抗-CD3抗体及包含其的用于癌症治疗的药物组合物的制作方法

本发明涉及抗-cd3抗体及包含该抗-cd3抗体的用于治疗癌症的药物组合物。

背景技术：

在各种死亡原因中，由癌症所致的死亡频繁发生，占第二大比例。过去已经进行了各种尝试以治疗癌症。目前，关于用于治疗癌症的治疗方法，已经进行了抗癌剂施用、放射或外科手术。然而，此种治疗方法可能在癌症的早期阶段是有效的，而在末期癌症中当癌症已扩散至其他组织或当癌症复发时疗效不佳。

近些年，关于过继细胞免疫疗法的研究得到关注，其中通过对取自患者外周血的淋巴细胞进行体外大规模培养然后将培养的淋巴细胞重新移植到患者中来治疗癌症。此外，也正在开发这样的技术，其中通过对取自患者外周血的免疫细胞进行体外大规模培养，利用抗原如癌症细胞裂解产物对增殖的免疫细胞进行处理以使免疫细胞被激活，然后将所得的免疫细胞重新施用于所述患者，从而使对癌症细胞具有特异性的毒性t细胞能够除去癌症细胞。

技术问题

进行本发明以解决以上提及的现有技术的问题。本发明的目的是提供对cd3具有高结合亲和力的抗体和使用所述抗体的具有优异癌症治疗效力的药物组合物。

然而，本发明要解决的问题不限于以上提及的问题，并且本领域技术人员根据以下描述将清楚地理解未被提及的其他问题。

问题的解决方案

在本发明的一个方面，提供抗体，所述抗体包含轻链可变结构域(vl结构域)和重链可变结构域(vh结构域)，所述轻链可变结构域(vl结构域)由与seqidno:7、8、15或16的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列组成，所述重链可变结构域(vh结构域)由与seqidno:18至25中任一的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列组成。

在本发明的另一个方面，提供多核苷酸，所述多核苷酸编码所述抗体的轻链可变结构域(vl结构域)和重链可变结构域(vh结构域)。

在本发明的又另一个方面，提供包含所述多核苷酸的表达载体。

在本发明的仍又另一个方面，提供用所述表达载体转化的宿主细胞。

在本发明的仍又另一个方面，提供用于生产特异性结合cd3的抗体的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞。

在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含所述抗体或其片段。

发明的有益效果

由于对cd3的高亲和力和特异性，本发明的抗体可有效用于预防或治疗癌症。

要理解的是，本发明的效果不限于以上描述的效果，并且包括可由在本发明的详细描述或权利要求中描述的本发明的结构推导出的所有效果。

附图说明

图1显示通过分析根据本发明的一个实施方案的抗体对人t细胞的结合亲和力获得的结果。

图2显示通过分析根据本发明的一个实施方案的抗体对猴t细胞的结合亲和力获得的结果。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明。

在本发明的一个方面，提供一种抗体，该抗体包含轻链可变结构域(vl结构域)和重链可变结构域(vh结构域)，所述轻链可变结构域(vl结构域)由与seqidno:7、8、15或16的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列组成，所述重链可变结构域(vh结构域)由与seqidno:18至25中任一的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列组成。

所述轻链可变结构域可由与seqidno:7、8、15或16的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，并且最优选地至少99％同一性的氨基酸序列组成。

此外，所述重链可变结构域可由与seqidno:18至25中任一的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，并且最优选地至少99％同一性的氨基酸序列组成。

包含所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域的所述抗体可以特异性结合分化簇3(cd3)。此处，所述抗体可以具有对人和猴cd3的交叉反应性。即，所述cd3可以包括，但不限于，来源于人的cd3和来源于猴的cd3。

当在本文中使用时，术语"cd3"可以指总体地指代以下各项的概念：存在于动物并且优选地存在于人和猴中的cd3自身，及其任何变体、同种型和旁系同源物。此外，当在本文中使用时，术语"人cd3"是指来源于人的cd3。当在本文中使用时，术语“猴cd3”是指来源于猴的cd3。

当在本文中使用时，术语"抗体"是指与特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白(ig)分子，即，充当特异性识别抗原的受体的蛋白质分子。此外，所述抗体可以是完整抗体或抗体片段。

在轻链和重链可变结构域中，一些氨基酸可以被置换、插入和/或缺失，只要保持与本发明的目的一致的性质如对cd3的亲和力和特异性即可。例如，氨基酸的保守置换可以发生在轻链和/或重链可变结构域中。保守置换是指将原有的氨基酸序列置换为与其具有相似性质的另一种氨基酸残基。

例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸因其具有碱性侧链而具有相似性质，而天冬氨酸和谷氨酸因其具有酸性侧链而具有相似性质。此外，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸因其具有不带电荷的极性侧链而具有相似性质；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸因其具有非极性侧链而具有相似性质；而酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸因其具有芳族侧链而具有相似性质。

因此，对于本领域技术人员来说显而易见的是，如上所述的具有相似性质的氨基酸的组内的氨基酸置换不会导致性质的任何显著变化。由于这个原因，经历了由可变结构域内的保守置换所致的变化的抗体也被包括在本发明的范围内，只要此种抗体保持本发明的抗体的性质即可。

另一方面，所述抗体可以通过与cd3特异性结合而特异性结合t细胞，具体地，特异性结合t细胞的表面。此处，所述t细胞可以包括，但不限于，来源于人的t细胞和来源于猴的t细胞。

即，当所述抗体存在于体内时，此种抗体可以通过与cd3特异性结合来吸引t细胞。因此，被吸引的t细胞可以在其附近诱发免疫应答，并且还可以攻击肿瘤如癌症细胞等。

所述抗体的轻链和重链可变结构域可以由互补决定区(cdr)和框架区(fr)组成。通常，cdr提供对特定抗原的结合特异性，而fr的功能是形成抗体的折叠结构以支持cdr的结合等。

所述抗体可以是保留现有的小鼠抗-cd3抗体sp34的cdr的抗体，其中sp34的恒定结构域(fc)和可变结构域的fr的氨基酸被其人对应物部分或全部替换。

所述抗体可以包含：轻链cdr1，所述轻链cdr1包括seqidno:29的氨基酸序列；轻链cdr2，所述轻链cdr2包括seqidno:30的氨基酸序列；轻链cdr3，所述轻链cdr3包括seqidno:31的氨基酸序列；重链cdr1，所述重链cdr1包括seqidno:32的氨基酸序列；重链cdr2，所述重链cdr2包括seqidno:33的氨基酸序列；和重链cdr3，所述重链cdr3包括seqidno:34的氨基酸序列。

因此，所述抗体可以是特异性结合人cd3的人源化抗体。当在本文中使用时，术语"人源化抗体"是指含有来源于非人抗体，如小鼠抗体的免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体，并且可以指这样的抗体，其中除了对应于高变区的序列以外，所有部分都被其人对应物替换。

此外，术语"高变区(hvr)"是指显示高可变性或在抗体序列中形成结构确定的环的可变结构域的区域。在用于确定其的定义中，根据kabat的互补决定区(cdr)定义最常被用于基于序列可变性来对区域进行分类。

也可以使用所述抗体的抗体片段作为所述抗体，只要所述抗体片段保持所述抗体的功能即可。所述抗体或抗体片段可以包括，但不限于，保持与cd3的结合功能的单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、fab片段、f(ab')2片段、fd、scfv、结构域抗体、微抗体(minibody)、scab、igd抗体、ige抗体、igm抗体、igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体、igg4抗体、抗体恒定结构域的衍生物、基于蛋白质支架(scaffold)的人工抗体等。

同时，所述抗体也可以以通过将所述抗体与具有肿瘤-细胞增殖抑制效力的抗癌药结合而获得的抗体-药物缀合物(adc)的形式使用。当在本文中使用时，术语"抗癌"包括对癌症的"预防"和"治疗"作用，并且"预防"表示抑制或延缓癌症的任何作用。此外，"治疗"表示改善或有益地改变癌症症状的任何作用。

可用于所述抗体-药物缀合物中的药物包括具有细胞毒性或抑制细胞生长效果的任何化合物，以及所述化合物的部分或官能团。药物的实例包括微管蛋白结构形成抑制剂、减数分裂抑制剂、rna聚合酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、dna嵌入剂、dna烷化剂、核糖体抑制剂、mirna、shrna、sirna、放射性同位素和毒素，其中可以使用至少一种化合物。

所述药物可以包括，但不限于：美登醇(maytansinoid)；奥利斯他汀(auristatin)；尾海兔素(dolastatin)；单端孢霉烯(trichothecene)；cc1065(nsc298223)；卡利奇霉素(calicheamicin)；紫杉烷(taxane)；蒽环霉素(anthracycline)；甲氨蝶呤(methotrexate)；阿霉素(adriamycin)；长春地辛(vindesine)；长春花生物碱(长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))；多柔比星(doxorubicin)；美法仑(melphalan)；丝裂霉素c(mitomycinc)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；道诺霉素(daunorubicin)；正定霉素(daunomycin)；依托泊苷(etoposide)；替尼泊苷(teniposide)；洋红霉素(carminomycin)；氨喋呤(aminopterin)；放线菌素d(dactinomycin)；丝裂霉素(mitomycins)；争光霉素(bleomycins)；埃斯培拉霉素(esperamicins)；其他烯二炔抗生素；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)；其他氮芥及其立体异构体、同电子排列体、同系物或衍生物；顺铂(cis-platinum)和顺铂同系物；其他嵌入剂酶及其片段，例如，核酸酶、抗生素、毒素(细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或小分子毒素)；以及各种抗肿瘤或抗癌剂如顺铂(cisplatin)，cpt-11，紫杉醇和多西他赛(docetaxel)。

此外，所述放射性同位素(放射性核素)包括3h、14c、32p、35s、36cl、51cr、57co、58co、59fe、90y、125i、131i、186re等。也可以使用能够抑制特定癌基因表达的microrna(mirna)、sirna、shrna等。

抗-cd3抗体与药物的结合优选地通过使用所述抗体中的氨基酸残基(如赖氨酸或半胱氨酸)的官能团(如硫醇基)的缀合来实现。如有必要，同样可能的是以常用的接头介导的形式进行缀合。也可以使用基于马来酰亚胺或碘乙酰胺的接头。

当将药物与所述抗体或其片段缀合时，从减小对所述抗体或片段与cd3的结合能力及特异性等的影响的角度出发，所述药物可以被缀合至与抗原结合位点相对的c-端位点，诸如此类。当使用完整抗体而不是其片段时，所述药物可以被缀合至fc区。

此外，所述抗体也可以用作含有所述抗体的基于嵌合抗原受体(car)的治疗剂。此种治疗剂的实例优选地包括，但不限于，嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)或嵌合抗原受体自然杀伤细胞(car-nk细胞)治疗剂。

所述抗体也可以以含有抗-cd3抗体的双特异性抗体的形式使用。所述双特异性抗体是具有同时结合两种抗原的能力的抗体，并且通常可以以结合不同抗原的重链和轻链对彼此相连的形式存在。

此外，所述双特异性抗体可以如以下的形式获得：vl和vh经由短接头肽彼此相连的单链抗体片段(scfv's)以scfv1-scfv2(-fc)的形式连接的双特异性单链抗体、基于单结构域抗体(sdab)的使用vh的双抗体、和使用来自德国micromet的bite技术(参见http://www.micromet.de)产生的双特异性抗体。

所述双特异性抗体可以以这样的形式存在，其中抗-cd3抗体与对免疫有效细胞特异性靶分子具有结合能力的抗体或其片段结合。所述免疫有效细胞特异性靶分子可以优选地选自，但不限于：tcr/cd3、cd16(fcγriiia)、cd44、cd56、cd69、cd64(fcγri)、cd89和cd11b/cd18(cr3)。

在本发明的另一方面，提供编码根据本发明的抗体的轻链可变结构域(vl结构域)和重链可变结构域(vh结构域)的多核苷酸以及包含其的表达载体。

本领域技术人员可以从抗-cd3抗体的氨基酸序列轻易推导出编码所述抗体或抗体片段的重链可变结构域的多核苷酸，即，基因。

当在本文中使用时，术语"表达载体"是指能够在宿主细胞中表达靶蛋白的重组载体，并且表示含有与其可操作相连的必要调控元件从而表达插入的基因的基因构建体。编码抗-cd3抗体的基因可以被插入到单独的载体中，也可以以被插入到相同载体中的形式使用。

具体地，编码抗-cd3抗体的氨基酸序列的多核苷酸可以以被插入到单独的或相同的载体中的形式使用，并且编码重链或其可变结构域的多核苷酸可以以被插入到单独的或相同的载体中的形式使用。

当在本文中使用时，术语"可操作相连"意味着核酸表达调控序列和编码所需的蛋白质的核酸序列功能相连从而执行所需的功能。与重组载体的可操作连接可以使用本领域中熟知的基因重组技术来实现，并且位点特异性dna剪切和连接可以使用本领域中普遍知道的酶等容易地实现。

除了表达调控元件如启动子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号和增强子，适用于生产抗-cd3抗体的表达载体还可以含有用于膜靶向或分泌的信号序列。起始密码子和终止密码子通常被认为是编码免疫原性靶蛋白的核苷酸序列的一部分。此种密码子在施用基因构建体时在受试者中必须是有功能的并且必须与编码序列同框。通常，启动子可以是组成型的或诱导型的。所述启动子可以包括，但不限于：原核启动子，如lac、tac、t3和t7；猿病毒40(sv40)启动子；小鼠乳腺瘤病毒(mmtv)启动子；人免疫缺陷病毒(hiv)启动子，例如，hiv的长端重复(ltr)启动子；莫洛尼病毒(moloneyvirus)启动子；巨细胞病毒(cmv)启动子；epsteinbar病毒(ebv)启动子；劳斯氏肉瘤病毒(roussarcomavirus)(rsv)启动子；以及β-肌动蛋白启动子，来源于人血红蛋白、人肌肉肌酸、人金属硫蛋白的真核启动子等。

所述表达载体还可以含有选择性标志物，所述选择性标志物允许选择含有该所述表达载体的宿主细胞。所述选择性标志物用于选择用所述载体转化的细胞。对于选择性标志物，可以使用赋予以下选择性表型的标志物：如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性或表面蛋白质的表达。在用选择剂处理的环境中，仅表达选择性标志物的细胞存活，这允许对转化的细胞进行选择。此外，当载体是可复制的表达载体时，此种载体可以含有复制起点，所述复制起点是复制自其开始的特定核酸序列。

作为用于插入外源基因的重组表达载体，可以使用各种形式的载体如质粒、病毒和粘粒。重组载体的类型不受特别限制，只要所述载体具有在包括原核和/或真核细胞在内的各种宿主细胞中表达所需的基因并生产所需的蛋白质的功能即可。优选地，所述载体可以是在具有具备强活性和强表达能力的启动子时能够以与其自然状态相似的形式生产大量外源蛋白质的载体。

各种表达宿主/载体组合可被用于表达抗-cd3抗体。适用于真核宿主的表达载体包括，但不限于：来源于sv40的表达调控序列、牛乳头瘤病毒，腺病毒，腺相关病毒，巨细胞病毒和反转录病毒。可用于细菌宿主中的表达载体包括：自大肠杆菌(escherichiacoli)获得的细菌质粒，如pet、prset、pbluescript、pgex2t、puc载体、cole1、pcr1、pbr322、pmb9及其衍生物；宿主范围广泛的质粒如rp4；可以多种噬菌体λ衍生物如λgt10、λgt11和nm989作为示例的噬菌体dna；以及其他dna噬菌体如m13和丝状单链dna噬菌体。可用于酵母细胞的表达载体可以包括2-微米质粒及其衍生物。可用于昆虫细胞的载体可以是pvl941。

在本发明的又另一个方面，提供用根据本发明的表达载体转化的宿主细胞。所述表达载体可以被插入到宿主细胞中以形成转化株。适用于所述载体的宿主细胞可以包括原核细胞，如大肠杆菌(escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、链霉菌属(streptomycessp.)、假单胞菌属(pseudomonassp.)、奇异变形杆菌(proteusmirabilis)或葡萄球菌属(staphylococcussp.)。此外，所述宿主细胞可以包括真核细胞，包括来源于：真菌如曲霉属(aspergillussp.)，酵母如毕赤酵母(pichiapastoris)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母属(schizosaccharomycessp.)和粗糙脉孢菌(neurosporacrassa)的低等真核细胞；和其他低等真核细胞，以及高等真核细胞如昆虫细胞。此外，所述宿主细胞也可以来源于植物或哺乳动物。优选地，可以使用的宿主细胞包括，但不限于：猴肾细胞(cos7细胞)、nso细胞(小鼠来源的骨髓瘤细胞)、sp2/0细胞(小鼠来源的骨髓瘤细胞)、其他骨髓瘤细胞系、中国仓鼠卵(cho)细胞、w138细胞(二倍体人细胞培养物)、幼仓鼠肾(bhk)细胞、mdck、hut78细胞、hek293细胞等，其中cho细胞是优选的。

当在本文中使用时，术语"转化到宿主细胞中"意在包括用于将核酸引入到生物体、细胞、组织或器官中的任何方法，并且此种转化可以使用根据宿主细胞类型选择的本领域中已知的标准技术进行。具体地，可以使用：电穿孔；原生质体融合；磷酸钙(capo4)沉淀；氯化钙(cacl2)沉淀；使用碳化硅纤维搅动；土壤杆菌介导的转化；peg、硫酸葡聚糖、lipofectamine或干燥/抑制介导的转化等。然而，本发明不限于此。

在本发明的仍又另一个方面，提供用于生产特异性结合cd3的抗体的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞。具体地，所述用于生产抗体的方法可以包括以下步骤：将编码抗-cd3抗体的核苷酸序列插入载体中以构建重组载体；用重组载体转化宿主细胞并且进行培养；并且包括从培养的转化株分离和纯化人源化抗体的步骤。

所述人源化抗体可以通过在营养培养基中培养其中表达重组载体的转化株而大量生产，并且培养基和培养条件可以根据宿主细胞的类型适当地选自本领域中已知的那些。在培养期间，可以适当地调整条件如温度、培养基的ph以及培养时间以适合细胞生长和蛋白质的大量生产。

如上所述的重组生产的抗-cd3抗体可以从培养基或细胞裂解产物回收。当所述抗体是与膜结合的形式时，可以使用合适的表面活性剂溶液(例如，triton-x100)或通过酶切将此种抗体从膜上释放。可以通过各种物理和化学手段如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂来分解用于表达人源化抗体的细胞，并且可以使用常规生化分离技术进行分离和纯化。可以使用的生化分离技术包括，但不限于，电泳、离心、凝胶过滤、沉淀、透析、色谱法(离子交换色谱法、亲和色谱法、免疫吸附色谱法、尺寸排阻色谱法等)、等电聚焦等。

在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的抗体或其片段。

可以用所述药物组合物治疗的癌症的类型可以包括实体癌和血液癌两者，并且优选地可以包括表达cd3的任何癌症。此处，所述抗体可以通过与cd3的特异性结合来吸引t细胞，并且因此诱发癌症细胞的死亡。

具体地，所述癌症可以是，但不限于：胰腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结直肠癌、直肠癌、甲状腺癌、食管癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌、血癌、皮肤癌、上皮癌、脑癌、中枢神经系统癌或卵巢癌。

所述药物组合物还可以包含药学可接受的载体。作为药学可接受的载体，粘合剂、助滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、色素、调味剂等可以用于口服施用；缓冲剂、防腐剂、疼痛缓解剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等可以混合使用以用于注射剂；并且基料(base)、赋形剂、润滑剂、防腐剂等可以用于局部施用。

本发明的药物组合物的制剂可以以各种方式通过与如上所述的药学可接受的载体混合来制备。例如，对于口服施用，所述药物组合物可以被配制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆、圆片剂(wafer)等的形式。对于注射剂，所述药物组合物可以被配制成单位剂量安瓿的形式或多剂量形式。

此外，所述药物组合物可以含有可以提高膜渗透性的表面活性剂。这些表面活性剂可以衍生自甾体或可以包括阳离子脂质如n-[1-(2,3-二油酰基)丙基-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)，或各种化合物如胆固醇琥珀酸单酯和磷脂酰甘油。然而，所述表面活性剂不限于此。

在本发明的仍又另一个方面，提供用于治疗癌症或抑制癌症生长的方法，所述方法包括向受试者施用所述药物组合物。可以以药学有效量施用包含所述抗-cd3抗体的所述药物组合物以治疗癌症细胞或其转移或抑制癌症生长。所述有效量可以根据各种因素如癌症类型，患者的年龄、体重，症状的性质和严重性，目前疗法的类型，治疗的数量，剂型以及施用途径而变化，并且可以由相应领域的专家容易地确定。

所述药物组合物可以与以上提及的药学或生理学组分一起或顺序施用，并且也可以与额外的常规治疗剂组合施用，在此种情况下，所述药物组合物可以与常规治疗剂顺序或同时施用。此种施用可以是单次或多次施用。考虑到所有以上因素，重要的是，施用的量是最小量并且允许获得最大效果而没有副作用，并且此种量可以由本领域技术人员容易地确定。

当在本文中使用时，术语"受试者"是指患有可以通过施用所述药物组合物而减轻、抑制或治疗的病症或疾病或处于可以通过施用所述药物组合物而减轻、抑制或治疗的病症或疾病的风险中的哺乳动物，优选是人。

当在本文中使用时，术语"施用"表示以任何合适的方式将预定的物质引入受试者中，并且所述药物组合物可以经由任何途径施用，只要所述途径允许所述药物组合物到达靶组织。此种施用方法可以包括，但不限于：腹膜内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺部施用或直肠施用。此处，在口服施用的情况下，从消化蛋白质的角度出发，理想的可能是将用于口服施用的组合物配制成使得活性剂被包被或所述组合物免于在胃中消化。此外，所述药物组合物可以通过任何使得活性成分能够迁移至其靶细胞的设备来施用。

在本发明的仍又另一个方面，提供本发明的抗体用于预防或治疗癌症的用途。

在本发明的仍又另一个方面，提供本发明的抗体用于制备用于预防或治疗癌症的药物的用途。

在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的抗体。

实施发明的最佳方式

下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。以下实施例出于说明本发明的目的而描述，并且本发明的范围不限于此。

实施例1.生产人源化抗-cd3抗体候选物

实施例1.1.选择用于人源化的候选抗体

将已知作为抗-cd3抗体的小鼠sp34的轻链可变结构域(vl结构域)和重链可变结构域(vh结构域)的氨基酸序列输入基于网络的数据库(igblast)，然后搜索最相似的人胚胎抗体序列。结果，在小鼠sp34的轻链可变区和智人(homosapiens)iglv7-46*01(imgt基因名称)之间，并且在小鼠sp34的重链可变结构域和智人(homosapiens)ighv3-73*02(imgt基因名称)之间显示出最高的氨基酸序列相似性。

实施例1.2.轻链可变结构域的人源化

将具有与sp34的轻链可变结构域最相似的序列的人胚胎抗体智人iglv7-46*01(imgt基因名称)的cdr氨基酸序列替换为小鼠sp34的cdr序列，从而制备部分人源化的sp34的轻链可变结构域。

为了增强部分人源化的sp34的轻链可变结构域的抗原结合性质，将框架区(fr)序列中被认为在抗原结合性质方面发挥重要功能的氨基酸残基替换为与小鼠sp34相同的氨基酸残基。由此制备的人源化的sp34的轻链可变结构域的氨基酸序列显示在以下表1中。

参见表1，对小鼠sp34的轻链可变结构域的氨基酸残基38、48、51和71进行随机修饰，以制备总计16种人源化的sp34的轻链可变结构域。此处，小鼠sp34的轻链可变结构域被用作对照以比较对cd3抗原的亲和力。

[表1]

实施例1.3.重链可变结构域的人源化

将具有与sp34的重链可变结构域最相似的序列的人胚胎抗体智人iglv3-73*02(imgt基因名称)的cdr氨基酸序列替换为小鼠sp34的cdr序列，从而制备部分人源化的sp34的重链可变结构域。

为了增强部分人源化的sp34的重链可变结构域的抗原结合性质，将框架区(fr)序列中被认为在抗原结合性质方面发挥重要功能的氨基酸残基替换为与小鼠sp34相同的氨基酸残基。由此制备的人源化的sp34的重链可变结构域的氨基酸序列显示在以下表2中。

参见表2，对小鼠sp34的重链可变结构域的氨基酸残基49、78、79和81进行随机修饰，以制备总计8种人源化的sp34的重链可变结构域。此处，小鼠sp34的重链可变结构域被用作对照以比较对cd3抗原的亲和力。

[表2]

实施例1.4.人源化抗-cd3抗体候选物的克隆

将如以上制备的16种轻链可变结构域的各基因插入含有λ轻链恒定结构域(λ-cl)的pcdna3.4动物细胞表达载体中，并且将8种重链可变结构域的各基因插入含有igg1恒定结构域(ch1、铰链、ch2、ch3)的pcdna3.4动物细胞表达载体中。

λ轻链恒定结构域和igg1重链恒定结构域的各自的具体氨基酸序列显示在以下表3中。

[表3]

实施例1.5.人源化抗-cd3抗体候选物的转染

转染前24小时，利用expi293培养基以125±10rpm在振荡培养箱中在37℃和8％co2的条件下将expi293f细胞以2.0×10⁶细胞/ml的密度传代。在进行转染时，测量细胞数量和细胞活力以确定是否展示95％或更高的细胞活力。

将所述细胞以7.5×10⁷个细胞分配在125ml培养瓶中，然后添加expi293培养基以调节终体积至25ml(基于30ml)。使用opti-memi培养基，将30μg的抗体表达载体与其混合至总计1.5ml并且在室温进行孵育达5分钟。对于抗体载体，使用通过组合8种重链可变结构域的表达载体和16种轻链可变结构域的表达载体获得的总计128种人源化sp34igg1抗体。小鼠人嵌合sp34igg1抗体被用作对照抗体载体。具体的抗体组合显示在以下表4中。

[表4]

使用opti-memi培养基，将80μl转染试剂与其混合至总计1.5ml，并且在室温进行孵育达5分钟。将分别含有载体和转染试剂的opti-memi培养基轻轻混合并允许在室温反应20分钟。然后，将所得物置于含有expi293f细胞的烧瓶中。以125±10rpm在振荡培养箱中在37℃和8％co2的条件下进行孵育达16至20小时。然后，向其添加1.5ml的转染增强剂i和150μl的转染增强剂ii，并且进行孵育达6天以获得候选抗体。

实施例1.6.抗体纯化

将孵育物以4,000rpm离心30分钟，通过0.22μm过滤器过滤，然后将细胞碎片除去以获得上清。向柱中加入0.2ml的mabselectxtra树脂，并且使用体积相当于10倍树脂体积的蛋白a结合缓冲液进行平衡。

随后，依靠重力将所述上清上样到所述柱上。在完成上样后，使用体积相当于10倍树脂体积的蛋白a结合缓冲液洗涤所述柱。

随后，向所述柱加入igg洗脱缓冲液并且进行洗脱。通过每1ml洗脱液加入25μl的1.5mtris-cl将洗脱液中和。然后，以280nm的od测量洗脱液浓度。利用pbs经由透析对已经测量了浓度的洗脱液进行缓冲液交换。

实施例2.选择人源化抗-cd3抗体

将酶联免疫吸附测定(elisa)用于在总计128种抗-cd3抗体(sp34)组合中选择对人cd3和猴cd3显示亲和力的抗体。

具体地，将人或食蟹猴重组cd3ε/δ异二聚体稀释在包被缓冲液中并用于处理96孔板。将所述平板在4℃储存12小时或更长时间。随后，将所述缓冲液除去并利用1％牛血清清蛋白(bsa)/pbs溶液在室温进行处理达1小时。接着，将溶液去除。然后用表达抗体的培养物溶液处理重组cd3包被的孔达约1小时。

将所述孔用0.05％tween20/pbs溶液洗涤，接着，利用稀释在1％bsa/pbs溶液中的缀合有辣根过氧化物酶的人igg抗体在室温进行处理达1小时。然后，除去所述溶液并且将所述孔用0.05％tween20/pbs溶液洗涤。

将tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液用于处理96孔板，并将96孔板在室温静置30分钟。然后，用终止溶液进行处理，并且立即在450nm的吸收波长测定显色程度。在人源化sp34抗体候选物中，仅那些显色的样品是保持小鼠sp34抗体对cd3的亲和力的克隆。通过亲和力测量获得的具体结果显示在以下表5中。

[表5]

如以上表5中的结果所见，24种克隆，a7、a8、a15、a16、b7、b8、b15、b16、c7、c8、c15、c16、d7、d8、d15、d16、e15、e16、f15、f16、g15、g16、h15和h16显示出保持对人cd3和猴cd3的亲和力。因此，选择这24种克隆作为人源化抗-cd3抗体(sp34)。

实施例3.测量人源化抗-cd3抗体对重组cd3的亲和力

将octet系统用于测量根据实施例2选择的人源化抗-cd3抗体(sp34)对重组cd3的亲和力。

具体地，以5μg/ml的浓度在1×动态缓冲液中制备人或猴重组cd3ε/δ并用于以200μl/孔处理96孔板。将处理后的cd3ε/δ固定至抗-五his(his1k，cat#18-5121，fortebio)传感器。

以50nm的浓度在1×动态缓冲液中制备在elisa结果中显示对人或猴重组cd3ε/δ的结合亲和力的克隆，并且以200μl/孔用该克隆进行处理。通过用pbs将10×动态缓冲液(fortebio，cat#18-1092)稀释10倍获得1×动态缓冲液并使用。

分析固定至传感器的cd3ε/δ和浓度为50nm的抗体之间的相互作用以计算抗原-抗体亲和力，并且结果显示在以下表6中。

[表6]

如由表6中的结果可见，确定的是，所有克隆对人和猴cd3ε/δ都显示优异的亲和力；并且其中，克隆a15、b15、c15、d15、a16、b16、c16和d16显示出最佳的亲和力。

实施例4.测量人源化抗-cd3抗体对人t细胞的亲和力

使用流式细胞术来测量根据实施例2选择的人源化抗-cd3抗体(sp34)对人t细胞的亲和力。

具体地，每个抗体样品以2×10⁵个细胞在100μlfacs缓冲液(1％fbs/facssheath)中制备h9htb-176tm)细胞，然后使用1μg的抗体来处理细胞。将所得物在4℃避光储存25分钟。随后，用3ml的facs缓冲液进行处理，并且以2,000rpm进行3分钟离心。然后，丢弃上清。

接下来，使用含有1μg的藻红蛋白(pe)缀合的人igg抗体的100μlfacs缓冲液来处理细胞，并将所得物在4℃避光储存25分钟。随后，用3ml的facs缓冲液进行处理，并且以2,000rpm进行3分钟离心。然后，丢弃上清。

将细胞用4％甲醛溶液处理，在4℃避光储存30分钟，然后用3mlfacs缓冲液处理。以2,000rpm进行3分钟离心，然后丢弃上清。用350μlfacs缓冲液进行处理，并使用流式细胞仪来进行所述抗体对人t细胞的亲和力分析。分析结果显示在图1中。

参见图1，发现与人重组cd3ε/δ结合的所有抗体也特异性结合人t细胞。

实施例5.测量人源化抗-cd3抗体对猴t细胞的亲和力

使用流式细胞术来测量根据实施例2选择的人源化抗-cd3抗体(sp34)对猴t细胞的亲和力。

具体地，每个抗体样品以10⁶个细胞在100μlfacs溶液中制备猴脾细胞，然后使用1μg的抗体来处理细胞。将所得物在4℃避光储存25分钟。随后，用3ml的facs缓冲液进行处理，并且以2,000rpm进行3分钟离心。然后，丢弃上清。

接下来，用含有1μg的pe缀合的人igg抗体的100μlfacs缓冲液来处理细胞，并将所得物在4℃避光储存25分钟。随后，用3ml的facs缓冲液进行处理，并且以2,000rpm进行3分钟离心。然后，丢弃上清。

用fitc缀合的抗-cd20抗体、pe-cy5缀合的抗-cd14抗体、pe-cy5缀合的抗7-aad抗体、apc-cy7缀合的抗-cd16抗体或v450缀合的抗-cd45抗体处理细胞，并将所得物在4℃避光储存25分钟。随后，用3ml的facs缓冲液进行处理，并且以2,000rpm进行3分钟离心。然后，丢弃上清。

将细胞用4％甲醛溶液处理，在4℃避光储存30分钟，然后用3mlfacs缓冲液处理。以2,000rpm进行3分钟离心，然后丢弃上清。用350μlfacs缓冲液进行处理，并使用流式细胞仪来进行所述抗体对人t细胞的亲和力分析。分析结果显示在图2中。

参见图2，发现与猴重组cd3ε/δ结合的所有抗体也特异性结合猴t细胞。

虽然已经通过如上所述的有限数目的实施例和附图描述了实施方案，对于本领域技术人员来说明显的是，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变和改进。例如，可能的是即使在以与所述方法不同的次序进行如所述的技术和/或以与所述方法不同的形式装配或组合如所述的组分或用其他组分或等效物替换或取代如所述的组分的情况下仍然实现所需的结果。

因此，其他实现方案、其他实施方案以及所附权利要求的等效物落在所附权利要求的范围内。

序列表

<110>株式会社绿十字

财团法人牧岩生命科学研究所

<120>抗-cd3抗体及包含其的用于癌症治疗的药物组合物

<130>pcb810112gcc

<160>34

<170>kopatentin3.0

<210>1

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-1克隆

<400>1

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrppheglnglnlysproglyglnalaproargthr

354045

leuiletyrglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyglylysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>2

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-2克隆

<400>2

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrppheglnglnlysproglyglnalaproargthr

354045

leuiletyrglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyasplysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>3

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-3克隆

<400>3

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrppheglnglnlysproglyglnalaproargthr

354045

leuileglyglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyglylysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>4

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-4克隆

<400>4

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrppheglnglnlysproglyglnalaproargthr

354045

leuileglyglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyasplysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>5

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-5克隆

<400>5

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrppheglnglnlysproglyglnalaproarggly

354045

leuiletyrglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyglylysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>6

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-6克隆

<400>6

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrppheglnglnlysproglyglnalaproarggly

354045

leuiletyrglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyasplysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>7

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-7克隆

<400>7

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrppheglnglnlysproglyglnalaproarggly

354045

leuileglyglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyglylysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>8

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-8克隆

<400>8

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrppheglnglnlysproglyglnalaproarggly

354045

leuileglyglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyasplysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>9

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-9克隆

<400>9

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrpvalglnglnlysproglyglnalaproargthr

354045

leuiletyrglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyglylysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>10

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-10克隆

<400>10

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrpvalglnglnlysproglyglnalaproargthr

354045

leuiletyrglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyasplysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>11

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-11克隆

<400>11

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrpvalglnglnlysproglyglnalaproargthr

354045

leuileglyglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyglylysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>12

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-12克隆

<400>12

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrpvalglnglnlysproglyglnalaproargthr

354045

leuileglyglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyasplysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>13

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-13克隆

<400>13

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrpvalglnglnlysproglyglnalaproarggly

354045

leuiletyrglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyglylysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>14

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-14克隆

<400>14

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrpvalglnglnlysproglyglnalaproarggly

354045

leuiletyrglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyasplysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>15

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-15克隆

<400>15

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrpvalglnglnlysproglyglnalaproarggly

354045

leuileglyglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyglylysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>16

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vl-16克隆

<400>16

glnalavalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrpvalglnglnlysproglyglnalaproarggly

354045

leuileglyglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe

505560

serglyserleuleuglyasplysalaalaleuthrleuserglyala

65707580

glnprogluaspglualaglutyrtyrcysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>17

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>小鼠sp34的vl结构域

<400>17

glnalavalvalthrglngluseralaleuthrthrserproglyglu

151015

thrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrser

202530

asntyralaasntrpvalglnglulysproasphisleuphethrgly

354045

leuileglyglythrasnlysargalaproglyvalproalaargphe

505560

serglyserleuileglyasplysalaalaleuthrilethrglyala

65707580

glnthrgluaspglualailetyrphecysalaleutrptyrserasn

859095

leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105110

<210>18

<211>125

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vh-a克隆

<400>18

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasnthrtyr

202530

alametasntrpvalargglnalaserglylysglyleuglutrpval

354045

glyargileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaasp

505560

servallysaspargphethrileserargaspaspserlysasnthr

65707580

alatyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysvalarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphe

100105110

alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>19

<211>125

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vh-b克隆

<400>19

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasnthrtyr

202530

alametasntrpvalargglnalaserglylysglyleuglutrpval

354045

glyargileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaasp

505560

servallysaspargphethrileserargaspaspserlysasnthr

65707580

leutyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysvalarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphe

100105110

alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>20

<211>125

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vh-c克隆

<400>20

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasnthrtyr

202530

alametasntrpvalargglnalaserglylysglyleuglutrpval

354045

glyargileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaasp

505560

servallysaspargphethrileserargaspaspserglnserthr

65707580

alatyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysvalarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphe

100105110

alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>21

<211>125

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vh-d克隆

<400>21

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasnthrtyr

202530

alametasntrpvalargglnalaserglylysglyleuglutrpval

354045

glyargileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaasp

505560

servallysaspargphethrileserargaspaspserglnserthr

65707580

leutyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysvalarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphe

100105110

alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>22

<211>125

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vh-e克隆

<400>22

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasnthrtyr

202530

alametasntrpvalargglnalaserglylysglyleuglutrpval

354045

alaargileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaasp

505560

servallysaspargphethrileserargaspaspserlysasnthr

65707580

alatyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysvalarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphe

100105110

alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>23

<211>125

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vh-f克隆

<400>23

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasnthrtyr

202530

alametasntrpvalargglnalaserglylysglyleuglutrpval

354045

alaargileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaasp

505560

servallysaspargphethrileserargaspaspserlysasnthr

65707580

leutyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysvalarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphe

100105110

alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>24

<211>125

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vh-g克隆

<400>24

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasnthrtyr

202530

alametasntrpvalargglnalaserglylysglyleuglutrpval

354045

alaargileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaasp

505560

servallysaspargphethrileserargaspaspserglnserthr

65707580

alatyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysvalarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphe

100105110

alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>25

<211>125

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化sp34的vh-h克隆

<400>25

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasnthrtyr

202530

alametasntrpvalargglnalaserglylysglyleuglutrpval

354045

alaargileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaasp

505560

servallysaspargphethrileserargaspaspserglnserthr

65707580

leutyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysvalarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphe

100105110

alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>26

<211>125

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>小鼠sp34的vh结构域

<400>26

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnprolysgly

151015

serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheasnthrtyr

202530

alametasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

alaargileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaasp

505560

servallysaspargphethrileserargaspaspserglnserile

65707580

leutyrleuglnmetasnasnleulysthrgluaspthralamettyr

859095

tyrcysvalarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphe

100105110

alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>27

<211>104

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>λcl结构域

<400>27

glnprolysalaasnprothrvalthrleupheproproserserglu

151015

gluleuglnalaasnlysalathrleuvalcysleuileseraspphe

202530

tyrproglyalavalthrvalalatrplysalaaspglyserproval

354045

lysalaglyvalgluthrthrlysproserlysglnserasnasnlys

505560

tyralaalasersertyrleuserleuthrprogluglntrplysser

65707580

hisargsertyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrvalglu

859095

lysthrvalalaprothrglucys

100

<210>28

<211>330

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg1ch结构域

<400>28

alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys

151015

serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr

65707580

tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys

859095

lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys

100105110

proalaproglualaalaglyglyproservalpheleuphepropro

115120125

lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys

130135140

valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp

145150155160

tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu

165170175

gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu

180185190

hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn

195200205

lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly

210215220

glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspglu

225230235240

leuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr

245250255

proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn

260265270

asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe

275280285

leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn

290295300

valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr

305310315320

glnlysserleuserleuserproglylys

325330

<210>29

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗-cd3抗体的cdr1(vl)的氨基酸序列

<400>29

argserserthrglyalavalthrthrserasntyralaasn

1510

<210>30

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗-cd3抗体的cdr2(vl)的氨基酸序列

<400>30

glythrasnlysargalapro

15

<210>31

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗-cd3抗体的cdr3(vl)的氨基酸序列

<400>31

alaleutrptyrserasnleutrpval

15

<210>32

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗-cd3抗体的cdr1(vh)的氨基酸序列

<400>32

glyphethrpheasnthrtyralametasn

1510

<210>33

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗-cd3抗体的cdr2(vh)的氨基酸序列

<400>33

argileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaaspser

151015

vallysasp

<210>34

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗-cd3抗体的cdr3(vh)的氨基酸序列

<400>34

valarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphealatyr

151015