PD-L1和TA-MUC1抗体的制作方法
本发明涉及一种抗体，与包括大于80％的核心岩藻糖基化的糖基化的参照抗体相比，该种抗体实现增强的t细胞活化。此外，与非糖基化的参照抗体相比，该种抗体实现增强的t细胞活化，和其中所述t细胞活化是通过特征在于与fcγriiia的结合增强的抗体实现的。所述抗体是糖基化的，但是基本上缺少核心岩藻糖基化。
背景技术：
免疫检查点蛋白阻断
程序性死亡配体1(pd-l1)，也称为分化簇274(cd274)或b7同源物1(b7-h1)，是一种在人类中由cd274基因编码的蛋白质并且是指免疫检查点蛋白质。
pd-l1在比如t细胞和b细胞、树突细胞(dc)、巨噬细胞、间充质干细胞和源自骨髓的肥大细胞的免疫细胞上组成性地表达(yamazaki等，2002,j.immunol.169:5538-45)。根据keir等(2008),annu.rev.immunol.26:677-704，pd-l1还可以在各种非造血细胞上表达，如角膜、肺、血管上皮、肝脏非实质细胞、间充质干细胞、胰岛、胎盘合体滋养细胞、角质形成细胞等等。此外，许多类型的细胞活化后在这些细胞上均能实现pd-l1的上调。在组织自身免疫疾病、同种异体移植和其它疾病状态中，pd-l1在抑制免疫系统方面发挥了重要作用。
pd-l1与程序性死亡-1受体(pd-1)(cd279)结合，后者提供调节t细胞活化的重要负共刺激信号。pd-1可以在所有类型的免疫细胞上表达，比如t细胞、b细胞、天然杀伤t细胞、活化的单核细胞和dc。pd-1由活化的人cd4+和cd8+t细胞、b细胞和骨髓细胞表达，但不由未刺激的这些细胞表达。另外，除了与pd-l1结合外，pd-1还与其配体结合配偶体pd-l2(b7-dc、cd273)结合。pd-1与cd28和ctla-4有关，但缺少允许同二聚化的膜近端半胱氨酸。
一般而言，pd-l1与pd-1的结合传递降低cd8+t细胞的增殖的抑制信号。
还将pd-l1看作是b7.1(cd80)的结合配偶体(butte等，2007,immunity27:111-22)。化学交联研究表明，pd-l1和b7.1可通过它们的igv-样结构域相互作用。此外，b7.1-pd-l1相互作用可以诱导抑制信号进入t细胞。
当t细胞缺少全部已知的pd-l1受体(即没有pd-1和b7.1)时，t细胞增殖不再受损。换言之，pd-l1与其受体pd-1在t细胞上的接合(engagement)受损导致t细胞受体介导的il-2产生和t细胞增殖的活化。因此，pd-l1在通过b7.1或pd-1抑制t细胞中起特定作用。
癌细胞也可以使pd-l1上调，从而使癌避开宿主免疫系统。pd-l1在多种不同类型的癌症上表达，包括但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤和白血病、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。磷酸酶及张力蛋白同源物(pten)的丢失或抑制使癌症中转录后pd-l1的表达增加，其中pten是一种修饰磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)和akt信号传导的细胞磷酸酶(parsa等，2007,nat.med.13:84-88)。
特别地，用于癌症治疗(例如肿瘤免疫)和急性或慢性感染的t细胞免疫的增强与pd-l1信号传导的抑制密切相关。
作为癌症的治疗手段，因此通常将靶向pd-l1/pd-1轴(例如抗pd-l1或抗pd-1)或pd-l1/cd80相互作用并能够靶向癌细胞的特异性抗体应用于治疗中，这是一个非常有前景并得到临床证明的概念。
adcc和adcp活性
介导如抗体依赖性细胞毒性(adcc)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)的细胞毒性效应子功能的能力是能够增强抗体抗肿瘤效力的有前景的手段。
一般而言，对于igg类抗体，adcc和adcp由fc区与所谓特异性的fcγ受体(fcγr)的结合来介导。人体中有三类受体：fcγri(cd64)，fcγrii(cd32)及其同种型fcγriia、fcγriib和fcγriic，和fcγriii(cd16)及其同种型fcγriiia和fcγriiib。所有的fcγr结合iggfc上的相同区，区别仅在于它们的亲和力，即fcγri具有高亲和力，而fcγrii和fcγriii具有低亲和力。因此，具有优化的fcγr亲和力的抗体可以产生更好的功能，从而在治疗中产生更好的细胞抗肿瘤效果。
adcc是这样一种机制：通过该机制抗体以其fab区结合靶细胞抗原，并通过其fc部分与这些细胞表面上的fc受体结合而募集效应细胞，从而导致如ifn-γ的细胞因子以及进入靶细胞并促进细胞死亡的含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒的释放。已发现特别是fcγriiia在介导针对所靶向癌细胞的adcc活性中起最关键的作用。
从文献中已知，fc区中低聚糖结构的修饰(fcn-糖基化)主要影响抗体与fc受体的结合，并且是用于增强adcc活性的既定方法。通常，已知糖基化本身和糖型的变化通过影响igg抗体的生物学功能而发挥重要作用。
通常，糖基化抗体可以在ch2结构域中的每个保守的天冬酰胺297(n297)处(根据eu命名法)包含两个n-连接的低聚糖。通常，与抗体的每个n297连接的n-聚糖可以是复合(complex)型的，然而高甘露糖或杂合型n-聚糖也可以与抗体的每个n297连接。复合型n-糖基化的特征可在于就存在/不存在二等分的n-乙酰葡糖胺和核心-岩藻糖具有变化的甘露糖基-壳二糖核心(man3glcnac2-asn)，其可以α-1.6-连接至附着在抗体上的n-乙酰葡糖胺。此外，复合型n-糖基化的特征可在于与甘露糖基-壳二糖核心(man3glcnac2-asn)连接的触角(antennary)n-乙酰葡糖胺，其具有可选的通过半乳糖和唾液酸部分的触角延伸。另外，触角岩藻糖和/或n-乙酰半乳糖胺也可以是触角延伸的一部分。
由于癌细胞上调“肿瘤相关粘蛋白1表位ta-muc1”，adcc活性通常通过应用靶向ta-muc1阳性癌细胞的抗体在癌症治疗中起重要作用。
ta-muc1存在于癌细胞上，但不存在于正常细胞上，和/或只有当存在于肿瘤细胞上时ta-muc1才能被宿主循环中的抗体接近，而当存在于正常细胞上时则不能。靶向ta-muc1提供了特定的方向和向肿瘤中的积累。ta-muc1的过表达通常与结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌相关。
增强的t细胞活化
当t细胞第一次遇到在活化的抗原呈递细胞(apc)表面上以肽：mhc复合物的形式的特异性抗原时，初始t细胞被活化。最重要的抗原呈递细胞是高度特异化的树突细胞(dc)，通过摄取和呈递抗原起作用。组织树突细胞在感染部位摄取抗原并作为先天免疫应答的一部分被活化。然后它们迁移到局部淋巴组织并成熟为在将抗原呈递给再循环t细胞方面非常有效的细胞。这些成熟树突细胞的表征基于表面分子，称为共刺激分子，这些共刺激分子与抗原协同作用将初始t细胞活化成效应t细胞。
根据dc向t细胞呈递的(例如细胞内和细胞外)肽抗原，不同的t细胞被活化。通过mhcii类分子将细胞外肽携带至细胞表面并呈递给cd4t细胞。其中，两种主要类型的效应t细胞，称为th1和th2是分化的。通过mhci类分子将细胞内抗原携带至细胞表面并呈递给cd8t细胞。在分化成细胞毒性t细胞后，它们杀死感染的靶细胞，例如癌细胞。(janeway等，2001，2001,“immunobiology:theimmunesysteminhealthanddisease”,garlandscience,5thedition)。因此，在癌症治疗以及其它疾病中，t细胞活化起重要作用。
本发明的目的是提供一种改进的抗体，其可用于不同的治疗应用。
技术实现要素：
本发明提供一种抗体，与包括大于80％的核心岩藻糖基化的糖基化的参照抗体相比，所述抗体实现增强的t细胞活化，其中优选地所述参照抗体是可从chodhfr-(atccno.crl-9096)获得的。特别地，本发明可设想一种基本上缺少核心岩藻糖基化的糖基化的抗体，与包括大于80％的核心岩藻糖基化的糖基化的参照抗体相比，所述抗体实现增强的t细胞活化。优选地，本发明的抗体可为0％至80％岩藻糖基化的。
与非糖基化的参照抗体相比，本发明的抗体也可实现增强的t细胞活化。此外，本发明的所述t细胞活化可以是通过特征在于与fcγriiia的结合增强的本发明的抗体实现的。
本发明还可涵盖一种抗体，其中所述糖基化为人糖基化。另外，包括大于80％的核心岩藻糖基化的参照抗体的糖基化也可以是人糖基化。
此外，本发明可预期一种抗体，其中所述抗体可以是可从细胞系nm-h9d8-e6(dsmacc2807)、nm-h9d8-e6q12(dsmacc2856)或源自它们的细胞或细胞系获得的。本发明的抗体还可包含一个或多个序列突变，其中与未突变的抗体相比，所述抗体与fcγriiia的结合增加。此外，本发明还可提供一种本发明的抗体，其中所述抗体可包含选自以下的根据eu-命名法的一个或多个序列突变：s238d、s239d、i332e、a330l、s298a、e333a、l334a、g236a和l235v。
本发明可进一步预期本发明的一种抗体，其中t细胞活化可伴有树突细胞的成熟和/或共刺激分子和成熟标志物的表达，和其中所述t细胞活化可以是可通过cd25、cd69和/或cd137的表达检测的。
本发明可提供一种抗体，其中优选地所述抗体为pd-l1抗体。本发明的所述pd-l1抗体可为双功能单特异性抗体或三功能双特异性抗体。当为三功能双特异性抗体时，所述pd-l1抗体可进一步结合癌抗原，其中优选地所述癌抗原为ta-muc1。另外，本发明的所述pd-l1抗体可包含fc区。
本发明可提供本发明的一种抗体，其中优选地所述抗体为ta-muc1抗体。所述ta-muc1抗体可为双功能单特异性抗体或三功能双特异性抗体。当为三功能双特异性抗体时，所述ta-muc1抗体可进一步结合免疫检查点蛋白，其中优选地所述免疫检查点蛋白为pd-l1。另外，本发明的所述ta-muc1抗体可包含fc区和结合pd-l1的单链fv区。此外，所述ta-muc1抗体可包含结合ta-muc1的vh和vl结构域。所述ta-muc1抗体的所述单链fv区可与所述轻链的恒定结构域或与所述fc区的ch3结构域偶联。
本发明可提供本发明的一种抗体，单特异性或双特异性pd-l1抗体和/或单特异性或双特异性ta-muc1抗体用在治疗中。此外，本发明可提供一种抗体，单特异性或双特异性pd-l1抗体和/或单特异性或双特异性ta-muc1抗体用在用于活化t细胞的方法中。另外，本发明可涵盖本发明的一种抗体，其中优选地t细胞的活化用于癌症疾病、炎性疾病、病毒感染性疾病和自身免疫疾病的治疗。特别地，癌症疾病可选自黑色素瘤、癌(carcinoma)、淋巴瘤、肉瘤和间皮瘤，包括肺癌、肾癌、膀胱癌、胃肠癌、皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌。另外，炎性疾病可选自炎症性肠病(ibd)、盆腔炎(pid)、缺血性卒中(is)、阿尔茨海默病、哮喘、寻常天疱疮、皮炎/湿疹。病毒感染性疾病可选自人免疫缺陷病毒(hiv)、单纯疱疹病毒(hsv)、epsteinbarr病毒(ebv)、流感病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)。此外，自身免疫疾病选自i型糖尿病(dm)、多发性硬化症(ms)、系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎(ra)、白癜风、牛皮癣和牛皮癣关节炎、特应性皮炎(ad)、硬皮病、结节病、原发性胆汁性肝硬化、格巴二氏症候群、graves病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、强直性脊柱炎(as)。
附图说明
图1：测量核心岩藻糖基化。
与单特异性pdl-gexh9d8和双特异性pm-pdl-gexh9d8相比，单特异性pdl-gexfuc-和双特异性pm-pdl-gexfuc-具有减少的核心岩藻糖基化。本文阐释了单特异性抗体pdl-gexh9d8和pdl-gexfuc-以及双特异性抗体pm-pdl-gexh9d8和pm-pdl-gexfuc-的核心岩藻糖基化的n-聚糖的相对摩尔量。单特异性pdl-gexh9d8和双特异性pm-pdl-gexh9d8分别含有92％和91％的核心岩藻糖基化的n-聚糖，并由此称为正常岩藻糖基化。单特异性pdl-gexfuc-和双特异性pm-pdl-gexfuc-仅包含低百分比的核心岩藻糖基化的n-聚糖，优选地对于pdl-gexfuc-为4％，对于pm-pdl-gexfuc-为1％，并因此被称为岩藻糖减少的。这在实施例1中描述。
图2：岩藻糖减少的抗体和正常岩藻糖基化的抗体的阻断能力。
与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示相当的阻断能力：a)检测所有四种变体的pd-1结合的浓度依赖性阻断，分别地，在正常的和岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gex-h9d8和pdl-gex-fuc-)之间以及在正常的和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gex-h9d8和pm-pdl-gex-fuc-)之间未检测到pd-l1/pd-1阻断elisa的差异。双特异性抗pd-l1/ta-muc1higg1的抑制的轻微降低可能是由于抗pd-l1higg1转变为抗pd-l1scfv形式。b)测试的所有四种变体(pdl-gex-h9d8、pdl-gex-fuc-、pm-pdl-gex-h9d8和pm-pdl-gex-fuc)均显示对pd-l1和cd80之间的相互作用的有效抑制，并且未检测到糖基化变体(岩藻糖减少与正常岩藻糖基化)之间的明显差异。这在实施例2中描述。
图3：与ta-muc1的结合能力。
岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-和pm-pdl-gex-h9d8)两者均显示相当的与ta-muc1的结合。如所预期的，单特异性抗-pd-l1(pdl-gexh9d8)显示不与乳腺癌细胞系zr-75-1结合。这在实施例3中描述。
图4：与fcγriiia的结合能力。
与正常岩藻糖基化的变体相比，抗-pd-l1higg1和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1的岩藻糖减少的变体显示与fcγriiia的结合增加：本文阐述了抗-pd-l1higg1和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1的不同岩藻糖基化变体的比较。与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1(pdl-gexfuc-)具有降低的ec50值，这表明与正常岩藻糖基化的变体相比，岩藻糖减少的变体与fcγriiia的结合增强了～5倍。
在同一实验中未比较双特异性岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的抗-pd-l1/ta-muc1higg1，但是通过计算与正常岩藻糖基化的参照抗体相比的相对效力(参照抗体的ec50除以测试抗体的ec50)从而定量地比较了它们。对于双特异性正常岩藻糖基化的抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexh9d8)而言，测定的相对效力为1.9。相比而言，双特异性岩藻糖减少的抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)的相对效力测定为10.4。由此，与正常岩藻糖基化的对应物(pm-pdl-gexh9d8)相比，岩藻糖减少的变体(pm-pdl-gexfuc-)与fcγriiia的结合也增强了～5倍。这在实施例4中描述。
图5：测量对ta-muc+和pd-l1+肿瘤细胞的adcc活性。
与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示对ta-muc+和pd-l1+肿瘤细胞的杀伤增加：a)由于与fcγriiia的结合增加，与正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gex-h9d8)相比，岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)对表达高水平ta-muc1和仅表达微小(marginal)水平pd-l1的乳腺癌细胞系zr-75-1显示显著增强的adcc活性。由于靶细胞表达很少或不表达pd-l1，单特异性抗-pd-l1抗体(pdl-gexfuc-和pdl-gexh9d8)未显示所预期的adcc。前列腺癌细胞系du-145强表达pd-l1(b)并具有中度的ta-muc1表达(c)。d)与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1(pdl-gexfuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)介导对pd-l1阳性肿瘤细胞显著增强的adcc。与它们相应的单特异性抗pd-l1higg1相比，双特异性形式的adcc效应的轻微降低可能是由于抗pd-l1higg1转化为抗pd-l1scfv形式。这在实施例5中描述。
图6：测量对pd-l1+pbmc的adcc活性。
岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示对pd-l1+pbmc无adcc效应：令人惊讶地，未检测到由岩藻糖减少的抗-pd-l1(pdl-gex-fuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1(pm-pdl-gex-fuc-)介导的对b细胞(a)和单核细胞(b)的adcc效应。相比而言，阳性对照
图7：测量pd-1/pd-l1阻断。
在基于细胞的pd-1/pd-l1阻断生物分析中，岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示相当的结果。根据pd-l1/pd-1阻断elisa，岩藻糖减少的(pm-pdl-gexfuc-)和正常岩藻糖基化(pm-pdl-gexh9d8)的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1均检测到pd-1/pd-l1阻断(break)的相当的剂量依赖性释放(参见图1)。正如所预期的，纳武单抗(nivolumab)作为阳性对照是有效的。这在实施例7中描述。
图8：mlr中il-2的测量。
在同种异体混合淋巴细胞反应(mlr)中，岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1和岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1诱导相当的il-2。a)通过流式细胞术分析modc表型的代表性实验。modc表达共刺激分子cd80和cd86、dc标志物cd209和mhcii类表面受体hla-dr。此外，发现modc表达cd16(fcγriii)和cd274(pd-l1)。b)由于岩藻糖减少的(pm-pdl-gexfuc-)和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexh9d8)和岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)诱导相当的量的il-2，因此未检测到去岩藻糖基化对il-2分泌的影响。这在实施例8中描述。
图9：测量t细胞活化。
与正常岩藻糖基化的对应物和不具有/具有弱的结合fcγr的能力的抗-pd-l1抗体相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示增加的t细胞活化。在同种异体mlr中采用自三个不同的健康志愿者((a)＝供体1、(b)＝供体2和(c)＝供体3)中分离的t细胞获得的结果证明，与它们的正常岩藻糖基化的单特异性抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexh9d8)对应物相比，同样与不具有/具有弱的结合fcγr的能力的抗-pd-l1抗体(阿特珠单抗(atezolizumab))相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)诱导增强的t细胞活化。这在实施例9中描述。
图10：在采用分离的t细胞和总pbmc的mlr中测量t细胞活化。
在采用分离的t细胞和总pbmc的mlr中与正常岩藻糖基化的对应物和不具有/具有弱的结合fcγr的能力的抗-pd-l1相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示增加的t细胞活化。流式细胞术分析显示，在mlr中采用t细胞(a、b)或pbmc(c、d)作为应答细胞通过测量cd3+cd8+细胞上cd25和cd137的表达与正常岩藻糖基化单特异性抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)相比，与双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexh9d8)相比和与不具有/具有弱的结合fcγr的能力的抗-pd-l1抗体(阿特珠单抗)相比，岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)诱导更强的cd8t细胞活化。
通过测量cd25(e)和cd137(f)的表达，由于岩藻糖减少的单特异性pdl-gexfuc-和岩藻糖减少的双特异性pm-pdl-gexfuc-，采用pbmc培育modc还导致增加的cd4t细胞活化(cd3+cd8-细胞和因此的(ergo)cd4t细胞)，这在之前的采用分离的t细胞的mlr中未观察到。这在实施例10中描述。
图11：测量t细胞上的cd69表达。
岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1还使t细胞上的cd69表达增加。流式细胞术分析显示，与正常岩藻糖基化的单特异性抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexh9d8)相比，岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)诱导cd8t细胞上更强的cd69表达。这在实施例11中描述。
图12：fcγr及其对于t细胞活化的关键作用。
采用modc和分离的t细胞的同种异体mlr显示fcγr结合在采用岩藻糖减少的抗-pd-l1抗体的增加的t细胞活化中具有关键作用。由于另一种具有无关特异性(称为阻断)的岩藻糖减少的抗体(mlr中不存在抗原)的添加，该种由于岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)而增加的t细胞活化将被抑制至与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)或不具有/具有弱的结合fcγr的能力的非糖基化的抗-pd-l1higg1(阿特珠单抗)相当的水平。这在实施例12中描述。
图13：测量树突细胞的成熟。
与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1相比，在去岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1存在下，树突细胞显示出更成熟的表型。与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)相比，在岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)存在下，modc显示较少的cd14表达(a)。相比而言，与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1相比，在岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1存在下cd16(fcγriii)(b)和共刺激分子cd40(c)和cd86(e)和dc-标志物cd83(d)以更高水平表达。这在实施例13中描述。
图14：通过细胞毒性测量的t细胞的活化。
与pdl-gexh9d8、阿特珠单抗和培养基对照(培养基对照＝未添加测试抗体的mlr后的t细胞)相比，采用pdl-gexfuc-活化的t细胞导致增加的细胞毒性。来自两个不同健康志愿者((a)＝供体2，(b)＝供体3，其是指与图9中所用的相同的供体)的t细胞显示了该种效果。这在实施例14中描述。
图15：采用具有不同量的核心岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1的t细胞活化。
如通过cd8+t细胞上cd137(a)和cd25(b)的表达的测定，采用pdl-gex的t细胞的活化依赖于核心岩藻糖基化的量。将培养基和阿特珠单抗(tecentriq)作为对照。这在实施例15中描述。
图16：在它们的fc部分具有突变的抗-pd-l1抗体的相当的抗原结合。
在pdl-gexh9d8(未突变的)、在fc部分包含根据eu命名法的三个氨基酸改变s239d、i332e和g236a的pdl-gexh9d8mut1和包含根据eu命名法的五个氨基酸改变l235v、f243l、r292p、y300l和p396l的pdl-gexh9d8mut2之间未观察到pd-l1结合的明显差异。这在实施例16中描述。
图17：在它们的fc部分具有突变的抗-pd-l1抗体的fcγriiia接合增加。
通过向较低有效浓度移动(shift)可以看出，与未突变的pdl-gexh9d8相比，pm-pdl-gexh9d8mut1和pm-pdl-gexh9d8mut2显示与fcγriiia增加的结合。这在实施例17中描述。
图18：在它们的fc部分具有突变的抗-pd-l1抗体的t细胞活化增加。
与pdl-gexh9d8(未突变的)相比，pm-pdl-gexmut1和pdl-gexmut2显示增加的t细胞活化，这证明通过采用去岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体(pdl-gexfuc-)或通过采用包含导致增强的fcγriiia结合的序列突变的抗-pd-l1抗体可以实现增强的t细胞活化。这在实施例18中描述。
图19：通过增殖表现的由于去岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体而增强的t细胞活化。
与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体(pdl-gexh9d8)相比和与非糖基化的抗-pd-l1(阿特珠单抗)相比，去岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体(pdl-gexfuc-)显示cd8t细胞增殖增加。这在实施例19中描述。
图20：在癌细胞存在下增强的t细胞活化。
在mlr中比较了去岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体(pdl-gexfuc-)与去岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1抗体(pm-pdl-gexfuc-)在癌细胞存在下诱导t细胞活化的能力。然而，在所有测试的癌细胞系存在下观察到通过pdl-gexfuc-和pm-pdl-gexfuc-的增强的活化。这在实施例20中描述。
图21：pdl-gexcdr突变体显示了与未突变的对应物相当的结合和阻断能力。
a)采用表达pd-l1的du-145细胞和流式细胞术分析，在结合pd-l1的vh结构域的cdr中具有不同的突变的岩藻糖减少的pdl-gex，比如：
-pdl-gexfuc-cdrmuta(seqidno.60+seqidno.68)
-pdl-gexfuc-cdrmutb(seqidno.62+seqidno.69)
-pdl-gexfuc-cdrmutc(seqidno.63+seqidno.70)
-pdl-gexfuc-cdrmutd(seqidno.64)
-pdl-gexfuc-cdrmute(seqidno.65+seqidno.71)
-pdl-gexfuc-cdrmutf(seqidno.66+seqidno.72)
-pdl-gexfuc-cdrmutg(seqidno.63+seqidno.72)
-pdl-gexfuc-cdrmuth(seqidno.67+seqidno.74)
-pdl-gexfuc-cdrmuti(seqidno.63+seqidno.68)
也显示了与未突变的pdl-gexfuc-相当的结合pd-l1的能力。b)采用pd-l1/pd1阻断elisa，岩藻糖减少的pdl-gex的cdr突变体(参见a)也显示了与未突变的pdl-gexfuc-相当的阻断能力。这在实施例21中描述。
图22：pm-pdl-gexcdr突变体显示了与未突变的对应物相当的结合和阻断能力。
a)采用pd-l1抗原elisa，在结合pd-l1的scfv区的vh结构域的cdr中具有不同的突变的岩藻糖减少的pm-pdl-gex，比如pm-pdl-gexfuc-cdrmuta(seqidno.64)或pm-pdl-gexfuc-cdrmutb(seqidno.66+seqidno.72)，显示与未突变的pm-pdl-gexfuc-相当的结合pd-l1的能力。b)采用pd-l1/pd1阻断elisa，岩藻糖减少的pm-pdl-gex的cdr突变体也显示了与未突变的pm-pdl-gexfuc-相当的阻断能力。c)采用表达ta-muc1的t-47d和流式细胞术分析，在vh结构域的cdr中具有不同的突变的岩藻糖减少的pm-pdl-gex显示与未突变的pm-pdl-gexfuc-相当的结合ta-muc1的能力。这在实施例22中描述。
图23：pm-pdl-gexcdr突变体显示与未突变的对应物相当的增强的cd8t细胞活化。
在结合pd-l1的scfv区的vh结构域的cdr中具有不同的突变的岩藻糖减少的pm-pdl-gex，比如pm-pdl-gexfuc-cdrmuta(seqidno.64)或pm-pdl-gexfuc-cdrmutb(seqidno.66+seqidno.72)显示了与未突变的pm-pdl-gexfuc-相当的增强的cd8t细胞活化(cd8t细胞的cd25+细胞)。cdr突变的pm-pdl-gexh9d8变体活化cd8t细胞的程度与未突变的pm-pdl-gexh9d8相当。这在实施例23中描述。
发明详述
在下文描述了、实施例中举例说明了、在附图中阐释了并在权利要求中反映了本发明的方案。
本发明提供一种糖基化的抗体，其基本上缺少核心岩藻糖基化并且与包括大于80％的核心岩藻糖基化的糖基化的参照抗体相比，所述抗体实现增强的t细胞活化。
可将本发明的抗体看作岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1，优选地它们是可从细胞系nm-h9d8-e6(dsmacc2807)、nm-h9d8-e6q12(dsmacc2856)或源自它们的细胞或细胞系获得的。单特异性和双特异性岩藻糖减少的抗体可包含fc区和与fc区结合的复合的n-连接糖链，其中在与fc区结合的全部复合的n-连接糖链中，岩藻糖减少的抗体的1,6-核心-岩藻糖的含量为0％至80％。
优选地，本发明的宿主细胞可以是一个细胞、多个细胞或细胞系nm-h9d8-e6(dsmacc2807)和/或nm-h9d8-e6q12(dsmacc2856)，其在无血清条件下生长并产生本发明所述岩藻糖减少的单特异性和岩藻糖减少的双特异性抗体。此外，在下文中优选的可为在无血清条件下生长的细胞，其中可以将编码所述岩藻糖减少的单特异性和岩藻糖减少的双特异性抗体的核酸引入这些细胞中，并且其中可以在无血清条件下分离所述岩藻糖减少的单特异性和岩藻糖减少的双特异性抗体。
优选地，单特异性的、岩藻糖减少的抗体是指抗-pdl1-gexfuc-(简称：pdl-gex-fuc-)，双特异性、岩藻糖减少的抗体是指双特异性pankomab-抗pdl1-gexfuc-(简称：pm-pdl-gex-fuc-)。该命名方法可互换使用。
在核心岩藻糖基化、pd-l1阻断能力、与fcγriiia的结合、与表达ta-muc1和/或pd-l1的细胞的结合、adcc活性和t细胞活化方面，对本发明的单特异性和双特异性岩藻糖减少的抗体进行测试并将之与参照抗体进行比较。作为参照抗体，采用正常岩藻糖基化的单特异性抗-pdl-gex(简称：pdl-gex-h9d8)和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pm-pdl-gex(简称：pm-pdl-gexh9d8)，这些是包括大于80％的核心岩藻糖基化的糖基化的，并且优选地是可从chodhfr-(atccno.crl-9096)获得的。同样，该命名方法可互换使用。
首先，通过hilic-uplc-hiresqtofmsms分析单特异性抗体pdl-gexh9d8和pdl-gexfuc-及双特异性抗体pm-pdl-gexh9d8和pm-pdl-gexfuc-的n-糖基化。单特异性抗体pdl-gexh9d8和pdl-gexfuc-及双特异性抗体pm-pdl-gexh9d8和pm-pdl-gexfuc-的核心岩藻糖基化的n-聚糖的相对摩尔量列于图1。
正常糖基化的单特异性pdl-gexh9d8和双特异性pm-pdl-gexh9d8可含有大于80％的核心岩藻糖基化的n-聚糖(核心岩藻糖基化)。优选地，本发明设想含有大于80％小于100％核心岩藻糖基化的n-聚糖的正常糖基化的抗体。优选地，本发明的正常糖基化的抗体可含有约81％至100％、85％至95％岩藻糖基化的n-聚糖或90％至95％岩藻糖基化的n-聚糖。本发明的正常岩藻糖基化的抗体可含有大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％岩藻糖基化的n-聚糖，优选地pdl-gexh9d8抗体含有约92％核心岩藻糖基化的n-聚糖和优选地pm-pdl-gexh9d8含有约91％核心岩藻糖基化的n-聚糖。因此，这些具有大于80％核心岩藻糖基化的n-聚糖的抗体可以是指正常岩藻糖基化的抗体。
岩藻糖减少的单特异性pdl-gexfuc-和双特异性pm-pdl-gexfuc-仅含有低百分数的核心岩藻糖基化的n-聚糖。优选地，本发明提供0％至80％岩藻糖基化的岩藻糖减少的抗体。优选地，本发明的岩藻糖减少的抗体可含有约0％至80％、0％至75％、0％至70％、0％至65％、0％至60％、0％至55％、0％至50％、0％至45％、0％至40％、0％至35％、0％至30％、0％至25％、0％至20％、0％至15％、0％至10％或10％至50％、15％至50％、20％至50％、25％至50％、30％至50％、35％至50％、40％至50％、45％至50％或1％至20％、1％至15％、1％至10％、1％至5％或5％至30％、5％至20％、5％至15％或4％至80％、4％至75％、4％至70％、4％至65％、4％至60％、4％至55％、4％至50％、4％至45％、4％至40％、4％至35％、4％至30％、4％至25％、4％至20％、4％至15％、4％至10％岩藻糖基化的n-聚糖。优选地，本发明的岩藻糖减少的抗体可含有0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20.0％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、41％、42％、43％、44％、45.0％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61.0％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或甚至80％岩藻糖基化的n-聚糖。更优选地，本发明的岩藻糖减少的抗体可含有5％以下的岩藻糖基化的n-聚糖。最优选地，pdl-gexfuc-抗体含有约4％岩藻糖基化的n-聚糖和pm-pdl-gexfuc-抗体含有约1％岩藻糖基化的n-聚糖。因此，这些自0％至80％岩藻糖基化的抗体可是指岩藻糖减少的抗体。此外，当在本文中表述时，单特异性和双特异性岩藻糖减少的抗体与自atccno.crl-9096(chodhfr-)中分离的相同量的抗体相比可具有低至少5％的岩藻糖基化值。
此外，在本发明中应用了两种不同的竞争性elisa以分析抗-pd-l1抗体和能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的抗体抑制pd-l1与其结合配偶体pd-1和cd80的相互作用的潜力。
首先，在pd-l1/pd-1阻断elisa中将岩藻糖减少的pdl-gexfuc-和岩藻糖减少的双特异性pm-pdl-gexfuc-与它们的正常岩藻糖基化的对应物pdl-gexh9d8和pm-pdl-gexh9d8进行比较。对于所测试的全部四种变体，均检测到pd-1结合的浓度依赖性阻断。分别地，在正常的和岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1higg1以及在正常的和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1之间未检测到差异(图2a)。
第二，如上所述进行了相关的阻断elisa，但采用cd80配体代替pd-1。所测试的全部四种变体均显示出对pd-l1与cd80之间相互作用的有效抑制，并且未检测到糖基化变体(岩藻糖减少的相对于正常岩藻糖基化的)之间的明显差异(图2b)。总之，岩藻糖减少的抗体显示出与它们的正常岩藻糖基化的对应物相当的阻断能力。
pd-1/pd-l1阻断生物分析(promega)证实了这些结果，该生物分析是一种基于生物发光细胞的分析，其可用于测量设计为阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体的效力。在基于细胞的pd-1/pd-l1阻断生物分析中，岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示出相当的结果(图7)。
此外，进一步显示在vh结构域的cdr具有不同突变的岩藻糖减少的pdl-gex还可显示与未突变的pdl-gexfuc-相当的结合pd-l1能力。岩藻糖减少的pdl-gex的突变体还可显示与未突变的pdl-gexfuc-相当的阻断能力，优选地包含以下单特异性pd-l1抗体：所述抗体在vh结构域的cdr中包含突变，因此具有如seqidno.60(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第29位具有苯丙氨酸至异亮氨酸的突变)和68(在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的第52位具有丝氨酸至苏氨酸的突变)所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.62(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第26位具有甘氨酸至丙氨酸的突变)和69(在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的第49位具有丙氨酸至甘氨酸的突变)所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.63(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第34位具有异亮氨酸至甲硫氨酸的突变)和70(在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的第51位具有异亮氨酸至亮氨酸的突变)所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.64(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第26位具有甘氨酸至丙氨酸的突变和在根据kabat编号的第31位具有天冬氨酸至谷氨酸的突变)所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.65(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第31位具有天冬氨酸至谷氨酸的突变)和71(在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的第63位具有缬氨酸至亮氨酸的突变)所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.66(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第28位具有苏氨酸至丝氨酸的突变)和72(在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的第62位具有丝氨酸至苏氨酸的突变)所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.63(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第34位具有异亮氨酸至甲硫氨酸的突变)和72(在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的62位具有丝氨酸至苏氨酸的突变)所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.67(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第32位具有丝氨酸至苏氨酸的突变)和74(在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的第56位具有丝氨酸至苏氨酸的突变)所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.63(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第34位具有异亮氨酸至甲硫氨酸的突变)和68(在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的第52位具有丝氨酸至苏氨酸的突变)所示的氨基酸序列(图21a和b)。
这些数据揭示了采用本发明的岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的单特异性和双特异性抗体和/或采用在本发明的所述抗体的vh结构域中具有不同cdr突变的岩藻糖减少的单特异性抗体可以实现靶向表达pd-l1的细胞。
此外，为了就与肿瘤细胞上表达的ta-muc1的结合来进一步表征岩藻糖减少的抗体，通过流式细胞术分析了正常岩藻糖基化的和岩藻糖减少的双特异性pm-pdl-gexh9d8和fuc-的结合特性。采用具有强ta-muc1表达但仅很少或无pd-l1表达的乳腺癌细胞系zr-75-1测定ta-muc1结合。岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示了相当的与ta-muc1的结合(图3)。
此外，进一步显示在结合pd-l1的scfv区的vh结构域的cdr中具有不同突变、优选地具有如seqidno.64(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第26位具有甘氨酸至丙氨酸的突变和在根据kabat编号的第31位具有天冬氨酸至谷氨酸的突变)所示的氨基酸序列或具有如seqidno.66(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第28位具有苏氨酸至丝氨酸的突变)和72(在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的第62位具有丝氨酸至苏氨酸的突变)所示的氨基酸序列的岩藻糖减少的pm-pdl-gex可显示出与未突变的pm-pdl-gex相当的结合pd-l1的能力、相当的pd-l1/pd1相互作用的阻断能力和相当的结合ta-muc1的能力(图22a、b和c)。
这些数据揭示了采用本发明的岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗体和/或采用在本发明的所述抗体的结合pd-l1的scfv区的vh结构域中具有不同cdr突变的、优选地具有如上所述的如seqidno.64所示的氨基酸序列或具有如seqidno.66和72所示的氨基酸序列的岩藻糖减少的双特异性抗体可以实现靶向表达ta-muc1的肿瘤细胞。
除了上述发现之外，还发现单特异性抗-pd-l1higg1和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1的岩藻糖减少的变体与正常岩藻糖基化的变体之间的主要差异是与fcγriiia的增加的结合。为了在分子水平上表征抗体fc部分与fcγriiia的结合，开发了采用perkinelmer
在同一实验中未比较双特异性岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的抗-pd-l1/ta-muc1higg1，但是通过计算与正常岩藻糖基化的参照抗体相比的相对效力从而定量地比较了它们。相对效力是指参照抗体的ec50除以测试抗体的ec50。对双特异性正常岩藻糖基化的pm-pdl-gexh9d8测定的相对效力为1.9。相比而言，双特异性岩藻糖减少的pm-pdl-gexfuc-的相对效力测定为10.4。由此，与正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的变体与fcγriiia的结合增强了～5倍(图4)。
此外，还发现了岩藻糖减少的抗体与正常岩藻糖基化的抗体之间的另一差异。与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示对ta-muc+和pd-l1+肿瘤细胞的杀伤增加。
首先，针对表达高水平ta-muc1和仅表达微小水平pd-l1的乳腺癌细胞系zr-75-1进行adcc分析。如所预期，由于与fcγriiia的结合增加，与正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1相比，岩藻糖减少的双特异性pm-pdl-gexfuc-显示显著增强的adcc活性(图5a)。这一数据表明通过应用岩藻糖减少的双特异性pm-pdl-gexfuc-抗体可以增强针对ta-muc1+癌细胞的adcc。
第二，还采用强表达pd-l1并具有中等ta-muc1表达的前列腺癌细胞系du-145进一步研究对pd-l1+肿瘤细胞的杀伤。再次发现，与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的单特异性pdl-gexfuc-和岩藻糖减少的双特异性pm-pdl-gexfuc-介导对pd-l1阳性肿瘤细胞显著增强的adcc(图5d)。这一数据表明通过应用岩藻糖减少的单特异性pdl-gexfuc-和双特异性pm-pdl-gexfuc-抗体可以增强针对pd-l1+癌细胞的adcc。
据报道，pd-l1不仅在肿瘤细胞上表达，还在不同的免疫细胞如单核细胞或b细胞上表达。由于与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1对肿瘤细胞显示显著增强的adcc效应，可以预期它们还介导针对pd-l1+免疫细胞的adcc。由于描述了单核细胞和b细胞表达pd-l1，因此在基于facs的adcc分析中将两种免疫细胞群作为潜在的靶细胞进行了分析。
令人惊讶地，未检测到由岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1介导的针对比如b细胞和单核细胞的免疫细胞的adcc效应(图6a和6b)。
此外，实施例8中描述的实验表明，在同种异体混合淋巴细胞反应(mlr)中，岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1和岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1诱导相当的il-2(图8b)。
混合淋巴细胞反应(mlr)是一种功能分析，建立该分析以用于分析pd-l1阻断抗体对通过表达pd-l1的抗原呈递细胞抑制表达pd-1的t细胞的作用。该分析法测量来自作为应答物的一位供体的t细胞对来自作为刺激物的另一供体的衍生自单核细胞的树突细胞(modc)的应答(＝同种异体mlr)。
本申请的发明人还惊讶地发现，与正常岩藻糖基化的对应物和作为另一参照抗体的称为“阿特珠单抗”的抗-pd-l1抗体相比，岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1可显示在同种异体混合淋巴细胞反应(mlr)中测量的增强的t细胞活化(图9a、b和c)。因此，本发明还包含一种抗体，与包括大于80％的核心岩藻糖基化的糖基化的参照抗体相比，该抗体实现在同种异体混合淋巴细胞反应(mlr)中测量的增强的t细胞活化。
通过流式细胞术经由cd25的表达分析了在测试抗体(1μg/ml测试抗体)存在下采用modc和分离的t细胞的同种异体mlr的cd8t细胞(cd3+cd8+细胞)的活化。采用来自不同供体的t细胞获得的结果证明，与正常岩藻糖基化的单特异性pdl-gexh9d8和双特异性pm-pdl-gexh9d8相比，也与另一抗-pd-l1抗体(比如阿特珠单抗)相比，岩藻糖减少的pdl-gexfuc-和岩藻糖减少的双特异性pm-pdl-gexfuc-可诱导增强的t细胞活化。后一种称为“阿特珠单抗”的参照抗体可不具有或具有弱的结合fcγr的能力并且是非糖基化的。图14中还证实了与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1相比，由于岩藻糖减少的抗-pd-l1引起的t细胞活化增加。为了分析由于岩藻糖减少的抗-pd-l1引起的t细胞活化增加是否导致功能益处，收获在pdl-gexh9d8、pdl-gexfuc-和阿特珠单抗存在或不存在的同种异体mlr中活化的t细胞，并随后采用铕释放分析测量它们的细胞毒性能力。
事实上，岩藻糖减少的抗-pd-l1和抗-pd-l1/ta-muc1抗体可诱导增强的t细胞活化是令人惊奇的，这是因为在阻断elisa(参见实施例2)、在pd-1/pd-l1阻断生物分析(参见实施例7)和在il-2分泌(参见实施例8)中未观察到糖基化变体之间的差异。采用不同供体的t细胞观察到了由于岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1引起的t细胞活化增加，并且再次预期这是意想不到的效果。
岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1可诱导增强的cd8t细胞活化这一发现是非常重要的，因为cd8t细胞代表了在抗肿瘤应答中起关键作用并具有直接杀伤癌细胞能力的细胞毒性t细胞。用岩藻糖减少的单特异性pd-l1抗体和能够结合pd-l1和ta-muc1的岩藻糖减少的双特异性抗体治疗后，在癌症疾病、炎性疾病、病毒感染性疾病和自身免疫疾病的过程中可能发生增加的t细胞活化。
进一步显示还可在mlr中在比如hsc-4、zr-75-1、ramos癌细胞的癌细胞存在下观察到由于去岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体和去岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1抗体的增强的t细胞活化(图20)。
本发明还提供一种与(i)包括大于80％的核心岩藻糖基化的糖基化的参考pd-l1抗体(如pdl-gex-h9d8)相比和与(ii)非糖基化的参照抗体(如阿特珠单抗)相比，实现增强的t细胞活化的单特异性pd-l1抗体(如pdl-gexfuc-)。此外，本发明还提供一种与(i)能够结合ta-muc1和pd-l1的且包括大于80％的核心岩藻糖基化的糖基化的参照抗体(如pm-pdl-gex-h9d8)相比，能够以其scfv区结合ta-muc1和pd-l1且实现增强的t细胞活化的双特异性抗体(如pm-pdl-gexfuc-)。
在另一同种异体mlr中，在测试抗体存在下用modc培育分离的t细胞或pbmc。流式细胞术分析表明在采用t细胞(图10a和b)或外周血单核细胞(pbmc)(图10c和d)作为应答细胞的mlr中，通过测量cd3+cd8+细胞上cd25和cd137的表达确定，与正常岩藻糖基化的单特异性抗-pd-l1higg1或双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1相比，和与比如阿特珠单抗的抗-pd-l1higg1相比，pdl-gexfuc-和pm-pdl-gexfuc-诱导更强的cd8+t细胞活化。通过测量cd25(图10e)和cd137(图10f)的表达确定，由于岩藻糖减少的单特异性pdl-gexfuc-和岩藻糖减少的双特异性pm-pdl-gexfuc-，采用pbmc培育的modc还导致增加的cd4t细胞活化(cd3+cd8-细胞和因此的(ergo)cd4t细胞)，这在之前的采用分离的t细胞的mlr中未观察到。有趣的是，含有nk细胞的pbmc(而不是分离的t细胞)的应用表明由nk细胞或潜在的nk细胞介导的对pd-l1+细胞的adcc效应对t细胞活化没有负面影响。
为了完成上述发现，也可以通过增殖来表现由于去岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体(pdl-gexfuc-)而增强的t细胞活化。与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体(pdl-gexh9d8)相比和与非糖基化的抗-pd-l1(阿特珠单抗)相比，pdl-gexfuc-抗体可显示cd8t细胞增殖增加(图19)。
此外，这些数据得到了确证并甚至通过在另一个同种异体mlr中的发现得到了扩展，所述发现即：与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)还可使t细胞上的cd69表达增加(图11)。除了cd25和cd137之外，cd69是另一活化标志物，其在用单特异性和/或双特异性岩藻糖减少的抗体处理后得到更强的诱导。
此外，本发明公开了通过cd25、cd69和/或cd137的表达水平，t细胞活化可以是可检测的。在本上下文或本文其他地方，具有通过cd137和/或cd25的表达水平可检测的活化的t细胞意指检测到全部测量的cd8+t细胞的至少8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％、或8％至60％、8％至55％、8％至50％、8％至45％、8％至40％、8％至35％、8％至30％、8％至25％、8％至24％、8％至23％、8％至22％、8％至21％、8％至20％、8％至19％、8％至18％、8％至17％、8％至16％、8％至15％cd137+和/或cd25+t细胞。优选地，在本上下文中，具有通过cd25的表达水平可检测的活化的t细胞意指检测到全部测量的cd8+t细胞的8％至25％、8％至24％、8％至23％、8％至22％、8％至21％或8％至20％cd25+t细胞。优选地，在本上下文中，具有通过cd137的表达水平可检测的活化的t细胞意指检测到全部测量的cd8+t细胞的8％至20％、8％至19％、8％至18％、8％至17％、8％至16％、8％至15％cd137+t细胞。通过采用本发明的抗体实现全部cd8+t细胞的至少8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％、或8％至60％、8％至55％、8％至50％、8％至45％、8％至40％、8％至35％、8％至30％、8％至25％、8％至24％、8％至23％、8％至22％、8％至21％、8％至20％、8％至19％、8％至18％、8％至17％、8％至16％、8％至15％cd137+和/或cd25+t的所述活化，本发明的抗体为0％至80％、0％至75％、0％至70％、0％至65％、0％至60％、0％至55％、0％至50％、0％至45％、0％至40％、0％至35％、0％至30％、0％至25％、0％至20％、0％至15％、0％至10％、0％至5％岩藻糖基化的，优选地为4％至80％、4％至75％、4％至70％、4％至65％、4％至60％、4％至55％、4％至50％、4％至45％、4％至40％、4％至35％、4％至30％、4％至25％、4％至20％、4％至15％、4％至10％岩藻糖基化的或5％以下岩藻糖基化的，最优选地为4％岩藻糖基化的(图15)。通过采用本发明的抗体实现全部cd8+t细胞的至少15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％cd137+和/或cd25+t细胞的所述活化，本发明的抗体为0％至80％、0％至75％、0％至70％、0％至65％、0％至60％、0％至55％、0％至50％、0％至45％、0％至40％、0％至35％、0％至30％、0％至25％、0％至20％、0％至15％、0％至10％、0％至5％岩藻糖基化的，优选地为4％至80％、4％至75％、4％至70％、4％至65％、4％至60％、4％至55％、4％至50％、4％至45％、4％至40％、4％至35％、4％至30％、4％至25％、4％至20％、4％至15％、4％至10％岩藻糖基化的或5％以下岩藻糖基化的，最优选地为4％岩藻糖基化的且如本文其它地方所示在结合pd-l1的(scfv区的)vh结构域的cdr中具有突变。一般而言，将100.000个t细胞用于，比如实施例15中描述的混合实验。通常，t细胞包含cd4+t细胞(cd4)以及cd8+t细胞(cd8)和少量天然杀伤t细胞(nkt)。所使用的cd8+t细胞的量可以通过应用现有技术中关于总t细胞(cd45+cd3+)中cd8+t细胞(cd45+cd3+cd8+)的量的参考文献来获得，优选地为36％。采用36％的优选百分比的量，例如全部测量的cd8+t细胞的至少8％cd137+和/或cd25+t细胞，意指具有例如至少2880个cd137+和/或cd25+t细胞(valiathan等，2014,immunobiology219,487-496)。这同样适用于上面列出的其它百分比值。
为了研究可如何诱导特异性和增强的t细胞活化，进行另一个采用modc和分离的t细胞的同种异体mlr，结果表明fcγr可对使用岩藻糖减少的抗-pd-l1抗体的t细胞活化增加起关键作用。因此，可考虑该增加的t细胞活化与结合fcγr的能力、优选地与结合fcγriiia的能力相关，由此认为与fc-n-糖基化间接相关。
由于另一种具有无关特异性(称为阻断)的岩藻糖减少的抗体的添加，该种由于岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)而增加的t细胞活化将被抑制至与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)或非糖基化的抗-pd-l1higg1(阿特珠单抗)相当的水平(图12)。
实施例12中描述的该实验可证明了fcγr一般对由于应用岩藻糖减少的抗pd-l1抗体而增加的t细胞活化具有重要作用。由于从实施例4已知，与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，单特异性抗-pd-l1和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1的岩藻糖减少的变体可显示与fcγriiia的结合增加，更有说服力的是，特异性受体fcγriiia可能是t细胞活化增强的原因。因此，通过与fcγri(cd64)，包括同种型fcγriia、fcγriib、fcγriic的fcγrii(cd32)，或包括同种型fcγriiia或fcγriiib的fcγriii(cd16)的结合增强，优选地通过与fcγriiia的结合增强，可介导t细胞活化。
最后，如本文其它地方所示，在结合pd-l1的scfv区的vh结构域中具有不同cdr突变、优选地具有如seqidno.64(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第26位具有甘氨酸至丙氨酸的突变和在根据kabat编号的第31位具有天冬氨酸至谷氨酸的突变)所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.66(在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第28位具有苏氨酸至丝氨酸的突变)和72(在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的第62位具有丝氨酸至苏氨酸的突变)所示的氨基酸序列的岩藻糖减少的双特异性抗体可进一步显示与未突变的pm-pdl-gexfuc-相当的增强的cd25t细胞活化(图23)。这些数据揭示了，与包含大于80％核心岩藻糖基化的糖基化的参照抗体相比，本发明的岩藻糖减少的双特异性抗体和/或在结合pd-l1的scfv区的vh结构域中具有不同cdr突变的、优选地具有如seqidno.64所示的氨基酸序列或具有如seqidno.66和72所示的氨基酸序列的岩藻糖减少的双特异性抗体也可以增强t细胞活化。
通过提供本发明的抗体，本发明无疑地使现有技术更充实，因为采用糖基-优化的抗体来活化t细胞对于可能与t细胞活化相关的所有类型的疾病是非常令人鼓舞的方法。
如已经讨论的，作为经由fc区的糖基化使fcγr介导的效应子功能增加的可选方法，努力致力于通过fc工程化增加fc区的亲和力。
一般而言，抗体药物开发的重点是使抗体的头(top)部工程化，该部分负责结合抗原靶标。然而，如genentech、xencor或medimmune等的不同地点的研究人员通过致力于使抗体的fc区工程化来进行抗体药物开发，该fc区负责所述抗体的天然免疫功能。已经识别了fc区内的若干突变(对已经被靶向于增强fc效应子功能的氨基酸的选择)直接或间接地与fc受体的结合增强、也因此是细胞的细胞毒性(例如adcc和/或adcp)增强相关联。genentech的研究人员识别了突变s239d/a330l/i332e(lazar等，2006,“engineeredantibodyfcvariantswithenhancedeffectorfunction”,pnas103,4005–4010和shields等，2001,“highresolutionmappingofthebindingsiteonhumanigg1forfcγri,fcγrii,fcγriii,andfcrnanddesignofigg1variantswithimprovedbindingtothefcγr”,j.biol.chem.276,6591–6604)，medimmune的研究人员识别了突变f243l(stewart等，2011,“avarianthumanigg1-fcmediatesimprovedadcc”,proteinengineering,designandselection24,671–678)和xencor的研究人员识别了g236a(richards等，2008,“optimizationofantibodybindingtofcγriiaenhancesmacrophagephagocytosisoftumorcells”,molcancerther7,2517–2527)。
根据lazar等(2006)构建了包括单突变体s239d和i332e、双突变体s239d/i332e以及三突变体s239d/i332e/a330l的不同变体，使之表达、纯化并筛选fcγr亲和力。这些变体，特别是a330l与s239d/i332e的组合显示与特异性fcγriiia受体的结合显著增强。包括双(s239d/i332e)突变体的变体还提供与特异性fcγriiia受体的结合显著增加。s239d/i332e和s239d/i332e/a330l变体还提供显著的adcc增强。
本发明可包括一种包含一个或多个序列突变的抗体，其中与未突变的抗体相比，所述抗体与fcγriiia的结合可增加。这些序列突变可以选自根据eu-命名法的s238d、s239d、i332e、a330l、s298a、e333a、l334a、g236a、l235v、f243l、r292p、y300l、v305i和p396l，其中编号是根据kabat中的eu索引。包含来自上文列出的那些的一个或多个序列突变的本发明的抗体可以是单特异性pd-l1抗体或能够结合ta-muc1并且以其scfv区域结合pd-l1的双特异性抗体。此外，本发明还可设想能够结合pd-l1并且以其scfv区域结合ta-muc1并且包含来自上文列出的那些的一个或多个序列突变的双特异性抗体。与不具有突变的参照抗体相比，本发明的不是去岩藻糖基化的但包含一个或多个序列突变的抗体可增强t细胞活化。选自上文列出的序列突变的单一突变或选自上文列出的任何序列突变的双重、三重、四重、五重突变可导致与fcγr的结合、优选地与fcγriiia的结合增加，从而导致增强的t细胞活化。在具体的实施方案中，在它们的fc部分中包含三重突变g236a/s239d/i332e或在它们的fc部分中包含五重突变l235v/f243l/r292p/y300l/p396l的本发明的抗体可以是优选的。包含三重突变g236a/s239d/i332e或包含五重突变l235v/f243l/r292p/y300l/p396l的本发明的抗体可以是正常岩藻糖基化的单特异性pd-l1抗体或能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的正常岩藻糖基化的双特异性抗体，其可显示增加的fcγriiia结合和由此增强的t细胞活化。本发明还进一步包含能够结合pd-l1并且以其scfv区结合ta-muc1且包含三重突变g236a/s239d/i332e和五重突变l235v/f243l/r292p/y300l/p396l的双特异性抗体，其可显示增加的fcγriiia结合和由此增强的t细胞活化。
已清楚地表明，即使两种正常岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体，其中第一种根据kabat编号在抗体的fc部分中包含三个氨基酸改变s239d、i332e和g236a(pdl-gexh9d8mut1)和第二种根据kabat编号在抗体的fc部分中包含氨基酸改变：l235v、f243l、r292p、y300l和p396l(pdl-gexh9d8mut2)，均显示出与它们的未突变对应物(pdl-gexh9d8)相当的抗原结合(图16)，所述抗体显示增加的fcγriiia接合(图17)和增加的t细胞活化(图18)。因此，通过采用本发明的抗体实现全部cd8+t细胞的至少15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％cd137+和/或cd25+t细胞的所述活化，本发明的抗体在它们的fc部份中包含三重突变g236a/s239d/i332e或在它们的fc部份中包含五重突变l235v/f243l/r292p/y300l/p396l。
本发明可进一步包含缺少fc糖基化的抗体，因此该抗体是非糖基化的，并且包含一个或多个所述序列突变或选自上文列出的任何序列突变的任何双重、三重、四重、五重突变，该抗体可导致与fcγriiia的结合增加并由此导致增强的t细胞活化。
综上，现在从本发明中已知，与(i)不具有或具有弱的结合fcγriiia的pd-l1抗体(例如阿特珠单抗)和与(ii)具有正常fcγriiia结合的pd-l1抗体(pdl-gex-h9d8)相比，所述pd-l1抗体(pdl-gexfuc-)可能够通过增强的与免疫细胞的fcγr、优选地与fcγriiia的结合来增强t细胞活化。从本发明中还已知，与能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1且具有正常fcγriiia结合的抗体(pm-pdl-gex-h9d8)相比，所述能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的抗体(pm-pdl-gexfuc-)可能够通过增强的与免疫细胞的fcγr、优选地与fcγriiia的结合来增强t细胞活化。这同样适用于fcγri和/或fcγrii。
换言之，与(i)非糖基化的pd-l1抗体(例如阿特珠单抗)和与(ii)糖基化的、正常岩藻糖基化的pd-l1抗体(pdl-gex-h9d8)相比，所述糖基化的、基本上去岩藻糖基化的pd-l1抗体可能够通过增强的与免疫细胞的fcγr、优选地与fcγriiia的结合来增强t细胞活化。本发明可进一步预期一种糖基化的、基本上去岩藻糖基化的、能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的抗体(pm-pdl-gex-h9d8)，与糖基化的、正常岩藻糖基化的、能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的抗体(pm-pdl-gex-h9d8)相比，所述抗体可能够通过增强的与免疫细胞的fcγr、优选地与fcγriiia的结合来增强t细胞活化。
另外，发明人发现，与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1相比，在去岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1存在下，树突细胞显示出更成熟的表型。采用流式细胞术通过不同标志物的表达证明了上述结论。与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1相比，去岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1存在下cd16(fcγriii)和共刺激分子cd40和cd86以及dc-标志物cd83以更高水平表达(图13b、c、d和e)。
在实施例13中描述的实验表明，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1可能对dc的成熟状态具有积极作用，dc的成熟又反过来可以使t细胞活化，从而有助于决定t细胞活化。因此，可将t细胞活化看作伴有树突细胞的成熟和/或共刺激分子(如cd40、cd86等)和成熟标志物(比如cd83)的表达。
通过本发明的抗体可以决定经由fcγriiia依赖性的dc成熟的t细胞应答增强，其中本发明的抗体的特征在于fc区与dc上的fcγr、优选地与fcγriiia的结合增强。
为此目的并考虑到使用pd-l1抗体和/或能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的抗体来增强t细胞活化，本发明可进一步涵盖将本文所述的抗体和/或本文所述的能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的抗体用在治疗中。特别地，本发明可进一步涵盖将本文所述的pd-l1抗体和/或本文所述的能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的抗体用在用于活化t细胞的方法中。所述t细胞的活化可用于癌症疾病、炎性疾病、病毒感染性疾病和自身免疫疾病的治疗。优选地，t细胞活化可用于癌症疾病的治疗。
癌症疾病可选自胸腺癌、淋巴瘤(lymphomaincl.)、何杰金氏淋巴瘤、恶性胸膜孤立性纤维性肿瘤(msft)、阴茎癌、肛门癌、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌(hnsc)、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌(sclc)、外阴癌(鳞状细胞癌)、膀胱癌、宫颈癌、非黑色素瘤皮肤癌、腹膜(后)癌、黑色素瘤、胃肠道间质瘤(gist)、恶性胸膜间皮瘤、肾细胞癌(rcc)、肾癌、肝细胞癌(hcc)、食管和胃食管交界处癌、肝外胆管癌、男性生殖道恶性肿瘤、小肠恶性肿瘤、肉瘤、胰腺癌，胃癌(胃腺癌)、乳腺癌、结肠直肠癌(crc)、恶性间皮瘤、merkel细胞癌、鳞状细胞癌、晚期癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌(ucc)、肺癌。优选地，癌症疾病可选自黑色素瘤、癌(carcinoma)、淋巴瘤、肉瘤和间皮瘤，包括肺癌、肾癌、膀胱癌、胃肠癌、皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌，最优选地，癌症疾病可以是乳腺癌。
此外，本发明可设想本发明的抗体，优选的pd-l1抗体和/或能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的抗体在制备用于在癌症疾病、炎性疾病、病毒感染性疾病和自身免疫疾病中治疗应用的药物中的用途。此外，本发明还可涵盖本发明的抗体、优选的pd-l1抗体和/或能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的抗体在用于制备用于活化t细胞的药物中的用途。
此外，本发明可包括活化受试者中t细胞的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的所述抗体、优选的pd-l1抗体和/或能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的抗体。
本发明可进一步考虑将本发明的抗体用在用于活化受试者中t细胞的方法中。可以向患有癌症疾病和/或炎性疾病和/或病毒感染性疾病和/或自身免疫疾病的受试者施用本发明的抗体。所述受试者可以是本文所述的任何受试者，优选地为人受试者。优选地，所述受试者需要施用本发明的抗体。优选地，所述受试者可以是动物，包括鸟类。动物可以是哺乳动物，包括大鼠、兔、猪、小鼠、猫、狗、绵羊、山羊和人。最优选地，所述受试者为人。在一个实施方案中，受试者为成人。
定义：
术语“糖基化”是指在抗体的fc区的ch2结构域中的每个保守的天冬酰胺297(asn297/n297)(根据eu命名法)处的两个n-连接的低聚糖。本文中，优选地，单特异性pd-l1抗体和能够结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的双特异性抗体的糖基化以及包含大于80％岩藻糖基化的正常糖基化的抗体(如正常岩藻糖基化的抗体，比如pdl-gex-h9d8和pm-pdl-gexh9d8)的糖基化是指人糖基化，其中所述单特异性pd-l1抗体和双特异性抗体是糖基化的，基本上缺少核心岩藻糖基化(如岩藻糖减少的抗体，比如pdl-gex-fuc-和pm-pdl-gexfuc-)。
术语“人糖基化”是指在fc区的ch2结构域中的每个n297处具有两个n-连接的低聚糖的已知fc-n-糖基化。本发明的糖基化的抗体所含有的n-连接的低聚糖的一般结构可以是复合型的并将该结构描述如下：一种甘露糖基-壳二糖核心(man3glcnac2-asn)，其就存在/不存在二等分的n-乙酰葡糖胺和最内核心l-岩藻糖(fuc)具有变化，其可以α-1.6-连接至n-乙酰葡糖胺。此外，复合型n-糖基化的特征可在于与甘露糖基-壳二糖核心(man3glcnac2-asn)连接的触角n-乙酰葡糖胺，其具有可选的通过半乳糖和唾液酸部分的触角延伸。本发明的最内核心l-岩藻糖可以α-1.6-连接至n-连接的低聚糖结构的n-乙酰葡糖胺(glcnac)。
术语“n-连接的低聚糖”是指与fc区结合的n-连接的糖链/n-聚糖，更具体地，其是指与fc区的两个ch2结构域结合的、优选地附着至fc区的两个ch2结构域中的每个n297上的n-连接的糖链/n-聚糖。总之，本发明包含两个n-连接的低聚糖。
术语“正常糖基化的抗体”是指在fc区的ch2结构域中的每个n297处含有两个n-连接的低聚糖的抗体，由此，其是糖基化的。此外，本发明的正常糖基化的抗体也可包含大于80％α-1,6-核心岩藻糖基化。因此，本发明的正常糖基化的抗体可指糖基化的抗体，为正常岩藻糖基化的。在此，正常糖基化的抗体可指双功能单特异性pdl-gex-h9d8，也可指三功能双特异性pm-pdl-gexh9d8，可将它们用作所述参照抗体。在本上下文中，本发明的正常糖基化的抗体是可从chodhfr-(atccno.crl-9096)获得的。
术语“非糖基化的抗体”可指抗-pd-l1抗体，无论该抗体是单特异性的还是双特异性的，该种抗体可不具有或具有弱的结合fcγr的能力，优选地结合fcγriiia的能力，由此具有降低的t细胞活化。非糖基化的抗体在fc区的ch2结构域中的每个n297处不含两个n-连接的低聚糖，因此是非糖基化的。优选地，可将非糖基化的roche抗体“阿特珠单抗”用作所述参照抗体。该抗体是本领域技术人员已知的。通常，阿特珠单抗中的非糖基化是由氨基酸序列中天冬酰胺至丙氨酸(aa297)(根据eu命名法)的修饰导致的。
术语“非糖基化的”还可与术语“非糖基化的(aglycosylated)”或其名词形式比如“非糖基化(aglycosylation)”互换使用。
术语“正常岩藻糖基化的抗体”可指一种抗体，无论该种抗体是单特异性的还是双特异性的，其可具有正常的结合fcγr的能力，优选地结合fcγriiia的能力，因此具有正常的t细胞活化。本发明的正常岩藻糖基化的抗体是糖基化的，具有两个与fc区结合的n-连接的糖链，其中在全部与fc区结合的复合型n-连接的糖链中，1,6-核心岩藻糖的含量可大于80％。本发明的正常岩藻糖基化的抗体可含有大于80％小于100％的核心岩藻糖基化的n-聚糖。优选地，本发明的正常糖基化的抗体可含有约80％至100％、85％至95％的岩藻糖基化的n-聚糖，或90％至95％的岩藻糖基化的n-聚糖。本发明的正常岩藻糖基化的抗体可含有大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的岩藻糖基化的n-聚糖。优选地，术语“正常岩藻糖基化的抗体”可是指术语“包含大于80％核心岩藻糖基化的糖基化的抗体”。在本文中，正常岩藻糖基化的抗体可是指双功能单特异性pdl-gex-h9d8以及三功能双特异性pm-pdl-gexh9d8抗体。
术语“岩藻糖减少的抗体”可指一种抗体，无论该种抗体是单特异性的还是双特异性的，其可具有增加的结合fcγr的能力，优选地具有增加的结合fcγriiia的能力，因此具有增强的t细胞活化。本发明的岩藻糖减少的抗体在fc区的ch2结构域中的每个n297处含两个n-连接的低聚糖，因此是糖基化的。此外，本发明的岩藻糖减少的抗体可包含0％至80％的α-1,6-核心岩藻糖基化。特别地，本发明的岩藻糖减少的抗体包含fc区并具有两个与fc区结合的复合型n-连接的糖链，其中在全部与fc区结合的复合型n-连接的糖链中，1,6-核心岩藻糖的含量可为0％至80％。优选地，本发明的岩藻糖减少的抗体可包含约0％至70％、0％至60％、0％至50％、0％至40％、0％至30％、0％至20％、0％至10％或10％至50％、15％至50％、20％至50％、25％至50％、30％至50％、35％至50％、40％至50％、45％至50％或1％至20％、1％至15％、1％至10％、1％至5％或5％至30％、5％至20％、5％至15％的岩藻糖基化的n-聚糖。优选地，本发明的岩藻糖减少的抗体可包含0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20.0％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、41％、42％、43％、44％、45.0％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61.0％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或甚至80％的岩藻糖基化的n-聚糖。本发明的岩藻糖减少的抗体可指为岩藻糖减少的糖基化抗体。在此，本发明的岩藻糖减少的抗体可指双功能单特异性pdl-gex-fuc-以及三功能双特异性pm-pdl-gexfuc-抗体。
术语“岩藻糖减少的”是指α-1,6-核心岩藻糖含量的减少，该α-1,6-核心岩藻糖附着在作为甘露糖基-壳二糖核心(man3glcnac2-asn)的一部分的第一n-乙酰葡糖胺(glcnac)上，该glcnac与fc区的ch2结构域中的每个保守氨基酸天冬酰胺n297结合。该术语还可与术语“去岩藻糖基化的/基本上去岩藻糖基化的”或其名词形式比如“去岩藻糖基化”互换使用。该术语“岩藻糖减少的”还可与术语“基本上缺少核心岩藻糖基化”互换使用。在本发明中还可将岩藻糖减少的抗体看作糖基-优化的抗体。
可将术语“基本上缺少核心岩藻糖基化”用于抗体，其中所述抗体是岩藻糖减少的/去岩藻糖基化的；或用于具有与fc区结合的n-连接的糖链的糖基化的抗体，其中在全部与fc区结合的复合型n-连接的糖链中，α-1,6-核心岩藻糖的含量可为0％至80％。换言之，所述抗体可以是0％至80％岩藻糖基化的。
术语“核心岩藻糖基化的n-聚糖”是指大量抗体的n-聚糖，所述抗体是核心岩藻糖基化的。核心岩藻糖基化的n-聚糖的摩尔量相对于大量抗体的总n-聚糖的分子量可以大于80％或为0％至80％。优选地，对于本发明所述的正常岩藻糖基化的抗体所描述的大于80％的核心岩藻糖基化n-聚糖的含量自大量抗体确定，其中大量抗体的总n-聚糖的分子量的大于80％可以是核心α-1,6-岩藻糖基化的。优选地，对于本发明所述的岩藻糖减少的抗体所描述的0％至80％的核心岩藻糖基化的n-聚糖的含量也可自大量抗体确定，其中大量抗体的n-聚糖的分子量的0％至80％可以是核心α-1,6-岩藻糖基化的。在实施例1中确定了n-聚糖的核心岩藻糖基化。通过α-(1.6)-岩藻糖基转移酶(fut8)可以催化岩藻糖的添加或减少，该种酶在人体中由fut8基因编码。
术语“核心岩藻糖”或“核心岩藻糖基化的”是指单糖岩藻糖，其附着在作为甘露糖基-壳二糖核心(man3glcnac2-asn)的一部分的第一n-乙酰葡糖胺(glcnac)的α-1,6位，该glcnac与fc区的ch2结构域中的每个保守氨基酸天冬酰胺n297结合。
术语“α-1,6-核心岩藻糖的含量”是指核心岩藻糖的量，该核心岩藻糖附着在作为甘露糖基-壳二糖核心(man3glcnac2-asn)的一部分的第一n-乙酰葡糖胺(glcnac)上，该glcnac与fc区的ch2结构域中的每个保守氨基酸天冬酰胺n297结合。在全部与fc区结合的复合型n-连接的糖链中，本发明的正常岩藻糖基化的抗体的α-1,6-核心岩藻糖的含量可大于80％，或本发明的岩藻糖减少的抗体的α-1,6-核心岩藻糖的含量可为0％至80％。优选地，可通过大量抗体确定α-1,6-核心岩藻糖的含量。优选地，可以通过hilic-uplc-hiresqtofmsms分析所述α-1,6-核心岩藻糖的含量，即对于大量抗体分析n-聚糖的α-1,6-核心岩藻糖的含量(参见实施例1)。
如本领域所熟知的，“抗体”是一种免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子能够通过位于其可变区的至少一个表位识别位点特异性结合靶标(表位)。如本文所使用的术语“抗体”可包含单克隆抗体和多克隆抗体以及它们的(天然存在的或合成的)片段或变体，包括融合蛋白，该融合蛋白包含含具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分和包含具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的抗体的任何其它修饰构型。抗体片段或抗体的示例性实例可包括dab、fab、fab′、f(ab’)2、fv、单链fvs(scfv)、与κ轻链的恒定结构域或重链的ch3结构域偶联的单链fvs(scfv)、双抗体和微型抗体。当在本文中提及时，本发明的抗体也可以是包含大量抗体的组合物。
抗体是由通过二硫键连接的两个重(h)链和两个轻(l)链组成的。根据功能将抗体分为能够结合抗原的fab(片段，抗原结合)区和具有比如补体活化或与fc受体结合的效应子功能的fc(片段，可结晶)区。
术语“大量抗体”是指抗体的量，优选地是聚糖分析所需的抗体的量，优选地为15μg。
本发明的抗体可以是人源化抗体(或其抗原结合变体或片段)。术语“人源化抗体”是指含有来自非人抗体的最小序列的抗体。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白，其包含来自移植到人免疫球蛋白(“受体抗体”)上的非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的免疫球蛋白(“供体抗体”)的高可变区的残基。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(fr)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包含既不存在于受体抗体也不存在于供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体可包含基本上全部的至少一个、通常为两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高可变环对应于非人免疫球蛋白的高可变环，并且全部或基本上全部的fr是人免疫球蛋白序列的那些fr。人源化抗体任选还可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)，典型地包含至少一部分人免疫球蛋白的恒定区。
抗体可以是单特异性抗体。术语“单特异性”是指与、优选地特异性地与单个表位或抗原决定簇反应的任何同源抗体或其抗原结合区。对相同抗原均具有亲和力的抗体；对一个抗原或一个表位具有特异性的抗体；或对一类细胞或组织具有特异性的抗体均可称为“单特异性抗体”。术语“单特异性抗体”还可称为单克隆抗体，也缩写为“moab”，正如通常对该术语的理解那样。然而，除了像产生单克隆抗体那样从常规生殖细胞中产生单特异性抗体，还可通过其它方式产生它们。然而，如本文所用的术语“单特异性抗体”可以是指天然的、修饰的或合成的同源抗体，并且可以包括杂合或嵌合抗体。特别地，优选地，本发明的单特异性抗体包含与免疫检查点蛋白结合的vh和vl结构域，优选地，所述免疫检查点蛋白是pd-l1。因此，本发明的单特异性抗体可包括pd-l1抗体。本发明可以进一步设想包含结合癌抗原的vh和vl结构域的抗体，优选地，所述癌抗原是ta-muc1。因此，本发明的单特异性抗体还可包括ta-muc1抗体。
如果在本发明中提出结合pd-l1的单特异性抗体，则所述抗体具有示于seqidno.40和50的氨基酸序列。在此，seqidno.40是指所述pd-l1抗体的重链，而seqidno.50是指所述pd-l1抗体的轻链。本发明还可包含一种包含多肽链的结合pd-l1的抗体，其中每条多肽链可与seqidno.40和50中的任意一个具有至少50％的序列同一性。一种结合pd-l1的抗体可包含多肽链，其中每条多肽链可与seqidno.40和50中的任意一个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。本发明可设想一种包含能够结合pd-l1的重链或包含轻链的结合pd-l1的抗体，所述重链与seqidno.40具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性，所述轻链与seqidno.50具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。
此外，本发明还可包括一种结合pd-l1的抗体，所述抗体具有示于seqidnos.41-49和seqidno.50的氨基酸序列中的任意一个。在此，seqidnos.41-49是指本发明的结合pd-l1的抗体的突变的重链，从而在所述抗体的vh结构域的cdr中具有不同的突变。
本发明还可包含一种结合pd-l1的抗体，所述抗体在其vh结构域的cdr中具有不同的突变，从而具有如seqidnos.51-59和18所示的氨基酸序列。在此，seqidnos.51-59是指本发明的结合pd-l1的抗体的突变的vh结构域，从而在所述抗体的vh结构域的cdr中具有不同的突变。
本发明的在其vh结构域的cdr中具有不同的突变的抗体可包含以下vhcdr：具有如seqidno.60和68所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.62和69所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.63和70所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.64所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.65和71所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.66和72所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.63和72所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.67和74所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.63和68所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.61所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.73所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合；或具有如seqidno.75所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合。
在本发明的上下文中，可将术语“双特异性抗体”理解为具有两个不同抗原结合区(基于序列信息)的抗体。这可以意指不同的靶标的结合，但也包括与一个靶标中的不同表位的结合。特别地，本发明的双特异性抗体优选能够结合ta-muc1并且还能够结合免疫检查点蛋白，其中优选地所述免疫检查点蛋白为pd-l1。此外，优选地，本发明还可提供能够结合pd-l1并且还能够结合癌抗原的抗体，其中优选地所述癌抗原为ta-muc1。本发明还可以考虑进一步结合免疫细胞上的另一分子的抗-pd-l1抗体，因此具有能够结合pd-l1并且还能够结合免疫细胞上的另一分子的抗体。
本发明通常设想一种结合ta-muc1并进一步结合pd-l1的双特异性抗体，该种双特异性抗体具有示于seqidno.13(或seqidno.37)和14和/或seqidno.15和16(或seqidno.38)的氨基酸序列。在此，seqidno.13(或seqidno.37)是指轻链，其中结合pd-l1的scfv区与所述轻链的恒定结构域偶联，而seqidno.14是指所述抗体的重链。seqidno.15是指重链，其中结合pd-l1的scfv区与fc区的ch3结构域偶联，而seqidno.16(或seqidno.38)是指所述抗体的轻链。在本发明中，可优选这样一种双特异性抗体，其包含与scfv区偶联的轻链(seqidno.13或seqidno.37)和重链(seqidno.14)，其中所述scfv区与所述轻链的恒定结构域偶联并能够结合pd-l1。本发明还可包含一种抗体，其具有根据seqidno.13(或seqidno.37)的两个轻链和根据seqidno.14的两个重链，其中所述轻链与能够与pd-l1结合的scfv区偶联。
本发明还可包含一种包含多肽链的抗体，其中每条多肽链可与seqidno.13(或seqidno.37)和14以及15和16(或seqidno.38)中的任意一个具有至少50％的序列同一性。本发明的抗体可包含多肽链，其中每条多肽链可与seqidno.13(或seqidno.37)和14以及15和16(或seqidno.38)中的任意一个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。本发明可设想一种包含与能够与pd-l1结合的scfv区偶联的轻链和重链，所述轻链与seqidno.13(或seqidno.37)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性，所述重链与seqidno.14具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。本发明还可进一步考虑一种具有与能够与pd-l1结合的scfv区偶联的两个轻链和两个重链的抗体，所述两个轻链与seqidno.13(或seqidno.37)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性，所述两个重链与seqidno.14具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。本发明还可包括包含与能够结合pd-l1的scfv区偶联的重链和轻链的抗体，所述重链与seqidno.15具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性，所述轻链与seqidno.16(或seqidno.38)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。本发明还可进一步考虑一种具有与能够与pd-l1结合的scfv区偶联的两个重链和两个轻链的抗体，所述两个重链与seqidno.15具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性，所述两个轻链与seqidno.16(或seqidno.38)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。本发明的包含多肽链的抗体也可能够结合pd-l1和ta-muc1，其中每条多肽链可与seqidno.13(或seqidno.37)和14以及15和16(或seqidno.38)中的任意一个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。
如果在本发明中提出结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的双特异性抗体，其在scfv区的vh结构域的cdr中具有不同的突变，则所述抗体还可具有如seqidnos.76-79和14所示的氨基酸序列中的任意一个。在此，seqidnos.76-79是指轻链，其中结合pd-l1的scfv区与结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的双特异性抗体的所述轻链的恒定结构域偶联，所述双特异性抗体在结合pd-l1的scfv区的vh结构域的cdr中具有不同的突变。优选地，所述双特异性抗体具有如seqidno.77或78所示的氨基酸序列，其中所述双特异性抗体结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1，并在scfv区的vh结构域的cdr中具有不同的突变。
本发明还包括一种双特异性抗体，该双特异性抗体结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1，并在scfv区的vh结构域的cdr中具有不同的突变，其中所述抗体还可具有如seqidnos.80-83和16(或seqidno.38)中所示的氨基酸序列中的任意一个。在此，seqidnos.80-83是指重链，其中结合pd-l1的scfv区与结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的双特异性抗体的fc区的ch3结构域偶联，所述双特异性抗体在结合pd-l1的scfv区的vh结构域的cdr中具有不同的突变。
术语“未突变的抗体”是指一种抗体，该种抗体可不含根据eu-命名法的一个或多个选自s238d、s239d、i332e、a330l、s298a、e333a、l334a、g236a、l235v、f243l、r292p、y300l、v305i和p396l的序列突变。优选地，未突变的抗体可不包含三重突变g236a/s239d/i332e和五重突变l235v/f243l/r292p/y300l/p396l。
术语“fab区”是指“片段，抗原结合区”，其由一条完整的轻链和一条重链的可变和ch1结构域组成。然而，还可将fab区分成由vh和vl结构域组成的可变片段(fv)以及由轻链的恒定结构域(cl)和ch1结构域组成的恒定片段(fb)。
术语“fc区”是指“片段，可结晶区”，其由抗体的两条重链的第二恒定结构域(ch2)和第三恒定结构域(ch3)组成。其具有比如补体活化或与fc受体结合的效应子功能。
术语“scfv区”是指术语单链片段可变区，其包含重链的可变结构域(vh结构域)和轻链的可变结构域(vl结构域)。通过连接子，优选通过gs-连接子，scfv区可以对称地与所述抗体的轻链的恒定结构域偶联(“c-末端-融合”)或与所述抗体的fc区的ch3结构域偶联(“c-末端-融合”)。通过连接子将scfv区与所述抗体的轻链的恒定结构域偶联或与所述抗体的fc区的ch3结构域偶联。原则上，连接子可以具有任何氨基酸数目和任何氨基酸序列。连接子可包含至少3、5、8、10、15或20个氨基酸，优选地包含至少5个氨基酸。此外，连接子可包含小于50或小于40、35、30、25、20个氨基酸，优选小于45个氨基酸。特别地，连接子可包含5至20个氨基酸，优选地包含5个氨基酸。优选地，连接子可以由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在连接子中，甘氨酸和丝氨酸可以以2比1、3比1、4比1或5比1(甘氨酸残基数比丝氨酸残基数)的比率存在。例如，连接子可以包含四个甘氨酸残基、之后是一个丝氨酸残基的序列，特别地，包含该序列的1、2、3、4、5或6个重复。由氨基酸序列的2个重复组成的连接子可以是指(ggggs)2，由氨基酸序列的4个重复组成的连接子可以是指(ggggs)4，和由氨基酸序列的6个重复组成的连接子可以是指(ggggs)6，特别地，由氨基酸序列的4个重复组成的连接子(ggggs)4可以是优选的。将scfv区与轻链的恒定结构域偶联或与重链的ch3结构域偶联的连接子可以是gs-连接子。另外，连接子可包含在人体中不显示或显示很小的潜在免疫原性的序列，优选地包含为人序列或天然存在的序列的序列。因此，连接子与相邻氨基酸可不显示或仅显示很小的潜在免疫原性。
此外，优选地，scfv区由通过gs-连接子、优选地通过4gs-连接子连接的一个vh(seqidno.17)和一个vl结构域(seqidno.18)组成。本发明的抗体可具有两个scfv区，它们均与所述抗体的轻链的恒定结构域偶联或与所述抗体的fc区的ch3结构域偶联。如果在本发明中提出结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的双特异性抗体，该双特异性抗体在结合pd-l1的scfv区的vh结构域的cdr中具有不同突变，则本发明还可包括一种scfv区，其由一个突变的vh结构域和一个未突变的vl结构域组成，所述vh结构域优选地具有如seqidnos.51-59所示的氨基酸序列中的任意一个，所述vl结构域如seqidno.18所示。
scfv区可以是基因工程化的，但是未修饰的序列也可以用于形成scfv区。尽管移除了恒定区，scfv区仍然概括了原始亲本抗体的单价抗原结合特征。
本发明的所述抗体可包含结合免疫检查点蛋白的单链fv区，其中优选地，所述免疫检查点蛋白为pd-l1。这些单链fv区可与轻链的恒定结构域或与fc区的ch3结构域偶联。本发明的抗体可包含以下vh和vl结构域cdr：具有如seqidno.1-68所示的氨基酸序列，优选地其带来与pd-l1的结合。seqidnos.1-3可指scfv区的vh结构域cdr，而seqidnos.4-6可指scfv区的vl结构域cdr：
seqidno.1：glyphethrpheseraspsertrpilehis(pd-l1结合位点的vh结构域中的cdr1)，
seqidno.2：alatrpileserprotyrglyglyserthrtyrtyralaaspservallysgly(pd-l1结合位点的vh结构域中的cdr2)，
seqidno.3：arghistrpproglyglypheasptyr(pd-l1结合位点的vh结构域中的cdr3)。
seqidno.4：argalaserglnaspvalserthralavalala(pd-l1结合位点的vl结构域中的cdr1)，
seqidno.5：seralaserpheleutyrser(pd-l1结合位点的vl结构域中的cdr2)，
seqidno.6：glnglntyrleutyrhisproalathr(pd-l1结合位点的vl结构域中的cdr3)。
本发明还可包含一种抗体，其中与seqidno.1相比，能够结合pd-l1的scfv区的vh结构域cdr1可具有1、2、3、4或5个突变。此外，本发明还可包含一种抗体，其中与seqidno.2相比，能够结合pd-l1的scfv区的vh结构域cdr2可具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变。另外，本发明可考虑一种抗体，其中与seqidno.3相比，能够结合pd-l1的scfv区的vh结构域cdr3可具有1、2、3、4或5个突变。另外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.21的框架区1相比，scfv区的vh结构域框架区1可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个突变。此外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.22的框架区2相比，scfv区的vh结构域框架区2可具有1、2、3、4、5或6个突变。此外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.23的框架区3相比，scfv区的vh结构域框架区3可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个突变。本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.24的框架区4相比，scfv区的vh结构域框架区4可具有1、2、3、4或5个突变。本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.4相比，能够结合pd-l1的scfv区的vl结构域cdr1可具有1、2、3、4或5个突变。本发明可包括一种抗体，其中与seqidno.5相比，所述抗体在能够结合pd-l1的scfv区的vl结构域cdr2中具有1、2或3个突变。本发明还可涵盖一种抗体，其中与seqidno.6相比，所述抗体在scfv区的vl结构域cdr3中具有1、2、3或4个突变。此外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.25的框架区1相比，scfv区的vl结构域框架区1可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变。此外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.26的框架区2相比，scfv区的vl结构域框架区2可具有1、2、3、4、5、6或7个突变。另外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.27的框架区3相比，scfv区的vl结构域框架区3可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个突变。本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.28的框架区4相比，scfv区的vl结构域框架区4可具有1、2、3、4或5个突变。本发明的拥有具有所述突变的一个或多个vh和vl结构域cdr的抗体也可带来与pd-l1的结合。此外，本发明还可考虑一种包含scfv区的vh和vl结构域cdr的抗体，其可能够结合癌抗原，优选地能够结合ta-muc1。
如果在本发明中提出结合ta-muc1并且以其scfv区结合pd-l1的双特异性抗体，其在scfv区的vh结构域的cdr中具有不同的突变，则优选地所述抗体可包含以下vhcdr，优选地其带来与pd-l1的结合：seqidno.64，其在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第26位具有甘氨酸至丙氨酸的突变和在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第31位具有天冬氨酸至谷氨酸的突变；或如在本文其它地方所述的seqidno.66和seqidno.72，其中seqidno.66在vh结构域的cdr1中在根据kabat编号的第28位具有苏氨酸至丝氨酸的突变，seqidno.72在vh结构域的cdr2中在根据kabat编号的第62位具有丝氨酸至苏氨酸的突变。
术语“vh和vl结构域”可以是指本发明的抗体的fab区的重链可变结构域和轻链可变结构域。如果在本发明中提出scfv区的重链可变结构域和轻链可变结构域，则可采用术语“scfv区的vh和vl结构域”。
本发明的抗体的所述vh(seqidno.19)和vl结构域(seqidno.20或seqidno.39)可能够结合癌抗原，其中优选地所述癌抗原为ta-muc1。因此，本发明的双特异性抗体可包含优选地与ta-muc1结合的vh和vl结构域。本发明的抗体可包含以下vh和vl结构域cdr：具有示于seqidnos.7-12的氨基酸序列，其优选地带来与ta-muc1的结合。seqidnos.7-9可指vh结构域cdr，而seqidnos.10-12可指vl结构域cdr：
seqidno.7：asntyrtrpmetasn(ta-muc1结合位点的vh结构域中的cdr1)，
seqidno.8：gluileargleulysserasnasntyrthrthrhistyralagluservallysgly(ta-muc1结合位点的vh结构域中的cdr2)，
seqidno.9：histyrtyrpheasptyr(ta-muc1结合位点的vh结构域中的cdr3)。
seqidno.10：argserserlysserleuleuhisserasnglyilethrtyrphephe(ta-muc1结合位点的vl结构域中的cdr1)，
seqidno.11：glnmetserasnleualaser(ta-muc1结合位点的vl结构域中的cdr2)，
seqidno.12：alaglnasnleugluleuproprothr(ta-muc1结合位点的vl结构域中的cdr3)。
本发明还可包含一种抗体，其中与seqidno.7相比，vh结构域cdr1区可具有1、2或3个突变。此外，本发明还可包含一种抗体，其中与seqidno.8相比，vh结构域cdr2可具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变。另外，本发明可考虑一种抗体，其中与seqidno.9相比，vh结构域cdr3可具有1、2或3个突变。此外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.29的框架区1相比，vh结构域框架区1可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个突变。此外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.30的框架区2相比，vh结构域框架区2可具有1、2、3、4、5、6或7个突变。另外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.31的框架区3相比，vh结构域框架区3可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个突变。本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.32的框架区4相比，vh结构域框架区4可具有1、2、3、4或5个突变。
本发明还可设想一种抗体，其中与seqidno.10相比，vl结构域cdr1区可具有1、2、3、4、5、6、7或8个突变。本发明可包括一种抗体，其中与seqidno.11相比，所述抗体在vl结构域cdr2中具有1、2或3个突变。本发明可还涵盖一种抗体，其中与seqidno.12相比，所述抗体在vl结构域cdr3中具有1、2、3或4个突变。此外，本发明可还设想一种抗体，其中与seqidno.33的框架区1相比，vl结构域框架区1可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变。此外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.34的框架区2相比，vl结构域框架区2可具有1、2、3、4、5、6或7个突变。另外，本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.35的框架区3相比，vl结构域框架区3可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个突变。本发明可设想一种抗体，其中与seqidno.36的框架区4相比，vl结构域框架区4可具有1、2、3、4、5或6个突变。
此外，本发明的拥有一个或多个具有所述突变的vh和vl结构域cdr的抗体也可带来与ta-muc1的结合。本发明还可考虑一种包含vh和vl结构域cdr的抗体，其可能够结合免疫检查点蛋白，优选地能够结合pd-l1。
术语“框架区”是指cdr之前和之后的氨基酸区域以及vh和vl结构域中的或scfv区的vh和vl结构域中的cdr之间的氨基酸区域。
术语“cdr”是指互补决定区，其指β-链的可变环，在由b细胞产生的免疫球蛋白(抗体)中或与免疫球蛋白偶联的单链fv区中的轻链(vl)和重链(vh)可变结构域上各有三个，其负责与抗原结合。除非另有说明，否则本文公开的cdr序列遵循maass2007的定义(journalofimmunologicalmethods324(2007)13-25)。还有用于定义cdr的其它标准，比如如sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,usdepartmentofhealthandhumanservices(1991),eds.kabat等中描述的根据kabatcdr的定义。用于表征抗原结合位点的另一个标准是指如chothia(参见如，chothia等，(1992)；j.moi.biol.227:799-817；和tomlinson等，(1995)emboj.14:4628-4638)描述的高变环。还一个标准是oxfordmolecular'sabm抗体建模软件使用的abm定义。一般参见如proteinsequenceandstructureanalysisofantibodyvariabledomains.in:antibodyengineeringlabmanual(版本：duebel,s.和kontermann,r.,springer-verlag,heidelberg)。应当理解，参照maass的cdr定义描述的实施方案，可选地也可以使用类似的描述的关系来实施，比如参照kabatcdr、chothia高可变环或abm定义的环来实施。
术语“突变”是指置换、插入和/或缺失。突变可以发生在vh和vl结构域cdr中和/或发生在vh和vl结构域的相应的框架区中。突变也可以发生在scfv区的vh和vl结构域cdr中和/或发生在scfv区的vh和vl结构域的相应的框架区中。
术语“gs-连接子”是指一种肽连接子或具有甘氨酸(gly/g)和丝氨酸(ser/s)残基区段的序列。gs-连接子可含有5、10、15、20、25或大于25个氨基酸，优选含有5个氨基酸。大多数情况，可在抗体中使用常见的(g4s)4连接子重复(在此称为4gs-连接子-“ggggs-ggggs-ggggs-ggggs”)或(g4s)6连接子肽(在此称为6gs-连接子-“ggggs-ggggs-ggggs-ggggs-ggggs-ggggs”)。一般而言，4gs-连接子可以将scfv区的vh结构域与所述抗体的轻链的恒定结构域偶联或将scfv区的vh结构域与所述抗体的fc区的ch3结构域偶联。6gs-连接子可以将vh结构域与scfv区的vl结构域偶联，具有vh-连接子-vl取向。在此，本发明的双特异性的正常岩藻糖基化的和双特异性的岩藻糖减少的抗体可包含4gs-连接子。第一个4gs-连接子可以将scfv区的vh结构域与所述抗体的轻链的恒定结构域偶联或与所述抗体的fc区的ch3结构域偶联，另一4gs-连接子可以将vh结构域与scfv区的vl结构域偶联，具有vh-连接子-vl取向。
术语“双功能单特异性抗体”可指本发明的抗体，其中fc区可结合fcγr受体，优选地结合fcγriiia，而vh和vl结构域可结合免疫检查点蛋白，优选地，所述免疫检查点蛋白为pd-l1。本发明还可包含一种抗体，该种抗体包含与fcγr受体，优选地与fcγriiia结合的fc区，以及与癌抗原结合的vh和vl结构域，优选地所述癌抗原为ta-muc1。
术语“三功能双特异性抗体”可指本发明的一种抗体，其中fc区可结合fcγr受体，优选地结合fcγriiia，而vh和vl结构域可结合癌抗原，优选地所述癌抗原为ta-muc1。此外，所述能够结合ta-muc1的三功能双特异性抗体可进一步具有单链fv区，其可结合免疫检查点蛋白，优选地所述免疫检查点蛋白为pd-l1。本发明可优选所述能够结合ta-muc1并且以其scfv区能够结合pd-l1的三功能双特异性抗体。术语“三功能双特异性抗体”还可指本发明的一种抗体，其中fc区可结合fcγr受体，优选地结合fcγriiia，而vh和vl结构域可结合免疫检查点蛋白，优选地，所述免疫检查点蛋白为pd-l1。此外，该能够结合pd-l1的三功能双特异性抗体可进一步具有单链fv区，其可结合癌抗原，优选地所述癌抗原为ta-muc1。
术语“pm-pdl-gex”是指与pd-l1特异性组合的pankomab抗体，也称为双特异性pankomab-抗pddl1-gex抗体或抗-pd-l1/ta-muc1higg1抗体。pm-pdl-gex抗体由glycotopegmbh开发。在此，具有pd-l1特异性的pankomab抗体是三功能双特异性的。此外，作为pankomab-抗-pd-l1-gex抗体的scfv区的抗-pd-l1部分可以包含拮抗作用。
术语“pankomab”是指识别粘蛋白-1的肿瘤特异性表位(ta-muc1)的人源化单克隆抗体，从而使其能够在肿瘤muc1和非肿瘤muc1表位之间区分。它由glycotopegmbh开发。本发明的pankomab抗体能够结合癌抗原，优选地能够结合ta-muc1并与pd-l1特异性组合，因此能够以其scfv区结合免疫检查点蛋白，优选地所述免疫检查点蛋白为pd-l1。
术语“糖基-优化的抗体”是指这样一种抗体，在其fc区中的低聚糖的糖基化被修饰。在此，术语“糖基-优化的”是指在α-1,6位的低聚糖结构的去岩藻糖基化。由于与fcγriii、优选与fcγriiia的结合增加，糖基-优化提供了进一步增加抗肿瘤t细胞应答的机会。因此，由于携带fcγr的免疫细胞，糖基-优化的抗体具有直接杀死肿瘤细胞并耗尽pd-l1+免疫抑制细胞的潜力。
术语“免疫检查点蛋白”是指免疫系统中的蛋白质分子，其调节免疫应答，以抗炎或促炎。它们通过调高信号(共刺激分子)或调低信号来监测免疫应答的正确功能。存在比如a2ar、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、btla、ctla-4、ido、kir、lag3、pd-1、pd-l1、tim-3、vista(蛋白质)的抑制(抗炎)免疫检查点蛋白和比如cd27、cd40、ox40、gitr和cd137(4-1bb)的促炎免疫检查点蛋白质。本发明可优选抑制免疫检查点蛋白。在此，优选地，所述免疫检查点蛋白是指pd-l1。
术语“癌抗原”是指在癌细胞中产生的抗原物质。由于癌抗原在癌细胞中的相对丰度，因此可将它们用于识别特定的癌细胞。一些癌症具有丰富的若干癌症抗原。癌症相关抗原可包括但不限于her2、egfr、vegf、ta-muc1、psa。在此，优选地，所述癌抗原指ta-muc1。术语“肿瘤抗原”可互换使用。
术语“衍生自”或“由其衍生”可与术语“源自(originatedfrom/originatedtherefrom)”或“获自”/“由其获得”互换使用。例如，细胞或细胞系可以源自本发明中提到的另一种细胞或细胞系。
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应当注意的是，如本文所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数指代，除非上下文另有清楚说明。因此，例如，提到的“试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，而提到的“该方法”包括提到的本领域普通技术人员已知的可以改进或替代本文所述方法的等同的步骤和方法。
除非另有说明，在一系列要素前面的术语“至少”应当理解为是指系列中的每个要素。本领域技术人员将会意识到或者能够使用不超过常规实验而确定，许多与本文描述的本发明的具体实施方案的等同物。预期这类等同物涵盖在本发明中。
术语“和/或”无论在本文何处使用均包括“和”、“或”以及“所述术语所连接的元素的全部或任何其它组合”的含义。
术语“小于”或其反义词“大于”不包括具体数字。例如，小于20意为小于所指定的数字。同样地，多于或大于意为多于或大于所指定的数字，例如大于80％意为大于或多于所指定的数字80％。
贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，词语“包括/包含(comprise)”以及变形词语诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数或步骤、或整数或步骤的集合，但并不排除任何其它的整数或步骤、或整数或步骤的集合。当本文使用时，术语“包括/包含(comprising)”能够被术语“含有(containing)”或“包括(including)”替代，或有时本文使用时会以术语“具有”替代。本文使用的“由……组成”排除任何未规定的元素、步骤或成分。
术语“包括(including)”意为“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体的方法学、方案、材料、试剂和物质等，因为这些能够改变。本文所使用的术语只用于描述特定实施方案的目的而并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
本说明书全文所引用的所有出版物(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、说明书等)，无论在前还是在后，其通过参考以全文并入本文。本文的任何内容均不能被解释为承认本发明由于在先发明而不早于这样的公开物。在通过参考方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致时，本说明书将取代任何这样的材料。
本文引用的所有文献和专利文献的内容均通过参考整体并入本文。
通过以下仅出于说明性目的提供的实施例可以更好的理解本发明及其优势。这些实施例并非意在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
在下文中，更详细地描述本发明，并具体参考这些实施例，然而其不用于限制本发明。
实施例1：与单特异性pdl-gexh9d8和双特异性pm-pdl-gexh9d8相比，单特异性pdl-gexfuc-和双特异性pm-pdl-gexfuc-具有减少的核心岩藻糖基化。
单特异性pdl-gexfuc-和双特异性pm-pdl-gexfuc-仅包含低百分比的核心岩藻糖基化的n-聚糖，并由此被称为岩藻糖减少的(图1)。
文献中讨论了fcn-糖基化主要影响抗体与fc受体的结合，并因此起到介导adcc的作用。通过hilic-uplc-hiresqtofmsms(亲水相互作用超高效色谱与高分辨率四极杆-飞行时间串联质谱联用)分析了单特异性抗体pdl-gexh9d8和pdl-gexfuc-的n-糖基化和双特异性抗体pm-pdl-gexh9d8和pm-pdl-gexfuc-的n-糖基化。
简言之，通过
实施例2：岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示与它们的正常岩藻糖基化的对应物相当的阻断能力。
岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示对pd-l1/pd-1和pd-l1/cd80阻断相当的阻断能力。
开发了两种不同的竞争性elisa，以分析抗-pd-l1抗体抑制pd-l1与其结合配偶体pd-1和cd80相互作用的潜力。通过描绘pd-1和pd-l1之间的阻断情况，将pd-l1/pd-1阻断elisa看作最相关的elisa。将fc标记的人pd-l1(tebu-bio/bpsbioscience)涂布在maxisorp96孔板上。洗涤并封闭后，在系列稀释的抗pd-l1higg1或双特异性抗pd-l1/ta-muc1higg1存在下加入固定浓度的生物素化的人pd-1(tebu-bio/bpsbioscience)，由此竞争与pd-1的结合。洗涤后，通过链霉抗生物素蛋白-pod和tmb检测pd-1的结合。结果显示，抗-pd-l1抗体对pd-1与pd-l1之间相互作用的抑制越高，在450nm处产生的od越低。
首先，在pd-l1/pd-1阻断elisa中，将岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)与它们的正常岩藻糖基化的对应物(pdl-gexh9d8和pm-pdl-gexh9d8)进行比较(图2a)。对全部四个变体均检测到pd-1结合的浓度依赖性阻断。
此外，如上所述开发了相关阻断elisa，但是采用pd-l1的另一功能相关配体，cd80配体代替了pd-1(图2b)。
实施例3：岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示相当的与ta-muc1的结合。
岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示相当的与ta-muc1的结合。如所预期的，单特异性抗-pd-l1(pdl-gexh9d8)显示不与细胞系zr-75-1结合(图3)。
通过流式细胞术分析岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexh9d8和fuc-)与表达人ta-muc1的肿瘤细胞的结合特性。将具有强ta-muc1表达但具有很少或不存在pd-l1表达的乳腺癌细胞系zr-75-1用于确定ta-muc1结合。简言之，收获靶细胞并与系列稀释的指定抗体一起温育。然后，细胞洗涤并于4℃下在黑暗中与第二山羊抗-higgaf488缀合的抗体一起温育。通过流式细胞术分析细胞。
实施例4：与正常岩藻糖基化的变体相比，抗-pd-l1higg1和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1的岩藻糖减少的变体显示与fcγriiia的结合增加。
与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1(pdl-gexfuc-)具有降低的ec50值，这表明与正常岩藻糖基化的变体相比，岩藻糖减少的变体与fcγriiia的结合增强了～5倍。相比而言，双特异性岩藻糖减少的抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)的相对效力测定为10.4。基于此，对于双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1，与正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的变体的与fcγriiia的结合也增强了～5倍(图4)。
抗体依赖性细胞毒性(adcc)的诱导和抗体在一个位点上与肿瘤抗原结合以及经由该抗体的fc部分与这些细胞上的另一位点上的fcγiiia受体的结合而募集效应细胞有关。预期higg1的去岩藻糖基化导致与fcγriiia的更高亲和力，由此导致由人外周血单核细胞介导的针对表达相应抗原的肿瘤细胞的更强adcc。
为了在分子水平上表征抗体fc部分与fcγriiia的结合，开发了采用perkinelmer
实施例5：与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示对ta-muc+和pd-l1+肿瘤细胞的杀伤增加。
与正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1相比，岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)对表达高水平ta-muc1和仅表达微小水平pd-l1的乳腺癌细胞系zr-75-1显示显著增强的adcc活性。与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1(pdl-gexfuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)介导对pd-l1阳性肿瘤细胞(比如前列腺癌细胞系du-145)显著增强的adcc。
采用铕释放分析来分析介导针对肿瘤细胞的adcc的能力。简言之，通过电穿孔将铕(eu2+)加载至靶细胞，并在测试抗体存在下将靶细胞与fcγriiia转染的nk细胞系以30:1的e:t比一起温育5小时。使用荧光板读数器定量向上清液中释放的铕(指示抗体介导的细胞死亡)。通过用triton-x-100温育靶细胞实现最大释放，并且在仅含有靶细胞且无抗体和效应细胞的样品中测量自发释放。特异性细胞毒性计算如下：％特异性裂解＝(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100。
首先，分析对表达高水平ta-muc1和仅表达微小水平pd-l1的乳腺癌细胞系zr-75-1的adcc(图5a，参见实施例3)。
第二，分析对强表达pd-l1和具有中等ta-muc1表达的前列腺癌细胞系du-145的adcc(图5b和c)。通过分别采用pdl-gexh9d8和ta-muc1特异性抗体的流式细胞术分析pd-l1和ta-muc1表达，所述特异性抗体通过荧光染料标记的二抗检测。
第三，通过采用岩藻糖减少的抗-pd-l1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，再次分析了对前列腺癌细胞系du-145的adcc(图5d)。
实施例6：岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示对pd-l1+pbmc无adcc效应。
未检测到岩藻糖减少的抗-pd-l1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1对b细胞(图6a)和单核细胞(图6b)介导的adcc效应。
据报道，pd-l1不仅在肿瘤细胞上表达，还在不同的免疫细胞如单核细胞或b细胞上表达。由于与它们的正常岩藻糖基化的对应物相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1对肿瘤细胞显示显著增加的adcc效应，则可以预期它们还介导针对pd-l1+免疫细胞的adcc。
由于描述了单核细胞和b细胞表达pd-l1，因此在基于facs的adcc分析中将两种免疫细胞群作为潜在的靶细胞进行了分析。简言之，通过经由磁性活化细胞分选(macs)的阴性选择从pbmc中分离b细胞和单核细胞至纯度>95％。将商购抗-cd20mab(
实施例7：在基于细胞的pd-1/pd-l1阻断生物分析中，岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示相当的结果。
根据pd-l1/pd-1阻断elisa(参见实施例1)，对去-(pm-pdl-gexfuc-)和正常岩藻糖基化(pm-pdl-gexh9d8)的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1均检测到pd-1/pd-l1阻断(break)的相当的剂量依赖性释放。正如所预期的，纳武单抗(nivolumab)作为阳性对照是有效的(图7)。
pd-1/pd-l1阻断生物分析(promega)是一种基于生物发光细胞的测定，其可用于测量设计为阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体的效力。该分析由两种基因工程化的细胞系组成：
i.具有荧光素酶报告基因的pd-1阳性应答细胞(jurkatt细胞)
ii.pd-l1阳性刺激物cho-k1细胞
由于pd-1/pd-l1相互作用，tcr信号传导和应答细胞中产生的nfat介导的荧光素酶活性受到抑制。在阻断pd-1或pd-l1的抗体存在下可以逆转这种抑制，产生可以在发光读数器中检测的发光信号。
实施例8：在同种异体混合淋巴细胞反应(mlr)中，岩藻糖减少的和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1和岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1诱导相当的il-2。
由于岩藻糖减少的(pm-pdl-gexfuc-)和正常岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexh9d8)和岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)诱导相当的量的il-2，因此未检测到去岩藻糖基化对il-2分泌的影响。
混合淋巴细胞反应(mlr)是一种功能分析，建立该分析以用于分析pd-l1阻断抗体对通过表达pd-l1的抗原呈递细胞抑制表达pd-1的t细胞的作用。该分析测量来自作为应答物的一位供体的t细胞(分离的t细胞或pbmc)对来自作为刺激物的另一供体的衍生自单核细胞的树突细胞(modc)的应答(＝同种异体mlr)。
简言之，通过采用磁性活化细胞分选的阴性选择从血沉棕黄层中分离单核细胞，然后用il-4和gm-csf使所述单核细胞分化成modc达7天。然后，通过流式细胞术分析modc的表型(图8a)。
此外，在分化后，用分离的t细胞培育modc，刺激物/应答物比率为1:10。3天后，收获上清液用于il-2elisa(affimetryxebioscience)(图8b)。
实施例9：与正常岩藻糖基化的对应物和不具有/具有弱的结合fcγr的能力的抗-pd-l1抗体相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示增加的t细胞活化。
在同种异体mlr中，与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexh9d8)相比，以及与不具有/具有弱的结合fcγr的能力的抗-pd-l1抗体(阿特珠单抗)相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)诱导增强的t细胞活化。
通过流式细胞术经由cd25的表达在第5天分析了在1μg/ml测试抗体存在下采用modc和来自三个不同供体(图9a、b和c)的分离的t细胞的同种异体mlr的cd8t细胞(cd3+cd8+细胞)的活化。未添加抗体的mlr作为阴性对照。
事实上，岩藻糖减少的抗-pd-l1和抗-pd-l1/ta-muc1抗体诱导了增加的t细胞活化是令人惊奇的，这是因为在阻断elisa(实施例2)、在pd-1/pd-l1阻断生物分析(参见实施例7)和在il-2分泌(实施例8)中未观察到糖基化变体之间的差异。采用不同供体的t细胞观察到了由于岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1引起的t细胞活化增加，并预期这是一般效果。
岩藻糖减少的单特异性抗-pd-l1(pdl-gexfuc-)和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)诱导增强的cd8t细胞活化这一发现是非常重要的，因为cd8t细胞代表了在抗肿瘤应答中起关键作用并具有直接杀伤癌细胞能力的细胞毒性t细胞。
实施例10：在采用分离的t细胞和总pbmc的mlr中，与正常岩藻糖基化的对应物以及不具有/具有弱的结合fcγr的能力的抗-pd-l1抗体相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1显示增加的t细胞活化。
在采用t细胞或pbmc作为应答细胞的mlr中，通过测量cd3+cd8+细胞上cd25和cd137的表达确定，与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)相比，与双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexh9d8)相比和与不具有/具有弱的结合fcγr的能力的抗-pd-l1抗体(阿特珠单抗)相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)诱导更强的cd8t细胞活化。
此外，通过测量cd25和cd137的表达确定，采用pbmc培育modc还导致增加的cd4t细胞活化(cd3+cd8-细胞和因此的(ergo)cd4t细胞)，这在之前的采用分离的t细胞的mlr中未观察到。含有nk细胞的pbmc(而不是分离的t细胞)的应用表明由nk细胞或潜在的nk细胞介导的对pd-l1+细胞的adcc效应对t细胞活化没有负面影响。
在同种异体mlr中，在1μg/ml测试抗体存在下采用modc培育分离的t细胞或pbmc达5天。未添加抗体的mlr作为阴性对照。然后，对于采用分离的t细胞(图10a和b)的mlr和采用pbmc(图10c和d)的mlr，通过cd8t细胞上cd25和cd137的表达测量cd8t细胞活化。对于采用pbmc(图10e和f)的mlr，通过cd4t细胞上cd25和cd137的表达测量cd4t细胞活化。
实施例11：岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1还使t细胞上的cd69表达增加。
与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)和双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexh9d8)相比，岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)和岩藻糖减少的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1higg1(pm-pdl-gexfuc-)诱导cd8t细胞上更强的cd69表达(图11)。
在第5天通过流式细胞术分析在1μg/ml测量抗体存在下采用分离的t细胞和modc的同种异体mlr的d8t细胞(cd3+cd8+细胞)的cd69表达。将未添加抗体的mlr用作阴性对照。除了cd25和cd137之外，cd69是另外的活化标志物。
实施例12：经由pd-l1的阻断，fcγr对于t细胞活化具有关键作用。
该同种异体mlr表明，fcγr结合对应用岩藻糖减少的抗-pd-l1抗体而增加的t细胞活化具有重要作用。由于另一种具有无关特异性(称为阻断)的岩藻糖减少的抗体(该mlr中不存在其抗原)的添加，该种由于岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)而增加的t细胞活化将被抑制至与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)或不具有/具有弱的结合fcγr能力的非糖基化的抗-pd-l1higg1(阿特珠单抗)相当的水平(图12)。
在该采用modc和分离的t细胞的同种异体mlr中，以岩藻糖减少的抗-pd-l1higg110倍高的浓度加入具有无关特异性(称为阻断)的岩藻糖减少的抗体，因此阻断岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1与fcγr的结合。该实验证明了fcγr对由于岩藻糖减少的抗-pd-l1抗体而增加的t细胞活化的重要作用。
实施例13：与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1相比，在去岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1存在下的树突细胞显示出更成熟的表型。
与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1(pdl-gexh9d8)相比，在岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)存在下，modc显示较少的cd14表达。相比而言，与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1higg1相比，在岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1存在下cd16(fcγriii)和共刺激分子cd40和cd86和dc-标志物cd83以更高水平表达。
在第5天通过流式细胞术分析该mlr的modc的不同标志物的表面表达，所述不同标志物比如cd14(图13a)、cd16(图13b)、cd40(图13c)、cd86(图13e)和cd83(图13d)。
这一实施例表明岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1抗体对dc的成熟状态具有阳性作用。
实施例14：通过正常岩藻糖基化的抗-pdl1higg1和岩藻糖减少的抗-pdl1higg1的细胞毒性测量了t细胞活化。
为了分析由于岩藻糖减少的抗-pd-l1引起的t细胞活化增加是否导致功能益处，收获在pdl-gexh9d8、pdl-gexfuc-和阿特珠单抗[1μg/ml]存在或不存在的同种异体mlr中活化的t细胞，并随后采用铕释放分析测量它们的细胞毒性能力，所述t细胞来自与实施例9中所示相同的不同供体。简言之，通过电穿孔将铕(eu2+)加载至作为靶细胞的癌细胞系zr-75-1，并将其与收获的t细胞以50:1的e:t-比(e:t-比＝效应子:靶-比，效应子＝t细胞；靶＝zr-75-1)一起温育5小时。使用荧光板读数器定量向上清液中释放的铕(指示靶细胞裂解)。将细胞毒性表示为相比于未刺激的t细胞(未经由于同种异体modc导致的刺激的t细胞)的倍数变化。
与pdl-gexh9d8、阿特珠单抗和培养基对照(培养基对照＝未添加测试抗体的mlr后的t细胞)相比，采用pdl-gexfuc-活化的t细胞导致增加的细胞毒性(图14)。
实施例15：通过采用具有不同量的核心岩藻糖基化的岩藻糖减少的抗-pd-l1higg1(pdl-gexfuc-)的t细胞活化检测。
为了找出pdl-gexfuc-的最具前景的核心岩藻糖基化的量，将具有89％核心岩藻糖基化的n-聚糖的pdl-gexh9d8与具有4％核心岩藻糖基化的n-聚糖的pdl-gex混合以模拟不同量的核心岩藻糖基化。在mlr分析中测试抗体或更确切地说抗体混合物的t细胞活化，在所述mlr中采用来自一个供体的分离的t细胞作为应答物和采用来自另一个供体的单核细胞衍生的树突细胞(modc)作为刺激物。读数为cd8+t细胞上的cd25和cd137表达(图15)。
实施例16：在它们的fc部分具有突变的抗-pd-l1抗体与它们的未突变的对应物的相当的抗原结合。
采用在它们的fc部分的突变产生两个正常岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体。第一，具有根据eu命名法的三个氨基酸改变：s239d、i332e和g236a的抗-pd-l1抗体(称为pdl-gexh9d8mut1)。第二，具有根据eu命名法的五个氨基酸改变：l235v、f243l、r292p、y300l和p396l的抗-pd-l1抗体(称为pdl-gexh9d8mut2)。
在抗原elisa中，测试pdl-gexh9d8mut1和pdl-gexh9d8mut2与未突变的pdl-gexh8d8相比的与pd-l1的结合。因此，将人pd-l1涂布在maxisorp96孔板上。洗涤和封闭后，加入系列稀释的测试抗体。洗涤后，使用pod偶联的二抗和tmb测定测试抗体的结合。
在pdl-gexh9d8、pdl-gexh9d8mut1和pdl-gexh9d8mut2之间未观察到pd-l1结合的明显差异(图16)。
实施例17：与它们的未突变的对应物相比，在它们的fc部分具有突变的抗-pd-l1抗体的fcγriiia接合增加。
如实施例4所述采用perkinelmer
通过向较低有效浓度移动可以看出，与未突变的pdl-gexh9d8相比，pm-pdl-gexh9d8mut1和pm-pdl-gexh9d8mut2显示与fcγriiia增加的结合(图17)。
实施例18：与它们的未突变的对应物相比，在它们的fc部分具有突变的抗-pd-l1抗体的t细胞活化增加。
在如实施例9所述的同种异体mlr中测定正常岩藻糖基化的fc-突变的pdl-gexh9d8mut1和pdl-gexh9d8mut2相比于正常岩藻糖基化的未突变的pdl-gexh9d8和相比于去岩藻糖基化的未突变的pdl-gexfuc-的t细胞活化。
与pdl-gexh9d8相比，pm-pdl-gexmut1和pdl-gexmut2显示增加的t细胞活化，这证明通过采用去岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体(pdl-gexfuc-)或通过采用包含导致增强的fcγriiia结合的序列突变的抗-pd-l1抗体可以实现增强的t细胞活化(图18)。
实施例19：通过增殖来表现由于去岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体而增强的t细胞活化。
在第5天通过流式细胞术分析测量的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)稀释度测定mlr中cd8t细胞的增殖。因此，用cfse标记细胞。增殖细胞显示由于细胞分裂导致的cfse信号减少。
与正常岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体(pdl-gexh9d8)相比和与非糖基化的抗-pd-l1(阿特珠单抗)相比，去岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体(pdl-gexfuc-)显示cd8t细胞增殖增加(图19)。
实施例20：在癌细胞存在下观察到了由于去岩藻糖基化的抗-pd-l1抗体和去岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1抗体而增强的t细胞活化。
在mlr中比较了去岩藻糖基化的抗-pd-l1(pdl-gexfuc-)与去岩藻糖基化的双特异性抗-pd-l1/ta-muc1抗体(pm-pdl-gexfuc-)在癌细胞存在下诱导t细胞活化的能力。因此，mlr中加入了多种癌细胞系(t细胞:modc:癌细胞-比＝100:10:1)。
测量cd8t细胞上的cd25表达揭示了hsc-4和zr-75-1的存在对cd8t细胞活化没有明显影响，而ramos细胞似乎具有一定的抑制性影响。然而，在所有测试的癌细胞系存在下均观察到通过pdl-gexfuc-和pm-pdl-gexfuc-的增强的活化(图20)。
实施例21：pdl-gexcdr突变体显示了与未突变的对应物相当的结合和阻断能力。
产生了不同的pdl-gexfuc-的cdr突变体：
pdl-gexfuc-cdrmuta(seqidno.60+seqidno.68)
pdl-gexfuc-cdrmutb(seqidno.62+seqidno.69)
pdl-gexfuc-cdrmutc(seqidno.63+seqidno.70)
pdl-gexfuc-cdrmutd(seqidno.64)
pdl-gexfuc-cdrmute(seqidno.65+seqidno.71)
pdl-gexfuc-cdrmutf(seqidno.66+seqidno.72)
pdl-gexfuc-cdrmutg(seqidno.63+seqidno.72)
pdl-gexfuc-cdrmuth(seqidno.67+seqidno.74)
pdl-gexfuc-cdrmuti(seqidno.63+seqidno.68)
并i)采用表达pd-l1的du-145和流式细胞术分析，测试了这些突变体结合pd-l1的能力，和ii)在如实施例2所述的pd-l1/pd-1阻断elisa中测试了这些突变体的阻断能力。全部cdr突变体均显示了与未突变的pdl-gexfuc-相当的结合和阻断(图21a和b)。
实施例22：pm-pdl-gexcdr突变体显示了与未突变的对应物相当的结合和阻断能力。
产生了pm-pdl-gexfuc-的不同的cdr突变体：
pm-pdl-gexfuc-cdrmuta(seqidno.64)
pm-pdl-gexfuc-cdrmutb(seqidno.66+seqidno.72)，
并在多个分析中测试：
i)在采用pd-l1抗原的elisa中测试这些突变体的结合pd-l1的能力。因此，将人pd-l1涂布至maxisorp96孔板。洗涤并阻断后，加入系列稀释的测试抗体。洗涤后，使用pod偶联的二抗和tmb测定测试抗体的结合(图22a)。
ii)在如实施例2所述的pd-l1/pd-1阻断elisa中测试了这些突变体的阻断能力(图22b)。
iii)采用表达ta-muc1的t-47d和流式细胞术分析，测试了这些突变体结合ta-muc1的能力(图22c)。
cdr部分的突变对pm-pdl-gex与pd-l1的结合、pd-l1/pd1相互作用的阻断和与ta-muc1的结合没有明显影响。
实施例23：pm-pdl-gexcdr突变体显示与未突变的对应物相当的增强的cd8t细胞活化。
产生了pm-pdl-gexh9d8和pm-pdl-gexfuc-的不同的cdr突变体：
pm-pdl-gexh9d8cdrmuta(seqidno.64)
pm-pdl-gexh9d8cdrmutb(seqidno.66+seqidno.72)
pm-pdl-gexfuc-cdrmuta(seqidno.64)
pm-pdl-gexfuc-cdrmutb(seqidno.66+seqidno.72)，
并如实施例9所述在同种异体mlr中测试这些突变体活化t细胞的能力。cdr突变的pm-pdl-gexfuc-变体活化的cd8t细胞(cd8t细胞的cd25+细胞)的程度与未突变的pm-pdl-gexfuc-相当。cdr突变的pm-pdl-gexh9d8变体活化cd8t细胞的程度与未突变的pm-pdl-gexh9d8相当(图23)。
序列表
<110>葛莱高托普有限公司
<120>pd-l1和ta-muc1抗体
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340345350
proserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleu
355360365
vallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasn
370375380
glyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspser
385390395400
aspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserarg
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trpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluglyleu
420425430
hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys
435440445
<210>15
<211>713
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>与scfv区偶联的重链
<400>15
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
sermetargleusercysvalalaserglyphepropheserasntyr
202530
trpmetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
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65707580
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145150155160
glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser
165170175
serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser
180185190
leuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasn
195200205
thrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhis
210215220
thrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproserval
225230235240
pheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthr
245250255
progluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspproglu
260265270
vallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalys
275280285
thrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalser
290295300
valleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlys
305310315320
cyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrile
325330335
serlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupro
340345350
proserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleu
355360365
vallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasn
370375380
glyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspser
385390395400
aspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserarg
405410415
trpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluglyleu
420425430
hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylysgly
435440445
glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglygly
450455460
glyglysergluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalgln
465470475480
proglyglyserleuargleusercysalaalaserglyphethrphe
485490495
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500505510
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aspservallysglyargphethrileseralaaspthrserlysasn
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545550555560
tyrtyrcysalaargarghistrpproglyglypheasptyrtrpgly
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glnglythrleuvalthrvalseralaglyglyglyglyserglygly
580585590
glyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspilegln
595600605
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610615620
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serpheleutyrserglyvalproserargpheserglyserglyser
660665670
glythraspphethrleuthrileserserleuglnprogluaspphe
675680685
alathrtyrtyrcysglnglntyrleutyrhisproalathrphegly
690695700
glnglythrlysvalgluilelysarg
705710
<210>16
<211>220
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>轻链
<400>16
aspilevalmetthrglnserproleuserasnprovalthrprogly
151015
gluproalaserilesercysargserserlysserleuleuhisser
202530
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505560
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65707580
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leugluleuproprothrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105110
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115120125
gluglnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasn
130135140
phetyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleu
145150155160
glnserglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysasp
165170175
serthrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyr
180185190
glulyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuser
195200205
serprovalthrlysserpheasnargglyglucys
210215220
<210>17
<211>118
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pd-l1结合位点的vh结构域
<400>17
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheseraspser
202530
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354045
alatrpileserprotyrglyglyserthrtyrtyralaaspserval
505560
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65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
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100105110
leuvalthrvalserala
115
<210>18
<211>108
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pd-l1结合位点的vl结构域
<400>18
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspvalserthrala
202530
valalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile
354045
tyrseralaserpheleutyrserglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro
65707580
gluaspphealathrtyrtyrcysglnglntyrleutyrhisproala
859095
thrpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg
100105
<210>19
<211>117
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vh结构域
<400>19
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
sermetargleusercysvalalaserglyphepropheserasntyr
202530
trpmetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
glygluileargleulysserasnasntyrthrthrhistyralaglu
505560
servallysglyargphethrileserargaspaspserlysasnser
65707580
leutyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr
859095
tyrcysthrarghistyrtyrpheasptyrtrpglyglnglythrleu
100105110
valthrvalserser
115
<210>20
<211>114
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vl结构域
<400>20
aspilevalmetthrglnserproleuserasnprovalthrprogly
151015
gluproalaserilesercysargserserlysserleuleuhisser
202530
asnglyilethrtyrphephetrptyrleuglnlysproglyglnser
354045
proglnleuleuiletyrglnmetserasnleualaserglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuargile
65707580
serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysalaglnasn
859095
leugluleuproprothrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105110
serlys
<210>21
<211>25
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pd-l1结合位点的vh结构域框架区
<400>21
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaser
2025
<210>22
<211>13
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pd-l1结合位点的vh结构域框架区2
<400>22
trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
1510
<210>23
<211>32
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pd-l1结合位点的vh结构域框架区3
<400>23
argphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyrleugln
151015
metasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysalaarg
202530
<210>24
<211>11
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pd-l1结合位点的vh结构域框架区4
<400>24
trpglyglnglythrleuvalthrvalserala
1510
<210>25
<211>23
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pd-l1结合位点的vl结构域框架区1
<400>25
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcys
20
<210>26
<211>15
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pd-l1结合位点的vl结构域框架区2
<400>26
trptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuiletyr
151015
<210>27
<211>32
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pd-l1结合位点的vl结构域框架区3
<400>27
glyvalproserargpheserglyserglyserglythraspphethr
151015
leuthrileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcys
202530
<210>28
<211>11
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>pd-l1结合位点的vl结构域框架区4
<400>28
pheglyglnglythrlysvalgluilelysarg
1510
<210>29
<211>30
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vh结构域框架区1
<400>29
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
sermetargleusercysvalalaserglyphepropheser
202530
<210>30
<211>14
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vh结构域框架区2
<400>30
trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalgly
1510
<210>31
<211>32
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vh结构域框架区3
<400>31
argphethrileserargaspaspserlysasnserleutyrleugln
151015
metasnserleulysthrgluaspthralavaltyrtyrcysthrarg
202530
<210>32
<211>11
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vh结构域框架区4
<400>32
trpglyglnglythrleuvalthrvalserser
1510
<210>33
<211>23
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vl结构域框架区1
<400>33
aspilevalmetthrglnserproleuserasnprovalthrprogly
151015
gluproalaserilesercys
20
<210>34
<211>15
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vl结构域框架区2
<400>34
trptyrleuglnlysproglyglnserproglnleuleuiletyr
151015
<210>35
<211>32
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vl结构域框架区3
<400>35
glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr
151015
leuargileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcys
202530
<210>36
<211>12
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vl结构域框架区4
<400>36
pheglyglnglythrlysvalgluilelysserlys
1510
<210>37
<211>485
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>与scfv区偶联的轻链
<400>37
aspilevalmetthrglnserproleuserasnprovalthrprogly
151015
gluproalaserilesercysargserserlysserleuleuhisser
202530
asnglyilethrtyrphephetrptyrleuglnlysproglyglnser
354045
proglnleuleuiletyrglnmetserasnleualaserglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuargile
65707580
serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysalaglnasn
859095
leugluleuproprothrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105110
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
115120125
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
130135140
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
145150155160
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
165170175
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
180185190
lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser
195200205
provalthrlysserpheasnargglyglucysglyglyglyglyser
210215220
glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglu
225230235240
valglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyglyser
245250255
leuargleusercysalaalaserglyphethrpheseraspsertrp
260265270
ilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala
275280285
trpileserprotyrglyglyserthrtyrtyralaaspservallys
290295300
glyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyrleu
305310315320
glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala
325330335
argarghistrpproglyglypheasptyrtrpglyglnglythrleu
340345350
valthrvalseralaglyglyglyglyserglyglyglyglysergly
355360365
glyglyglyserglyglyglyglyseraspileglnmetthrglnser
370375380
proserserleuseralaservalglyaspargvalthrilethrcys
385390395400
argalaserglnaspvalserthralavalalatrptyrglnglnlys
405410415
proglylysalaprolysleuleuiletyrseralaserpheleutyr
420425430
serglyvalproserargpheserglyserglyserglythraspphe
435440445
thrleuthrileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyr
450455460
cysglnglntyrleutyrhisproalathrpheglyglnglythrlys
465470475480
valgluilelysarg
485
<210>38
<211>219
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>轻链
<400>38
aspilevalmetthrglnserproleuserasnprovalthrprogly
151015
gluproalaserilesercysargserserlysserleuleuhisser
202530
asnglyilethrtyrphephetrptyrleuglnlysproglyglnser
354045
proglnleuleuiletyrglnmetserasnleualaserglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuargile
65707580
serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysalaglnasn
859095
leugluleuproprothrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105110
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
115120125
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
130135140
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
145150155160
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
165170175
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
180185190
lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser
195200205
provalthrlysserpheasnargglyglucys
210215
<210>39
<211>113
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>ta-muc1结合位点的vl结构域
<400>39
aspilevalmetthrglnserproleuserasnprovalthrprogly
151015
gluproalaserilesercysargserserlysserleuleuhisser
202530
asnglyilethrtyrphephetrptyrleuglnlysproglyglnser
354045
proglnleuleuiletyrglnmetserasnleualaserglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuargile
65707580
serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysalaglnasn
859095
leugluleuproprothrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105110
arg
<210>40
<211>448
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>重链pdl-gex
<400>40
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheseraspser
202530
trpilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
alatrpileserprotyrglyglyserthrtyrtyralaaspserval
505560
lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr
65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaargarghistrpproglyglypheasptyrtrpglyglnglythr
100105110
leuvalthrvalseralaalaserthrlysglyproservalphepro
115120125
leualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleugly
130135140
cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn
145150155160
serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln
165170175
serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser
180185190
serleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser
195200205
asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthr
210215220
histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser
225230235240
valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg
245250255
thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro
260265270
gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala
275280285
lysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalval
290295300
servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr
305310315320
lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr
325330335
ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu
340345350
proproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcys
355360365
leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser
370375380
asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp
385390395400
seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser
405410415
argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglugly
420425430
leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys
435440445
<210>41
<211>448
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>重链pdl-gex变体
<400>41
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrileseraspser
202530
trpilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
alatrpilethrprotyrglyglyserthrtyrtyralaaspserval
505560
lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr
65707580
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151015
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151015
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151015
lysgly
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151015
lysgly
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glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglu
225230235240
valglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyglyser
245250255
leuargleusercysalaalaseralaphethrpheserglusertrp
260265270
ilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala
275280285
trpileserprotyrglyglyserthrtyrtyralaaspservallys
290295300
glyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyrleu
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glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala
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355360365
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<220>
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aspilevalmetthrglnserproleuserasnprovalthrprogly
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100105110
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115120125
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145150155160
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165170175
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210215220
glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglu
225230235240
valglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyglyser
245250255
leuargleusercysalaalaserglypheserpheseraspsertrp
260265270
ilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala
275280285
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290295300
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