体上展示并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。在某些实施方案中,可以在一个或多个cdr内发生替代,插入,或删除,只要此类变化不实质性降低抗原结合分子结合抗原的能力。例如,可以在cdr中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如如本文中提供的保守替代)。一种对于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域有用的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由cunninghamandwells(1989)science,244:1081-1085描述的。在此方法中,鉴定残基或靶残基的组(例如带电荷的残基,诸如arg,asp,his,lys,和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。作为替代的候选,可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有想要的特性。氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有n端甲硫氨酰基残基的抗原结合分子。分子的其它插入变体包括与延长抗原结合分子的血清半衰期的多肽的n或c端的融合。在某些实施方案中,改变本文中提供的抗原结合分子以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或去除一个或多个糖基化位点来方便地获得分子的糖基化变体。在抗原结合分子包含fc区的情况中,可改变附着于其的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的双触角寡糖,其一般通过n连接附着至fc区的ch2域的asn297。参见例如wrightetal.,tibtech15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖,n-乙酰葡糖胺(glcnac),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构的“主干”中的glcnac的岩藻糖。在一些实施方案中,可进行抗原结合分子中的寡糖的修饰以创建具有某些改良特性的变体。在一个方面,提供具有缺乏(直接或间接)附着于fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗原结合分子的变体。此类岩藻糖基化变体可具有改善的adcc功能,参见例如美国专利公开号us2003/0157108(presta,l.)或us2004/0093621(kyowahakkokogyoco.,ltd)。本发明的抗原结合分子的别的变体包括那些具有两分寡糖的,例如,其中附着于fc区的双触角寡糖通过glcnac两分。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能,参见例如wo2003/011878(jean-mairet等人)；美国专利no.6,602,684(umana等人)；和us2005/0123546(umana等人)。还提供附着于fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的cdc功能且在例如wo1997/30087(patel等人)；wo1998/58964(raju,s.)；和wo1999/22764(raju,s.)中描述。在某些实施方案中,可能想要创建本发明的抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体,例如“thiomab”,其中分子的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中,替代的残基出现于分子的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,由此反应性硫醇基团放置在抗体的可及位点且可用于将抗体与其它模块诸如药物模块或接头-药物模块缀合以创建免疫缀合物。在某些实施方案中,可以用半胱氨酸替代任一个或多个下述残基:轻链的v205(kabat编号方式)；重链的a118(eu编号方式)；和重链fc区的s400(eu编号方式)。可以如例如美国专利no.7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。在某些方面,可进一步修饰本文中提供的抗原结合分子以含有本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(peg),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(或是均聚物或是随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇,及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物的数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可基于下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的特定特性或功能,双特异性抗体衍生物是否会用于限定条件下的疗法,等。在另一个方面,提供抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(kam,n.w.etal.,proc.natl.acad.sci.usa102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长的,而且包括但不限于对普通细胞没有损害,但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。在另一个方面,可获得本文中提供的含有4-1bbl的抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒剂在内的一个或多个异源分子缀合的抗体。术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建物,例如信使rna(mrna),病毒衍生的rna,或质粒dna(pdna)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键,诸如在肽核酸(pna)中找到的)。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段,例如dna或rna片段。“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经自其天然环境移出的核酸分子,dna或rna。例如,出于本发明的目的,认为载体中包含的编码多肽的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部分或实质性)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。分离的rna分子包括本发明的体内或体外rna转录物,以及正和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件,诸如启动子,核糖体结合位点,或转录终止子。具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指除了该多核苷酸序列可包括至多该参照核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外,该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列同一。换言之,为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸,参照序列中至多5％的核苷酸可以删除或用另一种核苷酸替代,或者,在参照序列中,总核苷酸的至多5％的数目的多个核苷酸可插入参照序列。参照序列的这些改变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方,或是在参照序列中的残基间个别散布或是以一个或多个连续组在参照序列内散布。实际上,使用已知的计算机程序,诸如上文关于多肽讨论的(例如align-2),可常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一。术语“表达盒”指重组或合成生成的多核苷酸,具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列规定核酸元件。重组表达盒可并入质粒,染色体,线粒体dna,质体dna,病毒,或核酸片段。典型地,在其它序列以外,表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中,本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。术语“载体”或“表达载体”与“表达构建物”同义且指用于将与其可操作联合的特定基因导入靶细胞并指导表达的dna分子。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入其已经导入的宿主细胞的基因组的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体容许大量稳定mrna的转录。一旦表达载体在靶细胞内,则由细胞转录和/或翻译机制生成由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用且指其中已经导入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体/转化子”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和自其衍生的后代,不管传代的次数。后代在核酸内容方面与亲本细胞可以不是完全同一,但是可含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。宿主细胞是可用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,诸如cho细胞,bhk细胞,ns0细胞,sp2/0细胞,yo骨髓瘤细胞,p3x63小鼠骨髓瘤细胞,per细胞,per.c6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞,和植物细胞,仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。药剂的“有效量”指在接受其施用的细胞或组织中导致生理变化必需的量。依照本发明的组合疗法具有协同效应。两种化合物的“协同效应”是如下的,其中两种药剂的组合的效果大于它们个别的效果之和且在统计学上不同于对照和单一药物。在另一个实施方案中,本文中公开的组合疗法具有叠加效应。两种化合物的“叠加效应”是如下的,其中两种药剂的组合的效果是它们个别的效果之和且在统计学上不同于对照和/或单一药物。药剂(例如药用组合物)的“治疗有效量”指在剂量和时间段方面有效实现想要的治疗或预防结果必需的量。例如,治疗有效量的药剂消除,减轻/减少,延迟,最小化或预防疾病的不利影响。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长类(例如人和非人灵长类,诸如猴),家兔,和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。特定地,个体或受试者是人。术语“药用组合物”指其为此类形式的制剂,所述形式允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的,而且所述制剂不含另外的对会接受该配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的成分。“药学可接受载剂”指药用组合物中除了活性组分以外,对受试者无毒的组分。药学可接受赋形剂包括但不限于缓冲剂,稳定剂,或防腐剂。术语“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书,其含有关于关注此类治疗性产品的使用的适应症,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。如本文中使用的,“治疗/处理”指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预,而且可以或是为了预防或是在临床病理学的过程中实施的。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。在一些实施方案中,使用本发明的分子来延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。如本文中使用的术语“癌症”指增殖性疾病,诸如实体瘤,或黑素瘤。例示性的供本发明中使用的靶向性ox40激动剂特别地,与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合使用的靶向性ox40激动剂是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体。特别地,包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体是抗成纤维细胞激活蛋白(fap)/抗ox40双特异性抗体。在一个方面,抗fap/抗ox40抗体是ox40激动剂。在一个方面,抗fap/抗ox40抗体是包含fc域的抗原结合分子。在一个特定方面,抗fap/抗ox40抗体是包含具有降低fcγ受体结合和/或效应器功能的修饰的fc域的抗原结合分子。通过肿瘤相关抗原的交联使之有可能避免非特异性fcγr介导的交联和如此可以施用与常用ox40抗体相比更高和更加有效剂量的抗fap/抗ox40抗体。在一个方面,本发明提供供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合使用且其中该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合fap的抗原结合域,其包含(a)重链可变区(vhfap),其包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),其包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhfap),其包含(i)包含seqidno:9的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:10的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:11的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),其包含(iv)包含seqidno:12的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-l3。在又一个方面,提供的是如本文中之前定义的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含至少一个包含与seqidno:7的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhfap)和与seqidno:8的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlfap)的能够特异性结合fap的抗原结合域或包含与seqidno:15的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhfap)和与seqidno:16的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlfap)的能够特异性结合fap的抗原结合域。在一个特定方面,双特异性ox40抗体包含至少一个包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区(vhfap)和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区(vlfap)的能够特异性结合fap的抗原结合域。在另一个方面,该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合fap的抗原结合域,其包含包含seqidno:15的氨基酸序列的重链可变区(vhfap)和包含seqidno:16的氨基酸序列的轻链可变区(vlfap)。在又一个方面,提供的是如本文中之前定义的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域,其包含(a)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3,或(c)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-l3,或(d)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-l3,或(e)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l3,或(f)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l3,或(g)重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:39的氨基酸序列的cdr-l3。更加特别地,该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域,其包含重链可变区(vhox40),其包含(i)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlox40),其包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-l3。在又一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域,其包含(a)包含seqidno:40的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:41的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(b)包含seqidno:42的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:43的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(c)包含seqidno:44的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:45的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(d)包含seqidno:46的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:47的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(e)包含seqidno:48的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:49的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(f)包含seqidno:50的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:51的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40),或(g)包含seqidno:52的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:53的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40)。在一个特定方面,该双特异性ox40抗体包含至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域,其包含与seqidno:40的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhox40)和与seqidno:41的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlox40)。更加特别地,包含至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域的双特异性ox40抗体包含包含seqidno:40的氨基酸序列的重链可变区(vhox40)和包含seqidno:41的氨基酸序列的轻链可变区(vlox40)。在一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体是进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域的抗原结合分子。特别地,该双特异性ox40抗体是包含iggfc域,具体是igg1fc域或igg4fc域的抗原结合分子。更加特别地,该双特异性ox40抗体是包含包含一处或多处降低对fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的fc域的抗原结合分子。在一个特定方面,该双特异性ox40抗体包含包含氨基酸替代l234a,l235a和p329g的igg1fc域。在本发明的另一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的如本文中之前描述的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含对肿瘤相关靶物的单价结合和对ox40的至少二价结合。在一个方面,该抗fap/抗ox40双特异性抗体包含对肿瘤相关靶物的单价结合和对ox40的二价结合。在一个特定方面,该抗fap/抗ox40双特异性抗体包含对肿瘤相关靶物的单价结合和对ox40的四价结合。在另一个方面,本发明提供供用于治疗癌症或延迟癌症进展的如本文中之前描述的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含能够特异性结合ox40的第一fab片段,其在ch1域的c端融合至能够特异性结合ox40的第二fab片段的vh域,和能够特异性结合ox40的第三fab片段,其在ch1域的c端融合至能够特异性结合ox40的第四fab片段的vh域。在一个方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的如本文中之前描述的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含(i)包含seqidno:54的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:55的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:56的氨基酸序列的四条轻链,或(ii)包含seqidno:57的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:58的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:56的氨基酸序列的四条轻链,或(iii)包含seqidno:59的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:60的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:56的氨基酸序列的四条轻链,或(iv)包含seqidno:61的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:62的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:56的氨基酸序列的四条轻链。在一个特定方面,提供的是供用于治疗癌症或延迟癌症进展的如本文中描述的方法中使用的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,特别是抗fap/抗ox40双特异性抗体,其中该双特异性ox40抗体包含包含seqidno:54的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:55的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:56的氨基酸序列的四条轻链。例示性的供本发明中使用的抗cea/抗cd3双特异性抗体本发明涉及靶向性ox40激动剂和它们的与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体组合的用途,特别是它们在用于治疗癌症或延迟癌症进展,更加特别是用于治疗实体瘤或延迟实体瘤进展的方法中的用途。特别地,肿瘤相关抗原是cea。本文中使用的抗cea/抗cd3双特异性抗体是包含结合cd3的第一抗原结合域和结合cea的第二抗原结合域的双特异性抗体。如此,本文中使用的抗cea/抗cd3双特异性抗体包含包含重链可变区(vhcd3)和轻链可变区(vlcd3)的第一抗原结合域和包含重链可变区(vhcea)和轻链可变区(vlcea)的第二抗原结合域。在一个特定方面,供组合中使用的抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含包含seqidno:63的cdr-h1序列,seqidno:64的cdr-h2序列,和seqidno:65的cdr-h3序列的重链可变区(vhcd3)；和/或包含seqidno:66的cdr-l1序列,seqidno:67的cdr-l2序列,和seqidno:68的cdr-l3序列的轻链可变区(vlcd3)。更加特别地,抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含与seqidno:69的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhcd3)和/或与seqidno:70的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlcd3)。在又一个方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体包含包含seqidno:69的氨基酸序列的重链可变区(vhcd3)和/或包含seqidno:70的氨基酸序列的轻链可变区(vlcd3)。在一个方面,特异性结合cd3的抗体是全长抗体。在一个方面,特异性结合cd3的抗体是人igg类的抗体,特别是人igg1类的抗体。在一个方面,特异性结合cd3的抗体是抗体片段,特别是fab分子或scfv分子,更加特别是fab分子。在一个特定方面,特异性结合cd3的抗体是交换fab分子,其中fab重和轻链的可变域或恒定域是交换的(即彼此替换)。在一个方面,特异性结合cd3的抗体是人源化抗体。在另一个方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第二抗原结合域,其包含(a)包含seqidno:71的cdr-h1序列,seqidno:72的cdr-h2序列,和seqidno:73的cdr-h3序列的重链可变区(vhcea),和/或包含seqidno:74的cdr-l1序列,seqidno:75的cdr-l2序列,和seqidno:76的cdr-l3序列的轻链可变区(vlcea),或(b)包含seqidno:79的cdr-h1序列,seqidno:80的cdr-h2序列,和seqidno:81的cdr-h3序列的重链可变区(vhcea),和/或包含seqidno:82的cdr-l1序列,seqidno:83的cdr-l2序列,和seqidno:84的cdr-l3序列的轻链可变区(vlcea)。更加特别地,抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含与seqidno:77的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:78的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlcea)。在又一个方面,抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含包含seqidno:77的氨基酸序列的重链可变区(vhcea)和/或包含seqidno:78的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)。在另一个方面,抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含与seqidno:85的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:86的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlcea)。在又一个方面,抗cea/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含包含seqidno:85的氨基酸序列的重链可变区(vhcea)和/或包含seqidno:86的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)。在另一个特定方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体包含结合cea的第三抗原结合域。特别地,抗cea/抗cd3双特异性抗体包含第三抗原结合域,其包含(a)包含seqidno:71的cdr-h1序列,seqidno:72的cdr-h2序列,和seqidno:73的cdr-h3序列的重链可变区(vhcea)；和/或包含seqidno:74的cdr-l1序列,seqidno:75的cdr-l2序列,和seqidno:76的cdr-l3序列的轻链可变区(vlcea),或(b)包含seqidno:79的cdr-h1序列,seqidno:80的cdr-h2序列,和seqidno:81的cdr-h3序列的重链可变区(vhcea)；和/或包含seqidno:82的cdr-l1序列,seqidno:83的cdr-l2序列,和seqidno:84的cdr-l3序列的轻链可变区(vlcea)。更加特别地,抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合域,其包含与seqidno:77的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:78的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlcea)。在又一个方面,抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合域,其包含包含seqidno:77的氨基酸序列的重链可变区(vhcea)和/或包含seqidno:78的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)。在另一个特定方面,抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合域,其包含与seqidno:85的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhcea)和/或与seqidno:86的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlcea)。在又一个方面,抗cea/抗cd3双特异性包含第三抗原结合域,其包含包含seqidno:85的氨基酸序列的重链可变区(vhcea)和/或包含seqidno:86的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)。在又一个方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体是双特异性抗体,其中第一抗原结合域是交叉fab分子,其中fab重和轻链的可变域或恒定域是交换的,且第二和第三,如果存在的话,抗原结合域是常规fab分子。在另一个方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体是双特异性抗体,其中(i)第二抗原结合域在fab重链的c端与第一抗原结合域的fab重链的n端融合,第一抗原结合域在fab重链的c端与fc域的第一亚基的n端融合,且第三抗原结合域在fab重链的c端与fc域的第二亚基的n端融合,或(ii)第一抗原结合域在fab重链的c端与第二抗原结合域的fab重链的n端融合,第二抗原结合域在fab重链的c端与fc域的第一亚基的n端融合,且第三抗原结合域在fab重链的c端与fc域的第二亚基的n端融合。fab分子可以直接或经由包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽接头与fc域或彼此融合。肽接头是本领域知道的且在本文中有描述。例如,合适的非免疫原性肽接头包括(g4s)n,(sg4)n,(g4s)n或g4(sg4)n肽接头。“n”一般是1至10,典型地2至4的整数。在一个实施方案中,所述肽接头具有至少5个氨基酸的长度,在一个实施方案中,5至100个,在又一个实施方案中,10至50个氨基酸的长度。在一个实施方案中,所述肽接头是(gxs)n或(gxs)ngm,其中g＝甘氨酸,s＝丝氨酸,且(x＝3,n＝3,4,5或6,且m＝0,1,2或3)或(x＝4,n＝2,3,4或5且m＝0,1,2或3),在一个实施方案中,x＝4且n＝2或3,在又一个实施方案中,x＝4且n＝2。在一个实施方案中,所述肽接头是(g4s)2。一种对于将第一和第二fab分子的fab轻链彼此融合特别合适的肽接头是(g4s)2。一种例示性的对于连接第一和第二fab片段的fab重链合适的肽接头包含序列(d)-(g4s)2。另一种合适的此类接头包含序列(g4s)4。另外,接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别是在fab分子与fc域亚基的n端融合的情况中,它可以经由免疫球蛋白铰链区或其一部分融合,有或无另外的肽接头。在又一个方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体包含包含一处或多处降低对fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的fc域。特别地,抗cea/抗cd3双特异性抗体包含包含氨基酸替代l234a,l235a和p329g的igg1fc域。在一个特定方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体包含与seqidno:87的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的两条多肽,与seqidno:88的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽,与seqidno:89的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽,和与seqidno:90的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽。在又一个特定实施方案中,双特异性抗体包含seqidno:87的两条多肽,seqidno:88的多肽,seqidno:89的多肽和seqidno:90的多肽(ceacd3tcb)。在又一个特定方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体包含与seqidno:91的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的两条多肽,与seqidno:92的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽,与seqidno:93的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽,和与seqidno:94的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽。在又一个特定实施方案中,双特异性抗体包含seqidno:91的两条多肽,seqidno:92的多肽,seqidno:93的多肽和seqidno:94的多肽(ceacam5cd3tcb)。特定的双特异性抗体描述于pct公开号wo2014/131712a1。在又一个方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体还可包含双特异性t细胞啮合物在又一个方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体是如wo2007/071426或wo2014/131712中描述的双特异性抗体。在另一个方面,双特异性抗体是medi565(amg211)。例示性的供本发明中使用的抗folr1/抗cd3双特异性抗体本发明还涉及抗folr1/抗cd3双特异性抗体和它们的与靶向性ox40激动剂组合的用途,特别是它们在用于治疗癌症或延迟癌症进展,更加特别是用于治疗实体瘤或延迟实体瘤进展的方法中的用途。本文中使用的抗folr1/抗cd3双特异性抗体是包含结合cd3的第一抗原结合域和结合folr1的第二抗原结合域的双特异性抗体。特别地,本文中使用的抗folr1/抗cd3双特异性抗体包含结合folr1的第三抗原结合域。在一个方面,t细胞激活性抗cd3双特异性抗体包含包含重链可变区(vhcd3)的第一抗原结合域,包含重链可变区(vhfolr1)的第二抗原结合域,包含重链可变区(vhfolr1)的第三抗原结合域和三次共同轻链可变区。在另一个方面,第一抗原结合域包含包含seqidno:95的cdr-h1序列,seqidno:96的cdr-h2序列,和seqidno:97的cdr-h3序列的重链可变区(vhcd3)；第二抗原结合域包含包含seqidno:98的cdr-h1序列,seqidno:99的cdr-h2序列,和seqidno:100的cdr-h3序列的重链可变区(vhfolr1)；第三抗原结合域包含包含seqidno:98的cdr-h1序列,seqidno:99的cdr-h2序列,和seqidno:100的cdr-h3序列的重链可变区(vhfolr1)；且共同轻链包含seqidno:101的cdr-l1序列,seqidno:102的cdr-l2序列,和seqidno:103的cdr-l3序列。在另一个方面,第一抗原结合域包含包含seqidno:104的序列的重链可变区(vhcd3)；第二抗原结合域包含包含seqidno:105的序列的重链可变区(vhfolr1)；第三抗原结合域包含包含seqidno:105的序列的重链可变区(vhfolr1)；且共同轻链包含seqidno:106的序列。在一个特定方面,抗folr1/抗cd3双特异性抗体包含包含seqidno:107的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:108的氨基酸序列的第二重链和三次seqidno:109的共同轻链。供本发明中使用的阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂在本发明的一个方面,靶向性ox40激动剂,特别是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用,其中靶向性ox40激动剂与对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体组合使用且另外它们与阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂组合。在一个方面,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是pd-l1结合拮抗剂或pd-1结合拮抗剂。特别地,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体或抗pd-1抗体。术语“pd-l1”,也称作cd274或b7-h1,指来自任何脊椎动物来源的任何天然pd-l1,包括哺乳动物,诸如灵长类动物,例如人和非人灵长类动物(例如食蟹猴),和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠),特别是“人pd-l1”。完整人pd-l1的氨基酸序列在uniprot(www.uniprot.org)登录号q9nzq7(seqidno:110)中显示。术语“pd-l1结合拮抗剂”指降低,阻断,抑制,消除或干扰源自pd-l1与一种或多种它的结合配偶(诸如pd-1,b7-1)任一的相互作用的信号转导的分子。在一些实施方案中,pd-l1结合拮抗剂是抑制pd-l1对它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面,pd-l1结合拮抗剂抑制pd-l1对pd-1和/或b7-1的结合。在一些实施方案中,pd-l1结合拮抗剂包括降低,阻断,抑制,消除或干扰源自pd-l1与一种或多种它的结合配偶(诸如pd-1,b7-1)的相互作用的信号转导的抗pd-l1抗体,其抗原结合片段,免疫粘附素,融合蛋白,寡肽和其它分子。在一个实施方案中,pd-l1结合拮抗剂降低由或经由在t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负面共刺激性信号(经由pd-l1介导的信号传导),从而使得功能障碍性t细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。特别地,pd-l1结合拮抗剂是抗pd-l1抗体。术语“抗pd-l1抗体”或“结合人pd-l1的抗体”或“特异性结合人pd-l1的抗体”或“拮抗性抗pd-l1”指以kd值为1.0x10-8mol/l或更低,在一个方面kd值为1.0x10-9mol/l或更低的结合亲和力特异性结合人pd-l1抗原的抗体。结合亲和力是用标准结合测定法,诸如表面等离振子共振技术(ge-healthcareuppsala,sweden)测定的。在一个特定方面,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-l1抗体。在一个具体的方面,抗pd-l1抗体选自由阿特珠单抗((atezolizumab)(mpdl3280a,rg7446),度伐单抗(durvalumab)(medi4736),阿维单抗(avelumab)(msb0010718c)和mdx-1105组成的组。在一个具体的方面,抗pd-l1抗体是本文中描述的yw243.55.s70。在另一个具体的方面,抗pd-l1抗体是本文中描述的mdx-1105。在仍有另一个具体的方面,抗pd-l1抗体是medi4736(度伐单抗)。在还有又一个方面,抗pd-l1抗体是msb0010718c(阿维单抗)。更加特别地,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是阿特珠单抗(mpdl3280a)。在另一个方面,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是包含seqidno:112的重链可变域vh(pdl-1)和seqidno:113的轻链可变域vl(pdl-1)的抗pd-l1抗体。在另一个方面,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是包含seqidno:114的重链可变域vh(pdl-1)和seqidno:115的轻链可变域vl(pdl-1)的抗pd-l1抗体。术语“pd-1”,也称作cd279,pd1或编程性细胞死亡蛋白1,指来自任何脊椎动物来源的任何天然pd-l1,包括哺乳动物,诸如灵长类动物,例如人和非人灵长类动物(例如食蟹猴),和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠),特别是具有如uniprot(www.uniprot.org)登录号q15116(seqidno:111)中显示的氨基酸序列的人蛋白pd-1。术语“pd-1结合拮抗剂”指抑制pd-1对它的配体结合配偶的结合的分子。在一些实施方案中,pd-1结合拮抗剂抑制pd-1对pd-l1的结合。在一些实施方案中,pd-1结合拮抗剂抑制pd-1对pd-l2的结合。在一些实施方案中,pd-1结合拮抗剂抑制pd-1对pd-l1和pd-l2二者的结合。特别地,pd-l1结合拮抗剂是抗pd-l1抗体。术语“抗pd-1抗体”或“结合人pd-1的抗体”或“特异性结合人pd-1的抗体”或“拮抗性抗pd-1”指以kd值为1.0x10-8mol/l或更低,在一个方面kd值为1.0x10-9mol/l或更低的结合亲和力特异性结合人pd1抗原的抗体。结合亲和力是用标准结合测定法,诸如表面等离振子共振技术(ge-healthcareuppsala,sweden)测定的。在一个方面,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是抗pd-1抗体。在一个具体的方面,抗pd-1抗体选自由mdx1106(纳武单抗(nivolumab)),mk-3475(派姆单抗(pembrolizumab)),ct-011(匹迪单抗(pidilizumab)),medi-0680(amp-514),pdr001,regn2810,和bgb-108组成的组,特别是选自派姆单抗和纳武单抗。在另一个方面,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是包含seqidno:116的重链可变域vh(pd-1)和seqidno:117的轻链可变域vl(pd-1)的抗pd-1抗体。在另一个方面,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是包含seqidno:118的重链可变域vh(pd-1)和seqidno:119的轻链可变域vl(pd-1)的抗pd-1抗体。供本发明中使用的双特异性抗体的制备在某些方面,组合中使用的治疗剂包含多特异性抗体,例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面,结合特异性针对不同抗原。在某些方面,结合特异性针对同一抗原上的不同表位。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见milsteinandcuello,nature305:537(1983)),wo93/08829,和trauneckeretal.,emboj.10:3655(1991)),和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利no.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(wo2009/089004a1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利no.4,676,980,和brennanetal.,science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如kostelnyetal.,j.immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如hollingeretal.,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993))；和使用单链fv(sfv)二聚体(见例如gruberetal.,j.immunol.,152:5368(1994))；和如例如tuttetal.,j.immunol.147:60(1991)中所描述的,制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体,包括“章鱼抗体”(见例如us2006/0025576a1)。本文中的抗体或片段还包括包含结合两种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用fab”或“daf”(见例如us2008/0069820)。本文中还包括“crossmab”抗体(参见例如wo2009/080251,wo2009/080252,wo2009/080253,或wo2009/080254)。用于生成双特异性抗体片段的另一种技术是“双特异性t细胞衔接器”(engager)或办法(参见例如wo2004/106381,wo2005/061547,wo2007/042261,和wo2008/119567)。这种办法利用在单一多肽上排列的两种抗体可变域。例如,单一多肽链包括两个单链fv(scfv)片段,每个具有由多肽接头分开的一个可变重链(vh)域和一个可变轻链(vl)域,多肽接头的长度足以容许两个域之间的分子内联合。此单一多肽进一步包括两个scfv片段之间的多肽间隔物序列。每个scfv识别不同的表位,而且这些表位可以是不同细胞类型特异性的,使得当每种scfv啮合其关联表位时两种不同细胞类型的细胞变成紧密接近或系留。这种办法的一个具体实施方案包括识别由免疫细胞表达的细胞表面抗原(例如t细胞上的cd3多肽)的scfv连接识别由靶细胞(诸如恶性或肿瘤细胞)表达的细胞表面抗原的另一scfv。因为它是单一多肽,所以双特异性t细胞衔接器可以使用本领域已知的任何原核或真核细胞表达系统(例如cho细胞系)来表达。然而,特定纯化技术(参见例如ep1691833)对于分开单体双特异性t细胞衔接器与其它多聚体种类(其可能具有与单体的预定活性不同的生物学活性)可能是必需的。在一种例示性纯化方案中,首先对含有分泌多肽的溶液进行金属亲和层析,并用咪唑浓度的梯度洗脱多肽。使用阴离子交换层析进一步纯化此洗出液,并使用氯化钠浓度的梯度洗脱多肽。最后,对此洗出液进行大小排阻层析以分开单体与多聚体种类。在一个方面,在本发明中使用的双特异性双特异性抗体由包含通过肽接头的彼此融合的两个单链fv片段(scfv)的单一多肽链构成。降低fc受体结合和/或效应器功能的fc域修饰本发明的抗原结合分子的fc域由包含免疫球蛋白分子的重链域的一对多肽链组成。例如,免疫球蛋白g(igg)分子的fc域是二聚体,其每个亚基包含ch2和ch3igg重链恒定域。fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。fc域对本发明的抗原结合分子赋予有利的药动学特性,包括有助于较好的在靶组织中的积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而,与此同时,这可能导致不想要的本发明的双特异性抗体对表达fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。因而,在特定方面,与天然igg1fc域相比,本发明的抗原结合分子的fc域展现降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个方面,fc并不实质性结合fc受体和/或并不诱导效应器功能。在一个特定方面,fc受体是fcγ受体。在一个方面,fc受体是人fc受体。在一个具体方面,fc受体是激活性人fcγ受体,更具体地是人fcγriiia,fcγri或fcγriia,最具体地是人fcγriiia。在一个方面,fc域并不诱导效应器功能。降低的效应器功能可包括但不限于下述一种或多种:降低的补体依赖性细胞毒性(cdc),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc),降低的抗体依赖性细胞吞噬(adcp),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,降低的对nk细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的树突细胞成熟,或降低的t细胞引发。在某些方面,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的fc区,由此生成fc区变体。fc区变体可包含包含一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如替代)的人fc区序列(例如人igg1,igg2,igg3或igg4fc区)。在一个特定方面,本发明提供一种抗体,其中fc域包含一处或多处降低对fc受体,特别是对fcγ受体的结合的氨基酸替代。在一个方面,本发明的抗体的fc域包含一处或多处降低fc域对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。典型地,在fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。特别是,fc域包含位置e233,l234,l235,n297,p331和p329(eu编号方式)处的氨基酸替代。特别是,fc域包含igg重链的位置234和235(eu编号方式)和/或329(eu编号方式)处的氨基酸替代。更特别地,提供的是依照本发明的抗体,其包含具有igg重链中的氨基酸替代l234a,l235a和p329g(“p329glala”,eu编号方式)的fc域。氨基酸替代l234a和l235a指所谓的lala突变。“p329glala”氨基酸替代组合几乎完全消除人igg1fc域的fcγ受体结合且在国际专利申请公开号wo2012/130831a1中描述,其还描述了制备此类突变体fc域的方法及用于测定其特性诸如fc受体结合或效应器功能的方法。具有降低的fc受体结合和/或效应器功能的fc域还包括那些具有一个或多个fc域残基238,265,269,270,297,327和329的替代的(美国专利no.6,737,056)。此类fc突变体包括具有两个或更多个氨基酸位置265,269,270,297和327处的替代的fc突变体,包括具有残基265和297变成丙氨酸的替代的所谓的“dana”fc突变体(美国专利no.7,332,581)。在另一个方面,fc域是igg4fc域。与igg1抗体相比,igg4抗体展现降低的对fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。在一个更具体方面,fc域是包含位置s228(kabat编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代s228p的igg4fc域。在一个更具体方面,fc域是包含氨基酸替代l235e和s228p和p329g(eu编号方式)的igg4fc域。此类igg4fc域突变体和其fcγ受体结合特性也在wo2012/130831中描述。突变体fc域可使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,插入或修饰来制备。遗传方法可包括编码dna序列的位点特异性诱变,pcr,基因合成,等等。正确的核苷酸变化可例如通过测序来验证。对fc受体的结合可例如通过elisa或通过使用标准仪器诸如biacore仪(gehealthcare)的表面等离振子共振(spr),和fc受体(诸如可通过重组表达获得的)容易地测定。或者,fc域或包含fc域的细胞激活性抗体对fc受体的结合亲和力可使用已知表达特定fc受体的细胞系,诸如表达fcγiiia受体的人nk细胞来评估。fc域或包含fc域的本发明的抗体的效应器功能可通过本领域已知方法来测量。一种合适的用于测量adcc的测定法在本文中描述。评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定法的其它例子在美国专利no.5,500,362；hellstrometal.,procnatlacadsciusa83,7059-7063(1986)和hellstrometal.,procnatlacadsciusa82,1499-1502(1985)；美国专利no.5,821,337；bruggemannetal.,jexpmed166,1351-1361(1987)中描述。或者,可采用非放射性测定法方法(参见例如actitmnon-radioactivecytotoxicityassayforflowcytometry(celltechnology,inc.,mountainview,ca)；和cytotoxnon-radioactivecytotoxicityassay(promega,madison,wi))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(pbmc)和天然杀伤(nk)细胞。或者/另外,可以在体内,例如在动物模型中评估感兴趣分子的adcc活性,诸如clynesetal.,procnatlacadsciusa95,652-656(1998)中公开的。在一些方面,fc域对补体成分,具体是c1q的结合降低。因而,在其中将fc域工程化改造成具有降低的效应器功能的一些实施方案中,所述降低的效应器功能包括降低的cdc。可以进行c1q结合测定来确定本发明的双特异性抗体是否能够结合c1q并因此具有cdc活性(参见例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c结合elisa)。为了评估补体活化,可实施cdc测定法(参见例如gazzano-santoroetal.,jimmunolmethods202,163(1996)；craggetal.,blood101,1045-1052(2003)；和craggandglennie,blood103,2738-2743(2004))。促进异二聚化的fc域修饰本发明的双特异性抗原结合分子包含与fc域的两个亚基之一或另一融合的不同抗原结合位点,如此fc域的两个亚基可以包含在两条非相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和后续的二聚化导致两条多肽的数种可能组合。为了改善重组生成中本发明的双特异性抗体的产率和纯度,在本发明的双特异性抗原结合分子的fc域中引入促进想要的多肽的联合的修饰如此会是有利的。因而,在特定方面,本发明涉及如下的双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域,(b)至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人iggfc域的两个亚基之间最广泛蛋白质-蛋白质相互作用的位点在fc域的ch3域中。如此,在一个方面,所述修饰在fc域的ch3域中。在一个具体方面,所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰,包含fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。如此,本发明涉及一种抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域,(b)至少一个能够特异性结合ox40的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中依照节入穴方法,fc域的第一亚基包含节且fc域的第二亚基包含穴。在一个特定方面,fc域的第一亚基包含氨基酸替代s354c和t366w(eu编号方式)且fc域的第二亚基包含氨基酸替代y349c,t366s和y407v(编号方式依照kabateu索引)。“节-入-穴”技术在例如us5,731,168；us7,695,936；ridgwayetal.,proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中描述。一般地,方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得隆起可放置在空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与隆起相同或相似大小的补偿性空腔。因而,在一个方面,在本发明的双特异性抗原结合分子的fc域的第一亚基的ch3域中将氨基酸残基用具有较大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的ch3域内生成隆起,其可放置在第二亚基的ch3域内的空腔中,并且在fc域的第二亚基的ch3域中将氨基酸残基用具有较小侧链体积的氨基酸酸残基替换,由此在第二亚基的ch3域内生成空腔,其内可放置第一亚基的ch3域内的隆起。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个具体方面,在fc域的第一亚基的ch3域中将位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(t366w),并且在fc域的第二亚基的ch3域中将位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(y407v)。在一个方面,在fc域的第二亚基中另外将位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(t366s)并将位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(l368a)。在还有又一个方面,在fc域的第一亚基中另外将位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(s354c),并且在fc域的第二亚基中另外将位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(y349c)。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc域的两个亚基之间形成进一步稳定化二聚体的二硫桥(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。在一个特定方面,fc域的第一亚基包含氨基酸替代s354c和t366w(eu编号方式)且fc域的第二亚基包含氨基酸替代y349c,t366s和y407v(编号方式依照kabateu索引)。在一个备选方面,促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰,例如如pct公开文本wo2009/089004中描述的。一般地,这种方法牵涉将两个fc域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基用带电荷氨基酸残基替换,使得同二聚体形成变成在静电方面不利但异二聚化在静电方面有利。本文中报告的双特异性抗体的重链的c末端可以是以氨基酸残基pgk结束的完整c末端。重链的c末端可以是缩短的c末端,其中已经去除一个或两个c末端氨基酸残基。在一个优选的方面,重链的c末端是以pg结束的缩短的c末端。在本文中报告的所有方面的一个方面,本文中规定的包含包括c末端ch3域的重链的双特异性抗体包含c末端甘氨酸-赖氨酸二肽(g446和k447,编号方式依照kabateu索引)。在本文中报告的所有方面的一个实施方案中,本文中规定的包含包括c末端ch3域的重链的双特异性抗体包含c末端甘氨酸残基(g446,编号方式依照kabateu索引)。fab域中的修饰在一个方面,本发明涉及包含至少一个fab片段的双特异性抗体,其中可变域vh和vl或恒定域ch1和cl任一是交换的。双特异性抗体依照crossmab技术来制备。具有一个结合臂中的域替换/交换的多特异性抗体(crossmabvh-vl或crossmabch-cl)详细记载于wo2009/080252和schaefer,w.etal.,pnas,108(2011)11187-1191。它们清楚地减少由针对第一抗原的轻链与错误的针对第二抗原的重链错配引起的副产物(与没有此类域交换的办法相比)。在一个方面,本发明涉及一种包含fab片段的双特异性抗原结合分子,其中恒定域cl和ch1彼此替换使得ch1域是轻链的一部分且cl域是重链的一部分。在另一个方面,本发明涉及一种包含fab片段的双特异性抗原结合分子,其中可变域vl和vh彼此替换使得vh域是轻链的一部分且vl域是重链的一部分。在另一个方面,及为了进一步改善正确配对,双特异性抗原结合分子可含有不同的带电荷的氨基酸替代(所谓的“带电荷的残基”)。在交叉或非交叉ch1和cl域中引入这些修饰。在一个特定的方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其中在cl域之一中位置123(eu编号方式)处的氨基酸被精氨酸(r)替换且位置124(eu编号方式)处的氨基酸被赖氨酸(k)替代且其中在ch1域之一中位置147(eu编号方式)处的和位置213(eu编号方式)处的氨基酸被谷氨酸(e)替代。多核苷酸本发明进一步提供分离的多核苷酸,其编码如本文中描述的抗体或其片段。分离的编码本发明的抗体的多核苷酸可以作为编码整个抗原结合分子的单一多核苷酸或作为共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如,免疫球蛋白的轻链部分与免疫球蛋白的重链部分可以由分开的多核苷酸编码。当共表达时,重链多肽会与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。在一些方面,分离的多核苷酸编码整个依照如本文中描述的发明的抗体。在其它实施方案中,分离的多核苷酸编码依照如本文中描述的发明的抗体中包含的多肽。在某些实施方案中,多核苷酸或核酸是dna。在其它实施方案中,本发明的多核苷酸是rna,例如以信使rna(mrna)的形式。本发明的rna可以是单链的或双链的。重组方法如本发明中使用的双特异性抗体可通过例如固态肽合成(例如merrifield固相合成)或重组生成来获得。对于重组生成,分离编码例如如上文描述的抗体或其多肽片段的一种或多种多核苷酸并插入一个或多个载体供进一步克隆和/或宿主细胞中的表达。此类多核苷酸可使用常规规程容易地分离和测序。在本发明的一个方面,提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体,优选表达载体。可使用本领域技术人员公知的方法来构建含有抗体(片段)的编码序列连同适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如maniatisetal.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,n.y.(1989)；和ausubeletal.,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandwileyinterscience,n.y.(1989)中描述的技术。表达载体可以是病毒,质粒的部分,或者可以是核酸片段。表达载体包括其中与启动子和/或其它转录或翻译控制元件可操作联合地克隆编码抗体或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)的表达盒。如本文中使用的,“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(tag,tga,或taa)不翻译成氨基酸,但是如果存在的话,它可考虑作为编码区的一部分,但是任何侧翼序列,例如启动子,核糖体结合位点,转录终止子,内含子,5’和3’非翻译区,等等不是编码区的部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建物中,例如在单个载体上,或在分开的多核苷酸构建物中,例如在分开的(不同的)载体上。而且,任何载体可含有单个编码区,或者可包含两个或更多个编码区,例如,本发明的载体可编码一种或多种多肽,其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译地分开成最终的蛋白质。另外,本发明的载体,多核苷酸,或核酸可编码异源编码区,或是与编码本发明的抗体或其多肽片段,或其变体或衍生物的多核苷酸融合或是不融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序,诸如分泌信号肽或异源功能域。可操作联合是这样一种方式,当基因产物,例如多肽的编码区与一种或多种调节序列这样联合时,将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码想要的基因产物的mrna转录的话且如果两个dna片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰dna模板被转录的能力的话,两个dna片段(诸如多肽编码区和与其联合的启动子)是“可操作联合的”。如此,如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录的话,启动子区与核酸会是可操作联合的。启动子可以是仅仅在预定细胞中指导dna实质性转录的细胞特异性启动子。在启动子以外,其它转录控制元件,例如增强子,操纵基因,阻抑物,和转录终止信号可与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员知道的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区,诸如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子,连同内含子a),猿病毒40(例如早期启动子),和逆转录病毒(诸如例如劳斯(rous)肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因诸如肌动蛋白,热休克蛋白,牛生长激素和兔α珠蛋白衍生的,以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,多种翻译控制元件是本领域普通技术人员知道的。这些包括但不限于核糖体结合位点,翻译起始和终止密码子,和自病毒系统衍生的元件(特别是内部核糖体进入位点或ires,也称作cite序列)。表达盒还可包括其它特征,诸如复制起点,和/或染色体整合元件,诸如逆转录病毒长末端重复(ltr),或腺伴随病毒(aav)反向末端重复(itr)。本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌或信号肽(其指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌)的编码区联合。例如,如果想要分泌抗体或其多肽片段的话,可以将编码信号序列的dna放置在编码本发明的抗体或其多肽片段的核酸的上游。依照信号假说,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,其在一旦启动生长中的蛋白质链输出穿过粗面内质网时自成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽的n端融合的信号肽,其自翻译的多肽切割下来以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中,使用天然信号肽,例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或序列保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者,可使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如,野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原活化物(tpa)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替代。编码可用于推动稍后纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的dna可以包括在编码本发明的抗体或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。在本发明的又一个方面,提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中,提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体分别可单一地或组合地并入本文中关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面,宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的抗体(的一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的,术语“宿主细胞”指可以工程化改造以生成本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域公知的。可以用特定的表达载体适当地转染或转导此类细胞,并且可以培养大量的含有载体的细胞供接种大规模发酵罐以获得足够数量的抗原结合分子供临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物,诸如大肠杆菌,或各种真核细胞,诸如中国仓鼠卵巢(cho)细胞,昆虫细胞,等等。例如,特别是在不需要糖基化时,可以在细菌中生成多肽。表达后,多肽可以在可溶性级分中自细菌细胞糊分离且可以进一步纯化。在原核生物以外,真核微生物诸如丝状真菌或酵母对于编码多肽的载体是合适的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已经“人源化”,导致生成具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母株。参见gerngross,natbiotech22,1409-1414(2004),和lietal.,natbiotech24,210-215(2006)。对于表达(糖基化)多肽合适的宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞联合使用,特别是用于转染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞的众多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利no.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978,和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的plantibodiestm技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如,适应在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经sv40转化的猴肾cv1系(cos-7),人胚肾细胞系(例如grahametal.,jgenvirol36,59(1977)中描述的293或293t细胞),幼仓鼠肾细胞(bhk),小鼠塞托利(sertoli)细胞(如例如mather,biolreprod23,243-251(1980)中描述的tm4细胞),猴肾细胞(cv1),非洲绿猴肾细胞(vero-76),人宫颈癌细胞(hela),犬肾细胞(mdck),牛鼠(buffalorat)肝细胞(brl3a),人肺细胞(w138),人肝细胞(hepg2),小鼠乳房肿瘤细胞(mmt060562),tri细胞(如例如matheretal.,annalsn.y.acadsci383,44-68(1982)中描述的),mrc5细胞,和fs4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞,包括dhfr-cho细胞(urlaubetal.,procnatlacadsciusa77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如yo,ns0,p3x63和sp2/0。关于适合于蛋白质生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如yazakiandwu,methodsinmolecularbiology,vol.248(b.k.c.lo,ed.,humanapress,totowa,nj),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,细菌细胞和植物细胞,在此仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,优选哺乳动物细胞,诸如中国仓鼠卵巢(cho)细胞,人胚肾(hek)细胞或淋巴样细胞(例如y0,ns0,sp20细胞)。在这些系统中表达外来基因的标准技术是本领域已知的。可以工程化改造表达包含免疫球蛋白重链或轻链任一的多肽的细胞,从而还表达另一条免疫球蛋白链,使得所表达的产物是具有重和轻链二者的免疫球蛋白。在一个方面,提供一种生成本发明的抗体或其多肽片段的方法,其中方法包含在适于本发明的抗体或其多肽片段表达的条件下培养如本文中提供的包含编码本发明的抗体或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞,和自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收本发明的抗体或其多肽片段。在某些实施方案中,形成抗原结合分子的一部分的能够特异性结合靶细胞抗原的模块(例如fab片段)至少包含能够结合抗原的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然发生的抗体和其片段的一部分且自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域公知的(参见例如harlowandlane,"antibodies,alaboratorymanual",coldspringharborlaboratory,1988)。非天然发生抗体可以使用固相肽合成来构建,可以重组生成(例如如美国专利no.4,186,567中描述的)或可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如授予mccafferty的美国专利no.5,969,108)。任何动物物种的免疫球蛋白均可在本发明中使用。在本发明中有用的非限制性免疫球蛋白可以是鼠,灵长类,或人起源的。如果融合蛋白旨在供人使用的话,可使用嵌合形式的免疫球蛋白,其中免疫球蛋白的恒定区来自人。还可依照本领域公知的方法制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(参见例如授予winter的美国专利no.5,565,332)。人源化可通过多种方法来实现,包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)cdr嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上,有或没有保留关键框架残基(例如那些对于保留优秀的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基),(b)仅将非人特异性决定区(sdr或a-cdr；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上,或(c)移植整个非人可变域,但通过替换表面残基用人样区段“遮盖”它们。人源化抗体和生成它们的方法在例如almagroandfransson,frontbiosci13,1619-1633(2008)中综述,而且在例如riechmannetal.,nature332,323-329(1988)；queenetal.,procnatlacadsciusa86,10029-10033(1989)；美国专利no.5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；jonesetal.,nature321,522-525(1986)；morrisonetal.,procnatlacadsci81,6851-6855(1984)；morrisonandoi,advimmunol44,65-92(1988)；verhoeyenetal.,science239,1534-1536(1988)；padlan,molecimmun31(3),169-217(1994)；kashmirietal.,methods36,25-34(2005)(描述sdr(a-cdr)嫁接)；padlan,molimmunol28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；dall’acquaetal.,methods36,43-60(2005)(描述“fr改组”)；和osbournetal.,methods36,61-68(2005)和klimkaetal.,brjcancer83,252-260(2000)(描述用于fr改组的“导向选择”办法)中进一步描述。依照本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。人抗体和人可变区可使用本领域已知的多种技术来生成。人抗体在vandijkandvandewinkel,curropinpharmacol5,368-74(2001)和lonberg,curropinimmunol20,450-459(2008)中一般性描述。人可变区能形成通过杂交瘤方法生成的人单克隆抗体的一部分且自其衍生(参见例如monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987))。人抗体和人可变区还可以通过将免疫原施用于已经修饰以响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备(参见例如lonberg,natbiotech23,1117-1125(2005)。人抗体和人可变区还可以通过分离自人衍生噬菌体展示文库选择的fv克隆可变区序列来生成(参见例如hoogenboometal.,inmethodsinmolecularbiology178,1-37(o’brienetal.,ed.,humanpress,totowa,nj,2001)；和mccaffertyetal.,nature348,552-554；clacksonetal.,nature352,624-628(1991))。噬菌体典型地或是以单链fv(scfv)片段或是作为fab片段展示抗体片段。在某些方面,依照例如pct公开文本wo2012/020006(参见关于亲和力成熟的实施例)或美国专利申请公开文本no.2004/0132066中公开的方法工程化改造抗体以具有增强的结合亲和力。本发明抗原结合分子结合特定抗原性决定簇的能力可经由酶联免疫吸附测定法(elisa)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振技术(liljebladetal.,glycoj17,323-329(2000))),和传统的结合测定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。可使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施方案中,此类竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与参照抗原结合分子结合的相同。用于抗原结合分子结合的表位的作图的详细的例示性方法在morris(1996)“epitopemappingprotocols”,inmethodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中提供。在一种例示性竞争测定法中,在包含结合抗原的第一经标记抗原结合分子和第二未标记抗原结合分子(测试其与第一抗原结合分子竞争结合抗原的能力)的溶液中温育固定化抗原。第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含第一经标记抗原结合分子但不包含第二未标记抗原结合分子的溶液中温育固定化抗原。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育后,去除过量的未结合的抗体,并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果在测试样品中与固定化抗原联合的标记物的量相对于对照样品实质性降低,那么这指示第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合抗原。参见harlowandlane(1988)antibodies:alaboratorymanualch.14(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny)。如本文中所述制备的本发明的抗体可通过本领域已知的技术来纯化,诸如高效液体层析术,离子交换层析术,凝胶电泳,亲和层析术,大小排阻层析术,等等。用于纯化特定蛋白质的实际条件会部分取决于诸如净电荷,疏水性,亲水性等因素,而且对于本领域技术人员会是显而易见的。对于亲和层析术纯化,可使用结合抗原结合分子的抗体,配体,受体或抗原。例如,对于本发明的双特异性抗体的亲和层析术纯化,可使用具有蛋白a或蛋白g的基质。可以本质上如实施例中所述使用顺序蛋白a或g亲和层析术和大小排阻层析术来分离抗原结合分子。抗原结合分子或其片段的纯度可通过多种公知的分析方法任一来测定,包括凝胶电泳,高压液体层析术,等等。例如,如实施例中所述的双特异性抗体显示是完整的且正确装配的,如通过还原性和非还原性sds-page证明的。测定法本文中提供的抗原结合分子可通过本领域已知的多种测定法来鉴定,筛选,或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。1.亲和力测定法本文中提供的双特异性抗原结合分子对相应的受体的亲和力可依照实施例中提出的方法通过表面等离振子共振(spr),使用标准仪器诸如biacore仪器(gehealthcare),和受体或靶蛋白(诸如可通过重组表达获得的)来测定。双特异性抗原结合分子对靶细胞抗原的亲和力也可以通过表面等离振子共振(spr),使用标准仪器诸如biacore仪器(gehealthcare),和受体或靶蛋白(诸如可通过重组表达获得的)来测定。对于fap-ox40双特异性抗体,已经在国际专利申请公开号wo2017/055398a2或wo2017/060144a1中更加详细地描述方法。依照一个方面,于25℃使用t100机器(gehealthcare)通过表面等离振子共振测量kd。2.结合测定法和其它测定法在一个方面,对本文中报告的fap-ox40双特异性抗体测试它的抗原结合活性,如国际专利申请公开号wo2017/055398a2或wo2017/060144a1中更加详细描述的。3.活性测定法在一个方面,提供用于鉴定靶向性ox40双特异性抗原结合分子的生物学活性的测定法。在某些实施方案中,对本文中报告的抗体测试此类生物学活性。药用组合物,配制剂和施用路径在又一个方面,本发明提供药用组合物,其包含本文中提供的包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体,例如供任何下述治疗方法中使用。在一个实施方案中,药用组合物包含本文中提供的抗体和至少一种药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中,药用组合物包含本文中提供的抗体和至少一种例如如下文描述的另外的治疗剂。在一个方面,本发明提供包含抗fap/抗ox40双特异性抗体和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗folr1/抗cd3双特异性抗体的药学组合物。在另一个方面,本发明提供包含包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体和阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂的药学组合物。特别地,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是拮抗性抗pd-l1抗体或拮抗性抗pd1抗体。更加特别地,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂选自由阿特珠单抗,度伐单抗,派姆单抗和纳武单抗组成的组。在一个具体的方面,阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂是阿特珠单抗。本发明的药用组合物包含溶解或分散在药学可接受赋形剂中的治疗有效量的一种或多种抗体。短语“药用或药学可接受”指在采用的剂量和浓度一般对接受者无毒,即在适当施用于动物,诸如例如人时不产生不利的,变应性的或其它不想要的反应的分子实体和组合物。包含活性组分(例如包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的双特异性ox40抗体,对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体和/或阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂)的药用组合物的制备会是本领域技术人员根据本公开内容知道的,如由remington'spharmaceuticalsciences,18thed.mackprintingcompany,1990例示的,通过援引收入本文。特别地,组合物是冻干配制剂或水溶液。如本文中使用的,“药学可接受赋形剂”包括任何和所有溶剂,缓冲剂,分散介质,包衣,表面活性剂,抗氧化剂,防腐剂(例如抗细菌剂,抗真菌剂),等张剂,盐,稳定剂和其组合,正如本领域普通技术人员会知道的。胃肠外组合物包括那些为通过注射,例如皮下,皮内,损害内,静脉内,动脉内,肌肉内,鞘内或腹膜内注射的施用而设计的。对于注射,可以在水溶液中,优选在生理学相容缓冲液诸如汉克斯(hanks)氏溶液,林格(ringer)氏溶液,或生理盐水缓冲液中配制本发明的抗原结合分子。溶液可含有配制用剂,诸如悬浮,稳定和/或分散剂。或者,融合蛋白可处于粉末形式,供在使用前用合适的媒介,例如无菌无热原水建构。根据需要,通过与下文列举的多种其它组分一起以要求的量在适宜的溶剂中掺入本发明的融合蛋白来制备无菌可注射溶液。无菌性可例如通过穿过无菌滤膜过滤而容易地实现。一般地,通过将多种经过灭菌的活性组分掺入含有基础分散介质和/或其它组分的无菌媒介中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液,悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况中,优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术,其自其先前无菌过滤的液体介质产生活性组分加任何另外的想要的组分的粉末。液体介质在必要时应当适当缓冲且在注射前首先用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂变成等张。组合物在制造和贮存条件下必须是稳定的,而且针对微生物,诸如细菌和真菌的污染作用防腐。会领会的是,内毒素污染应当最低限度保持在安全水平,例如小于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受赋形剂包括但不限于:缓冲剂,诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚,丁或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质,诸如血清清蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖,二糖,和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,诸如edta；糖,诸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子,诸如钠；金属复合物(例如zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂,诸如聚乙二醇(peg)。水性注射悬浮液可含有提高悬浮液的粘度的化合物,诸如羧甲基纤维素钠,山梨醇,右旋糖酐,等等。任选地,悬浮液还可含有合适的稳定剂或提高化合物的溶解度以容许制备高度浓缩溶液的药剂。另外,活性化合物的悬浮液可制备为适宜的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油诸如芝麻油,或合成脂肪酸酯,诸如油酸乙酯或甘油三酯,或脂质体。可以将活性组分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶体药物投递系统(例如脂质体,清蛋白微球体,微乳液,纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。此类技术在remington'spharmaceuticalsciences(18thed.mackprintingcompany,1990)中公开。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质,所述基质处于成形物品的形式,例如薄膜,或微胶囊。在特定实施方案中,通过在组合物中使用延迟吸收的药剂,诸如例如单硬脂酸铝,明胶或其组合,可带来延长的可注射组合物的吸收。本文中的例示性药学可接受赋形剂进一步包括间质药物分散剂,诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp),例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白,诸如rhuph20(baxterinternational,inc.)。某些例示性shasegp和使用方法(包括rhuph20)在美国专利公开文本no.2005/0260186和2006/0104968中描述。在一个方面,将shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。例示性冻干抗体配制剂在美国专利no.6,267,958中描述。水性抗体配制剂包括美国专利no.6,171,586和wo2006/044908中描述的那些,后者的配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。在先前描述的组合物以外,活性组分还可配制成贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。如此,例如,融合蛋白可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂,或作为微溶衍生物,例如作为微溶盐配制。包含本发明的活性组分的药用组合物可依靠常规混合,溶解,乳化,封装,包埋或冻干工艺来制造。可以使用推动将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学可接受载剂,稀释剂,赋形剂或助剂以常规方式配制药用组合物。适当的配制剂取决于所选择的施用路径。可以以游离酸或碱,中性或盐形式将本发明的抗体配制成组合物。药学可接受盐是实质性保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐,例如那些与蛋白质性质组合物的游离氨基形成的或那些与无机酸诸如例如盐酸或磷酸,或有机酸诸如乙酸,草酸,酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱,诸如例如氢氧化钠,钾,铵,钙或铁；或有机碱,诸如异丙胺,三甲胺,组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比,药用盐趋于在水性和其它质子溶剂中溶解度更高。在所治疗的特定适应症需要时,本文中的组合物还可含有超过一种活性组分,优选那些具有彼此没有不利影响的互补活性的。此类活性组分以对于预定目的有效的量适当地组合存在。要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可例如通过穿过无菌滤膜过滤而容易地实现。抗fap/抗ox40双特异性抗体和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体的施用可以通过任何合适的手段(包括胃肠外,肺内,和鼻内,及若期望用于局部治疗的话,损伤内施用)来施用抗fap/抗ox40双特异性抗体和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体二者(均称作本文中的物质)。然而,关于通过胃肠外(特别是静脉内)输注施用的治疗剂,本发明的方法是特别有用的。胃肠外输注包括肌肉内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的,剂量给药可以通过任何合适的路径(例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射)来进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表,包括但不限于单次施用或在多个时间点上的多次施用,推注施用,和脉冲输注。在一个实施方案中,胃肠外(特别是静脉内)施用治疗剂。在一个特定实施方案中,通过静脉内输注施用治疗剂。抗fap/抗ox40双特异性抗体和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体二者会以符合优秀医学实践的方式配制,定剂量,和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂投递部位,施用方法,施用日程表,和医学从业人员知道的其它因素。抗fap/抗ox40双特异性抗体和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体二者无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的治疗剂的量,病症或治疗的类型,和上文讨论的其它因素。这些一般以与本文所述相同的剂量和施用路径使用,或以本文所述剂量的约1-99％使用,或以凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。对于预防或治疗疾病,抗fap/抗ox40双特异性抗体和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体(当以其组合或与一种或多种其它另外的治疗剂一起使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型,抗fap/抗ox40双特异性抗体的类型,疾病的严重性和过程,施用这两种药剂是为了预防还是治疗目的,先前的疗法,患者的临床史和对治疗剂的响应,和主治医师的斟酌。每种物质以一次或一系列治疗恰当地施用于患者。取决于疾病的类型和严重性,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的物质可以是对受试者施用的初始候选剂量,例如无论是通过一次或多次分开的施用,还是通过连续输注。取决于上文提到的因素,一个典型的日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用,取决于状况,治疗一般会持续直至发生期望的疾病症状遏制。每种物质的一个例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此,可以对受试者施用约0.5mg/kg,2.0mg/kg,4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量。此类剂量可以间歇施用,例如每周,每两周,或每三周(例如,使得受试者接受约2个至约20个,或例如约6个剂量的治疗剂)。可以施用较高的初始加载剂量,接着是一个或多个较低的剂量,或者较低的初始剂量,接着是一个或多个较高的剂量。一种例示性剂量给药方案包含施用约10mg的初始剂量,接着是约20mg治疗剂的两周一次剂量。然而,其它剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定法来监测。在一个方面,抗fap/抗ox40双特异性抗体和对肿瘤相关抗原特异性的t细胞激活性抗cd3双特异性抗体,特别是抗cea/抗cd3双特异性抗体二者的施用是单次施用。在某些方面,治疗剂的施用是两次或更多次施用。在一个此类方面,每周,每两周,或每三周,特别是每两周施用物质。在一个方面,以治疗有效量施用物质。在一个方面,以约50μg/kg,约100μg/kg,约200μg/kg,约300μg/kg,约400μg/kg,约500μg/kg,约600μg/kg,约700μg/kg,约800μg/kg,约900μg/kg或约1000μg/kg的剂量施用物质。在一个实施方案中,以比抗cea/抗cd3双特异性抗体在不施用抗fap/抗ox40双特异性抗体的相应治疗方案中的剂量要高的剂量施用抗cea/抗cd3双特异性抗体。在一个方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体的施用包含第一剂量的抗cea/抗cd3双特异性抗体的初始施用,和第二剂量的抗cea/抗cd3双特异性抗体的一次或多次后续施用,其中第二剂量比第一剂量要高。在一个方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体的施用包含第一剂量的抗cea/抗cd3双特异性抗体的初始施用,和第二剂量的抗cea/抗cd3双特异性抗体的一次或多次后续施用,其中第一剂量不比第二剂量要低。在一个方面,抗cea/抗cd3双特异性抗体在依照本发明的治疗方案中的施用是该抗cea/抗cd3双特异性抗体对受试者的首次施用(至少在相同治疗过程内)。在一个方面,在施用抗cea/抗cd3双特异性抗体前没有对受试者进行抗fap/抗ox40双特异性抗体的施用。在本发明中,抗cea/抗cd3双特异性抗体和抗fap/抗ox40双特异性抗体的组合可以在疗法中与别的药剂组合使用。例如,可以共施用至少一种另外的治疗剂。在某些方面,另外的治疗剂是免疫治疗剂。在一个方面,抗fap/抗ox40双特异性抗体和抗cea/抗cd3双特异性抗体的组合可以与pd-1轴结合拮抗剂组合使用。在一个方面,pd-1轴结合拮抗剂选自由pd-1结合拮抗剂,pd-l1结合拮抗剂和pd-l2结合拮抗剂组成的组。在一个特定方面,pd-1轴结合拮抗剂是pd-1结合拮抗剂,特别是拮抗性pd-1抗体。在一个方面,pd-1轴结合拮抗剂选自mdx1106(纳武单抗(nivolumab),cas注册号946414-94-4),mk-3475(派姆单抗(pembrolizumab)),ct-011(匹迪单抗(pidilizumab)),medi-0680(amp-514),pdr001,regn2810,和bgb-108。在另一个特定方面,pd-1轴结合拮抗剂是pd-l1结合拮抗剂,特别是拮抗性pd-l1抗体。在一个方面,pd-1轴结合拮抗剂选自mpdl3280a(阿特珠单抗(atezolizumab)),yw243.55.s70,mdx-1105,medi4736(度伐单抗(durvalumab)),和msb0010718c(阿维单抗(avelumab))。在一个方面,pd-l1拮抗性抗体选自由阿特珠单抗,度伐单抗和阿维单抗组成的组。更加特别地,抗fap/抗ox40双特异性抗体和抗cea/抗cd3双特异性抗体的组合可以与mpdl3280a(阿特珠单抗)组合使用。在一些方面,可以以约800mg至约1500mg每三周(例如约1000mg至约1300mg每三周,例如约1100mg至约1200mg每三周)的剂量施用阿特珠单抗。在一个特定方面,以约1200mg每三周的剂量施用阿特珠单抗。选择pd-1轴结合拮抗剂的施用和包含抗cea/抗cd3双特异性抗体和抗fap/抗ox40双特异性抗体的组合疗法的施用之间的时间段和剂量,诸如用以在施用组合疗法前有效收缩受试者中的肿瘤。上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一配制剂或分开的配制剂中),和分开施用,在情况中,治疗剂的施用可以在一种或多种另外的治疗剂的施用之前,同时,和/或之后发生。在一个实施方案中,治疗剂的施用和另外的治疗剂的施用彼此在约1个月内,或在约1,2或3周内,或在约1,2,3,4,5,或6天内发生。治疗方法和组合物识别不同细胞群体上的两种细胞表面蛋白的双特异性抗体持有将细胞毒性免疫细胞重定向来破坏致病性靶细胞的希望。在一个方面,提供的是一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,方法包括对受试者施用有效量的抗fap/抗ox40双特异性抗体和抗cea/抗cd3抗体。在一个此类方面,方法进一步包括对受试者施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在又一些实施方案中,本文中提供了一种用于肿瘤收缩的方法,方法包括对受试者施用有效量的抗fap/抗ox40双特异性抗体和抗cea/抗cd3抗体。依照任何上述方面的“个体”或“受试者”优选是人。在又一些方面,提供了一种包含抗fap/抗ox40双特异性抗体和抗cea/抗cd3抗体的组合物,其用于癌症免疫疗法。在某些实施方案中,提供了一种包含抗fap/抗ox40双特异性抗体和抗cea/抗cd3抗体的组合物,其用于癌症免疫疗法的方法。在又一个方面,本文中提供了包含抗fap/抗ox40双特异性抗体和抗cea/抗cd3抗体的组合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中,药物用于治疗实体瘤。在又一个实施方案中,药物用于肿瘤收缩的方法,方法包括对具有实体瘤的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中,方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在又一个实施方案中,药物用于治疗实体瘤。在一些方面,个体具有cea阳性癌症。在一些方面,cea阳性癌症是结肠癌,肺癌,卵巢癌,胃癌,膀胱癌,胰腺癌,子宫内膜癌,乳腺癌,肾癌,食管癌,或前列腺癌。在一些方面,乳腺癌是乳腺癌或乳腺腺癌。在一些方面,乳腺癌是侵入性导管癌。在一些方面,肺癌是肺腺癌。在一些实施方案中,结肠癌是结肠直肠腺癌。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。上文记录的组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一配制剂或分开的配制剂中),和分开施用,在情况中,本文中报告的抗体的施用可以在一种或多种另外的治疗剂的施用之前,同时,和/或之后发生。在一个方面,抗fap/抗ox40双特异性抗体和抗cea/抗cd3抗体的施用和任选的另外的治疗剂的施用彼此在约1个月内,或在约1,2或3周内,或在约1,2,3,4,5,或6天内发生。可以通过任何合适的手段(包括胃肠外,肺内,和鼻内,及若期望用于局部治疗的话,损伤内施用)来施用本文中报告的抗fap/抗ox40双特异性抗体和抗cea/抗cd3双特异性抗体二者(和任何另外的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的,剂量给药可以通过任何合适的路径(例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射)来进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表,包括但不限于单次施用或在多个时间点上的多次施用,推注施用,和脉冲输注。本文中报告的抗fap/抗ox40双特异性抗体和抗cea/抗cd3双特异性抗体二者会以符合优秀医学实践的方式配制,定剂量,和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂投递部位,施用方法,施用日程表,和医学从业人员知道的其它因素。抗体无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量,病症或治疗的类型,和上文讨论的其它因素。这些一般以与本文所述相同的剂量和施用路径使用,或以本文所述剂量的约1-99％使用,或以凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。制品(试剂盒)在本发明的另一个方面,提供一种试剂盒,其含有对于治疗,预防和/或诊断上文描述的病症有用的材料。试剂盒包含至少一个容器和在容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,iv溶液袋,等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有本身或与另一种组合物组合有效治疗,预防和/或诊断状况的组合物且可具有无菌存取口(例如,容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。在一个方面,试剂盒中的至少两种活性剂是本发明的抗cea/抗cd3双特异性抗体和抗fap/抗ox40双特异性抗体。在一个特定方面,提供的是一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的试剂盒,其包含包装,包含(a)包含作为活性组分的抗fap/抗ox40双特异性抗体和药学可接受赋形剂的第一组合物；(b)包含作为活性组分的抗cea/抗cd3双特异性抗体和药学可接受赋形剂的第二组合物,和(c)关于在组合疗法中使用组合物的用法说明书。在又一个方面,提供的是一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的试剂盒,其包含包装,包含(a)包含作为活性组分的抗fap/抗ox40双特异性抗体和药学可接受赋形剂的第一组合物；(b)包含作为活性组分的抗cea/抗cd3双特异性抗体和药学可接受赋形剂的第二组合物,(c)包含作为活性组分的阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂和药学可接受赋形剂的第三组合物,和(d)关于在组合疗法中使用组合物的用法说明书。标签或包装插页指示组合物如何用于治疗选择的状况及提供关于在组合疗法中使用组合物的用法说明书。此外,试剂盒可包含(a)其中装有组合物的第一容器,其中组合物包含本发明的抗fap/抗ox40双特异性抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器,其中组合物包含本发明的抗cea/抗cd3双特异性抗体。另外,试剂盒可包含一个或多个其中装有能组合使用的别的活性组分的别的容器。本发明的这个实施方案中的制品可进一步包含指示组合物可用于治疗特定状况的包装插页。或者/另外,试剂盒可进一步包含第二(或第三)容器,其包含药学可接受缓冲剂,诸如抑菌性注射用水(bwfi),磷酸盐缓冲盐水,林格(ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料,包括其它缓冲剂,稀释剂,滤器,针,和注射器。表c(序列)关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在kabat,e.a.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中给出。抗体链的氨基酸依照如上文定义的依照kabat的编号系统(kabat,e.a.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))进行编号和提及。实施例下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践各种其它实施方案。重组dna技术使用标准方法来操作dna,如sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在kabat,e.a.etal.,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthed.,nihpublicationno91-3242中给出。dna测序通过双链测序测定dna序列。基因合成想要的基因区段或是使用适宜的模板通过pcr来生成或是由geneartag(regensburg,germany)自合成的寡核苷酸和pcr产物通过自动化基因合成来合成。在确切的基因序列不可得的情况中,基于来自最近同源物的序列设计寡核苷酸引物,并通过rt-pcr自源自适宜组织的rna分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入标准克隆/测序载体。自转化细菌纯化质粒dna并通过uv光谱术测定浓度。通过dna测序确认亚克隆的基因片段的dna序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以容许亚克隆入相应的表达载体。所有构建物均设计成具有编码在真核细胞中将蛋白质靶向分泌的前导肽的5’端dna序列。细胞培养技术使用标准细胞培养技术,如currentprotocolsincellbiology(2000),bonifacino,j.s.,dasso,m.,harford,j.b.,lippincott-schwartz,j.andyamada,k.m.(eds.),johnwiley&sons,inc.中描述的。蛋白质纯化参考标准方案,自经过过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之,将抗体应用于蛋白asepharose柱(gehealthcare)并用pbs清洗。于ph2.8实现抗体的洗脱,继以立即中和样品。在pbs中或在20mm组氨酸,150mmnaclph6.0中通过大小排阻层析术(superdex200,gehealthcare)将聚集的蛋白质与单体抗体分开。合并单体抗体级分,使用例如milliporeamiconultra(30mwco)离心浓缩机浓缩(在需要时),冷冻并贮存于-20℃或-80℃。提供部分样品用于后续蛋白质分析和分析性表征,例如通过sds-page,大小排阻层析术(sec)或质谱术。sds-page依照制造商的说明书使用预制凝胶系统(invitrogen)。特别地,使用10％或4-12％bis-tris预制凝胶(ph6.4)和mes(还原凝胶,具有抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或mops(非还原凝胶)运行缓冲液。分析性大小排阻层析术通过hplc层析术实施大小排阻层析术(sec),用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之,将经过蛋白a纯化的抗体应用于agilenthplc1100系统上的300mmnacl,50mmkh2po4/k2hpo4,ph7.5中的tosohtskgelg3000sw柱或dionexhplc系统上的2xpbs中的superdex200柱(gehealthcare)。通过uv吸光度和峰面积积分量化洗脱的蛋白质。biorad凝胶过滤标准品151-1901充当标准品。质谱术此节描述具有vh/vl交换(vh/vlcrossmab)的多特异性抗体的表征,重点在于它们的正确装配。通过去糖基化的完整crossmab和去糖基化的/纤溶酶消化的或替代地去糖基化的/有限lysc消化的crossmab的电喷雾电离质谱术(esi-ms)分析预期的一级结构。将vh/vlcrossmab以1mg/ml的蛋白质浓度用磷酸盐或tris缓冲液中的n-糖苷酶f于37℃去糖基化多达17小时。纤溶酶或有限lysc(roche)消化用tris缓冲液ph8中的100μg去糖基化的vh/vlcrossmab分别于室温实施120小时和于37℃实施40分钟。质谱术前,将样品在sephadexg25柱(gehealthcare)上经由hplc脱盐。在配备有triversananomate源(advion)的maxis4guhr-qtofms系统(brukerdaltonik)上经由esi-ms测定总质量。使用表面等离振子共振(spr)(biacore)测定多特异性抗体对相应抗原的结合和结合亲和力使用biacore仪器(gehealthcarebiosciencesab,uppsala,sweden)通过表面等离振子共振调查所生成的抗体对相应抗原的结合。简言之,为了亲和力测量,将山羊抗人igg,jir109-005-098抗体经由胺偶联固定化在cm5芯片上,用于呈现针对相应抗原的抗体。于25℃(或替代地于37℃)在hbs缓冲液(hbs-p(10mmhepes,150mmnacl,0.005％吐温20,ph7.4))中测量结合。以溶液中的多种浓度添加抗原(r&dsystems或内部纯化的)。通过80秒至3分钟的抗原注射来测量结合；通过用hbs缓冲液清洗芯片表面3-10分钟来测量解离,并使用1:1朗格缪尔(langmuir)结合模型来估算kd值。自样品曲线减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线),用于修正系统内在基线漂移和用于噪声信号降低。使用相应的biacore评估软件进行传感图的分析和亲和力数据的计算。实施例1抗fap/抗ox40双特异性抗体的制备,纯化和表征如国际专利申请公开号wo2017/055398a2或wo2017/060144a1中所述制备抗fap/抗ox40双特异性抗体。特别地,生成依照wo2017/060144a1的实施例4.4的分子,其拥有对ox40的四价结合和对fap的单价结合。应用节-入-穴技术以容许两条不同重链的装配。4+1格式的双特异性抗体的示意图在图1a中显示。在分子a中,第一重链(hc1)由抗ox40结合物49b4的两个fab单元(vhch1_vhch1),继以通过(g4s)接头融合至抗fap结合物4b9的vh域的fc节链构成。构建物的第二重链(hc2)由抗ox40结合物49b4的两个fab单元(vhch1_vhch1),继以通过(g4s)接头融合至抗fap结合物4b9的vl域的fc穴链构成。分子a(fapox40imab)因而包含包含seqidno:54的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:55的氨基酸序列的第二重链和四次seqidno:56的轻链。与分子a类似地制备分子b,然而用fap结合物28h1替换fap结合物4b9。分子b包含包含seqidno:57的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:58的氨基酸序列的第二重链和四次seqidno:56的轻链。在分子c中,第一重链(hc1)由抗ox40结合物49b4的两个fab单元(vhch1_vhch1),继以通过(g4s)接头融合至抗fap结合物4b9的vl域的fc节链构成。构建物的第二重链(hc2)由抗ox40结合物49b4的两个fab单元(vhch1_vhch1),继以通过(g4s)接头融合至抗fap结合物4b9的vh域的fc穴链构成。分子c包含包含seqidno:59的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:60的氨基酸序列的第二重链和四次seqidno:56的轻链。在所有这些分子中,依照wo2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly,leu234ala和leu235ala突变以消除对fc伽马受体的结合,而在分子d中,使用具有节入穴突变的野生型人igg1fc域。分子d包含包含seqidno:61的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:62的氨基酸序列的第二重链和四次seqidno:56的轻链。分子的生成和表征在wo2017/060144a1中有详细描述。实施例2t细胞双特异性(tcb)抗体的制备,纯化和表征已经依照wo2014/131712a1或wo2016/079076a1中描述的方法制备tcb分子。实验中使用的抗cea/抗cd3双特异性抗体(ceacd3tcb或ceatcb)的制备在wo2014/131712a1的实施例3中描述。ceacd3tcb是一种“2+1iggcrossfab”抗体且由两条不同重链和两条不同轻链构成(它们之一在分子中存在两次)。引入ch3域中的点突变(“节入穴”)以促进两条不同重链的装配。进行cd3结合性fab中vh和vl域的交换以促进两条不同轻链的正确组装。2+1意味着分子具有两个对cea特异性的抗原结合域和一个对cd3特异性的抗原结合域。ceacam5cd3tcb具有相似的格式,但是包含另一个cea结合物且包含cd3结合物中的ch和cl域中的点突变以支持轻链的正确配对。ceacd3tcb包含两次seqidno:87的氨基酸序列的轻链,包含seqidno:88的氨基酸序列的重链,包含seqidno:89的氨基酸序列的重链和包含seqidno:90的氨基酸序列的轻链。2+1格式的双特异性抗体的示意图在图1c中显示。ceacam5cdtcb包含两次seqidno:91的氨基酸序列的轻链,包含seqidno:92的氨基酸序列的重链,包含seqidno:93的氨基酸序列的重链和包含seqidno:94的氨基酸序列的轻链。2+1格式的双特异性抗体的示意图在图1b中显示。实验中使用的抗folr1/抗cd3双特异性抗体(folr1cd3tcb或folr1tcb)的制备在wo2016/079076a1中描述。folr1cd3tcb在wo2016/079076的图1d中显示为“folr1tcb2+1经典的(共同轻链)”且由两条不同重链和三次相同vlcl轻链(共同轻链)构成。引入ch3域中的点突变(“节入穴”)以促进两条不同重链的装配。2+1意味着分子具有两个对folr1特异性的抗原结合域和一个对cd3特异性的抗原结合域。cd3结合物在fab重链的c端融合至fc域的包含节突变的第一亚基的n端。folr1cd3tcb包含包含seqidno:107的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:108的氨基酸序列的第二重链和三次seqidno:109的共同轻链。实施例3人免疫效应细胞的体外共培养物测定法在tcb(ceacd3tcb,ceacam5cd3tcb和folr1cd3tcb)和fapox40imab存在下在用人免疫效应细胞(静息的pbmc,cd4或cd8t细胞),靶抗原阳性肿瘤细胞和fap阳性成纤维细胞的体外共培养物测定法中测试t细胞的免疫功能。所评估的肿瘤细胞系是胃癌细胞系mkn-45,卵巢腺癌细胞系sk-ov-3和宫颈癌细胞系hela。使用经转导而表达人fap的小鼠胚胎成纤维细胞细胞系nih/3t3作为fap阳性成纤维细胞。效应细胞是静息的人pbmc和分离的静息的cd4或cd8t细胞。在一些测定法中,添加tnf-α传感细胞以监测tnf-α诱导。使用肿瘤细胞裂解(动态高含量生命成像,终点流式细胞术),细胞表面激活和成熟标志物表达(终点流式细胞术)和细胞因子分泌(动态高含量生命成像,终点细胞计量珠阵列)来监测受到tcb诱导且受到fapox40imab(分子a)调控的t细胞功能的程度。a)靶细胞系和成纤维细胞sk-ov-3细胞(atcc,目录号htp-77)天然表达叶酸受体。helanlr细胞(essenbioscience,目录号4489)天然表达叶酸受体且mkn45nlr细胞天然表达cea。两种细胞系均包含essencellplayernuclightred慢病毒(essenbioscience,目录号4476；ef1α,嘌呤霉素)以局限于核,稳定表达nuclightred荧光蛋白。这能够容易与非荧光效应t细胞或成纤维细胞分开。由于每个孔测量的红色荧光与红色核和因而健康肿瘤细胞的数目成正比,因此通过高通量生命荧光显微术对肿瘤细胞裂解或增殖的实时评估是可能的。在含有10％胎牛血清(fbs,gibcobylifetechnology,目录号16000-044,批次941273,经伽马照射,无支原体且于56℃热灭活35分钟),1％(v/v)glutamaxi(gibcobylifetechnologies,目录号35050038),和1mm丙酮酸钠(sigma,目录号s8636)的dmem(gibco,目录号42430-082)中培养helanuclightred(nlr)细胞。mkn45nuclightred(nlr)细胞天然表达cea。在含有10％胎牛血清(fbs,gibcobylifetechnology,目录号16000-044,经伽马照射,无支原体且于56℃热灭活35分钟),1％(v/v)glutamaxi(gibcobylifetechnologies,目录号35050038),1mm丙酮酸钠(sigma,目录号s8636)和0.5μg/ml嘌呤霉素(sigma-aldrich,目录号ant-pr-1)的dmem(gibco,目录号42430-082)中培养mkn45nuclightred细胞。遵循制造商的说明书在8μg/mlpolybrene存在下以5的moi(tu/细胞)用essencellplayernuclightred慢病毒试剂(essenbioscience,目录号4476；ef1α,嘌呤霉素)转导mkn-45(dsmz；acc409)以稳定表达局限于核的nuclightred荧光蛋白。这能够容易通过高通量生命荧光显微术与非荧光效应t细胞或成纤维细胞分开及监测肿瘤细胞生长。随时间每个孔的量化如此容许实时评估肿瘤细胞裂解或增殖。由人成纤维细胞激活蛋白(hufap)表达性nih/3t3-hufap克隆19提供fap结合抗体通过细胞表面fap的交联。这种细胞系是如下生成的,即用表达载体petr4921转染小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3细胞系(atcccrl-1658)以表达hufap。在含有10％小牛血清(sigma-aldrich,目录号c8056-500ml,经伽马照射,无支原体且于56℃热灭活35分钟)和1.5μg/ml嘌呤霉素(sigma-aldrich,目录号ant-pr-1)的dmem(gibco,目录号42430-082)中培养细胞。b)效应细胞的制备自苏黎世献血中心获得血沉棕黄层。为了分离新鲜外周血单个核细胞(pbmc),用相同体积的dpbs(gibcobylifetechnologies,目录号14190326)稀释血沉棕黄层。对50ml聚丙烯离心管(tpp,目录号91050)供应15mlhistopaque1077(sigmalifescience,目录号10771,聚蔗糖和泛影酸钠,调节至1.077g/ml的密度)并在histopaque1077上覆盖血沉棕黄层溶液。将管以400xg离心30分钟,室温且低加速且无中断。之后自界面收集pbmc,用dpbs清洗三次并在由供应有10％胎牛血清(fbs,gibcobylifetechnology,目录号16000-044,批号941273,经伽马照射,无支原体且于56℃热灭活35分钟),1％(v/v)glutamaxi(gibcobylifetechnologies,目录号35050038),1mm丙酮酸钠(sigma,目录号s8636),1％(v/v)mem非必需氨基酸(sigma,目录号m7145)和50μmβ-巯基乙醇(sigma,m3148)的rpmi1640培养基(gibcobylifetechnology,目录号42401-042)组成的t细胞培养基中重悬浮。在一些情况中,用fluorobritedmem培养基(gibco,invitrogen,目录号a18967-01)替换rpmi1640以改善高含量生命显微术及降低背景荧光。在分离后直接使用pbmc作为效应细胞(静息的人pbmc)或分别使用未触碰的人cd4+t细胞分离试剂盒(miltenyi,目录号130-096-533)和未触碰的人cd8+t细胞分离试剂盒(miltenyi,目录号130-096-495)依照制造商的说明书分离某些子级分,如静息的cd4t细胞或cd8t细胞。简言之,将人pbmc于4℃以400xg离心8分钟,并用macs缓冲液(pbs+bsa(0.5％v/w,sigma-aldrich,目录号a9418)+edta([2nm],ambion,am9261))清洗一次。用各自提供的链霉亲合素标记的阴性抗体混合物重悬浮团粒并于4℃温育5分钟(每1x107个细胞40μlmacs缓冲液和10μl抗体混合物),继以后续与生物素化磁捕捉珠(每1x107个细胞30μlmacs缓冲液和20μl珠混合物)一起于4℃温育10分钟。使用ls柱(miltenyi,目录号130-042-401)依照制造商的说明书通过磁分离去除经标记的非cd4或非c8t细胞。如上文所述将分别含有未标记的静息的cd4和cd8t细胞的柱流出液离心并用macs缓冲液清洗一次。在基于rpmi1640或fuorobrightdmem的t细胞培养基中将细胞调节至2x106个细胞/ml。c)tnf-α传感细胞tnf-α传感细胞是经编码在nfκb敏感性启动子元件控制下的绿色荧光蛋白(gfp)的报告质粒petr14327转导的hek293t细胞(atcc,目录号xxx)。hek293t细胞天然表达tnf受体,其能受到由激活的t细胞分泌的tnf-α结合。这导致nfκb的剂量依赖性激活和易位至核,这继而打开剂量依赖性gfp生成。gfp荧光可随时间通过高通量生命荧光显微术来量化且如此容许实时评估tnf-α分泌。通过慢病毒转导hek293t细胞(atcc；crl-3216)来生成tnf-α传感细胞系。通过用慢病毒包装质粒和偶联最小巨细胞病毒(mcmv)启动子连同nfκb共有转录响应元件的编码绿色荧光蛋白(gfp)的慢病毒表达载体(petr14372)共转染hek293t细胞来生成基于慢病毒的病毒载体。依照制造商的说明书用lipofectamineltx(lifetechnologies)实施质粒转染入hek293t细胞。在转染前那天用2.5μg质粒dna在接种6x105个细胞/孔的6孔板中进行转染。48小时后收集含有慢病毒载体的上清液并穿过0.45μm孔径聚醚砜膜过滤。为了生成稳定表达细胞系,在6孔板中以1.0x106个细胞/孔接种hek293t细胞并覆盖1ml含有病毒载体的上清液。通过在eppendorf离心机5810台式离心机(eppendorf)中以800xg和于32℃旋转接种30分钟进行转导。通过facs分选(facsaria,becton,dickinsonandcompany)获得tnf-α可诱导细胞克隆。d)细胞毒性和t细胞激活测定法于37℃使用细胞解离缓冲液(invitrogen,目录号13151-014)收获小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3-hufap细胞,tnf-α传感细胞和mkn45nlr细胞达10分钟。将细胞用dpbs清洗一次。使用4500rad的剂量在x射线照射仪中照射tnfα传感细胞或成纤维细胞以防止稍后效应或肿瘤细胞系过度生长。在温箱(heracell150)中于37℃和在5％co2中在无菌96孔平底贴壁组织培养板(tpp,目录号92097)中在t细胞培养基中以0.1x105个细胞每孔的密度将靶细胞系,nih/3t3-hufap和在一些测定法中的tnf-α传感细胞培养过夜。如上文所述制备静息的人pbmc,人cd4t细胞,人cd8t细胞或nlv特异性t细胞并以0.5x105个细胞每孔的密度添加。添加一行连续稀释的tcb(ceacd3tcb或ceacd3tcb(2))和固定浓度的fapox40imab(2nm)至200μl每孔的总体积。在温箱(heracell150)中于37℃和5％co2将细胞共培养长至72小时。在一些测定法中,于37℃和5％co2使用incucytezoom系统(essenbioscience,hd相差,绿色荧光和红色荧光,10倍物镜)通过荧光显微术高含量生命成像以3小时间隔对板监测长至72小时。使用incucytezoom软件量化与nlr+细胞每孔的量成比例的健康肿瘤细胞的积分红色荧光(rcuxμm2/图像)以监测肿瘤细胞生长较之t细胞所致裂解。关于各自时间点和条件将值针对所使用的tcb浓度绘图以分析对t细胞的溶胞潜力的影响。在存在tnf-α传感细胞的一些测定法中,使用incucytezoom软件量化积分绿色rcuxμm2/图像以监测tnf-α诱导的tnf-α传感细胞的gfp生成。关于各自时间点和条件将值针对所使用的tcb浓度绘图以分析t细胞对tnf-α分泌的影响。在72小时后,收集上清液用于后续使用细胞计量珠阵列依照制造商的说明书分析选定的细胞因子。评估的细胞因子是il-2(人il-2cbaflex-set(珠a4),bdbioscience,目录号558270),il-17a(人il-17acbaflex-set(珠b5),bdbioscience,目录号560383),tnf-α(人tnf-αcbaflex-set(珠c4),bdbioscience,目录号560112),ifn-γ(ifn-γcbaflex-set(珠e7),bdbioscience,目录号558269),il-4(人il-4cbaflex-set(珠a5),bdbioscience,目录号558272),il-10(人il-10cbaflex-set(珠b7),bdbioscience,目录号558274)和il-9(人il-9cbaflex-set(珠b6),bdbioscience,目录号558333)。之后,通过与细胞解离缓冲液一起于37℃温育10分钟,继以于4℃以400xg离心,使所有细胞脱离孔。用冰冷的含bsa(0.1％v/w,sigma-aldrich,目录号a9418)的facs缓冲液(dpbs(gibcobylifetechnologies,目录号14190326)清洗团粒。将细胞用荧光染料缀合的抗体抗人cd4(克隆rpa-t4,biolegend,目录号300532),cd8(克隆rpa-t8,biolegend,目录号3010441),cd62l(克隆dreg-56,biolegend,目录号304834),cd127(克隆019d5,biolegend,目录号a019d5),cd134(克隆ber-act35,biolegend,目录号350008),cd137(克隆4b4-1,biolegend,目录号309814),gitr(克隆621,biolegend,目录号3311608)和cd25(克隆m-a251,biolegend,目录号356112)在facs缓冲液中于4℃表面染色20分钟。然后,将它们用facs缓冲液清洗一次,之后在85μl/孔含有0.2μg/mldapi(santacruzbiotec,目录号sc-3598)的facs缓冲液中重悬浮,之后在同一天使用5激光lsr-fortessa(bdbioscience及diva软件)获取它们。对活的cd4和cd8t细胞设门(dapi-,nuclightred-,cd4或cd8+)并计数,关于各自条件将激活标志物(cd134,cd137,gitr,cd25)或成熟标志物(cd127,cd62l)的均值荧光强度(mfi)或阳性细胞的百分比针对所使用的tcb浓度绘图以分析对t激活的影响。结果3.1t细胞双特异性抗体诱导cd8和cd4t细胞上ox40的剂量依赖性上调将不同人免疫效应细胞制备物(静息的pbmc,cd4或cd8t细胞,nlv特异性cd8t效应记忆细胞)与mkn-45nuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的ceacam5cd3tcb存在下共培养48小时。使用incucytezoom系统通过荧光显微术高含量生命成像量化活的肿瘤细胞的量并使用健康肿瘤细胞的积分红色荧光来计算比裂解(图2)。通过流式细胞术对cd4和cd8阳性t细胞评估ox40的表达(图3a-3d)。ceacam5cd3tcb能够在所有使用的免疫效应细胞制备物中诱导mkn45nuclightred细胞裂解,如图2中关于42小时时间点显示的。ec50值和裂解的程度在不同效应细胞制备物之间略微不同,分离的cd8t细胞最高。伴随着肿瘤细胞裂解,t细胞提高激活标志物的表面表达,包括ox40(图3a-3d)。ox40的表面表达在cd4阳性t细胞上最高,但是在cd8阳性t细胞上也以较低程度检测到。ox40表达的程度并不依赖于辅助细胞的存在(pbmc中的表达水平较之cd4或cd8t细胞的分离群体没有差异)。3.2fap靶向性ox40激动剂的存在并不影响t细胞的溶胞潜力接下来,我们评估ox40共刺激对tcb介导的肿瘤细胞裂解的影响。如3.1中描述的,将t细胞与mkn-45nuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的ceacam5cd3tcb存在下分别有或无固定浓度的fapox40imab的情况下共培养48小时。以3小时间隔使用incucytezoom系统通过荧光显微术高含量生命成像量化活的肿瘤细胞的量并使用健康肿瘤细胞的积分红色荧光来计算比裂解。在所有评估的时间点对folr1cd3tcb没有观察到fapox40imab共刺激对肿瘤细胞裂解程度的影响(图4a-4c)。为了更加容易随时间比较,有和无fapox40imab共刺激的情况下为每个时间点计算曲线下面积(auc)并针对时间绘图。在tcb缺失下随着肿瘤细胞增殖auc随时间升高,但是显然没有检测到auc的共刺激依赖性差异。ox40共刺激的存在也既不加速肿瘤细胞裂解也不提高ceacam5cd3tcb所致肿瘤细胞裂解的程度也不降低实现某百分比的肿瘤细胞裂解所必需的tcb浓度(例如ec50值的位移)。这对于所有评估的效应细胞制备物均如此且在图5a-5c中关于42小时时间点例示性显示。使用ceacd3tcb获得类似的发现(数据未显示)。3.3fap靶向性ox40激动剂的存在确实影响细胞因子的分泌在一些测定法中,在上文描述的设置以外培养tnf-α传感细胞。tnf-α传感细胞天然表达tnf-α受体且经在nfκb敏感性启动子元件控制下的gfp遗传修饰。由激活的t细胞分泌的tnf-α的结合导致nfκb的剂量依赖性激活和随后gfp的表达。gfp荧光可随时间通过高通量生命荧光显微术来量化且如此容许实时评估tnf-α分泌。如上文3.1中描述的,cd4t细胞与作为靶细胞的mkn-45nuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起分别在固定浓度的fapox40imab和一行连续稀释的ceacam5cd3tcb,folr1cd3tcb和ceacd3tcb存在下共培养48小时。在tnf-α传感细胞中本tcb所致t细胞的激活导致剂量依赖性的释放tnf-α,这导致剂量依赖性的随时间的gfp荧光升高。另外用fapox40imab共刺激进一步提高激活的t细胞的gfp荧光和如此tnf-α分泌(图6a-6d和7a-7d)。这种效果大多在tcb介导的tnf-α分泌的程度上但并不降低诱导tnf-α分泌的tcb浓度(ec50值的位移)。还有,需要激动性tcr刺激来观察这种对细胞因子分泌的正面影响且在对照tcb处理的样品中没有检测到非特异性tnf-α分泌。为了更加容易随时间比较,有和无ox40共刺激的情况下为每个时间点计算曲线下面积(auc)并针对时间绘图(图8a-8d)。对所有测试的tcb(ceacd3tcb,folr1tcb和ceacam5cd3tcb)和在不同肿瘤细胞系(mkn45nlr,helanlrred,skov-3)存在下观察到升高的auc。在终点(48小时)时使用细胞计量珠阵列系统(bdbioscience)评估所有样品的上清液以量化对超出tnf-α的数种细胞因子的分泌的影响。评估的细胞因子是il-2和tnf-α(作为一般性t细胞激活的标志物),ifn-γ(th1细胞因子),il-4(th2细胞因子),il-9(th9细胞因子)和il-17a(th17细胞因子)(用于监测朝向某种th亚类的分化),和il-10(作为免疫遏制性细胞因子)。在tnf-α之后,本tcb所致t细胞的激活导致所有评估的细胞因子的剂量依赖性释放,即il-2,il-4,ifn-γ,il-17a和il-10(图9a-9d,图10a-10d,图11a-11d和图12a-12d)。当使用相同的靶细胞系时,这种细胞因子释放的程度对于tcb是不同的。自图9a-9d(ceacam5cd3tcb)和图10a-10d(ceacd3tcb)的比较能看到这一点。但是,当使用相同的tcb(folrcd3tcb)时当使用不同靶细胞系时也能观察到差异。图11a-11d显示helanlr细胞的细胞因子释放而在图12a-12d中使用skov-3细胞。另外用fapox40imab共刺激调控剂量依赖性细胞因子分泌的程度,但并不降低细胞因子分泌所需要的tcb阈浓度。其中,观察到促炎性il-2,tnf-α和ifn-γ分泌的升高,其中免疫遏制性il-10的浓度降低。为了更加容易比较,对于tcb高台浓度,相对于无共刺激的样品计算有ox40共刺激的样品中细胞因子浓度的变化(图13)。其中,促炎性il-2,tnf-α和ifn-γ分泌的升高是明显的,其中免疫遏制性il-10的浓度仅仅在一些靶细胞/tcb组合中降低。有具有强剂量依赖性细胞因子分泌的更加有力的t细胞激活也受到ox40共刺激更强调控的趋势可见。尤其是,免疫遏制性il-10释放的降低偶联强t细胞激活。我们还测试ox40共刺激调控静息的cd4和cd8t细胞和静息的人pbmc的细胞因子分泌的能力。如3.1中描述的,将静息的人pbmc,分离的cd4或cd8t细胞与mkn-45nuclightred细胞和经照射的nih/3t3hufap一起在一行连续稀释的ceacam5cd3tcb存在下有或无固定浓度的fapox40imab的情况下共培养72小时。在72小时时如上文所述使用细胞计量珠阵列(cba)评估上清液。ox40共刺激支持静息的人pbmc和还有cd8t细胞(程度较低)中促炎性细胞因子的分泌(剂量依赖性,静息的cd4t细胞见图14a-14h,静息的cd8t细胞见图15a-15h而静息的pbmc见图16a-16h)。最高tcb浓度的比较在图17中显示。对静息的cd8t细胞中的il-2和tnf-α生成显示尤其显著的影响。如此,经由ox40的共刺激在48-72小时体外细胞毒性测定法中并不直接提高t细胞的溶胞潜力,但是它提高分泌细胞因子的能力且调控细胞因子微环境。肿瘤中更加促炎性的细胞因子生境能使肿瘤微环境朝向更多免疫激活性且更少免疫遏制性的状态转变,例如更低水平的il-10和升高浓度的ifn-γ能容许肿瘤中的髓样细胞成熟成th1和细胞毒性t细胞,支持抗原呈递细胞。朝向支持性细胞因子网络的转变会在肿瘤实现逃避免疫控制之前恢复成功且持久的肿瘤细胞消除。与ox40在cd4t细胞上的优先表达一致,与cd8t细胞相比对cd4t细胞上的细胞因子分泌观察到更强的调控。然而,两种细胞类型均受到影响。实施例4在体内fapox40imab和ceacam5tcb的组合疗法4.1方法在下面的实施例中,我们测试tcb和fapox40imab的组合是否在体内导致与各自单一疗法相比卓越的抗肿瘤功效。针对媒介和仅ceacam5cd3tcb处理的仅用ceacam5cd3tcb处理的动物测试作为单一药剂和与人ceacam5cd3tcb(ceacd3tcb(2))组合的人单价fap靶向性,四价ox40双特异性抗体(fapox40imab)。在nog人源化小鼠中与小鼠成纤维细胞细胞系(3t3)一起皮下共移植人胃mkn45癌细胞。4.2细胞系和肿瘤模型人mkn45细胞(人胃癌)最初自atcc获得并在扩充后保藏于glycart内部细胞库。于37℃在水饱和气氛中于5％co2在含有10％fcs的dmem中培养细胞。将体外传代7用于皮下注射,存活力98％。人成纤维细胞nih-3t3最初自atcc获得,在rochenutley改造成表达人fap并在含有10％小牛血清,1x丙酮酸钠和1.5μg/ml嘌呤霉素的dmem中培养。使用克隆39,分别为体外传代编号9(实验1,表1)和7(实验2,表2),分别为存活力98.8％和98.4％。用22g至30g针在麻醉小鼠的体侧中皮下注射与50μlmatrigel混合的50μl细胞悬浮液(1x106个mkn45细胞+1x106个3t3-hufap)。4.3小鼠模型nog雌性小鼠由taconic交付并内部转染人干细胞。依照承诺的准则(gv-solas；felasa；tierschg)以12小时明亮/12小时黑暗的日周期在无特定病原体条件下维持小鼠。实验性研究方案得到当地政府审查和批准(pzh193/2014)。到达后,将动物维持一周以习惯新环境和进行观察。定期进行连续健康监测。4.4实验1的治疗和实验操作作为单一药剂和与人ceacam5cd3tcb的组合测试具有对ox40的四价结合的人单价fap靶向性ox40双特异性抗体(fapox40imab,如实施例1中描述的分子a)。fapox40imab构建物中使用的fap结合物是4b9。在nog人源化小鼠中与小鼠成纤维细胞细胞系(3t3)一起皮下共移植人胃mkn45癌细胞。在细胞注射前7天,对小鼠采血并筛选血液中人t细胞的量。在研究第0天对小鼠皮下注射与1x106个3t3成纤维细胞混合的1x106个mkn45细胞。在整个实验期间每周2至3次用测径器测量肿瘤。在第10天将小鼠针对肿瘤尺寸和人t细胞计数随机化,平均t细胞计数/μl血液为140且平均肿瘤尺寸为170mm3。在随机化那天,对小鼠静脉内注射媒介,ceacam5cd3tcb,fap(4b9)ox40imab或fap(4b9)ox40imab与ceacam5cd3tcb的组合达5周。对所有小鼠静脉内注射200μl适宜溶液。对媒介组中的小鼠注射组氨酸缓冲液而对处理组注射ox40激动性构建物,ceacam5cd3tcb或组合。为了获得每200μl恰当量的化合物,在必要时用组氨酸缓冲液稀释储备溶液。用于ceacam5tcb的剂量和进度表是0.5mg/kg,一次/周而fapox40imab以12.5mg/kg的剂量,一次/周给予。在第一周期间在第一次治疗后10分钟,4小时,72小时和168小时对每组2只小鼠采血以测定化合物的暴露。通过夹心式elisa测量fapox40imab,构建物对人ox40的结合和huch1域的检测。通过夹心式elisa检测ceacam5cd3tcb,tcb对抗cd3-cdr特异性抗体的结合和人fc的检测(见图18a和18b)。在研究第44天终止实验。在pbs中收获肿瘤,血液和脾,生成单细胞悬浮液并针对不同免疫细胞标志物染色并通过facs分析。依照制造商的说明书使用bdpharm裂解缓冲液(bd,目录号555899)于室温实施全血样品的红细胞溶解3分钟。通过脾穿过细胞滤网(尼龙滤器70μm,bdfalcon)的匀浆,继以如上所述的红细胞溶解来分离脾细胞。通过使用gentlemacsdissociator(miltenyi)并将匀浆物用dna酶i([0.025mg/ml],rochediagnostics,目录号11284932001)和胶原酶d([1mg/ml],rochediagnostics,目录号11088882001)于37℃消化30分钟来制备肿瘤单细胞悬浮液。之后,将细胞悬浮液穿过细胞滤网(尼龙滤器70μm,bdfalcon)过滤以去除碎片。用过量的冰冷facs缓冲液清洗所有制备物。在纯化的大鼠抗小鼠cd16/cd32(克隆2.4g2,bd,目录号553142)存在下在facs缓冲液中在黑暗中于4℃将细胞用荧光染料缀合的抗体抗小鼠cd4(克隆gk1.5,biolegend,目录号100422),cd8(克隆53-6.7,biolegend,目录号100730),cd45(克隆30-f11,biolegend,目录号103116),和cd3(克隆145-2c11,biolegend,目录号100351)表面染色30分钟。将样品在含有0.2μg/mldapi(santacruzbiotec,目录号sc-3598)的facs缓冲液中重悬浮,之后在同一天使用5激光lsr-fortessa(bdbioscience及diva软件)获取它们。为各个治疗组对活的cd4和cd8t细胞设门(dapi-,cd45+,cd3+,cd4或cd8+),计算标准化计数(每μl血液,mg脾或mg肿瘤)并将值绘图。表1:体内实验中使用的组合物4.5实验2的治疗和实验操作作为单一药剂和与人ceacam5cd3tcb的组合以3种不同剂量测试人单价抗fap(4b9)/抗ox40双特异性抗体(fapox40imab)。如上文所述在具有人干细胞的nog人源化小鼠中与小鼠成纤维细胞细胞系(3t3)一起皮下共移植人胃mkn45癌细胞。在细胞注射前7天,对小鼠采血并筛选血液中人t细胞的量。在研究第0天对小鼠皮下注射与1x106个3t3成纤维细胞混合的1x106个mkn45细胞。在整个实验期间每周2至3次用测径器测量肿瘤。在第26天,将小鼠针对肿瘤尺寸和人t细胞计数随机化,平均t细胞计数/μl血液为115且平均肿瘤尺寸为490mm3。随机化后1天,对小鼠静脉内注射媒介,ceacam5cd3tcb,fapox40imab或fapox40imab与ceacam5cd3tcb的组合达4周。对所有小鼠静脉内注射200μl适宜溶液。对媒介组中的小鼠注射组氨酸缓冲液并对处理组注射ox40激动性构建物,ceacam5cd3tcb或组合。为了获得每200μl恰当量的化合物,在必要时用组氨酸缓冲液稀释储备溶液。用于ceacam5cd3tcb的剂量和进度表是0.5mg/kg,一次/周而fapox40imab以12.5mg/kg,4.2mg/kg或1.4mg/kg的剂量,一次/周给予。在研究第50天终止实验。在pbs中收获肿瘤,血液和脾,生成单细胞悬浮液并针对不同免疫细胞标志物染色并通过facs分析。在终止时通过流式细胞术分析来自所有剩余小鼠每组的脾和肿瘤。将单细胞悬浮液针对cd45,cd3,cd4和cd8染色并分析细胞的量。将终止时的和实验期间来自动物的部分肿瘤福尔马林固定,之后在石蜡中包埋。将样品切片并针对cd3和cd8染色。冷冻血浆以及部分脾和肿瘤用于经由multiplex的细胞因子分析。将终止时的部分肿瘤福尔马林固定,之后在石蜡中包埋。将样品切片并针对cd3和cd8染色。表2:体内实验中使用的组合物为了测定第一周期间所注射的化合物的药动学概况,在第1次疗法后10分钟,4小时,72小时和7天对每组2只小鼠采血并通过elisa分析所注射的化合物。经由ox40结合来检测ox40imab(a)而经由对抗cd3cdr抗体的结合来检测ceacam5cd3tcb(b)。(a)将生物素化人ox40,测试样品,地高辛配基标记的抗huch1抗体和抗地高辛配基检测抗体(pod)逐步添加至96孔链霉亲合素包被的微量滴定板并在每一个步骤后于室温温育1小时。在每个步骤后将板清洗三次以去除未结合的物质。最后,通过添加abts底物溶液以形成有色反应产物来显现过氧化物酶结合的复合物。于405nm处光度法测定反应产物强度(参照波长为490nm),其与血清样品中的分析物浓度成比例。(b)将生物素化抗hucd3-cdr抗体,测试样品,地高辛配基标记的抗hufc抗体和抗地高辛配基检测抗体(pod)逐步添加至96孔链霉亲合素包被的微量滴定板并在每一个步骤后于室温温育1小时。在每个步骤后将板清洗三次以去除未结合的物质。最后,通过添加abts底物溶液以形成有色反应产物来显现过氧化物酶结合的复合物。于405nm处光度法测定的反应产物强度(参照波长为490nm),其与血清样品中的分析物浓度成比例。4.6肿瘤,脾和血清样品的细胞因子分析在终止时(第50天),最后一次抗体施用后2天,自动物收集血清并收获皮下肿瘤和脾。在研究终止时为全蛋白质分离加工20-30mg速冻脾和肿瘤组织。简言之,通过使用组织裂解系统和不锈钢珠在总体积150μl的裂解缓冲液中将组织样品过筛。通过离心澄清过筛的样品并依照制造商的说明书使用bca蛋白质测定试剂盒(fischerthermoscientific)分析上清液中的全蛋白质内容。使用bio-plex系统遵循制造商的说明书(bio-plexprotm人细胞因子17路测定法,biorad)使用肿瘤和脾裂解物的总共200μg全蛋白质以及1:10稀释的血清样品来分析不同细胞因子/趋化因子。4.7免疫组织化学实施自人源化nog小鼠中的指定处理组衍生的与3t3鼠成纤维细胞一起共移植的人mkn45胃皮下肿瘤的免疫组织化学分析。在终止时,最后一次抗体施用后2天,自动物收获皮下肿瘤,在福尔马林10％(sigma,germany)中固定并稍后为ffpet(leica1020,germany)加工。随后在切片机(leicarm2235,germany)中切出4μm石蜡切片。在leica自动染色仪(leicast5010,germany)中遵循制造商的方案使用抗人cd8(cellmarquecorporation,california)和抗人cd3(thermofischerscientific,usa)实施hucd8和hucd3免疫组织化学。用definiens软件(definiens,germany)实施hucd3和hucd8阳性t细胞的量化。通过单因素anova及多重比较检验分析统计学。4.8实验1的结果在体外实验中可能早就显示fapox40imab能改变t细胞激活状态和细胞因子释放。还确认了ox40的影响似乎在cd4阳性t细胞上比在cd8阳性t细胞上更强。为了测试fapox40imab是否也能在体内将免疫状态改变成更加有益的结局,我们使用将人干细胞转移入免疫缺陷小鼠并因此生成主要由t和b细胞组成的部分人免疫系统的人源化小鼠模型。我们共注射mkn45,cea表达性人胃癌细胞系,和3t3成纤维细胞,这改进肿瘤中的基质成分和fap表达。cea受到ceacam5cd3tcb靶向,交联t细胞与肿瘤细胞并诱导t细胞介导的肿瘤细胞杀伤和t细胞激活。在t细胞激活后,ox40上调。fapox40imab交联fap表达性成纤维细胞和ox40表达性t细胞且因此诱导ox40信号传导。这导致改善的t细胞存活和细胞因子释放。我们在这项研究中能证明fapox40imab和ceacam5cd3tcb的组合疗法导致与单一疗法相比改善的功效。还有,fapox40imab单一疗法显示与媒介相比显著改善的功效。我们评估各个单一疗法和组合组中第一次治疗后ceacam5cd3tcb以及fapox40imab的血清浓度以排除暴露差异作为功效差异的起因。如图18a和18b中显示的,所有构建物的暴露在单一和组合疗法中是相当的。如图19中显示的,fapox40imab单一疗法治疗的动物显示略微延迟的肿瘤进展,ceacam5cd3tcb是更加突出的一个。然而,只有在组合疗法中才实现皮下肿瘤的消退(见表3)。表3:研究第41和43天时的肿瘤生长抑制(tgi)组第41天tgi[％]第43天tgi[％]ceacam5cd3tcb93.692.6fapox40imab55.235.9ceacam5cd3tcb+fapox40imab103.8103.44.9实验2的结果在第二项研究中我们作为单一疗法和与ceacam5cd3tcb(ceacd3tcb(2))的组合测试不同剂量的fapox40imab。此处,我们还延迟治疗的开始,与第一项研究中的170mm3相比,直至我们达到490mm3的中值肿瘤尺寸。所有注射化合物的组显示在不同组之间相当的分子最大浓度,无论ox40靶向性化合物或是tcb。在图20a和20b中显示所注射的化合物在第一周期间的药动学概况。如图21a-21c中描绘的,我们能再次确认组合较之单一疗法卓越的抗肿瘤功效。任何测试剂量的fapox40imab和ceacam5cd3tcb作为单一疗法均不能减缓肿瘤生长的进展,这最有可能是由于治疗开始时就有的可观的肿瘤负担。只有组合治疗在整个研究时间里显著阻止肿瘤生长的进展(表4)。在12.5mg/kgfapox40imab的剂量观察到强烈的延长的功效,然而更低剂量(4.2和1.4mg/kg)仅仅与ceacam5cd3tcb单一疗法相比暂时能够降低进展(图22)。观察到清楚的剂量依赖性。如图20a和20b中显示的,所有构建物的暴露在单一和组合疗法中是相当的。在研究第40和49天计算基于中值的肿瘤生长抑制。值可以在下文表4中找到。表4:在研究第40和49天时的肿瘤生长抑制(tgi)为了为多重比较检验组均值中的显著差异,使用dunnett氏方法自动产生标准方差分析(anova)。dunnett氏方法检验均值是否不同于对照组的均值。表5:p值:使用dunnett氏方法与对照比较(auc＝曲线下面积)流式细胞术(图23a-23d)和组织病理学(图25a和25b)评估显示升高的人白细胞对肿瘤块的浸润。对ceacam5cd3tcb单一疗法早就观察到这一点,但是在ceacam5cd3tcb与4.2或12.5mg/kgfapox40imab的组合中强烈增强。fapox40imab单一疗法本身仅仅最低限度提高肿瘤内白细胞计数。检测到的细胞类型是人cd4以及cd8t细胞,还有非t细胞(例如b细胞或髓样衍生细胞)。有趣的是,与ceacam5cd3tcb单一疗法相比组合疗法中的倍数升高对于cd4t细胞比对于cd8t细胞计数更加突出,这与主要在cd4t细胞上表达的ox40的生物学一致。在外周中没有检测到细胞数的显著改变,强调两种化合物的肿瘤靶向性质(图24a和24b)。我们还评估了脾,血液和肿瘤内细胞因子的浓度(bio-plexprotm人细胞因子17路测定法,biorad)。具有最高抗肿瘤功效的组也显示最大的肿瘤内细胞因子(例如il-6,il-8,ifn-γ,tnf-α,mcp-1,mip-1β)的总体升高(图26a-26c),而且是fapox40imab(12.5mg/kg)和ceacam5cd3tcb的组合。在外周(脾或血液)中没有观察到显著变化。如此,由fapox40imab和ceacam5cd3tcb治疗触发的免疫学变化是肿瘤特异性的,指示人t细胞的交联和激活唯独在cea表达性肿瘤中发生,在cea呈阴性的其它区域,像血液和脾中不发生。我们对于组合治疗的动物进一步发现肿瘤进展和肿瘤内细胞因子浓度的量之间,但非肿瘤内白细胞计数之间的直接负相关(图27a-27f)。存在的细胞因子的量对于所有动物确实也与浸润性白细胞的数目没有严格关联。尤其是,当比较ceacam5cd3tcb单一疗法治疗的动物与组合治疗的动物时,我们观察到相似的白细胞计数并非必然意味着相同的抗肿瘤功效或存在的细胞因子含量。这导致如下假设,即超出仅仅升高的肿瘤内t细胞的数目,肿瘤内t细胞的更高的每细胞功能性和分泌细胞因子的潜力是fapox40imab和ceacam5cd3tcb的组合的增强的抗肿瘤活性的起因。改善的细胞因子环境在介导抗肿瘤功效中发挥主要作用。它能募集更多淋巴细胞至肿瘤,对那些t细胞支持增殖和提高存活并阻止建立遏制和耗竭。我们能显示fapox40imab能够在体外对不同的肿瘤细胞系,效应群体和肿瘤靶物调控tcb介导的细胞因子分泌朝向更多炎性和更少遏制性的。而且,我们还能显示这在模拟人免疫系统的人源化小鼠模型中转化成改善的抗肿瘤功效。实施例5在体内fapox40imab,ceatcb和pd-l1抗体的组合疗法5.1实验规程在下面的实施例中,在人胃mkn45癌症模型中测试浓度为12.5mg/kg与人ceacd3tcb和抗pd-l1抗体(a-pd-l1)组合的人fap靶向性ox40激动剂fapox40imab(fap结合物4b9)。在nsg人源化小鼠中与小鼠成纤维细胞细胞系(3t3)一起皮下共移植mkn45细胞。人mkn45细胞(人胃癌)最初自dsmz获得并在扩充后保藏于glycart内部细胞库。于37℃在水饱和气氛中于5％co2在含有10％fcs的dmem中培养细胞。将体外传代13用于皮下注射,存活力99.1％。人成纤维细胞nih-3t3最初自atcc获得,在hoffmann-larocheinc.改造成表达人fap并在含有10％小牛血清,1x丙酮酸钠和1.5μg/ml嘌呤霉素的dmem中培养。使用克隆39,体外传代编号8且存活力97.6％。用22g至30g针在麻醉小鼠的体侧中皮下注射与50μlmatrigel混合的50μl细胞悬浮液(1x106个mkn45细胞+1x106个3t3-hufap)。依照承诺的准则(gv-solas；felasa；tierschg)以12小时明亮/12小时黑暗的日周期在无特定病原体条件下维持在实验开始时5周龄的nsg雌性小鼠(购自charlesriver)。实验性研究方案得到当地政府当局审查和批准。到达后,将动物维持一周以习惯新环境和进行观察。每天进行连续健康监测。为了人源化,对小鼠注射白消安(20mg/kg),24小时后注射100,000个人hsc(购自stemcelltechnologies)。在细胞注射前7-14天,对小鼠采血并筛选血液中人t细胞的量。将小鼠针对人t细胞随机化,平均t细胞计数/μl血液为131。在研究第0天对小鼠皮下注射与1x106个3t3成纤维细胞混合的1x106个mkn45细胞。在整个实验期间每周2至3次用测径器测量肿瘤。在第17天将小鼠针对肿瘤尺寸随机化,平均肿瘤尺寸为205mm3。在随机化那天,对小鼠每周静脉内注射媒介,ceacd3tcb,ceacd3tcb加a-pd-l1,ceacd3tcb加fapox40imab或ceacd3tcb,a-pd-l1和fapox40imab的三重组合达长至4周。对所有小鼠静脉内注射200μl适宜溶液。对媒介组中的小鼠注射组氨酸缓冲液而对处理组注射ceacd3tcb和ceacd3tcb和/或fapox40imab的组合。为了获得每200μl恰当量的化合物,在必要时用组氨酸缓冲液稀释储备溶液。用于ceacd3tcb的剂量和进度表是2.5mg/kg,两次/周而fapox40imab以12.5mg/kg的剂量而a-pd-l1以10mg/kg的剂量,一次/周给予(表7)。在研究第44天终止实验。由于实验期间健康状态差不得不处死一些小鼠。表6:在第44天活的小鼠组第44天活的小鼠媒介7/9ceacd3tcb5/9ceacd3tcb+fapox40imab5/10ceacd3tcb+a-pd-l13/9ceacd3tcb+fapox40imab+a-pd-l16/10在pbs中收获肿瘤和血液,生成单细胞悬浮液并针对不同免疫细胞标志物染色并通过facs分析。冷冻血浆以及部分肿瘤用于经由multiplex的细胞因子分析。将终止时的部分肿瘤福尔马林固定,之后在石蜡中包埋。将样品切片并针对cd3和cd8染色。表7:体内实验中使用的组合物5.2结果在这项研究中,我们想要首次证明fapox40imab能改善由ceacd3tcb和a-pd-l1的组合介导的功效。a-pd-l1是一种免疫检查点抑制剂且在癌症免疫疗法领域得到公认。a-pd-l1结合物与小鼠pd-l1有交叉反应性且以鼠igg格式生成。ceacd3tcb靶向癌细胞上表达的cea而fapox40imab结合肿瘤基质中的fap表达性成纤维细胞。fapox40imab以12.5mg/kg的剂量每周给予而a-pd-l1以10mg/kg的剂量而ceacd3tcb以2.5mg/kg的剂量每周两次给予。为了测试我们的人构建物,人免疫细胞,特别是t细胞不得不存在于小鼠系统中。为了这个原因,我们使用人源化小鼠,意味着小鼠转移有人干细胞。这些小鼠随时间发生部分人的免疫系统,主要由t和b细胞组成。我们共注射mkn45,cea表达性人胃癌细胞系,和3t3成纤维细胞,这改进肿瘤中的基质成分。cea受到ceacd3tcb靶向,交联t细胞与肿瘤细胞并诱导t细胞介导的肿瘤细胞杀伤和t细胞激活。在t细胞激活后,ox40上调,pd-1也是如此。fapox40imab交联fap表达性基质细胞和ox40表达性t细胞且因此诱导ox40信号传导。这导致t细胞改善的细胞因子分泌,存活和增殖。pd-l1主要由肿瘤细胞表达,阻断pd-l1防止与pd-1表达t细胞交联且因此防止t细胞的pd-1依赖性灭活。我们能在这项研究中显示ceacd3tcb与a-pd-l1和fapox40imab组合介导与媒介组相比改善的就肿瘤生长抑制而言的功效(图28a和28b)。在研究第36,38,41和43天计算基于中值的肿瘤生长抑制。用ceacd3tcb+a-pd-l1+fapox40imab处理的组显示最强的肿瘤生长抑制。表8:第36,38,41和43天时的肿瘤生长抑制(tgi)组第36天第38天第41天第43天ceacd3tcb62.7755.1347.3032.73ceacd3tcb+fapox40imab12.5mg/kg36.7640.6332.9719.48ceacd3tcb+a-pd-l145.9155.3241.3537.60ceacd3tcb+a-pd-l1+fapox40imab81.2882.6371.6159.21考虑直至第43天的曲线下面积(auc),只有ceacd3tcb+a-pd-l1+fapox40imab的组合显著不同于媒介单一疗法。表9:直至第43天的肿瘤体积的单向分析,auc,与媒介比较使用dunnett氏方法与对照的均值比较(sauc)p值对照组＝媒介-ceacd3tcb0.0563ceacd3tcb+fapox40imab0.6395ceacd3tcb+a-pd-l10.1318ceacd3tcb+a-pd-l1+fapox40imab0.0079*表10:第43天的肿瘤体积的单向分析,auc,与媒介比较与媒介相比,所有其它组(单一疗法以及双重疗法)不能显著改善功效。如实施例4中所述研究所注射的化合物在第一周期间的药动学概况。另外,为了检测a-pd-l1,将生物素化抗人fc,pd-l1-hufc,测试样品和多克隆抗鼠igg(hrp)逐步添加至96孔链霉亲合素包被的微量滴定板并在每一个步骤后于室温温育1小时。在每个步骤后将板清洗三次以去除未结合的物质。最后,通过添加abts底物溶液以形成有色反应产物来显现过氧化物酶结合的复合物。于405nm处光度法测定的反应产物强度(参照波长为490nm)与血清样品中的分析物浓度成比例。在第一次和第三次治疗后1小时和72小时对每组2只小鼠采血并通过elisa分析所注射的化合物。所有注射化合物的组均显示在不同组之间相当的分子暴露,无论fapox40imab,ceacd3tcb或是a-pd-l1(见图29a,29b和29c)。三重组合组中通过第44天的ihc(免疫组织化学)的终止时肿瘤中的t细胞浸润与所有其它组相比显著提高(见图30a和30b)。实施例6在体外fapox40imab,ceatcb和pd-l1抗体的组合疗法6.1实验规程在这种测定法中,与如实施例5中描述的相似的对fapox40imab测试它在ceacd3tcb和阿特珠单抗(tecentriq,抗人pd-l1特异性人源化人igg1κ抗体)存在或缺失下激活人pbmc(自血沉棕黄层分离,冷冻并在液氮中保存)的潜力。为了模拟肿瘤环境,将6名不同供体的pbmc与fap表达性nih/3t3-hufap成纤维细胞细胞系和cea表达性mkn45-folr1-pdl1胃癌细胞系一起在2nmfapox40imab和/或100nmceacd3tcb和/或80nm阿特珠单抗存在或缺失下温育4天。为了测定pbmc激活,通过流式细胞术对cd4和cd8t细胞分析增殖(cfse稀释),cd25(il-2rα),4-1bb(cd137),ox-40(cd134),t-bet(t盒转录因子),eomes(eomesodermin),粒酶b,和pd-1表达。通过multiplex对上清液分析ifnγ,tnfα,gm-csf,粒酶b,il-2,il-8和il-10。a)pbmc的制备自苏黎世献血中心获得血沉棕黄层血液。为了分离新鲜外周血单个核细胞(pbmc),用相同体积的dpbs(gibcobylifetechnologies,目录号14190326)稀释血沉棕黄层。对50mlfalcon离心管(tpp,目录号91050)供应15mlhistopaque1077(sigmalifescience,目录号10771,聚蔗糖和泛影酸钠,调节至1.077g/ml的密度)并在15mlhistopaque1077上覆盖血沉棕黄层溶液。将管以400xg离心30分钟,室温且低加速度且无中断。之后自界面收集pbmc,用dpbs清洗三次并在由90％(v/v)胎牛血清(fbs,gibcobylifetechnologies,目录号16000-044,批号941273,经伽马照射,无支原体且于56℃热灭活35分钟)和10％二甲亚砜(sigma,目录号d2650)10％(v/v)组成的t细胞冷冻培养基中重悬浮。将1ml快速转移至无菌冷冻管,转移至冷冻盒并于-80℃保存24小时。之后将管形瓶转移至液氮容器或蒸气相容器。在37℃水浴中融化来自6名供体的管形瓶并在由供应有10％(v/v)胎牛血清(fbs),1％(v/v)glutamaxi,1mm丙酮酸钠(sigma,目录号s8636),1％(v/v)mem非必需氨基酸(sigma,目录号m7145)和50μmβ-巯基乙醇(sigma,m3148)的rpmi1640培养基组成的测定培养基中清洗。融化后让细胞在细胞温箱中于37℃和5％co2静息2小时。对细胞计数,用dpbs清洗并在37℃dpbs中重悬浮至1x106个细胞/ml。添加cfda-se至200nm的终浓度并于37℃温育10分钟。之后添加fbs,清洗细胞并在测定培养基中设置为2x106个细胞/ml。b)靶细胞系用dpbs清洗装有nih/3t3-hufap克隆19的t150烧瓶并于37℃与无酶基于pbs的解离缓冲液一起温育8分钟。收集细胞,清洗,在测定培养基中重悬浮并使用x射线照射仪rs2000照射50gy。将细胞置于测定培养基中至1x106个细胞/ml。用dpbs清洗装有mkn45-folr1-pdl1胃癌细胞系的t150烧瓶并于37℃与无酶基于pbs的解离缓冲液一起温育8分钟。收集细胞,用dpbs清洗并在c稀释剂中重悬浮(至少250μl,8x107个细胞/ml或更低)。对相同量的c稀释剂供应4μl/mlpkh-26染料并充分混合。将这种染料溶液添加至细胞并充分且立即混合。将细胞于室温温育5分钟。之后添加fbs,在测定中清洗细胞,在测定培养基中重悬浮并使用x射线照射仪rs2000(radsource)照射50gy。将细胞置于测定培养基中至1x106个细胞/ml。c)测定法设置对于测试混合物,如下在测定培养基中制备每种成分的主溶液:16nmfapox40imab,800nmceacd3tcb和640nm阿特珠单抗。在96孔圆底组织培养板(ttp,目录号92097)中以50μlpkh-26red标记的mkn45-folr1-pd-l1(10`000个细胞/孔),50μlnih/3t3-hufap克隆19(10`000个细胞/孔),25μl一名供体的pbmc(50`000个细胞/孔),25μl16nmfapox40imab溶液或测定培养基(终浓度2nm),25μl800nmceacd3tcb溶液或测定培养基(终浓度100nm),和25μl640nm阿特珠单抗溶液或测定培养基(终浓度80nm)的量组合细胞和成分。然后将板于37℃和5％co2在增湿细胞温箱中温育4天。4天后,取出50μl上清液并保存于-80℃,稍后用于分析细胞因子含量(见下文)。为了实施t细胞增殖和t细胞激活标志物表面表达的流式细胞术分析,将板离心并用冷的dpbs清洗一次。将样品以等体积分入两块96孔板,用于2个单独的染色小组。对于染色小组1,将细胞在50μl/孔供应有1:800稀释的活/死可固定aqua死细胞染剂的dpbs中于室温(rt)染色15分钟。将细胞用200μl/孔facs缓冲液清洗一次(于4℃以350xg离心4分钟,弹掉)。之后,将它们在25μl/孔由含有抗体抗人cd4(克隆a161a1,biolegend,目录号-357410),cd8(克隆rpa-t8,biolegend,目录号301040),cd25(克隆bc96,biolegend,目录号302636),pd-1(克隆eh12.2h7,biolegend,目录号329920),cd134(克隆ber-act35,biolegend,目录号-350008),cd137(克隆4b4-1,biolegend,目录号-309814)的facs缓冲液构成的染色溶液中重悬浮并于4℃温育20分钟。将细胞用200μl/孔facs缓冲液清洗一次(于4℃以350xg离心4分钟,弹掉)并在120μl/孔facs缓冲液中重悬浮,之后在同一天使用4激光lsrii(bdbioscience及diva软件)获取它们。对于染色小组2,将细胞在50μl/孔供应有1:800稀释的活/死可固定aqua死细胞染剂的dpbs中于室温(rt)染色15分钟并用200μl/孔facs缓冲液清洗一次(于4℃以350xg离心4分钟,弹掉)。在由含有抗体抗人cd4(克隆rpa-t4,biolegend,目录号300558),cd8(sk-1,biolegend,目录号344710),ccr7(克隆g043h7,biolegend,目录号353204),cd45ro(克隆bc96,biolegend,目录号304236)的facs缓冲液构成的25μl/孔染色溶液中重悬浮细胞并于4℃温育20分钟。将细胞用200μl/孔facs缓冲液清洗一次(于4℃以350xg离心4分钟,弹掉)并在100μl/孔foxp3固定/透化工作溶液(通过混合1份foxp3固定/透化浓缩液与3份foxp3透化固定/透化稀释液(foxp3/转录因子染色缓冲液套组,ebiosciences,目录号-005523-00))中于室温重悬浮60分钟。然后将细胞用透化缓冲液工作溶液(通过混合1份透化缓冲液与9份水(foxp3/转录因子染色缓冲液套组,ebiosciences,目录号-005523-00))清洗一次,并在50μl/孔由含有抗体抗人eomes(克隆dan11mag,ebiosciences,目录号-25-4857-80),t-bet(克隆4b10,biolegend,目录号-644815)和粒酶b(克隆gb11,biolegend,目录号515406)的透化缓冲液工作溶液构成的染色溶液中重悬浮,室温40分钟。然后将细胞用200μl/孔透化缓冲液工作溶液清洗两次并在120μl/孔facs缓冲液中重悬浮,之后在同一天使用4激光lsrii(bdbioscience及diva软件)获取它们。使用用于pc的flowjov10.3(flowjollc),microsoftexcel(professionalplus2010)和graphpadprismv6.07(graphpadsoftware,inc)分析数据。对活的cd4和cd8t细胞设门(zombieaqua-,cd4或cd8+)并计数,关于每种条件将激活标志物(cd134,cd137,cd25,pd-1)或成熟标志物(ccr7,cd45ro)或转录因子(t-bet,eomes)或细胞因子(粒酶b)的均值荧光强度(mfi)和阳性细胞的百分比或均值荧光强度(mfi)绘图。为了分析上清液中释放的细胞因子,取出先前的冷冻的样品并依照制造商的说明书使用细胞计量珠阵列分析ifnγ,gm-csf,tnfα,il-2,粒酶b,il-8和il-10。评估的细胞因子是il-2(人il-2cbaflex-set(珠a4),bdbioscience,目录号558270),tnf-α(人tnf-αcbaflex-set(珠c4),bdbioscience,目录号560112),ifn-γ(ifn-γcbaflex-set(珠e7),bdbioscience,目录号558269),il-10(人il-10cbaflex-set(珠b7),bdbioscience,目录号558274),tnf(人tnfcbaflex-set(珠c4),bdbioscience,目录号560112),il-8(人il-8cbaflex-set(珠a9),bdbioscience,目录号558277),粒酶b(人粒酶bcbaflex-set(珠d7),bdbioscience,目录号560304)。6.2结果6.2.1ceacd3tcb和fapox40imab的组合优于与a-pd-l1的组合如图31a和31b中显示的,单独添加100nmceacd3tcb(点线实心柱,实心三角形)但非2nmfapox40imab(空心柱,空心圆形)能提高cd4和cd8t细胞的激活标志物cd25的表达和增殖。如图31a和31b中显示的,与用ceacd3tcb和apd-l1的组合治疗(空心柱,实心黑色圆形)相比,fapox40imab与ceacd3tcb(灰色柱,空心方形)和/或apd-l1(黑色柱,灰色实心方形)的组合导致最高的cd4和cd8t细胞激活和增殖。另外,fapox40imab和ceacd3tcb组合治疗导致cd4t细胞上更高百分比的t细胞转录因子(t-bet)和cd8t细胞上更高的t-bet表达(图32a和32b)。t-bet表达调节t辅助1细胞谱系定型,而且这些结果显示fapox40imab治疗导致驱动th1t细胞应答。进一步如图33a至33d中显示的,fapox40imab和ceacd3tcb治疗的组合导致更高百分比的粒酶b表达性cd4和cd4t细胞,提示更高的t细胞的细胞毒性潜力。实验终点时上清液中细胞因子的分析显示ceacd3tcb和fapox40imab中与ceacd3tcb和apd-l1治疗相比更高量的促炎性细胞因子ifn-γ和粒酶b,然而,由于高供体间变异性,差异不是统计学显著的。总之,ceacd3tcb与fapox40imab的组合导致卓越的cd4和cd8t细胞二者的激活,增殖和th1分化。6.2.2ceacd3tcb,fapox40imab和pd-l1的三重组合导致最高的细胞因子分泌如图34a至34c中显示的,与所有其它治疗组相比,ceacd3tcb,fapox40imab和pd-l1的三重组合(黑色柱,灰色实心方形)是在免疫细胞激活性促炎性细胞因子,诸如ifn-γ,粒酶b和il-8的释放方面最有效的。如图34c中显示的,三重组合治疗还导致cd4和cd8t细胞二者上溶胞酶粒酶b的最高细胞内表达,与我们测量所分泌的细胞因子的结果一致。比较三重组合与ceacd3tcb和apd-l1的组合的细胞因子的倍数升高在图35a至35c中显示。尽管细胞因子分泌的水平在不同供体间有强烈差异,三重组合在大多数测试供体中导致比2高的倍数差异。对il-8和ifnγ观察到最高倍数变化。如图31a和31b中显示的,与ceacd3tcb和fapox40imab组合治疗相比,三重组合(黑色柱,灰色实心圆形)并不导致cd4和cd8t细胞增殖和激活的变化。总之,fapox40imab共刺激在与ceacd3tcb组合时在刺激t细胞激活,增殖和th1谱系促进性转录因子t-bet和粒酶b表达的细胞内表达方面导致较强作用。对此组合添加pd-l1进一步增强cd4和cd8t细胞二者的细胞毒性潜力,如通过升高的细胞内和分泌粒酶b和促炎性细胞因子ifn-γ表达看到的。序列表<110>豪夫迈·罗氏有限公司（f.hoffmann-larocheag）<120>用靶向性ox40激动剂的组合疗法<130>p34512-wo<150>ep171995426<151>2017-11-01<160>146<170>patentinversion3.5<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-h1<400>1sertyralametser15<210>2<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-h2<400>2alaileileglyserglyalaserthrtyrtyralaaspservallys151015gly<210>3<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-h3<400>3glytrppheglyglypheasntyr15<210>4<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-l1<400>4argalaserglnservalserargsertyrleuala1510<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-l2<400>5valglyserargargalathr15<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-l3<400>6glnglnglyilemetleuproprothr15<210>7<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)vh<400>7gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralaileileglyserglyalaserthrtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysglytrppheglyglypheasntyrtrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserser115<210>8<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)vl<400>8gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalthrserser202530tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu354045ileasnvalglyserargargalathrglyileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglnglyilemetleupro859095prothrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>9<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-h1<400>9serhisalametser15<210>10<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-h2<400>10alailetrpalaserglygluglntyrtyralaaspservallysgly151015<210>11<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-h3<400>11glytrpleuglyasnpheasptyr15<210>12<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-l1<400>12argalaserglnservalserargsertyrleuala1510<210>13<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-l2<400>13glyalaserthrargalathr15<210>14<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-l3<400>14glnglnglyglnvalileproprothr15<210>15<211>116<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)vh<400>15gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserserhis202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralailetrpalaserglygluglntyrtyralaaspservallys505560glyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyrleu65707580glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala859095lysglytrpleuglyasnpheasptyrtrpglyglnglythrleuval100105110thrvalserser115<210>16<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)vl<400>16gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrl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