与相关申请的交叉引用本申请要求2017年8月23日提交的其公开内容为所有目的整体通过引用并入本文的美国临时专利申请号62/549,201、2017年9月14日提交的其公开内容为所有目的整体通过引用并入本文的美国临时专利申请号62/558,509、2017年9月14日提交的美国临时专利申请号62/558,510、2017年9月14日提交的其公开内容为所有目的整体通过引用并入本文的美国临时专利申请号62/558,511、2017年9月14日提交的其公开内容为所有目的整体通过引用并入本文的美国临时专利申请号62/558,514、2017年10月2日提交的其公开内容为所有目的整体通过引用并入本文的美国临时专利申请号62/566,828、2017年11月3日提交的其公开内容为所有目的整体通过引用并入本文的美国临时专利申请号62/581,357和2017年12月20日提交的其公开内容为所有目的整体通过引用并入本文的美国临时专利申请号62/608,384的利益和优先权。序列表本申请含有以ascii格式电子提交并整体通过引用并入本文的序列表。所述在2018年8月22日生成的ascii拷贝被命名为dfy-034wo_sl.txt，大小为448,772字节。本发明涉及结合到nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的多特异性结合蛋白。
背景技术：
：：尽管在文献中已报道了治疗癌症的大量研究尝试和科学进展，但这种疾病依然是显著的健康问题。一些最频繁被诊断到的癌症包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠直肠癌。前列腺癌是男性中最常见的癌症形式。乳腺癌仍然是女性中主导的死亡原因。血液和骨髓癌症、包括多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤，也是频繁被诊断到的癌症类型。当前用于这些癌症的治疗方案不对所有患者有效和/或可能具有实质性严重副作用。其他类型的癌症对于使用现有治疗方案治疗来说也仍然具有挑战性。癌症免疫疗法是理想的，因为它们是高度特异性的并且可以使用患者自己的免疫系统来促进癌细胞的破坏。融合蛋白例如双特异性t-细胞衔接器是文献中描述的结合到肿瘤细胞和t-细胞以促进肿瘤细胞破坏的癌症免疫疗法。结合到某些肿瘤相关抗原和结合到某些免疫细胞的抗体在文献中已有描述。参见例如wo2016/134371和wo2015/095412。自然杀伤(nk)细胞是先天性免疫系统的组成部分，占循环淋巴细胞的大约15％。nk细胞事实上浸润所有组织，并且最初因它们不需前期致敏即可杀伤肿瘤细胞的能力而被表征。激活的nk细胞通过与细胞毒性t细胞相似的手段杀伤靶细胞，即通过含有穿孔素和颗粒酶的细胞溶解颗粒以及通过死亡受体途径。激活的nk细胞还分泌炎性细胞因子例如ifn-γ和促进其他白细胞向靶组织的召集的趋化因子。nk细胞通过它们表面上的各种不同激活和抑制受体对信号做出响应。例如，当nk细胞遇到健康的自体细胞时，它们的活性通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的激活而被抑制。或者，当nk细胞遇到外来细胞或癌细胞时，它们通过它们的激活受体(例如nkg2d、ncr、dnam1)而被激活。nk细胞也通过它们表面上的cd16受体被某些免疫球蛋白的恒定区激活。nk细胞对激活的总体灵敏度取决于刺激性和抑制性信号的总和。趋化因子介导主要与细胞归巢和迁移相关的大量生理和病理过程。人类趋化因子系统目前包括超过40种趋化因子和18种趋化因子受体。cxcr4是研究最多的趋化因子受体之一。它是一种352个氨基酸的视紫红质样g蛋白偶联受体，选择性结合趋化因子cxcl12，并通过多种不同途径介导趋化性、细胞内钙的提高、细胞粘附、存活、增殖和基因转录。cxcr4在超过23种不同类型的人类癌症包括肾癌、肺癌、脑癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和黑素瘤中过表达，并且这种异常表达通过多种信号传导途径强烈促进肿瘤增殖、迁移和侵入。cxcr4在例如急性髓系白血病和多发性骨髓瘤中，在恶性细胞向骨髓中的生态位的归巢中也是重要的，所述归巢已被描述促进对化疗的耐药性。调节性t细胞(treg)针对自体免疫提供保护，但在癌症中，treg甚至浸润最早的肿瘤病变，并破坏抗肿瘤效应性t细胞。treg的发育和体内平衡严重依赖于白介素-2(il-2)，并且大多数treg表达高水平的cd25这种il-2受体的细胞表面α链。已显示cd25单克隆抗体在体内剥夺cd25+treg，并增强肿瘤免疫力和免疫疗法。因此，cd25阻断代表了一种在癌症患者中绕过免疫抑制的主要组分的方法，所述癌症包括急性髓系白血病、慢性淋巴细胞性白血病、成胶质细胞瘤、膀胱癌、结肠癌、生殖细胞肿瘤、肺癌、骨肉瘤、黑素瘤、卵巢癌、多发性骨髓瘤、头颈部癌、肾细胞癌和乳腺癌。在treg上高表达的抗原可用于靶向特定抗原的抗癌疗法中，用于剥夺肿瘤中驻留的treg并因此在癌症患者中减轻免疫抑制。这些抗原包括：ccr8，其特异性结合到cc趋化因子家族的细胞因子并对其做出响应；cd7，也被称为leu-9或gp40，其是一种细胞表面糖蛋白；ctla4，也被称为cd152，其是一种蛋白受体，并起到免疫检查点的作用；cx3cr1，也被称为分形趋化因子受体或g蛋白偶联受体13(gpr13)，其是趋化因子cx3cl1的受体；entpd1，也被称为cd39或ntpdase1，其是一种外核苷酸酶，催化三磷酸和二磷酸核苷酸的γ-和β-磷酸酯残基水解成单磷酸核苷酸衍生物；havcr2，也被称为tim-3；il1r2，也被称为cd121b，其是白介素-1α(il1a)、白介素-1β(il1b)和白介素1受体拮抗剂(il1ra)的受体，阻止它们结合到它们的常规受体并由此抑制它们的信号转导；pdcd1lg2，也被称为b7dc、cd273或pd-l2，其是pd-1的配体并负调控t细胞激活；tigit，其是treg上的一种免疫受体并起到免疫检查点的作用；tnfrsf4，也被称为cd134或ox40；tnfrsf8，也被称为cd30；tnfrsf9，也被称为cd137；gem，gtp结合蛋白的rad/gem家族的一个成员；nt5e，也被称为cd73，其将amp转变成腺苷；和tnfrsf18，也被称为gitr或cd357。vla4、cd44、cd13、cd15、cd47和cd81与各种不同的肿瘤相关。非常晚期抗原-4(vla-4)是一种关键的粘附分子，其充当细胞外基质蛋白纤连蛋白和细胞反受体vcam-1的受体。它被大量造血起源的细胞表达，并在细胞免疫应答中具有关键作用，例如通过在炎性位点处介导白细胞系留、滚动、结合和最后跨过血管壁的迁移。此外，vla-4在白血病细胞和不同实体肿瘤例如急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、成胶质细胞瘤中表达。cd44是一种跨膜糖蛋白，其在细胞-细胞相互作用、细胞粘附和迁移中具有各种不同的功能。它也在几种癌症包括急性髓系白血病、乳腺癌、头颈部癌、卵巢癌、前列腺癌和黑素瘤中丰富表达。cd13，也被称为氨肽酶n，是一种zn2+依赖性膜结合的外肽酶，偏好性地降解具有n-端中性氨基酸的蛋白质和肽。cd13已与急性髓系白血病、肺癌、胰腺癌、肝癌和胃癌中的恶性肿瘤发生例如肿瘤细胞侵入、分化、增殖和凋亡、迁移和血管生成相关联。cd15(3-岩藻糖基-n-乙酰基-乳糖胺)是一种糖类粘附分子，其可以表达在糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖上。它在患有急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、肺癌和甲状腺癌的患者中表达。cd47(也被称为整合蛋白相关蛋白)是一种遍在表达的免疫球蛋白超家族的糖蛋白，在自我识别中发挥关键作用。各种不同的实体和血液癌症利用cd47表达以便避开免疫根除，并且它的过表达在临床上与不良预后相关。已证实，cd47的过表达发生在几乎所有类型的肿瘤中，其中一些包括急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、卵巢癌、肺癌、膀胱癌和乳腺癌。cd81是一种已知与整合蛋白复合的细胞表面糖蛋白。它是四次跨膜蛋白家族的成员，所述家族的大多数成员是以存在4个疏水性结构域为特征，并介导在细胞发育、激活、生长和迁移的调控中发挥作用的信号转导事件的细胞表面蛋白。cd81参与各种不同的重要细胞过程，例如膜组织、蛋白质转运、细胞融合和细胞-细胞相互作用。也已显示cd81对肿瘤生长和转移有贡献，并且在大多数类型的癌症包括急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤和脑癌中表达。cd23是属于钙依赖性凝集素超家族的一种ii型整合膜蛋白。它存在于成熟b细胞、激活的巨噬细胞、嗜曙红细胞、滤泡树突状细胞和血小板上。cd23也在大多数b细胞恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤中过表达。cd40是一种肿瘤坏死因子受体(tnfr)家族的分子，其在整个b-细胞发育中表达，并与细胞存活和分化相关。cd40在正常健康细胞上的广泛表达转化为它在各种不同肿瘤上的广泛表达。已显示，cd40广泛表达在黑素瘤、前列腺癌、肺癌以及鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌和肾癌上。在大多数b细胞恶性肿瘤和其他血液恶性肿瘤例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤上，也已报道了cd40表达。cd70是肿瘤坏死因子超家族的成员，主要表达在激活的淋巴细胞上。cd70与cd27相互作用以调控b和t细胞功能。在正常的非淋巴系组织中，cd70仅表达在胸腺髓质的基质细胞和成熟的树突状细胞上。cd70也持续表达在一部分b细胞恶性肿瘤上，包括非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病、t细胞淋巴瘤、肾癌、成胶质细胞瘤和头颈部癌。cd79a蛋白与相关的cd79b蛋白一起，形成与b-细胞中的膜结合免疫球蛋白相结合的二聚体，形成b-细胞抗原受体(bcr)。cd79a/b异二聚体在b细胞发育和功能中发挥多种多样的作用。它通过跨膜区与免疫球蛋白重链非共价结合，从而与免疫球蛋白轻链一起形成bcr。cd79a/b异二聚体与免疫球蛋白重链的结合为bcr的表面表达和bcr诱导的钙通量和蛋白质酪氨酸磷酸化所需。cd79a/b蛋白在b-细胞的整个生命周期中存在于b-细胞的表面上，并且不存在于所有其他健康细胞上。当b-细胞转化成活性浆细胞时所述蛋白质仍然存在，并且也存在于事实上所有的b-细胞恶性肿瘤中，包括b-细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤。cd80是介导免疫激活和抑制两者的免疫辅助调控蛋白的b7家族的成员。具体来说，最近已显示cd80通过与b7-h1相互作用，在支持免疫抑制中发挥重要作用。已显示，在滤泡性淋巴瘤的实质上所有病例中，在弥漫性大b-细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病的大多数病例中，cd80表达在恶性b细胞上。crlf2是一种i型细胞因子受体，也被称为胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)受体(tslpr)。它与tslp和il7r形成有功能的复合体，能够通过stat3、stat5和jak2途径的激活刺激细胞增殖，并与造血系统的发育相关。已显示，crlf2在b细胞恶性肿瘤包括急性成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病中过表达。多发性骨髓瘤是浆细胞的癌症，所述浆细胞是负责生产抗体的白细胞类型。表面抗原slamf7、cd138和cd38在多发性骨髓瘤中普遍过表达。slamf7(也被称为cd319)是信号传导淋巴细胞激活分子(slam)家族受体的成员，并在免疫细胞调控中发挥重要作用。cd138是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，对终末分化的正常浆细胞特异。它在多发性骨髓瘤中高表达，控制肿瘤细胞存活、生长、粘附和骨细胞分化。cd38是一种多功能胞外酶，催化环adp-核糖(cadpr)从nad+的合成和向adp-核糖的水解。靶向slamf7、cd138或cd38的单克隆抗体已被用作多发性骨髓瘤的疗法。t-细胞淋巴瘤和白血病是侵袭性强、对治疗有抗性、预后不良的癌症。t-细胞受体或tcr是在t细胞或t淋巴细胞的表面上发现的分子，其负责识别作为结合到主要组织相容性复合物(mhc)分子的肽的抗原片段。tcr由两条不同的蛋白链构成。在人类中，在95％的t细胞中，tcr由α链和β链构成，而在5％的t细胞中，tcr由γ和δ(γ/δ)链构成。tcr的β-恒定区包含2个功能上一致的基因：trbc1(t细胞受体β恒定区1)和trbc2(t细胞受体β恒定区2)。每个t-细胞仅仅表达这些基因之一。因此，正常的t-细胞将是表达trbc1或2的个体细胞的混合物。克隆的t-细胞癌症整体表达trbc1或trbc2，其可被用于治疗t细胞癌症。白细胞免疫球蛋白样受体(lilr)是主要在淋巴系和骨髓单核细胞上表达的至少13种受体的家族。它们被分成两个亚家族lilrb和lilra，其分别参与免疫系统的抑制和刺激。lilrb具有5个成员lilrb1-lilrb5，它们主要表达在造血谱系细胞中并抑制各种不同类型的免疫细胞的激活。除了白细胞之外，lilrb和相关受体也被肿瘤细胞表达，并被提出具有直接的肿瘤维持活性。例如，lilrb1在人类急性髓系白血病(aml)细胞(特别是在单核aml细胞中)、肿瘤b细胞(包括b细胞白血病、b细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞)、t细胞白血病和淋巴瘤细胞以及胃癌细胞上表达。lilrb2，也被称为lir-2、ilt-4、mir-10和cd85d，在aml细胞例如单核细胞亚型、慢性成淋巴细胞性白血病(cll)细胞、原发性导管和小叶乳腺癌细胞以及人类非小细胞肺癌细胞上表达。lilrb3在髓系白血病、b淋巴系白血病和骨髓瘤细胞上表达。lilrb4在aml细胞例如m4和m5亚型和约50％的b细胞慢性淋巴细胞性白血病(b-cll)细胞上表达。lilrb在肺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌细胞上被特异性表达或上调。技术实现要素：本发明提供了结合到肿瘤相关抗原(选自表15中提供的抗原中的任一者)并结合到自然杀伤细胞上的nkg2d受体和cd16受体的多特异性结合蛋白。这些蛋白质可以结合超过一种nk激活受体，并且可以阻断天然配体与nkg2d的结合。在某些实施方式中，所述蛋白质可以在人类和其他物种例如啮齿动物和食蟹猴中激活nk细胞。本发明的各个不同方面和实施方式将在下文中更详细描述。因此，本发明的一个方面提供了一种蛋白质，其包含：结合nkg2d的第一抗原结合位点；结合cxcr4的第二抗原结合位点；和抗体fc结构域、其足以结合cd16的部分或结合cd16的第三抗原结合位点。所述抗原结合位点可以各自包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域(例如像在抗体中那样排列或融合在一起以形成scfv)，或者一个或多个所述抗原结合位点可以是单域抗体，例如vhh抗体如骆驼抗体或vnar抗体如在软骨鱼中发现的。本发明提供了结合nkg2d受体、cd16和选自下述的抗原的多特异性结合蛋白：cxcr4，cd25，vla4，cd44，cd13，cd15，cd47，cd81，cd23，cd40，cd70，cd79a，cd79b，cd80，crlf2，slamf7，cd38，cd138，t-细胞受体β-1链c区(trbc1)，t-细胞受体β-2链c区(trbc2)，选自lilrb1、lilrb2、lilrb3、lilrb4、lilrb5、lilra1、lilra2、lilra3、lilra4、lilra5和lilra6的白细胞免疫球蛋白样受体家族成员，选自cc趋化因子受体8(ccr8)、分化抗原簇7(cd7)、细胞毒性t-淋巴细胞相关蛋白4(ctla4)、cx3c趋化因子受体1(cx3cr1)、胞外核苷酸三磷酸二磷酸水解酶-1(entpd1)、甲肝病毒细胞受体2(havcr2)、ii型白介素1受体(il-1r2)、程序化细胞死亡1配体2(pdcd1lg2)、具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tnfrsf4)、肿瘤坏死因子受体超家族成员8(tnfrsf8)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9)、gtp结合蛋白gem、胞外5'-核苷酸酶(nt5e)和肿瘤坏死因子超家族成员18(tnfrsf18)的调节性t细胞表达的蛋白。在某些实施方式中，所述结合到nkg2d的第一抗原结合位点可以包含与seqidno：1相关的重链可变结构域，例如通过具有与seqidno：1至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，和/或包含与seqidno：1的cdr1(seqidno：105)、cdr2(seqidno：106)和cdr3(seqidno：107)序列相同的氨基酸序列。所述与seqidno：1相关的重链可变结构域可以与各种不同的轻链可变结构域偶联，以形成nkg2d结合位点。例如，所述包含与seqidno：1相关的重链可变结构域的第一抗原结合位点还可以包含选自与seqidno：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40相关的序列中的任一者的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点包含具有与seqidno：1至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的重链可变结构域，和具有与选自seqidno：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的序列中的任一者至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。可选地，所述第一抗原结合位点可以包含与seqidno：41相关的重链可变结构域和与seqidno：42相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：41至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：41的cdr1(seqidno：43)、cdr2(seqidno：44)和cdr3(seqidno：45)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：42至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：42的cdr1(seqidno：46)、cdr2(seqidno：47)和cdr3(seqidno：48)序列相同的氨基酸序列。在其他实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与seqidno：49相关的重链可变结构域和与seqidno：50相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：49至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：49的cdr1(seqidno：51)、cdr2(seqidno：52)和cdr3(seqidno：53)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：50至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：50的cdr1(seqidno：54)、cdr2(seqidno：55)和cdr3(seqidno：56)序列相同的氨基酸序列。可选地，所述第一抗原结合位点可以包含与seqidno：57相关的重链可变结构域和与seqidno：58相关的轻链可变结构域，例如通过具有分别与seqidno：57至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性和与seqidno：58至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与seqidno：59相关的重链可变结构域和与seqidno：60相关的轻链可变结构域，例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：59至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：59的cdr1(seqidno：517)、cdr2(seqidno：518)和cdr3(seqidno：519)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：60至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：60的cdr1(seqidno：520)、cdr2(seqidno：521)和cdr3(seqidno：355)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述结合到nkg2d的第一抗原结合位点可以包含与seqidno：61相关的重链可变结构域和与seqidno：62相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：61至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：61的cdr1(seqidno：63)、cdr2(seqidno：64)和cdr3(seqidno：65)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：62至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：62的cdr1(seqidno：66)、cdr2(seqidno：67)和cdr3(seqidno：68)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与seqidno：69相关的重链可变结构域和与seqidno：70相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：69至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：69的cdr1(seqidno：71)、cdr2(seqidno：72)和cdr3(seqidno：73)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：70至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：70的cdr1(seqidno：74)、cdr2(seqidno：75)和cdr3(seqidno：76)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与seqidno：77相关的重链可变结构域和与seqidno：78相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：77至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：77的cdr1(seqidno：79)、cdr2(seqidno：80)和cdr3(seqidno：81)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：78至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：78的cdr1(seqidno：82)、cdr2(seqidno：83)和cdr3(seqidno：84)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与seqidno：85相关的重链可变结构域和与seqidno：86相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：85至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：85的cdr1(seqidno：87)、cdr2(seqidno：88)和cdr3(seqidno：89)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：86至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：86的cdr1(seqidno：90)、cdr2(seqidno：91)和cdr3(seqidno：92)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与seqidno：93相关的重链可变结构域和与seqidno：94相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：93至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：93的cdr1(seqidno：95)、cdr2(seqidno：96)和cdr3(seqidno：97)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：94至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：94的cdr1(seqidno：98)、cdr2(seqidno：99)和cdr3(seqidno：100)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与seqidno：101相关的重链可变结构域和与seqidno：102相关的轻链可变结构域，例如通过具有分别与seqidno：101至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性和与seqidno：102至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与seqidno：103相关的重链可变结构域和与seqidno：104相关的轻链可变结构域，例如通过具有分别与seqidno：103至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性和与seqidno：104至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cxcr4，并且可以包含与seqidno：109相关的重链可变结构域和与seqidno：110相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：109至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：109的cdr1(seqidno：111)、cdr2(seqidno：112)和cdr3(seqidno：113)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：110至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：110的cdr1(seqidno：114)、cdr2(seqidno：115)和cdr3(seqidno：116)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cxcr4，并且可以包含与seqidno：117相关的重链可变结构域和与seqidno：118相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：117至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：117的cdr1(seqidno：119)、cdr2(seqidno：120)和cdr3(seqidno：121)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：118至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的,和/或包含与seqidno：118的cdr1(seqidno：122)、cdr2(seqidno：123)和cdr3(seqidno：124)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cxcr4，并且可以包含与seqidno：125相关的重链可变结构域和与seqidno：126相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：125至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：125的cdr1(seqidno：127)、cdr2(seqidno：128)和cdr3(seqidno：129)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：126至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：126的cdr1(seqidno：130)、cdr2(seqidno：131)和cdr3(seqidno：132)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cxcr4，并且可以包含与seqidno：522相关的重链可变结构域和与seqidno：526相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：522至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：522的cdr1(seqidno：523)、cdr2(seqidno：524)和cdr3(seqidno：525)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：526至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：526的cdr1(seqidno：527)、cdr2(seqidno：528)和cdr3(seqidno：529)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd25，并且可以包含与seqidno：134相关的重链可变结构域和与seqidno：135相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：134至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：134的cdr1(seqidno：136)、cdr2(seqidno：137)和cdr3(seqidno：138)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：135至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：135的cdr1(seqidno：139)、cdr2(seqidno：140)和cdr3(seqidno：141)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd25，并且可以包含与seqidno：142相关的重链可变结构域和与seqidno：143相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：142至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：142的cdr1(seqidno：144)、cdr2(seqidno：145)和cdr3(seqidno：146)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：143至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：143的cdr1(seqidno：147)、cdr2(seqidno：148)和cdr3(seqidno：149)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd25，并且可以包含与seqidno：150相关的重链可变结构域和与seqidno：151相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：150至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：150的cdr1(seqidno：152)、cdr2(seqidno：153)和cdr3(seqidno：154)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：151至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：151的cdr1(seqidno：155)、cdr2(seqidno：156)和cdr3(seqidno：157)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到vla4，并且可以包含与seqidno：166相关的重链可变结构域和与seqidno：167相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：166至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：166的cdr1(seqidno：168)、cdr2(seqidno：169)和cdr3(seqidno：170)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：167至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：167的cdr1(seqidno：171)、cdr2(seqidno：172)和cdr3(seqidno：173)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd44，并且可以包含与seqidno：174相关的重链可变结构域和与seqidno：175相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：174至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：174的cdr1(seqidno：176)、cdr2(seqidno：177)和cdr3(seqidno：178)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：175至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：175的cdr1(seqidno：179)、cdr2(seqidno：180)和cdr3(seqidno：181)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd47，并且可以包含与seqidno：182相关的重链可变结构域和与seqidno：183相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：182至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：182的cdr1(seqidno：184)、cdr2(seqidno：185)和cdr3(seqidno：186)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：183至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：183的cdr1(seqidno：187)、cdr2(seqidno：188)和cdr3(seqidno：189)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd23，并且可以包含与seqidno：197相关的重链可变结构域和与seqidno：198相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：197至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：197的cdr1(seqidno：199)、cdr2(seqidno：200)和cdr3(seqidno：201)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：198至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：198的cdr1(seqidno：202)、cdr2(seqidno：203)和cdr3(seqidno：204)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd40，并且可以包含与seqidno：205相关的重链可变结构域和与seqidno：206相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：205至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：205的cdr1(seqidno：207)、cdr2(seqidno：208)和cdr3(seqidno：209)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：206至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：206的cdr1(seqidno：210)、cdr2(seqidno：211)和cdr3(seqidno：212)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd40，并且可以包含与seqidno：213相关的重链可变结构域和与seqidno：214相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：213至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：213的cdr1(seqidno：215)、cdr2(seqidno：216)和cdr3(seqidno：217)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：214至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：214的cdr1(seqidno：218)、cdr2(seqidno：219)和cdr3(seqidno：220)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd40，并且可以包含与seqidno：221相关的重链可变结构域和与seqidno：222相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：221至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：221的cdr1(seqidno：223)、cdr2(seqidno：224)和cdr3(seqidno：225)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：222至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：222的cdr1(seqidno：226)、cdr2(seqidno：227)和cdr3(seqidno：228)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd40，并且可以包含与seqidno：229相关的重链可变结构域和与seqidno：230相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：229至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：229的cdr1(seqidno：231)、cdr2(seqidno：232)和cdr3(seqidno：233)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：230至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：230的cdr1(seqidno：234)、cdr2(seqidno：235)和cdr3(seqidno：236)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd70，并且可以包含与seqidno：237相关的重链可变结构域和与seqidno：238相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：237至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：237的cdr1(seqidno：239)、cdr2(seqidno：240)和cdr3(seqidno：241)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：238至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：238的cdr1(seqidno：242)、cdr2(seqidno：243)和cdr3(seqidno：244)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd79b，并且可以包含与seqidno：245相关的重链可变结构域和与seqidno：246相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：245至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：245的cdr1(seqidno：247)、cdr2(seqidno：248)和cdr3(seqidno：249)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：246至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：246的cdr1(seqidno：250)、cdr2(seqidno：251)和cdr3(seqidno：252)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd80，并且可以包含与seqidno：253相关的重链可变结构域和与seqidno：254相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：253至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：253的cdr1(seqidno：255)、cdr2(seqidno：256)和cdr3(seqidno：257)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：254至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：254的cdr1(seqidno：258)、cdr2(seqidno：259)和cdr3(seqidno：260)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到crlf2，并且可以包含与seqidno：261相关的重链可变结构域和与seqidno：262相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：261至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：261的cdr1(seqidno：263)、cdr2(seqidno：264)和cdr3(seqidno：265)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：262至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：262的cdr1(seqidno：266)、cdr2(seqidno：267)和cdr3(seqidno：268)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到slamf7，并且可以包含与seqidno：272相关的重链可变结构域和与seqidno：273相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：272至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：272的cdr1(seqidno：274)、cdr2(seqidno：275)和cdr3(seqidno：276)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：273至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：273的cdr1(seqidno：277)、cdr2(seqidno：278)和cdr3(seqidno：279)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到slamf7，并且可以包含与seqidno：280相关的重链可变结构域和与seqidno：281相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：280至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：280的cdr1(seqidno：282)、cdr2(seqidno：283)和cdr3(seqidno：284)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：281至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：281的cdr1(seqidno：285)、cdr2(seqidno：286)和cdr3(seqidno：287)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd138，并且可以包含与seqidno：288相关的重链可变结构域和与seqidno：289相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：288至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：288的cdr1(seqidno：290)、cdr2(seqidno：291)和cdr3(seqidno：292)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：289至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：289的cdr1(seqidno：293)、cdr2(seqidno：294)和cdr3(seqidno：295)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd38，并且可以包含与seqidno：296相关的重链可变结构域和与seqidno：297相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：296至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：296的cdr1(seqidno：298)、cdr2(seqidno：299)和cdr3(seqidno：300)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：297至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：297的cdr1(seqidno：301)、cdr2(seqidno：302)和cdr3(seqidno：303)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd38，并且可以包含与seqidno：304相关的重链可变结构域和与seqidno：305相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：304至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：304的cdr1(seqidno：306)、cdr2(seqidno：307)和cdr3(seqidno：308)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：305至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：305的cdr1(seqidno：309)、cdr2(seqidno：310)和cdr3(seqidno：311)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd7，并且可以包含与seqidno：325相关的重链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：325至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：325的cdr1(seqidno：326)、cdr2(seqidno：327)和cdr3(seqidno：328)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cd7，并且可以包含与seqidno：329相关的重链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：329至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：329的cdr1(seqidno：330)、cdr2(seqidno：331)和cdr3(seqidno：332)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到ctla4，并且可以包含与seqidno：333相关的重链可变结构域和与seqidno：334相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：333至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：333的cdr1(seqidno：335)、cdr2(seqidno：336)和cdr3(seqidno：337)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：334至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：334的cdr1(seqidno：338)、cdr2(seqidno：339)和cdr3(seqidno：340)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到ctla4，并且可以包含与seqidno：341相关的重链可变结构域和与seqidno：342相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：341至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：341的cdr1(seqidno：343)、cdr2(seqidno：344)和cdr3(seqidno：345)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：342至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：342的cdr1(seqidno：346)、cdr2(seqidno：347)和cdr3(seqidno：348)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cx3cr1，并且可以包含与seqidno：349相关的重链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：349至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：349的cdr1(seqidno：350)、cdr2(seqidno：351)和cdr3(seqidno：352)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到cx3cr1，并且可以包含与seqidno：353相关的重链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：353至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：353的cdr1(seqidno：354)、cdr2(seqidno：356)和cdr3(seqidno：357)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到entpd1，并且可以包含与seqidno：358相关的重链可变结构域和与seqidno：359相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：358至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：358的cdr1(seqidno：360)、cdr2(seqidno：361)和cdr3(seqidno：362)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：359至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：359的cdr1(seqidno：363)、cdr2(seqidno：364)和cdr3(seqidno：365)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到entpd1，并且可以包含与seqidno：366相关的重链可变结构域和与seqidno：367相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：366至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：366的cdr1(seqidno：368)、cdr2(seqidno：369)和cdr3(seqidno：370)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：367至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：367的cdr1(seqidno：371)、cdr2(seqidno：372)和cdr3(seqidno：373)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到havcr2，并且可以包含与seqidno：374相关的重链可变结构域和与seqidno：375相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：374至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：374的cdr1(seqidno：376)、cdr2(seqidno：377)和cdr3(seqidno：378)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：375至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：375的cdr1(seqidno：379)、cdr2(seqidno：380)和cdr3(seqidno：381)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到havcr2，并且可以包含与seqidno：382相关的重链可变结构域和与seqidno：383相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：382至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：382的cdr1(seqidno：384)、cdr2(seqidno：385)和cdr3(seqidno：386)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：383至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：383的cdr1(seqidno：387)、cdr2(seqidno：388)和cdr3(seqidno：389)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到pdcdilg2，并且可以包含与seqidno：390相关的重链可变结构域和与seqidno：391相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：390至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：390的cdr1(seqidno：392)、cdr2(seqidno：393)和cdr3(seqidno：394)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：391至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：391的cdr1(seqidno：395)、cdr2(seqidno：396)和cdr3(seqidno：397)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到pdcdilg2，并且可以包含与seqidno：398相关的重链可变结构域和与seqidno：399相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：398至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：398的cdr1(seqidno：400)、cdr2(seqidno：401)和cdr3(seqidno：402)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：399至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：399的cdr1(seqidno：403)、cdr2(seqidno：404)和cdr3(seqidno：405)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到tigit，并且可以包含与seqidno：406相关的重链可变结构域和与seqidno：407相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：406至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：406的cdr1(seqidno：408)、cdr2(seqidno：409)和cdr3(seqidno：410)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：407至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：407的cdr1(seqidno：411)、cdr2(seqidno：412)和cdr3(seqidno：413)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到tigit，并且可以包含与seqidno：414相关的重链可变结构域和与seqidno：415相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：414至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：414的cdr1(seqidno：416)、cdr2(seqidno：417)和cdr3(seqidno：418)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：415至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：415的cdr1(seqidno：419)、cdr2(seqidno：420)和cdr3(seqidno：421)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到tnfrsf4，并且可以包含与seqidno：422相关的重链可变结构域和与seqidno：423相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：422至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：422的cdr1(seqidno：424)、cdr2(seqidno：425)和cdr3(seqidno：426)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：423至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：423的cdr1(seqidno：427)、cdr2(seqidno：428)和cdr3(seqidno：429)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到tnfrsf4，并且可以包含与seqidno：430相关的重链可变结构域和与seqidno：431相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：430至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：430的cdr1(seqidno：432)、cdr2(seqidno：433)和cdr3(seqidno：434)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：431至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：431的cdr1(seqidno：435)、cdr2(seqidno：436)和cdr3(seqidno：437)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到tnfrsf8，并且可以包含与seqidno：438相关的重链可变结构域和与seqidno：439相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：438至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：438的cdr1(seqidno：440)、cdr2(seqidno：441)和cdr3(seqidno：442)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：439至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：439的cdr1(seqidno：443)、cdr2(seqidno：444)和cdr3(seqidno：445)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到tnfrsf8，并且可以包含与seqidno：446相关的重链可变结构域和与seqidno：447相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：446至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：446的cdr1(seqidno：448)、cdr2(seqidno：449)和cdr3(seqidno：450)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：447至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：447的cdr1(seqidno：451)、cdr2(seqidno：452)和cdr3(seqidno：453)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到tnfrsf9，并且可以包含与seqidno：454相关的重链可变结构域和与seqidno：455相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：454至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：454的cdr1(seqidno：456)、cdr2(seqidno：457)和cdr3(seqidno：458)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：455至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：455的cdr1(seqidno：459)、cdr2(seqidno：460)和cdr3(seqidno：461)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到tnfrsf9，并且可以包含与seqidno：462相关的重链可变结构域和与seqidno：463相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：462至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：462的cdr1(seqidno：464)、cdr2(seqidno：465)和cdr3(seqidno：466)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：463至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：463的cdr1(seqidno：467)、cdr2(seqidno：468)和cdr3(seqidno：469)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到nst5，并且可以包含与seqidno：470相关的重链可变结构域和与seqidno：471相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：470至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：470的cdr1(seqidno：472)、cdr2(seqidno：473)和cdr3(seqidno：474)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：471至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：471的cdr1(seqidno：475)、cdr2(seqidno：476)和cdr3(seqidno：477)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到nst5，并且可以包含与seqidno：478相关的重链可变结构域和与seqidno：479相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：478至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：478的cdr1(seqidno：480)、cdr2(seqidno：481)和cdr3(seqidno：482)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：479至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：479的cdr1(seqidno：483)、cdr2(seqidno：484)和cdr3(seqidno：485)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到tnfrsf18，并且可以包含与seqidno：486相关的重链可变结构域和与seqidno：487相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：486至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：486的cdr1(seqidno：488)、cdr2(seqidno：489)和cdr3(seqidno：490)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：487至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：487的cdr1(seqidno：491)、cdr2(seqidno：492)和cdr3(seqidno：493)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点可以结合到tnfrsf18，并且可以包含与seqidno：494相关的重链可变结构域和与seqidno：495相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与seqidno：494至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：494的cdr1(seqidno：496)、cdr2(seqidno：497)和cdr3(seqidno：498)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与seqidno：495至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与seqidno：495的cdr1(seqidno：499)、cdr2(seqidno：500)和cdr3(seqidno：501)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点包含与所述第一抗原结合位点中存在的轻链可变结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述蛋白质包含抗体fc结构域的足以结合cd16的部分，其中所述抗体fc结构域包含铰链和ch2结构域，和/或与人类igg抗体的第234-332位氨基酸序列至少90％同一性的氨基酸序列。还提供了含有这些蛋白质之一的剂型，含有表达这些蛋白质的一种或多种核酸的细胞，和使用这些蛋白质增加肿瘤细胞死亡的方法。本发明的另一方面提供了一种在患者中治疗癌症的方法。所述方法包括向需要的患者施用治疗有效量的本文中描述的多特异性结合蛋白。使用所述多特异性结合蛋白治疗的示例性癌症包括例如急性髓系白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、胸腺瘤、腺样囊性癌、胃肠癌、肾癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、肺癌、卵巢癌、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和黑素瘤。附图说明图1是一种异二聚体多特异性抗体(三特异性结合蛋白(trinket))的图示。每个臂可以代表nkg2d结合结构域或肿瘤相关抗原结合结构域。在某些实施方式中，所述nkg2d和所述肿瘤相关抗原结合结构域可以享有共同轻链。图2是一种异二聚体多特异性抗体的图示。所述nkg2d结合结构域或所述肿瘤相关抗原结合结构域中的任一者可以采取scfv格式(右臂)。图3是在elisa测定法中证实了nkg2d结合结构域(作为克隆列出)对人类重组nkg2d的结合亲和力的线图。图4是在elisa测定法中证实了nkg2d结合结构域(作为克隆列出)对食蟹猴重组nkg2d的结合亲和力的线图。图5是在elisa测定法中证实了nkg2d结合结构域(作为克隆列出)对小鼠重组nkg2d的结合亲和力的线图。图6是通过流式细胞术证实了nkg2d结合结构域(作为克隆列出)与表达人类nkg2d的el4细胞的结合的柱状图，示出了平均荧光强度(mfi)与背景相比的倍数(fob)。图7是通过流式细胞术证实了nkg2d结合结构域(作为克隆列出)与表达小鼠nkg2d的el4细胞的结合的柱状图，示出了平均荧光强度(mfi)与背景相比的倍数(fob)。图8是通过与天然配体ulbp-6的竞争证实了nkg2d结合结构域(作为克隆列出)对重组人类nkg2d-fc的特异性结合亲和力的线图。图9是通过与天然配体mica的竞争证实了nkg2d结合结构域(作为克隆列出)对重组人类nkg2d-fc的特异性结合亲和力的线图。图10是通过与天然配体rae-1δ的竞争证实了nkg2d结合结构域(作为克隆列出)对重组小鼠nkg2d-fc的特异性结合亲和力的线图。图11是通过定量表达人类nkg2d-cd3ζ融合蛋白的tnf-α阳性细胞的百分率显示出人类nkg2d被nkg2d结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。图12是通过定量表达人类nkg2d-cd3ζ融合蛋白的tnf-α阳性细胞的百分率显示出小鼠nkg2d被nkg2d结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。图13是显示出人类nk细胞被nkg2d结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。图14是显示出人类nk细胞被nkg2d结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。图15是显示出小鼠nk细胞被nkg2d结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。图16是显示出小鼠nk细胞被nkg2d结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。图17是显示了nkg2d结合结构域(作为克隆列出)对肿瘤细胞的细胞毒性效应的柱状图。图18是显示了通过差示扫描荧光测定法测量的nkg2d结合结构域(作为克隆列出)的熔解温度的柱状图。图19a-19c是nk细胞使用cd16和nkg2d结合的协同激活的柱状图。图19a示出cd107a的水平；图19b示出ifnγ的水平；图19c示出cd107a和ifnγ的水平。图指示了平均值(n＝2)±sd。数据代表了使用5位不同健康供体的5个独立实验。图20是采取双特异性抗体(triomab)形式的三特异性结合蛋白(trinket)的图示，其是一种维持igg样形状的三功能、双特异性抗体。该嵌合体由源自于两个亲本抗体的两个半抗体构成，各自具有一条轻链和一条重链。triomab型可以是含有1/2的大鼠抗体和1/2的小鼠抗体的异二聚体构建体。图21是采取kih共同轻链形式的trinket的图示，其包含杵臼结构(kih)技术。kih是含有结合到靶1和2的2个fab片段和通过异二聚化突变稳定化的fc的异二聚体。采取kih格式的trinket可以是具有结合到靶1和靶2的2个fab片段，含有2个不同重链和与两个重链配对的共同轻链的异二聚体构建体。图22是采取双可变结构域免疫球蛋白(dvd-igtm)形式的trinket的图示，其将两个单克隆抗体的靶结合结构域通过柔性的天然存在的连接物结合，并产生四价igg样分子。dvd-igtm是同二聚体构建体，其中靶向抗原2的可变结构域被融合到靶向抗原1的fab片段的可变结构域的n端。dvd-igtm形式含有正常的fc。图23是采取正交fab界面(ortho-fab)形式的trinket的图示，其是含有融合到fc的结合到靶1和靶2的2个fab片段的异二聚体构建体。轻链(lc)-重链(hc)配对通过正交界面来确保。异二聚化通过fc中的突变来确保。图24是采取二合一ig格式的trinket的图示。图25是采取es形式的trinket的图示，其是含有融合到fc的结合到靶1和靶2的2个不同fab片段的异二聚体构建体。异二聚化通过fc中的静电操控突变来确保。图26是采取fab片段臂交换形式的trinket的图示：通过将重链和附连的轻链(半分子)与来自于另一个分子的重链-轻链对交换来交换fab臂以产生双特异性抗体的抗体。fab臂交换形式(cfae)是含有结合到靶1和2的2个fab片段和通过异二聚化突变稳定化的fc的异二聚体。图27是采取seed体形式的trinket的图示，其是含有结合到靶1和2的2个fab片段和通过异二聚化突变稳定化的fc的异二聚体。图28是采取luz-y形式的trinket的图示，其中使用亮氨酸拉链来诱导两个不同hc的异二聚化。所述luz-y形式是含有结合到融合到fc的靶1和2的两个不同scfab的异二聚体。异二聚化通过融合到fc的c-端的亮氨酸拉链基序来确保。图29是采取cov-x体形式的trinket的图示。图30a和30b是采取kλ体形式的trinket的图示，其是具有融合到通过异二聚化突变稳定化的fc的2个不同fab片段的异二聚体构建体：靶向抗原1的一个fab片段含有κlc，并且靶向抗原2的第二个fab片段含有λlc。图30a是kλ体的一种形式的示例性图示；图30b是另一种κλ体的示例性图示。图31是oasc-fab异二聚体构建体，其包括结合到靶1的fab片段和结合到靶2的scfab，两者均融合到fc结构域。异二聚化通过fc结构域中的突变来确保。图32是duetmab，其是含有结合到抗原1和2的2个不同fab片段和通过异二聚化突变稳定化的fc的异二聚体构建体。fab片段1和2含有不同的s-s桥，其确保正确的轻链和重链配对。图33是crossmab，其是具有结合到靶1和2的2个不同fab片段和通过异二聚化突变稳定化的fc的异二聚体构建体。cl和ch1结构域与vh和vl结构域被调换，例如ch1与vl内联融合，而cl与vh内联融合。图34是fit-ig，其是一种同二聚体构建体，其中结合到抗原2的fab片段被融合到结合到抗原1的fab片段的hc的n端。所述构建体含有野生型fc。图35示出了来自于facs的数据，显示出cxcr4在人类b细胞淋巴瘤细胞系raji上的表达(黑色＝同种型对照；空心＝cxcr4染色)。图36是示出了cxcr4-trinket介导的raji靶细胞的khyg-1杀伤的线图。图37是示出了靶向cxcr4的trinket介导人类raji靶细胞的nk细胞杀伤的柱状图。详细描述本发明提供了结合癌细胞上的cxcr4和自然杀伤细胞上的nkg2d受体和cd16受体以激活所述自然杀伤细胞的多特异性结合蛋白，包含这些多特异性结合蛋白的药物组合物，以及使用这些多特异性蛋白和药物组合物的治疗方法，包括用于癌症治疗。本发明的各个不同方面在下文分章节阐述；然而，在一个特定章节中描述的本发明的方面不应限于任何特定章节。为了便于本发明的理解，下文定义了许多术语和短语。当在本文中使用时，没有具体数目的指称意味着“一个或多个”，并包括复数指称物，除非上下文不适合。当在本文中使用时，术语“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子的参与抗原结合的部分。在人类抗体中，抗原结合位点由重(“h”)链和轻(“l”)链的n-端可变(“v”)区的氨基酸残基形成。所述重链和轻链的v区内的三个高度趋异的区段被称为“高变区”，它们插入在被称为“构架区”或“fr”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“fr”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在人类抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此配置，以形成抗原结合表面。所述抗原结合表面与被结合的抗原的三维表面互补，并且每个重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“cdr”。在某些动物例如骆驼和软骨鱼中，抗原结合位点由单一抗体链形成，提供了“单域抗体”。抗原结合位点可以存在于完整抗体中、抗体的保留了抗原结合表面的抗原结合片段中或重组多肽例如scfv中，所述scfv在单一多肽中使用肽连接物将重链可变结构域连接到轻链可变结构域。当在本文中使用时，术语“肿瘤相关抗原”意味着与癌症相关的任何抗原，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、神经节苷脂、糖类、脂类。这些抗原可以表达在恶性细胞中或肿瘤微环境中，例如与肿瘤相关的血管、细胞外基质、间充质基质或免疫浸润物上。当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠科、猿猴、马科、牛科、猪科、犬科、猫科动物等)，更优选地包括人类。当在本文中使用时，术语“有效量”是指化合物(例如本发明的化合物)的足以实现有益或所需结果的量。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用，并且不意图限于特定剂型或施用途径。当在本文中使用时，术语“治疗”包括导致病症、疾病、障碍等的改善的任何效应例如减轻、降低、调节、改善或消除或改善其症状。当在本文中使用时，术语“药物组合物”是指活性药剂与惰性或有活性的载体的组合，使得所述组合物特别适合于体内或离体诊断或治疗用途。当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指任何标准的制药载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种不同类型的润湿剂。所述组合物也可以包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如martin，《remington's制药学》(remington'spharmaceuticalsciences)，第15版，mackpubl.co.,easton,pa[1975]。当在本文中使用时，术语“可药用盐”是指本发明的化合物的任何制药上可接受的盐(例如酸或碱式盐)，其在施用到受试者后，能够提供本发明的化合物或其有活性的代谢物或残留物。正如本领域技术人员所知，本发明的化合物的“盐”可以源自于无机或有机酸和碱。示例性的酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸例如草酸，尽管本身不是可药用的，但可用于制备在获得本发明的化合物及其可药用酸加成盐中可用作中间体的盐。示例性的碱包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和式nw4+的化合物(其中w是c1-4烷基)等。示例性的盐包括但不限于：乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，柠檬酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊烷丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，延胡索酸盐，氟代庚酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，2-羟基乙磺酸盐，乳酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，苯基丙酸盐，苦味酸盐，新戊酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，甲苯磺酸盐，十一烷酸盐等。盐的其他实例包括与适合的阳离子例如na+、nh4+和nw4+(其中w是c1-4烷基)等化合的本发明的化合物的阴离子。对治疗应用来说，设想的本发明的化合物的盐是可药用的。然而，不可药用的酸和碱的盐也可以在例如可药用化合物的制备或纯化中发现用途。在整个本描述中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分时，或在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，设想了另外还存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物，并且还存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。一般来说，除非另有规定，否则规定百分率的组成是以重量计的。此外，如果变量不伴有定义，则以所述变量的以前的定义为准。i.蛋白质本发明提供了结合到自然杀伤细胞上的nkg2d受体和cd16受体以及选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的多特异性结合蛋白。所述多特异性结合蛋白在本文描述的药物组合物和治疗方法中有用。所述多特异性结合蛋白与自然杀伤细胞上的nkg2d受体和cd16受体的结合增强了所述自然杀伤细胞对表达选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的破坏的活性。所述多特异性结合蛋白与表达肿瘤相关抗原的细胞的结合将所述癌细胞带到所述自然杀伤细胞附近，促进了所述癌细胞被所述自然杀伤细胞的直接和间接破坏。一些示例性的多特异性结合蛋白的进一步描述在下文中提供。所述多特异性结合蛋白的第一组分结合到表达nkg2d受体的细胞，其可以包括但不限于nk细胞、γδt细胞和cd8+αβt细胞。在结合nkg2d后，所述多特异性结合蛋白可以阻断天然配体例如ulbp6(ul16结合蛋白6)和mica(i类主要组织相容性复合物链相关蛋白a)结合到nkg2d并激活nkg2d受体。所述多特异性结合蛋白的第二组分结合选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原。表达所述肿瘤相关抗原的细胞可以在白血病例如急性髓系白血病和t-细胞白血病中发现。所述多特异性结合蛋白的第三组分结合到表达cd16的细胞，所述cd16是白细胞包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞和滤泡树突细胞的表面上的fc受体。本文中描述的多特异性结合蛋白可以采取各种不同的格式。例如，一种格式是异二聚体多特异性抗体，其包括第一免疫球蛋白重链、第一免疫球蛋白轻链、第二免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白轻链(图1)。所述第一免疫球蛋白重链包括第一fc(铰链-ch2-ch3)结构域、第一重链可变结构域和任选的第一ch1重链结构域。所述第一免疫球蛋白轻链包括第一轻链可变结构域和第一轻链恒定结构域。所述第一免疫球蛋白轻链与所述第一免疫球蛋白重链一起，形成结合nkg2d的抗原结合位点。所述第二免疫球蛋白重链包含第二fc(铰链-ch2-ch3)结构域、第二重链可变结构域和任选的第二ch1重链结构域。所述第二免疫球蛋白轻链包括第二轻链可变结构域和第二轻链恒定结构域。所述第二免疫球蛋白轻链与所述第二免疫球蛋白重链一起，形成结合选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的抗原结合位点。所述第一fc结构域和第二fc结构域一起能够结合到cd16(图1)。在某些实施方式中，所述第一免疫球蛋白轻链与所述第二免疫球蛋白轻链相同。另一种示例性格式涉及一种异二聚体多特异性抗体，其包括第一免疫球蛋白重链、第二免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链(图2)。所述第一免疫球蛋白重链包括通过连接物或抗体铰链融合到单链可变片段(scfv)的第一fc(铰链-ch2-ch3)结构域，所述scfv由配对并结合nkg2d或结合选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的重链可变结构域和轻链可变结构域构成。所述第二免疫球蛋白重链包括第二fc(铰链-ch2-ch3)结构域、第二重链可变结构域和任选的ch1重链结构域。所述免疫球蛋白轻链包括轻链可变结构域和轻链恒定结构域。所述第二免疫球蛋白重链与所述免疫球蛋白轻链配对并结合到nkg2d或结合选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原。所述第一fc结构域和所述第二fc结构域一起能够结合到cd16(图2)。一个或多个另外的结合基序，可以任选地通过连接物序列融合到所述恒定区ch3结构域的c-端。在某些实施方式中，所述抗原结合基序是单链或二硫键稳定的可变区(scfv)，形成四价或三价分子。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取三功能抗体形式，其是维持igg样形状的三功能、双特异性抗体。这种嵌合体由源自于两个亲本抗体的两个半抗体构成，各自具有一条轻链和一条重链。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白是kih共同轻链(lc)形式，其涉及杵臼结构(kih)技术。所述kih包括工程化的ch3结构域，以在每条重链中产生“杵”或“臼”来促进异二聚化。在“杵臼结构(kih)”fc技术背后的概念是通过将小残基用大体积的残基替换而在一个ch3结构域(ch3a)中引入“杵”(例如采取eu编号的t366wch3a)。为了容纳所述“杵”，通过将最邻近所述球的残基用较小的残基代替，在另一个ch3结构域(ch3b)上产生互补的“臼”表面(例如t366s/l368a/y407vch3b)。所述“臼”突变通过结构化指导的噬菌体筛选进行优化(atwells,ridgwayjb,wellsja,carterp.，使用噬菌体展示文库从同二聚体的结构域界面的重塑得到的稳定的异二聚体(stableheterodimersfromremodelingthedomaininterfaceofahomodimerusingaphagedisplaylibrary)，jmolbiol(1997)270(1):26–35)。kihfc变体的x-射线晶体结构(elliottjm,ultschm,leej,tongr,takedak,spiessc等，杵和臼非糖基化半抗体同二聚体的反平行构象由ch2-ch3疏水相互作用介导(antiparallelconformationofknobandholeaglycosylatedhalf-antibodyhomodimersismediatedbyach2-ch3hydrophobicinteraction)，jmolbiol(2014)426(9):1947–57；mimotof,kadonos,katadah,igawat,kamikawat,hattorik等，对fcγr具有提高的亲和力的新的不对称工程化fc变体的晶体结构(crystalstructureofanovelasymmetricallyengineeredfcvariantwithimprovedaffinityforfcgammars)，molimmunol(2014)58(1):132–8)证实了由ch3结构域间核心界面处的空间互补性驱动的疏水相互作用使异二聚化在热力学上有利，而杵-杵和臼-臼界面分别由于空间位阻和有利相互作用的破坏而不利于同二聚作用。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取双可变结构域免疫球蛋白(dvd-igtm)形成，其通过柔性的天然存在的连接物将两个单克隆抗体的靶结合结构域结合，并得到四价igg样分子。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取正交fab界面(ortho-fab)形式。在ortho-fabigg方法中(lewissm,wux,pustilnika,serenoa,huangf,rickhl等，通过正交fab界面的基于结构的设计产生双特异性igg抗体(generationofbispecificiggantibodiesbystructure-baseddesignofanorthogonalfabinterface)，nat.biotechnol.(2014)32(2):191–8)，基于结构的区域性设计在仅仅一个fab片段中的lc和hcvh-ch1界面处引入互补突变，对另一个fab片段没有做出任何改变。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取二合一ig格式。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取es形式，其是含有融合到fc的结合到靶1和靶2的2个不同fab片段的异二聚体构建体。异二聚化通过所述fc中的静电操控突变来确保。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取kλ体形式，其是具有融合到通过异二聚化突变稳定化的fc的2个不同fab片段的异二聚体构建体：靶向抗原1的fab片段1含有κlc，而靶向抗原2的第二个fab片段含有λlc。图30a是一种形式的kλ体的示例性图示；图30b是另一种kλ体的示例性图示。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取fab臂交换形式(通过将重链和附连的轻链(半分子)与来自于另一个分子的重链-轻链对交换来交换fab臂以产生双特异性抗体的抗体)。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取seed体形式(所述链交换工程化结构域(seed)平台被设计成产生不对称且双特异性的抗体样分子，这种能力扩展了天然抗体的治疗性应用。这种蛋白质工程化平台是基于保守的ch3结构域内免疫球蛋白的结构相关的序列的交换。所述seed设计允许高效产生ag/ga异二聚体，而不利于ag和gaseedch3结构域的同二聚作用。(mudam.等，proteineng.des.sel.，2011,24(5):447-54)。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取luz-y形式，其中使用亮氨酸拉链来诱导两个不同hc的异二聚化(wranik,bj.等，j.biol.chem.(2012),287:43331-9)。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取cov-x体形式。在双特异性covx体中，两个不同的肽使用支链氮杂环丁酮连接物联结在一起，并在温和条件下以位点特异性方式融合到支架抗体。所述抗体支架提供长的半衰期和ig样分布，而所述药效团负责功能活性。所述药效团可以被化学优化或用其他药效团代替，以产生优化的或独特的双特异性抗体(doppalapudivr等，pnas(2010),107(52)；22611-22616)。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取oasc-fab异二聚体形式，其包括融合到fc的结合到靶1的fab片段和结合到靶2的scfab。异二聚化通过所述fc中的突变来确保。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取duetmab形式，其是含有结合到抗原1和2的2个不同fab片段和通过异二聚化突变稳定化的fc的异二聚体构建体。fab片段1和2含有不同的s-s桥，其确保正确的lc和hc配对。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取crossmab形式，其是具有融合到通过异二聚化稳定化的fc的结合到靶1和2的2个不同fab片段的异二聚体构建体。cl和ch1结构域与vh和vl结构域被调换，例如ch1与vl内联融合，而cl与vh内联融合。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取fit-ig形式，其是一种同二聚体构建体，其中结合到抗原2的fab片段被融合到结合到抗原1的fab片段的hc的n端。所述构建体含有野生型fc。表1列出了相组合可以结合到nkg2d的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。所述nkg2d结合结构域在它们对nkg2d的结合亲和力方面可以不同，然而它们都激活人类nkg2d和nk细胞。可选地，由seqidno：101所表示的重链可变结构域可以与由seqidno：102所表示的轻链可变结构域配对，以形成如us9,273,136中所示的可以结合到nkg2d的抗原结合位点。seqidno：101qvqlvesggglvkpggslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvafirydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakdrglgdgtyfdywgqgttvtvssseqidno：102qsaltqpasvsgspgqsitiscsgsssnignnavnwyqqlpgkapklliyyddllpsgvsdrfsgsksgtsaflaisglqsedeadyycaawddslngpvfgggtkltvl可选地，由seqidno：103表示的重链可变结构域可以与由seqidno：104所表示的轻链可变结构域配对，以形成如us7,879,985中所示的可以结合到nkg2d的抗原结合位点。seqidno：103qvhlqesgpglvkpsetlsltctvsddsissyywswirqppgkglewighisysgsanynpslksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycanwddafniwgqgtmvtvssseqidno：104eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik表2列出了相组合可以结合到cxcr4的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。可选地，可以通过筛选与由seqidno：133所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到cxcr4的新的抗原结合位点。seqidno：133megisiytsdnyteemgsgdydsmkepcfreenanfnkiflptiysiifltgivgnglvilvmgyqkklrsmtdkyrlhlsvadllfvitlpfwavdavanwyfgnflckavhviytvnlyssvlilafisldrylaivhatnsqrprkllaekvvyvgvwipallltipdfifanvseaddryicdrfypndlwvvvfqfqhimvglilpgivilscyciiisklshskghqkrkalkttvililaffacwlpyyigisidsfilleiikqgcefentvhkwisitealaffhcclnpilyaflgakfktsaqhaltsvsrgsslkilskgkrgghssvstesesssfhss表3列出了相组合可以结合到cd25的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。可选地，可以通过筛选与由seqidno：158所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到cd25的新的抗原结合位点。seqidno：158mdsyllmwglltfimvpgcqaelcdddppeiphatfkamaykegtmlnceckrgfrriksgslymlctgnsshsswdnqcqctssatrnttkqvtpqpeeqkerkttemqspmqpvdqaslpghcrepppweneateriyhfvvgqmvyyqcvqgyralhrgpaesvckmthgktrwtqpqlictgemetsqfpgeekpqaspegrpesetsclvtttdfqiqtemaatmetsiftteyqvavagcvfllisvlllsgltwqrrqrksrrti可以通过筛选与由seqidno：159或seqidno：160所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原vla4的抗原结合位点。seqidno：159mawearrepgprraavretvmlllclgvptgrpynvdtesallyqgphntlfgysvvlhshganrwllvgaptanwlanasvinpgaiyrcrigknpgqtceqlqlgspngepcgktcleerdnqwlgvtlsrqpgengsivtcghrwknifyiknenklptggcygvppdlrtelskriapcyqdyvkkfgenfascqagissfytkdlivmgapgssywtgslfvynittnkykafldkqnqvkfgsylgysvgaghfrsqhttevvggapqheqigkayifsidekelnilhemkgkklgsyfgasvcavdlnadgfsdllvgapmqstireegrvfvyinsgsgavmnametnlvgsdkyaarfgesivnlgdidndgfedvaigapqeddlqgaiyiyngradgisstfsqrieglqiskslsmfgqsisgqidadnngyvdvavgafrsdsavllrtrpvvivdaslshpesvnrtkfdcvengwpsvcidltlcfsykgkevpgyivlfynmsldvnrkaespprfyfssngtsdvitgsiqvssreancrthqafmrkdvrdiltpiqieaayhlgphviskrsteefpplqpilqqkkekdimkktinfarfcahencsadlqvsakigflkphenktylavgsmktlmlnvslfnagddayettlhvklpvglyfikileleekqincevtdnsgvvqldcsigyiyvdhlsridisflldvsslsraeedlsitvhatceneeemdnlkhsrvtvaiplkyevkltvhgfvnptsfvygsndenepetcmvekmnltfhvintgnsmapnvsveimvpnsfspqtdklfnildvqtttgechfenyqrvcaleqqksamqtlkgivrflsktdkrllycikadphclnflcnfgkmesgkeasvhiqlegrpsilemdetsalkfeiratgfpepnprvielnkdenvahvlleglhhqrpkryftiviissslllglivlllisyvmwkagffkrqyksilqeenrrdswsyinsksnddseqidno：160mnlqpifwiglissvccvfaqtdenrclkanakscgeciqagpncgwctnstflqegmptsarcddlealkkkgcppddienprgskdikknknvtnrskgtaeklkpeditqiqpqqlvlrlrsgepqtftlkfkraedypidlyylmdlsysmkddlenvkslgtdlmnemrritsdfrigfgsfvektvmpyisttpaklrnpctseqnctspfsyknvlsltnkgevfnelvgkqrisgnldspeggfdaimqvavcgsligwrnvtrllvfstdagfhfagdgklggivlpndgqchlennmytmshyydypsiahlvqklsenniqtifavteefqpvykelknlipksavgtlsanssnviqliidaynslssevilengklsegvtisyksyckngvngtgengrkcsnisigdevqfeisitsnkcpkkdsdsfkirplgfteevevilqyicececqsegipespkchegngtfecgacrcnegrvgrhcecstdevnsedmdaycrkensseicsnngecvcgqcvcrkrdntneiysgkfcecdnfncdrsnglicggngvckcrvcecnpnytgsacdcsldtstceasngqicngrgicecgvckctdpkfqgqtcemcqtclgvcaehkecvqcrafnkgekkdtctqecsyfnitkvesrdklpqpvqpdpvshckekdvddcwfyftysvngnnevmvhvvenpecptgpdiipivagvvagivliglallliwkllmiihdrrefakfekekmnakwdtgenpiyksavttvvnpkyegk可以通过筛选与由seqidno：161所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd44的抗原结合位点。seqidno：161mdkfwwhaawglclvplslaqidlnitcrfagvfhvekngrysisrteaadlckafnstlptmaqmekalsigfetcrygfieghvviprihpnsicaanntgvyiltsntsqydtycfnasappeedctsvtdlpnafdgpititivnrdgtryvqkgeyrtnpediypsnptdddvssgsssersstsggyifytfstvhpipdedspwitdstdripattlmstsatatetatkrqetwdwfswlflpsesknhlhtttqmagtssntisagwepneenederdrhlsfsgsgidddedfisstisttprafdhtkqnqdwtqwnpshsnpevllqtttrmtdvdrngttayegnwnpeahpplihhehheeeetphststiqatpsstteetatqkeqwfgnrwhegyrqtpkedshsttgtaaasahtshpmqgrttpspedsswtdffnpishpmgrghqagrrmdmdsshsitlqptanpntglvedldrtgplsmttqqsnsqsfstshegleedkdhpttstltssnrndvtggrrdpnhsegsttllegytshyphtkesrtfipvtsaktgsfgvtavtvgdsnsnvnrslsgdqdtfhpsggshtthgsesdghshgsqegganttsgpirtpqipewliilasllalalilavciavnsrrrcgqkkklvinsgngavedrkpsglngeasksqemvhlvnkessetpdqfmtadetrnlqnvdmkigv可以通过筛选与由seqidno：162所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd13的抗原结合位点。seqidno：162makgfyiskslgilgillgvaavctiialsvvysqeknknansspvasttpsasattnpasattldqskawnryrlpntlkpdsyrvtlrpyltpndrglyvfkgsstvrftckeatdviiihskklnytlsqghrvvlrgvggsqppdidktelvepteylvvhlkgslvkdsqyemdsefegeladdlagfyrseymegnvrkvvattqmqaadarksfpcfdepamkaefnitlihpkdltalsnmlpkgpstplpedpnwnvtefhttpkmstyllafivsefdyvekqasngvliriwarpsaiaaghgdyalnvtgpilnffaghydtpyplpksdqiglpdfnagamenwglvtyrensllfdplsssssnkervvtviahelahqwfgnlvtiewwndlwlnegfasyveylgadyaeptwnlkdlmvlndvyrvmavdalasshplstpaseintpaqiselfdaisyskgasvlrmlssflsedvfkqglasylhtfayqntiylnlwdhlqeavnnrsiqlpttvrdimnrwtlqmgfpvitvdtstgtlsqehflldpdsnvtrpsefnyvwivpitsirdgrqqqdywlidvraqndlfstsgnewvllnlnvtgyyrvnydeenwrkiqtqlqrdhsaipvinraqiindafnlasahkvpvtlalnntlflieerqympweaalsslsyfklmfdrsevygpmknylkkqvtplfihfrnntnnwreipenlmdqysevnaistacsngvpeceemvsglfkqwmenpnnnpihpnlrstvycnaiaqggeeewdfaweqfrnatlvneadklraalacskelwilnrylsytlnpdlirkqdatstiisitnnvigqglvwdfvqsnwkklfndygggsfsfsnliqavtrrfsteyelqqleqfkkdneetgfgsgtraleqalektkanikwvkenkevvlqwftensk可以通过筛选与3-岩藻糖基-n-乙酰基-乳糖胺的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd15的抗原结合位点。可以通过筛选与由seqidno：163所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd47的抗原结合位点。seqidno：163mwplvaalllgsaccgsaqllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspnenilivifpifaillfwgqfgiktlkyrsggmdektiallvaglvitvivivgailfvpgeyslknatglglivtstgilillhyyvfstaigltsfviailviqviayilavvglslciaacipmhgpllisglsilalaqllglvymkfvasnqktiqpprkaveeplnafkeskgmmnde可以通过筛选与由seqidno：165所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd81的抗原结合位点。seqidno：165mgvegctkcikyllfvfnfvfwlaggvilgvalwlrhdpqttnllylelgdkpapntfyvgiyiliavgavmmfvgflgcygaiqesqcllgtfftclvilfacevaagiwgfvnkdqiakdvkqfydqalqqavvdddannakavvktfhetldccgsstltalttsvlknnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgklyligiaaivvavimifemilsmvlccgirnssvy可选地，表4列出了相组合可以结合到vla4(那他珠单抗)、cd44(比伐珠单抗)或cd47的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。可以通过筛选与由seqidno：190所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd23的抗原结合位点。seqidno：190meegqyseieelprrrccrrgtqivllglvtaalwaglltllllwhwdttqslkqleeraarnvsqvsknleshhgdqmaqksqstqisqeleelraeqqrlksqdlelswnlnglqadlssfksqelnerneasdllerlreevtklrmelqvssgfvcntcpekwinfqrkcyyfgkgtkqwvharyacddmegqlvsihspeeqdfltkhashtgswiglrnldlkgefiwvdgshvdysnwapgeptsrsqgedcvmmrgsgrwndafcdrklgawvcdrlatctppasegsaesmgpdsrpdpdgrlptpsaplhs可以通过筛选与由seqidno：191所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd40的抗原结合位点。seqidno：191mvrlplqcvlwgclltavhpepptacrekqylinsqccslcqpgqklvsdctefteteclpcgesefldtwnrethchqhkycdpnlglrvqqkgtsetdtictceegwhctseacescvlhrscspgfgvkqiatgvsdticepcpvgffsnvssafekchpwtscetkdlvvqqagtnktdvvcgpqdrlralvvipiifgilfaillvlvfikkvakkptnkaphpkqepqeinfpddlpgsntaapvqetlhgcqpvtqedgkesrisvqerq可以通过筛选与由seqidno：192所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd70的抗原结合位点。seqidno：192mpeegsgcsvrrrpygcvlraalvplvaglviclvvciqrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrp可以通过筛选与由seqidno：193所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd79a的抗原结合位点。seqidno：193mpggpgvlqalpatifllfllsavylgpgcqalwmhkvpaslmvslgedahfqcphnssnnanvtwwrvlhgnytwppeflgpgedpngtliiqnvnkshggiyvcrvqegnesyqqscgtylrvrqppprpfldmgegtknriitaegiillfcavvpgtlllfrkrwqneklgldagdeyedenlyeglnlddcsmyedisrglqgtyqdvgslnigdvqlekp可以通过筛选与由seqidno：194所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd79b的抗原结合位点。seqidno：194marlalspvpshwmvalllllsaepvpaarsedryrnpkgsacsriwqsprfiarkrgftvkmhcymnsasgnvswlwkqemdenpqqlklekgrmeesqneslatltiqgirfedngiyfcqqkcnntsevyqgcgtelrvmgfstlaqlkqrntlkdgiimiqtlliilfiivpifllldkddskagmeedhtyegldidqtatyedivtlrtgevkwsvgehpgqe可以通过筛选与由seqidno：195所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd80的抗原结合位点。seqidno：195mghtrrqgtspskcpylnffqllvlaglshfcsgvihvtkevkevatlscghnvsveelaqtriywqkekkmvltmmsgdmniwpeyknrtifditnnlsivilalrpsdegtyecvvlkyekdafkrehlaevtlsvkadfptpsisdfeiptsnirriicstsggfpephlswlengeelnainttvsqdpetelyavsskldfnmttnhsfmclikyghlrvnqtfnwnttkqehfpdnllpswaitlisvngifviccltycfaprcrerrrnerlrresvrpv可以通过筛选与由seqidno：196所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原crlf2的抗原结合位点。seqidno：196mgrlvllwgaavfllggwmalgqggaaegvqiqiiyfnletvqvtwnaskysrtnltfhyrfngdeaydqctnyllqeghtsgclldaeqrddilyfsirngthpvftasrwmvyylkpsspkhvrfswhqdavtvtcsdlsygdllyevqyrspfdtewqskqentcnvtiegldaekcysfwvrvkamedvygpdtypsdwsevtcwqrgeirdacaetptppkpklskfilisslaillmvsllllslwklwrvkkflipsvpdpksifpglfeihqgnfqewitdtqnvahlhkmagaeqesgpeeplvvqlakteaesprmldpqteekeasggslqlphqplqggdvvtiggftfvmndrsyval可选地，表5列出了相组合可以结合到cd23(鲁昔单抗)、cd40(达西珠单抗、西来瑞单抗、鲁卡木单抗、比勒斯单抗)、cd70(伏司妥珠单抗)、cd79b(波妥珠单抗)、cd80(加利昔单抗)或crlf2(us20160046720)的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。可以通过筛选与由seqidno：269所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原slamf7的抗原结合位点。seqidno：269magsptcltliyilwqltgsaasgpvkelvgsvggavtfplkskvkqvdsivwtfnttplvtiqpeggtiivtqnrnrervdfpdggyslklsklkkndsgiyyvgiyssslqqpstqeyvlhvyehlskpkvtmglqsnkngtcvtnltccmehgeedviytwkalgqaaneshngsilpiswrwgesdmtficvarnpvsrnfsspilarklcegaaddpdssmvllclllvplllslfvlglflwflkrerqeeyieekkrvdicretpnicphsgenteydtiphtnrtilkedpantvystveipkkmenphslltmpdtprlfayenvi可以通过筛选与由seqidno：270所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd38的抗原结合位点。seqidno：270mancefspvsgdkpccrlsrraqlclgvsilvlilvvvlavvvprwrqqwsgpgttkrfpetvlarcvkyteihpemrhvdcqsvwdafkgafiskhpcniteedyqplmklgtqtvpcnkillwsrikdlahqftqvqrdmftledtllgyladdltwcgefntskinyqscpdwrkdcsnnpvsvfwktvsrrfaeaacdvvhvmlngsrskifdknstfgsvevhnlqpekvqtleawvihggredsrdlcqdptikelesiiskrniqfsckniyrpdkflqcvknpedssctsei可以通过筛选与由seqidno：271所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原cd138的抗原结合位点。seqidno：271mrraalwlwlcalalslqpalpqivatnlppedqdgsgddsdnfsgsgagalqditlsqqtpstwkdtqlltaiptspeptgleataaststlpagegpkegeavvlpevepgltareqeatprprettqlptthlastttattaqepatshphrdmqpghhetstpagpsqadlhtphtedggpsateraaedgassqlpaaegsgeqdftfetsgentavvavepdrrnqspvdqgatgasqglldrkevlggviagglvglifavclvgfmlyrmkkkdegsysleepkqanggayqkptkqeefya可选地，表6列出了相组合可以结合到slamf7(艾洛珠单抗、azintuxizumab)、cd138(吲妥昔单抗)或cd38(达雷木单抗、mor202)的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。可以通过筛选与由seqidno：312所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原trbc1的抗原结合位点。seqidno：312edlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf可以通过筛选与由seqidno：313所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到肿瘤相关抗原trbc2的抗原结合位点。seqidno：313dlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsesyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg结合到不同肿瘤相关抗原的抗原结合位点，可以常规地通过筛选与每种抗原的氨基酸序列的结合来鉴定。例如，可以通过筛选与由seqidno：314所定义的lilrb2的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilrb2的抗原结合位点。seqidno：314mtpivtvliclglslgprthvqtgtipkptlwaepdsvitqgspvtlscqgsleaqeyrlyrekksaswitrirpelvkngqfhipsitwehtgrygcqyysrarwselsdplvlvmtgaypkptlsaqpspvvtsggrvtlqcesqvafggfilckegeeehpqclnsqphargssraifsvgpvspnrrwshrcygydlnspyvwsspsdllellvpgvskkpslsvqpgpvvapgesltlqcvsdvgydrfvlykegerdlrqlpgrqpqaglsqanftlgpvsrsyggqyrcygahnlssecsapsdpldilitgqirgtpfisvqpgptvasgenvtllcqswrqfhtflltkagaadaplrlrsiheypkyqaefpmspvtsahagtyrcygslnsdpyllshpseplelvvsgpsmgssppptgpistpagpedqpltptgsdpqsglgrhlgvvigilvavvlllllllllflilrhrrqgkhwtstqrkadfqhpagavgpeptdrglqwrsspaadaqeenlyaavkdtqpedgvemdtraaaseapqdvtyaqlhsltlrrkatepppsqereppaepsiyatlaih可以通过筛选与由seqidno：315所定义的lilrb1的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilrb1的抗原结合位点。seqidno：315mtpiltvliclglslgprthvqaghlpkptlwaepgsvitqgspvtlrcqggqetqeyrlyrekktalwitripqelvkkgqfpipsitwehagryrcyygsdtagrsessdplelvvtgayikptlsaqpspvvnsggnvilqcdsqvafdgfslckegedehpqclnsqphargssraifsvgpvspsrrwwyrcyaydsnspyewslpsdllellvlgvskkpslsvqpgpivapeetltlqcgsdagynrfvlykdgerdflqlagaqpqaglsqanftlgpvsrsyggqyrcygahnlssewsapsdpldiliagqfydrvslsvqpgptvasgenvtllcqsqgwmqtflltkegaaddpwrlrstyqsqkyqaefpmgpvtsahagtyrcygsqsskpyllthpsdplelvvsgpsggpsspttgptstsgpedqpltptgsdpqsglgrhlgvvigilvavilllllllllflilrhrrqgkhwtstqrkadfqhpagavgpeptdrglqwrsspaadaqeenlyaavkhtqpedgvemdtrsphdedpqavtyaevkhsrprremasppsplsgefldtkdrqaeedrqmdteaaaseapqdvtyaqlhsltlrreatepppsqegpspavpsiyatlaih可以通过筛选与由seqidno：316所定义的lilrb3的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilrb3的抗原结合位点。seqidno：316mtpaltallclglslgprtrvqagpfpkptlwaepgsviswgspvtiwcqgsqeaqeyrlhkegspepldrnnplepknkarfsipsmtehhagryrchyyssagwsepsdplemvmtgayskptlsalpspvvasggnmtlrcgsqkgyhhfvlmkegehqlprtldsqqlhsrgfqalfpvgpvtpshrwrftcyyyytntpwvwshpsdpleilpsgvsrkpslltlqgpvlapgqsltlqcgsdvgynrfvlykegerdflqrpgqqpqaglsqanftlgpvspsnggqyrcygahnlssewsapsdplnilmagqiydtvslsaqpgptvasgenvtllcqswwqfdtflltkegaahpplrlrsmygahkyqaefpmspvtsahagtyrcygsyssnphllshpseplelvvsghsggsslpptgppstpglgrylevligvsvafvlllflllflllrrqrhskhrtsdqrktdfqrpagaaetepkdrgllrrsspaadvqeenlyaavkdtqsedrveldsqsphdedpqavtyapvkhssprremasppsslsgefldtkdrqveedrqmdteaaaseasqdvtyaqlhsltlrrkatepppsqegeppaepsiyatlaih可以通过筛选与由seqidno：317所定义的lilrb4的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilrb4的抗原结合位点。seqidno：317miptftallclglslgprthmqagplpkptlwaepgsviswgnsvtiwcqgtleareyrldkeespapwdrqnplepknkarfsipsmtedyagryrcyyrspvgwsqpsdplelvmtgayskptlsalpsplvtsgksvtllcqsrspmdtfllikeraahpllhlrsehgaqqhqaefpmspvtsvhggtyrcfsshgfshyllshpsdplelivsgsledprpsptrsvstaagpedqplmptgsvphsglrrhwevligvlvvsilllslllflllqhwrqgkhrtlaqrqadfqrppgaaepepkdgglqrrsspaadvqgenfcaavkntqpedgvemdtrqsphdedpqavtyakvkhsrprremasppsplsgefldtkdrqaeedrqmdteaaaseapqdvtyaqlhsftlrqkatepppsqegaspaepsvyatlaih可以通过筛选与由seqidno：318所定义的lilrb5的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilrb5的抗原结合位点。seqidno：318mtltlsvliclglsvgprtcvqagtlpkptlwaepasviargkpvtlwcqgpleteeyrldkeglpwarkrqnplepgakakfhipstvydsagryrcyyetpagwsepsdplelvatgfyaeptllalpspvvasggnvtlqcdtldglltfvlveeeqklprtlysqklpkgpsqalfpvgpvtpscrwrfrcyyyyrknpqvwsnpsdlleilvpgvsrkpsllipqgsvvarggsltlqcrsdvgydifvlykegehdlvqgsgqqpqaglsqanftlgpvsrshggqyrcygahnlsprwsapsdpldiliaglipdipalsvqpgpkvasgenvtllcqswhqidtffltkegaahpplclkskyqsyrhqaefsmspvtsaqggtyrcysairsypyllsspsypqelvvsgpsgdpslsptgstptpgpedqpltptgldpqsglgrhlgvvtgvsvafvlllflllflllrhrhqskhrtsahfyrpagaagpepkdqglqkraspvadiqeeilnaavkdtqpkdgvemdaraaaseapqdvtyaqlhsltlrreatepppsqereppaepsiyaplaih可以通过筛选与由seqidno：319所定义的lilra1的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilra1的抗原结合位点。seqidno：319mtpivtvliclrlslgprthvqagtlpkptlwaepgsvitqgspvtlwcqgiletqeyrlyrekktapwitripqeivkkgqfpipsitwehtgryrcfygshtagwsepsdplelvvtgayikptlsalpspvvtsggnvtlhcvsqvafgsfilckegedehpqclnsqprthgwsraifsvgpvspsrrwsyrcyaydsnsphvwslpsdllellvlgvskkpslsvqpgpivapgesltlqcvsdvsydrfvlykegerdflqlpgpqpqaglsqanftlgpvsrsyggqyrcsgaynlssewsapsdpldiliagqfrgrpfisvhpgptvasgenvtllcqswgpfhtflltkagaadaplrlrsiheypkyqaefpmspvtsahsgtyrcygslssnpyllshpsdslelmvsgaaetlsppqnksdskagaantlspsqnktashpqdytvenlirmgiaglvlvvlgillfeaqhsqrsl可以通过筛选与由seqidno：320所定义的lilra2的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilra2的抗原结合位点。seqidno：320mtpiltvliclglslgprthvqaghlpkptlwaepgsviiqgspvtlrcqgslqaeeyhlyrenksaswvrriqepgkngqfpipsitwehagryhcqyyshnhsseysdplelvvtgayskptlsalpspvvtlggnvtlqcvsqvafdgfilckegedehpqrlnshshargwswaifsvgpvspsrrwsyrcyaydsnspyvwslpsdllellvpgvskkpslsvqpgpmvapgesltlqcvsdvgydrfvlykegerdflqrpgwqpqaglsqanftlgpvspshggqyrcysahnlssewsapsdpldilitgqfydrpslsvqpvptvapgknvtllcqsrgqfhtflltkegaghpplhlrsehqaqqnqaefrmgpvtsahvgtyrcysslssnpyllslpsdplelvvseaaetlspsqnktdstttslgqhpqdytvenlirmgvaglvlvvlgillfeaqhsqrslqdaagr可以通过筛选与由seqidno：321所定义的lilra3的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilra3的抗原结合位点。seqidno：321mtpiltvliclglsldprthvqagplpkptlwaepgsvitqgspvtlrcqgsletqeyhlyrekktalwitripqelvkkgqfpilsitwehagrycciygshtaglsessdplelvvtgayskptlsalpspvvtsggnvtiqcdsqvafdgfilckegedehpqclnshshargssraifsvgpvspsrrwsyrcygydsrapyvwslpsdllgllvpgvskkpslsvqpgpvvapgekltfqcgsdagydrfvlykewgrdflqrpgrqpqaglsqanftlgpvsrsyggqytcsgaynlssewsapsdpldilitgqirarpflsvrpgptvasgenvtllcqsqggmhtflltkegaadsplrlkskrqshkyqaefpmspvtsahagtyrcygslssnpyllthpsdplelvvsgaaetlsppqnksdskage可以通过筛选与由seqidno：322所定义的lilra4的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilra4的抗原结合位点。seqidno：322mtliltsllffglslgprtrvqaenlpkpilwaepgpvitwhnpvtiwcqgtleaqgyrldkegnsmsrhilktlesenkvklsipsmmwehagryhcyyqspagwsepsdplelvvtaysrptlsalpspvvtsgvnvtlrcasrlglgrftlieegdhrlswtlnshqhnhgkfqalfpmgpltfsnrgtfrcygyenntpyvwsepsdplqllvsgvsrkpslltlqgpvvtpgenltlqcgsdvgyirytlykegadglpqrpgrqpqaglsqanftlspvsrsyggqyrcygahnvssewsapsdpldiliagqisdrpslsvqpgptvtsgekvtllcqswdpmftflltkegaahpplrlrsmygahkyqaefpmspvtsahagtyrcygsrssnpyllshpseplelvvsgatetlnpaqkksdsktaphlqdytvenlirmgvaglvllflgillfeaqhsqrspprcsqeansrkdnapfrvvepweqi可以通过筛选与由seqidno：323所定义的lilra5的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilra5的抗原结合位点。seqidno：323mapwshpsaqlqpvggdavspalmvllclglslgprthvqagnlskatlwaepgsvisrgnsvtircqgtleaqeyrlvkegspepwdtqnplepknkarfsipsmtehhagryrcyyyspagwsepsdplelvvtgfynkptlsalpspvvtsgenvtlqcgsrlrfdrfilteegdhklswtldsqltpsgqfqalfpvgpvtpshrwmlrcygsrrhilqvwsepsdlleipvsgaadnlspsqnksdsgtashlqdyavenlirmgmaglilvvlgilifqdwhsqrspqaaagr可以通过筛选与由seqidno：324所定义的lilra6的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到lilra6的抗原结合位点。seqidno：324mtpaltallclglslgprtrvqagpfpkptlwaepgsviswgspvtiwcqgsleaqeyqldkegspepldrnnplepknkarfsipsmtqhhagryrchyyssagwsepsdplelvmtgfynkptlsalpspvvasggnmtlrcgsqkgyhhfvlmkegehqlprtldsqqlhsggfqalfpvgpvtpshrwrftcyyyytntprvwshpsdpleilpsgvsrkpslltlqgpvlapgqsltlqcgsdvgydrfvlykegerdflqrpgqqpqaglsqanftlgpvspshggqyrcygahnlssewsapsdplnilmagqiydtvslsaqpgptvasgenvtllcqsrgyfdtflltkegaahpplrlrsmygahkyqaefpmspvtsahagtyrcygsyssnphllsfpseplelmvsghsggsslpptgppstpashakdytvenlirmgmaglvlvflgillfeaqhsqrnpqdaagr表7列出了自身或与轻链可变结构域相组合可以结合到每种treg相关抗原的重链可变结构域的肽序列的实例。*括号中的引用指示肽序列的来源。可选地，结合到每种treg相关抗原的抗原结合位点，可以通过筛选与每种抗原的氨基酸序列的结合来常规地鉴定。例如，可以通过筛选与由seqidno：502所定义的ccr8的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到ccr8的抗原结合位点。seqidno：502mdytldlsvttvtdyyypdifsspcdaeliqtngklllavfycllfvfsllgnslvilvlvvckklrsitdvyllnlalsdllfvfsfpfqtyylldqwvfgtvmckvvsgfyyigfyssmffitlmsvdrylavvhavyalkvrtirmgttlclavwltaimatipllvfyqvasedgvlqcysfynqqtlkwkiftnfkmnilgllipftifmfcyikilhqlkrcqnhnktkairlvlivviasllfwvpfnvvlfltslhsmhildgcsisqqltyathvteiisfthccvnpviyafvgekfkkhlseifqkscsqifnylgrqmprescekssscqqhssrsssvdyillilrhrrqgkhwtstqrkadfqhpagavgpeptdrglqwrsspaadaqeenlyaavkdtqpedgvemdtraaaseapqdvtyaqlhsltlrrkatepppsqereppaepsiyatlaih可以通过筛选与由seqidno：503所定义的cd7的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到cd7的抗原结合位点。seqidno：503magpprllllplllalarglpgalaaqevqqsphcttvpvgasvnitcstsgglrgiylrqlgpqpqdiiyyedgvvpttdrrfrgridfsgsqdnltitmhrlqlsdtgtytcqaitevnvygsgtlvlvteeqsqgwhrcsdapprasalpapptgsalpdpqtasalpdppaasalpaalavisfllglglgvacvlartqikklcswrdknsaacvvyedmshsrcntlsspnqyq可以通过筛选与由seqidno：504所定义的ctla4的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到ctla4的抗原结合位点。seqidno：504maclgfqrhkaqlnlatrtwpctllffllfipvfckamhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkatevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyvidpepcpdsdfllwilaavssglffysflltavslskmlkkrsplttgvyvkmpptepecekqfqpyfipin可以通过筛选与由seqidno：505所定义的cx3cr1的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到cx3cr1的抗原结合位点。seqidno：505mrepleafkladldfrksslasgwrmasgaftmdqfpesvtenfeyddlaeacyigdivvfgtvflsifysvifaiglvgnllvvfaltnskkpksvtdiyllnlalsdllfvatlpfwthylinekglhnamckfttafffigffgsiffitvisidrylaivlaansmnnrtvqhgvtislgvwaaailvaapqfmftkqkeneclgdypevlqeiwpvlrnvetnflgfllpllimsycyfriiqtlfscknhkkakaiklillvvivfflfwtpynvmifletlklydffpscdmrkdlrlalsvtetvafshcclnpliyafagekfrrylyhlygkclavlcgrsvhvdfsssesqrsrhgsvlssnftyhtsdgdallll可以通过筛选与由seqidno：506所定义的entpd1的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到entpd1的抗原结合位点。seqidno：506mgreelfltfsfssgfqesnvktfcsknilailgfssiiaviallavgltqnkalpenvkygivldagsshtslyiykwpaekendtgvvhqveecrvkgpgiskfvqkvneigiyltdcmerareviprsqhqetpvylgatagmrllrmeseeladrvldvverslsnypfdfqgariitgqeegaygwitinyllgkfsqktrwfsivpyetnnqetfgaldlggastqvtfvpqnqtiespdnalqfrlygkdynvythsflcygkdqalwqklakdiqvasneilrdpcfhpgykkvvnvsdlyktpctkrfemtlpfqqfeiqgignyqqchqsilelfntsycpysqcafngiflpplqgdfgafsafyfvmkflnltsekvsqekvtemmkkfcaqpweeiktsyagvkekylseycfsgtyilslllqgyhftadswehihfigkiqgsdagwtlgymlnltnmipaeqplstplshstyvflmvlfslvlftvaiigllifhkpsyfwkdmv可以通过筛选与由seqidno：507所定义的havcr2的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到havcr2的抗原结合位点。seqidno：507mfshlpfdcvlllllllltrsseveyraevgqnaylpcfytpaapgnlvpvcwgkgacpvfecgnvvlrtderdvnywtsrywlngdfrkgdvsltienvtladsgiyccriqipgimndekfnlklvikpakvtpaptrqrdftaafprmlttrghgpaetqtlgslpdinltqistlanelrdsrlandlrdsgatirigiyigagicaglalalifgalifkwyshskekiqnlslislanlppsglanavaegirseeniytieenvyeveepneyycyvssrqqpsqplgcrfamp可以通过筛选与由seqidno：508所定义的il1r2的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到il1r2的抗原结合位点。seqidno：508mlrlyvlvmgvsaftlqpaahtgaarscrfrgrhykrefrlegepvalrcpqvpywlwasvsprinltwhkndsartvpgeeetrmwaqdgalwllpalqedsgtyvcttrnasycdkmsielrvfentdaflpfisypqiltlstsgvlvcpdlseftrdktdvkiqwykdsllldkdnekflsvrgtthllvhdvaledagyyrcvltfahegqqynitrsielrikkkkeetipviisplktisaslgsrltipckvflgtgtplttmlwwtandthiesaypggrvtegprqeysennenyievplifdpvtredlhmdfkcvvhntlsfqtlrttvkeasstfswgivlaplslaflvlggiwmhrrckhrtgkadgltvlwphhqdfqsypk可以通过筛选与由seqidno：509所定义的pdcd1lg2的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到pdcd1lg2的抗原结合位点。seqidno：509miflllmlslelqlhqiaalftvtvpkelyiiehgsnvtlecnfdtgshvnlgaitaslqkvendtsphreratlleeqlplgkasfhipqvqvrdegqyqciiiygvawdykyltlkvkasyrkinthilkvpetdeveltcqatgyplaevswpnvsvpantshsrtpeglyqvtsvlrlkpppgrnfscvfwnthvreltlasidlqsqmeprthptwllhifipfciiafifiatvialrkqlcqklysskdttkrpvtttkrevnsai可以通过筛选与由seqidno：510所定义的tigit的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到tigit的抗原结合位点。seqidno：510mrwcllliwaqglrqaplasgmmtgtiettgnisaekggsiilqchlssttaqvtqvnweqqdqllaicnadlgwhispsfkdrvapgpglgltlqsltvndtgeyfciyhtypdgtytgriflevlessvaehgarfqipllgamaatlvvictavivvvaltrkkkalrihsvegdlrrksagqeewspsapsppgscvqaeaapaglcgeqrgedcaelhdyfnvlsyrslgncsfftetg可以通过筛选与由seqidno：511所定义的tnfrsf4的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到tnfrsf4的抗原结合位点。seqidno：511mcvgarrlgrgpcaallllglglstvtglhcvgdtypsndrcchecrpgngmvsrcsrsqntvcrpcgpgfyndvvsskpckpctwcnlrsgserkqlctatqdtvcrcragtqpldsykpgvdcapcppghfspgdnqackpwtnctlagkhtlqpasnssdaicedrdppatqpqetqgpparpitvqpteawprtsqgpstrpvevpggravaailglglvlgllgplaillalyllrrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki可以通过筛选与由seqidno：512所定义的tnfrsf8的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到tnfrsf8的抗原结合位点。seqidno：512mrvllaalgllflgalrafpqdrpfedtchgnpshyydkavrrccyrcpmglfptqqcpqrptdcrkqcepdyyldeadrctacvtcsrddlvektpcawnssrvcecrpgmfcstsavnscarcffhsvcpagmivkfpgtaqkntvcepaspgvspacaspenckepssgtipqakptpvspatssastmpvrggtrlaqeaaskltrapdspssvgrpssdpglsptqpcpegsgdcrkqcepdyyldeagrctacvscsrddlvektpcawnssrtcecrpgmicatsatnscarcvpypicaaetvtkpqdmaekdttfeapplgtqpdcnptpengeapastsptqsllvdsqasktlpiptsapvalsstgkpvldagpvlfwvilvlvvvvgssafllchrracrkrirqklhlcypvqtsqpklelvdsrprrsstqlrsgasvtepvaeerglmsqplmetchsvgaayleslplqdaspaggpssprdlpeprvstehtnnkiekiyimkadtvivgtvkaelpegrglagpaepeleeeleadhtphypeqetepplgscsdvmlsveeegkedplptaasgk可以通过筛选与由seqidno：513所定义的tnfrsf9的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到tnfrsf9的抗原结合位点。seqidno：513mgnscynivatlllvlnfertrslqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspqiisfflaltstallfllffltlrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel可以通过筛选与由seqidno：514所定义的gem的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到gem的抗原结合位点。seqidno：514mtlnnvtmrqgtvgmqpqqqrwsipadgrhlmvqkephqyshrnrhsatpedhcrrswssdstdsvissesgntyyrvvligeqgvgkstlanifagvhdsmdsdcevlgedtyertlmvdgesatiilldmwenkgenewlhdhcmqvgdaylivysitdrasfekaselriqlrrarqtedipiilvgnksdlvrcrevsvsegracavvfdckfietsaavqhnvkelfegivrqvrlrrdskeknerrlayqkrkesmprkarrfwgkivaknnknmafklkskschdlsvl可以通过筛选与由seqidno：515所定义的nt5e的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到nt5e的抗原结合位点。seqidno：515mcpraarapatlllalgavlwpaagaweltilhtndvhsrleqtsedsskcvnasrcmggvarlftkvqqirraepnvllldagdqyqgtiwftvykgaevahfmnalrydamalgnhefdngvegliepllkeakfpilsanikakgplasqisglylpykvlpvgdevvgivgytsketpflsnpgtnlvfedeitalqpevdklktlnvnkiialghsgfemdkliaqkvrgvdvvvgghsntflytgnppskevpagkypfivtsddgrkvpvvqayafgkylgylkiefdergnvisshgnpillnssipedpsikadinkwrikldnystqelgktivyldgssqscrfrecnmgnlicdaminnnlrhtdemfwnhvsmcilngggirspidernngtitwenlaavlpfggtfdlvqlkgstlkkafehsvhrygqstgeflqvggihvvydlsrkpgdrvvkldvlctkcrvpsydplkmdevykvilpnflanggdgfqmikdellrhdsgdqdinvvstyiskmkviypavegrikfstgshchgsfsliflslwavifvlyq可以通过筛选与由seqidno：516所定义的tnfrsf18的氨基酸序列的结合，常规地鉴定结合到tnfrsf18的抗原结合位点。seqidno：516maqhgamgafralcglallcalslgqrptggpgcgpgrlllgtgtdarccrvhttrccrdypgeeccsewdcmcvqpefhcgdpccttcrhhpcppgqgvqsqgkfsfgfqcidcasgtfsggheghckpwtdccwrcrrrpktpeaassprksgasdrqrrrggwetcgcepgrppgpptaaspspgapqaagalrsalgrallpwqqkwvqeggsdqrpgpcssaaaagpcrreretqswppsslagpdgvgs在所述fc结构域内，cd16结合由所述铰链区和ch2结构域介导。例如，在人类igg1内，与cd16的相互作用主要聚焦于氨基酸残基asp265-glu269、asn297-thr299、ala327-ile332、leu234-ser239和ch2结构域中的糖残基n-乙酰基-d-葡萄糖胺(参见sondermann等，nature,406(6793):267-273)。在所述已知结构域的基础上，可以选择突变以提高或降低与cd16的结合亲和力，例如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示cdna文库，或者可以在相互作用的已知三维结构的基础上设计突变。异二聚体抗体重链的组装可以通过在同一细胞中表达两种不同抗体重链序列来实现，这可能导致每种抗体重链的同二聚体的组装以及异二聚体的组装。促进异二聚体的偏好性组装可以通过在每种抗体重链恒定区的ch3结构域中并入不同的突变来实现，如us13/494870、us16/028850、us11/533709、us12/875015、us13/289934、us14/773418、us12/811207、us13/866756、us14/647480和us14/830336中所示。例如，可以在人类igg1的基础上在ch3结构域中制造突变，并在第一多肽和第二多肽内并入不同对的氨基酸替换，以允许这两条链选择性地彼此异二聚化。下面示出的氨基酸替换的位置都按照kabat中的eu指数来编号。在一种情形中，所述第一多肽中的氨基酸替换将原始氨基酸用选自精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)或色氨酸(w)的较大氨基酸代替，并且所述第二多肽中的至少一个氨基酸替换将原始氨基酸用选自丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)或缬氨酸(v)的较小氨基酸代替，使得所述较大氨基酸替换(突起)契合到所述较小氨基酸替换(孔穴)的表面中。例如，一个多肽可以包含t366w替换，并且另一个多肽可以包含三个替换，包括t366s、l368a和y407v。本发明的抗体重链可变结构域可以被任选地偶联到与抗体恒定区、例如包括铰链、ch2和ch3结构域并含有或不含ch1结构域的igg恒定区至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述恒定区的氨基酸序列与人类抗体恒定区例如人类igg1恒定区、igg2恒定区、igg3恒定区或igg4恒定区至少90％同一性。在某些其他实施方式中，所述恒定区的氨基酸序列与来自于另一种哺乳动物例如兔、狗、猫、小鼠或马的抗体恒定区至少90％同一性。与人类igg1恒定区相比可以在所述恒定区内并入一个或多个突变，例如在q347、y349、l351、s354、e356、e357、k360、q362、s364、t366、l368、k370、n390、k392、t394、d399、s400、d401、f405、y407、k409、t411和/或k439处。示例性的替换包括例如q347e、q347r、y349s、y349k、y349t、y349d、y349e、y349c、t350v、l351k、l351d、l351y、s354c、e356k、e357q、e357l、e357w、k360e、k360w、q362e、s364k、s364e、s364h、s364d、t366v、t366i、t366l、t366m、t366k、t366w、t366s、l368e、l368a、l368d、k370s、n390d、n390e、k392l、k392m、k392v、k392f、k392d、k392e、t394f、t394w、d399r、d399k、d399v、s400k、s400r、d401k、f405a、f405t、y407a、y407i、y407v、k409f、k409w、k409d、t411d、t411e、k439d和k439e。在某些实施方式中，可以并入到人类igg1恒定区的ch1中的突变可以在氨基酸v125、f126、p127、t135、t139、a140、f170、p171和/或v173处。在某些实施方式中，可以并入到人类igg1恒定区的cκ中的突变可以在氨基酸e123、f116、s176、v163、s174和/或t164处。可选地，氨基酸替换可以选自下面表8中示出的成组替换。表8第一多肽第二多肽组1s364e/f405ay349k/t394f组2s364h/d401ky349t/t411e组3s364h/t394fy349t/f405a组4s364e/t394fy349k/f405a组5s364e/t411ey349k/d401k组6s364d/t394fy349k/f405a组7s364h/f405ay349t/t394f组8s364k/e357ql368d/k370s组9l368d/k370ss364k组10l368e/k370ss364k组11k360e/q362ed401k组12l368d/k370ss364k/e357l组13k370ss364k/e357q组14f405lk409r组15k409rf405l可选地，氨基酸替换可以选自下面表9中示出的成组替换。可选地，氨基酸替换可以选自下面表10中示出的成组替换。表10第一多肽第二多肽组1t366k/l351kl351d/l368e组2t366k/l351kl351d/y349e组3t366k/l351kl351d/y349d组4t366k/l351kl351d/y349e/l368e组5t366k/l351kl351d/y349d/l368e组6e356k/d399kk392d/k409d可选地，每条多肽链中的至少一个氨基酸替换可以选自表11。可选地，至少一个氨基酸替换可以选自下面表12中的成组替换，其中在所述第一多肽列中标注的位置被任何已知的带负电荷的氨基酸代替，并且在所述第二多肽列中标注的位置被任何已知的带正电荷的氨基酸代替。表12第一多肽第二多肽k392，k370，k409或k439d399，e356或e357可选地，至少一个氨基酸替换可以选自下面表13中的成组，其中在所述第一多肽列中标注的位置被任何已知的带正电荷的氨基酸代替，并且在所述第二多肽列中标注的位置被任何已知的带负电荷的氨基酸代替。表13第一多肽第二多肽d399，e356或e357k409，k439，k370或k392可选地，氨基酸替换可以选自下面表14中的成组。表14第一多肽第二多肽t350v，l351y，f405a和y407vt350v，t366l，k392l和t394w可选地或另外地，异多聚体蛋白的结构稳定性可以通过在所述第一或第二多肽链任一者上引入s354c并在相对的多肽链上引入y349c来提高，所述突变在所述两个多肽的界面内形成人造二硫桥。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在t366位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自t366、l368和y407的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自t366、l368和y407的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在t366位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自e357、k360、q362、s364、l368、k370、t394、d401、f405和t411的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自y349、e357、s364、l368、k370、t394、d401、f405和t411的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自y349、e357、s364、l368、k370、t394、d401、f405和t411的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自e357、k360、q362、s364、l368、k370、t394、d401、f405和t411的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自l351、d399、s400和y407的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自t366、n390、k392、k409和t411的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自t366、n390、k392、k409和t411的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自l351、d399、s400和y407的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自q347、y349、k360和k409的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自q347、e357、d399和f405的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自q347、e357、d399和f405的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自y349、k360、q347和k409的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自k370、k392、k409和k439的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自d356、e357和d399的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自d356、e357和d399的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自k370、k392、k409和k439的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自l351、e356、t366和d399的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自y349、l351、l368、k392和k409的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自y349、l351、l368、k392和k409的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自l351、e356、t366和d399的一个或多个位置处不同于igg1恒定区的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于s354c替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于y349c替换。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于y349c替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于s354c替换。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于k360e和k409w替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于o347r、d399v和f405t替换。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于o347r、d399v和f405t替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于k360e和k409w替换。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于t366w替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于t366s、t368a和y407v替换。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于t366s、t368a和y407v替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于t366w替换。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于t350v、l351y、f405a和y407v替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于t350v、t366l、k392l和t394w替换。在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于t350v、t366l、k392l和t394w替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与igg1恒定区的氨基酸序列的差异在于t350v、l351y、f405a和y407v替换。在某些实施方式中，抗体恒定(人类igg1)区的一条多肽链的氨基酸序列可以是seqidno：164。seqidno：164astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfllyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg上述的多特异性蛋白可以使用本领域技术人员公知的重组dna技术来制造。例如，可以将编码所述第一免疫球蛋白重链的第一核酸序列克隆到第一表达载体中；可以将编码所述第二免疫球蛋白重链的第二核酸序列克隆到第二表达载体中；可以将编码所述免疫球蛋白轻链的第三核酸序列克隆到第三表达载体中；并且可以将所述第一、第二和第三表达载体一起稳定转染到宿主细胞中，以产生所述多聚体蛋白。为了获得所述多特异性蛋白的最高产量，可以探索所述第一、第二和第三表达载体的不同比率，以确定用于转染到所述宿主细胞中的最佳比率。在转染后，可以使用本领域中已知的方法例如有限稀释法、elisa、facs、显微术或clonepix来分离单一克隆，用于细胞库产生。可以将克隆在适合于生物反应器规模放大的条件下培养，并维持所述多特异性蛋白的表达。所述多特异性蛋白可以使用本领域中已知的方法包括离心、深度过滤、细胞裂解、匀浆、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用交换层析和混合模式层析来分离和纯化。ii.多特异性蛋白的特征本文描述的多特异性蛋白包括nkg2d结合位点、cd16结合位点和选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的结合位点。在某些实施方式中，所述多特异性蛋白同时结合到表达nkg2d和/或cd16的细胞例如nk细胞并结合到表达选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的肿瘤细胞。所述多特异性蛋白与nk细胞的结合能够提高所述nk细胞对所述癌细胞的破坏的活性。表15在某些实施方式中，所述多特异性蛋白以与相应的单克隆抗体(即含有与所述多特异性蛋白中所包含的相同的肿瘤相关抗原(选自表15中提供的抗原中的任一者)的结合位点的单克隆抗体)相近的亲和力结合到选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述多特异性蛋白与相应的单克隆抗体相比在杀伤表达选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的肿瘤细胞中更加有效。在某些实施方式中，本文中描述的包括nkg2d结合位点和用于选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的结合位点的多特异性蛋白，当与表达所述肿瘤相关抗原的细胞共培养时激活原代人类nk细胞。nk细胞激活以cd107a脱颗粒和ifn-γ细胞因子生产的增加为特征。此外，与用于选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的相应单克隆抗体相比，在表达所述肿瘤相关抗原的细胞存在下，所述多特异性蛋白可能显示出人类nk细胞的更高的激活。在某些实施方式中，本文中描述的包括nkg2d结合位点和用于选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的结合位点的多特异性蛋白，提高与表达所述肿瘤相关抗原的细胞共培养的静息和il-2激活的人类nk细胞的活性。在某些实施方式中，与结合到选自表15中提供的抗原中的任一者的肿瘤相关抗原的相应单克隆抗体相比，所述多特异性蛋白在靶向表达中和低水平的所述肿瘤相关抗原的肿瘤细胞中提供优势。本文中描述的多特异性结合蛋白在降低肿瘤生长和杀伤癌细胞中可能更加有效。例如，trinketa49-trinket-cxcr4-hz515h7(来自于克隆adi-27749的nkg2d结合结构域和源自于hz515h7的cxcr4结合结构域)、a44-trinket-cxcr4-hz515h7(来自于克隆adi-27744的nkg2d结合结构域和源自于hz515h7的cxcr4结合结构域)和c26-trinket-cxcr4-hz515h7(来自于克隆adi-28226的nkg2d结合结构域和源自于hz515h7的cxcr4结合结构域)与抗cxcr4单克隆抗体相比，对表达cxcr4的靶细胞具有提高的效能和最大的裂解。iii.治疗性应用本发明提供了使用本文中描述的多特异性结合蛋白和/或本文中描述的药物组合物治疗癌症的方法。所述方法通过向需要的患者施用治疗有效量的本文中描述的多特异性结合蛋白，可用于治疗表达cxcr4的各种不同的癌症。所述治疗方法可以根据待治疗的癌症来表征。例如，在某些实施方式中，所述癌症是急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、胸腺瘤、腺样囊性癌、胃肠癌、肾癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、肺癌、卵巢癌、脑癌、前列腺癌、胰腺癌或黑素瘤。在某些其他实施方式中，所述癌症是实体肿瘤。在某些其他实施方式中，所述癌症是结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肝癌、直肠癌、胃癌、睾丸癌或子宫癌。在其他实施方式中，所述癌症是血管化肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、肉瘤(例如血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆管癌、甲状腺癌、肢端雀斑痣样黑素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形胶质细胞瘤、巴氏腺癌、基底细胞癌、胆管癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺体癌、类癌瘤、胆管上皮癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌症、十二指肠癌、内分泌系统癌症、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃窦癌、胃底癌、胃泌素瘤、成胶质细胞瘤、胰高血糖素瘤、心脏癌症、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、回肠癌、胰岛细胞瘤、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞瘤变、肝内胆管癌、侵入性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波斯肉瘤、盆腔癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移性癌、口腔癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神经系统癌症、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、非上皮性皮肤癌、非霍奇金氏淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突神经胶质癌、口腔癌、骨肉瘤、浆液性乳头状腺癌、阴茎癌、舌咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌症、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、分泌生长抑素的肿瘤、脊椎癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑素瘤、t细胞白血病、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、尿道膀胱癌、泌尿系统癌症、宫颈癌、宫体癌、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、疣状癌、血管活性肠肽瘤、外阴癌、高分化癌或肾母细胞瘤。在某些其他实施方式中，所述癌症是非霍奇金氏淋巴瘤例如b-细胞淋巴瘤或t-细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，所述非霍奇金氏淋巴瘤是b-细胞淋巴瘤，例如弥漫性大b-细胞淋巴瘤、原发性纵隔b-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b-细胞淋巴瘤、淋巴结外边缘区b-细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区b-细胞淋巴瘤、脾边缘区b-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病或原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤。在某些其他实施方式中，所述非霍奇金氏淋巴瘤是t-细胞淋巴瘤，例如前t淋巴母细胞淋巴瘤、外周t-细胞淋巴瘤、皮肤t-细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞t-细胞淋巴瘤、淋巴结外自然杀伤细胞/t-细胞淋巴瘤、肠病型t-细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样t-细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤或外周t-细胞淋巴瘤。所述待治疗的癌症可以根据在癌细胞的表面上表达的特定抗原的存在来表征。在某些实施方式中，除了cxcr4之外，所述癌细胞可以表达下述一者或多者：cd2、cd19、cd20、cd30、cd38、cd40、cd52、cd70、egfr/erbb1、igf1r、her3/erbb3、her4/erbb4、muc1、trop2、cmet、slamf7、psca、mica、micb、trailr1、trailr2、mage-a3、b7.1、b7.2、ctla4、和pd1。在某些其他实施方式中，当所述第二结合位点结合cxcr4时，所述待治疗的癌症选自急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、胸腺瘤、腺样囊性癌、胃肠癌、肾癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、肺癌、卵巢癌、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和黑素瘤。在某些其他实施方式中，当所述第二结合位点结合cd25时，所述待治疗的癌症选自急性髓系白血病、慢性淋巴细胞性白血病、成胶质细胞瘤、膀胱癌、结肠癌、生殖细胞肿瘤、肺癌、骨肉瘤、黑素瘤、卵巢癌、多发性骨髓瘤、头颈部癌、肾细胞癌和乳腺癌。在某些其他实施方式中，当所述第二结合位点结合vla4、cd44、cd13、cd15、cd47或cd81时，所述待治疗的癌症选自急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、成胶质细胞瘤、头颈部癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌和脑癌。在某些其他实施方式中，当所述第二结合位点结合cd23、cd40、cd70、cd79a、cd79b、cd80或crlf2时，所述待治疗的癌症选自b细胞恶性肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、肾癌、成胶质细胞瘤、头颈部癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、肾癌和卵巢癌。在某些其他实施方式中，当所述第二结合位点结合lilrb1、lilrb2、lilrb3、lilrb4、lilrb5、lilra1、lilra2、lilra3、lilra4、lilra5或lilra6时，所述待治疗的癌症选自aml、b细胞白血病、b细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、t细胞白血病、t细胞淋巴瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌，其中所述方法包括向患者施用有效量的根据权利要求1-24中任一项所述的蛋白质或根据权利要求25所述的剂型。iv.组合疗法本发明的另一方面提供了组合疗法。本文描述的多特异性结合蛋白可以与其他治疗剂组合使用以治疗癌症。可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的示例性治疗剂包括例如放射线、丝裂霉素、维甲酸、盐酸苯达莫司汀(ribomustin)、吉西他滨、长春新碱、依托泊苷、克拉屈滨、二溴甘露醇、甲氨蝶呤、多柔比星、卡波醌、喷司他丁、硝基可润、净司他丁、西曲瑞克、来曲唑、雷替曲塞、柔红霉素、法倔唑、福莫司汀、胸腺法新、索布佐生、奈达铂、阿糖胞苷、比卡鲁胺、长春瑞滨、维司力农、氨鲁米特、安吖啶、丙谷胺、依利醋铵、酮色林、去氧氟尿苷、依曲替酯、异维甲酸、链脲佐菌素、尼莫司汀、长春地辛、氟他胺(flutamide)、氟他胺(drogenil)、布缩宫素、卡莫氟、雷佐生、西佐喃、卡铂、二溴卫矛醇、替加氟、异环磷酰胺、泼尼莫司汀、毕西巴尼、左旋咪唑、替尼泊苷、英丙舒凡、依诺他滨、麦角乙脲、羟甲烯龙、他莫昔芬、孕酮、美雄烷、环硫雄醇、福美司坦、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ(ifn-γ)、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、地尼白介素、白介素-2、黄体生成激素释放因子和上述药剂的可能表现出对同源受体的差异结合和增加或减少的血清半衰期的变化形式。可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的另一类药剂是免疫检查点抑制剂。示例性的免疫检查点抑制剂包括抑制下述一者或多者的药剂：(i)细胞毒性t-淋巴细胞相关抗原4(ctla4)，(ii)程序化细胞死亡蛋白1(pd1)，(iii)pdl1，(iv)lag3，(v)b7-h3，(vi)b7-h4，和(vii)tim3。ctla4抑制剂伊匹单抗已被美国食品和药品监督管理局(unitedstatesfoodanddrugadministration)批准用于治疗黑素瘤。可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的另一类药剂是靶向非检查点靶的单克隆抗体(例如赫赛汀)和非细胞毒性药剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)。另一类抗癌药剂包括例如：(i)选自alk抑制剂、atr抑制剂、a2a拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂、bruton's酪氨酸激酶抑制剂、cdc7抑制剂、chk1抑制剂、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、dna-pk抑制剂、dna-pk和mtor两者的抑制剂、dnmt1抑制剂、dnmt1抑制剂加2-氯-脱氧腺苷、hdac抑制剂、hedgehog信号传导途径抑制剂、ido抑制剂、jak抑制剂、mtor抑制剂、mek抑制剂、melk抑制剂、mth1抑制剂、parp抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂、parp1和dhodh两者的抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶-ii抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、vegfr抑制剂和wee1抑制剂的抑制剂；(ii)ox40、cd137、cd40、gitr、cd27、hvem、tnfrsf25或icos的激动剂；和(iii)选自il-12、il-15、gm-csf和g-csf的细胞因子。本发明的蛋白质也可用作原发性病灶的手术去除的辅助物。为了实现所需的组合治疗效果，可以选择多特异性结合蛋白和其他治疗剂的量和施用的相对时间安排。例如，当向需要这种施用的患者施用组合疗法时，所述组合的治疗剂或包含所述治疗剂的一种或多种药物组合物可以以任何顺序施用，例如顺序、并行、一起、同时施用等。此外，例如，多特异性结合蛋白可以在所述其他治疗剂发挥其预防或治疗效果的时间内施用，或与之相反。v.药物组合物本发明还描述了含有治疗有效量的本文中描述的蛋白质的药物组合物。所述组合物可以被配制成用于各种不同的药物递送系统。对于适合的剂型来说，一种或多种生理上可接受的赋形剂或载体也可以包含在所述组合物中。适合在本公开中使用的剂型参见《remington's制药学》(remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,philadelphia,pa.,17thed.,1985)。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见例如langer(science249:1527-1533,1990)。药物组合物可以含有治疗有效量的包含抗原(表15中列出的)位点的多特异性结合蛋白。本公开的静脉内药物递送剂型可以包含在袋子、笔或注射器中。在某些实施方式中，所述袋子可以被连接到包含管和/或针头的通道。在某些实施方式中，所述剂型可以是冷冻干燥剂型或液体剂型。在某些实施方式中，所述剂型可以被冷冻干燥(冻干)并包含在约12-60个小瓶中。在某些实施方式中，所述剂型可以被冷冻干燥，并且可以将45mg所述冷冻干燥的剂型包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，可以将约40mg-约100mg所述冷冻干燥的剂型包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，将来自于12、27或45个小瓶的冷冻干燥的剂型合并，以获得所述蛋白质在静脉内药物剂型中的治疗剂量。在某些实施方式中，所述剂型可以是液体剂型，并以约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶储存。在某些实施方式中，所述剂型可以是液体剂型并以约600mg/小瓶储存。在某些实施方式中，所述剂型可以是液体剂型并以约250mg/小瓶储存。所述蛋白质可以以水性液体药物剂型的形式存在，其在形成剂型的缓冲溶液中包括治疗有效量的所述蛋白质。这些组合物可以通过常规的灭菌技术灭菌，或者可以除菌过滤。得到的水性溶液可以原样包装以备使用，或者可以被冷冻干燥，所述冷冻干燥的制剂在施用之前与无菌水性载体合并。所述制剂的ph通常在3至11之间，更优选地在5至9之间或6至8之间，最优选地在7至8之间，例如7至7.5。所述得到的固体形式的组合物可以被包装在多个单一剂量单元中，各自含有固定量的上述一种或多种药剂。所述固体形式的组合物也可以以灵活的量包装在容器中。在某些实施方式中，本公开提供了具有延长的储存期限的剂型，其包含本公开的蛋白质与甘露糖醇、单水柠檬酸、柠檬酸钠、二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、氯化钠、聚山梨醇酯80、水和氢氧化钠的组合。在某些实施方式中，制备了一种水性剂型，其在ph缓冲的溶液中包含本公开的蛋白质。本发明的缓冲液可以具有约4至约8，例如约4.5至约6.0或约4.8至约5.5范围内的ph，或者可以具有约5.0至约5.2的ph。在上述ph之间的范围也打算作为本公开的一部分。例如，打算包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围。将ph控制在这个范围之内的缓冲剂的实例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。在某些实施方式中，所述剂型包括含有柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲系统，以将ph维持在约4至约8的范围内。在某些实施方式中，所述ph范围可以是约4.5至约6.0或约ph4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的ph范围内。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括单水柠檬酸、柠檬酸钠、二水磷酸氢二钠和/或二水磷酸二氢钠。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括约1.3mg/ml柠檬酸(例如1.305mg/ml)、约0.3mg/ml柠檬酸钠(例如0.305mg/ml)、约1.5mg/ml二水磷酸氢二钠(例如1.53mg/ml)、约0.9mg/ml二水磷酸二氢钠(例如0.86)和约6.2mg/ml氯化钠(例如6.165mg/ml)。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括1-1.5mg/ml柠檬酸、0.25至0.5mg/ml柠檬酸钠、1.25至1.75mg/ml二水磷酸氢二钠、0.7至1.1mg/ml二水磷酸二氢钠和6.0至6.4mg/ml氯化钠。在某些实施方式中，所述剂型的ph用氢氧化钠调节。充当等渗剂并且可以使抗体稳定的多元醇，也可以包含在所述剂型中。所述多元醇以可能根据剂型的所需等渗性而变的量添加到所述剂型。在某些实施方式中，所述水性剂型可以是等渗的。添加的多元醇的量也可能根据所述多元醇的分子量而变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比，可以添加较低量的单糖(例如甘露糖醇)。在某些实施方式中，可以在所述剂型中用作等渗剂的多元醇是甘露糖醇。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约5至约20mg/ml。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约7.5至15mg/ml。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约10-14mg/ml。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约12mg/ml。在某些实施方式中，多元醇山梨糖醇可以包含在所述剂型中。也可以向所述剂型添加去污剂或表面活性剂。示例性的去污剂包括非离子型去污剂例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。添加的去污剂的量使得它减少所述配制的抗体的聚集和/或将所述剂型中颗粒物的形成降至最低和/或减少吸附。在某些实施方式中，所述剂型可以包含作为表面活性剂的聚山梨醇酯。在某些实施方式中，所述剂型可以含有去污剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80是用于描述聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯的术语(参见fiedler,lexikonderhifsstoffe,editiocantorverlagaulendorf,4thed.,1996)。在某些实施方式中，所述剂型可以含有约0.1mg/ml至约10mg/ml之间或约0.5mg/ml至约5mg/ml之间的聚山梨醇酯80。在某些实施方式中，可以在所述剂型中添加约0.1％聚山梨醇酯80。在实施方式中，本公开的蛋白质产品被配制成液体剂型。所述液体剂型可以以10mg/ml的浓度存在于usp/pheuri型50r小瓶中，用橡胶塞封闭并用铝制压合密封盖密封。所述橡胶塞可以由符合usp和pheur的弹性体制成。在某些实施方式中，小瓶可以装填有61.2ml所述蛋白质产品溶液，以便允许可抽出体积为60ml。在某些实施方式中，可以将所述液体剂型用0.9％盐水溶液稀释。在某些实施方式中，本公开的液体剂型可以被制备成浓度为10mg/ml的溶液，并与稳定剂水平的糖相组合。在某些实施方式中，所述液体剂型可以在水性载体中制备。在某些实施方式中，稳定剂可以以不超过可能产生对静脉内施用来说不理想或不适合的黏度的量添加。在某些实施方式中，所述糖可以是二糖例如蔗糖。在某些实施方式中，所述液体剂型也可以包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂和防腐剂。在某些实施方式中，所述液体剂型的ph可以通过添加可药用酸和/或碱来设定。在某些实施方式中，所述可药用酸可以是盐酸。在某些实施方式中，所述碱可以是氢氧化钠。除了聚集之外，脱酰胺是肽和蛋白质在发酵、收获/细胞澄清、纯化、药物物质/药物制品储存期间和样品分析期间可能发生的常见产品变异。脱酰胺是从蛋白质失去nh3，形成琥珀酰亚胺中间体，其可能经历水解。所述琥珀酰亚胺中间体引起母体肽的质量减少17道尔顿。随后的水解导致质量增加18道尔顿。由于在水性条件下不稳定，所述琥珀酰亚胺中间体的分离是困难的。因此，脱酰胺通常可检测为质量增加1道尔顿。天冬酰胺的脱酰胺产生天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺速率的参数包括ph、温度、溶剂介电常数、离子强度、一级序列、局部多肽构象和三级结构。在肽链中与asn相邻的氨基酸残基影响脱酰胺速率。蛋白质序列中asn之后的gly和ser导致对脱酰胺更高的敏感性。在某些实施方式中，本公开的液体剂型可以在防止所述蛋白质产品脱酰胺的ph和湿度条件下保存。本文中感兴趣的水性载体是可药用(对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于制备液体剂型的水性载体。说明性载体包括无菌注射用水(swfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。防腐剂可以任选地添加到本发明的剂型以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)剂型。在特定情况下，例如当患者在医院中在移植后通过iv途径接受所有药物时，静脉内(iv)剂型可能是优选的施用途径。在某些实施方式中，在施用前将所述液体剂型用0.9％氯化钠溶液稀释。在某些实施方式中，所述稀释的注射用药物产品是等渗的，并适合于通过静脉内输注施用。在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以以10mm-200mm的量添加。所述盐和/或缓冲剂是可药用的，并源自于各种不同的已知酸(无机和有机酸)和“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲剂，在所述情况下，钠、钾或铵离子可以充当平衡离子。防腐剂可以任选地添加到本发明的剂型以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)剂型。本文中感兴趣的水性载体是可药用(对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于制备液体剂型的水性载体。说明性载体包括无菌注射用水(swfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。本公开的蛋白质可以以冷冻干燥剂型的形式存在，其包括所述蛋白质和冻干保护剂。所述冻干保护剂可以是糖例如二糖。在某些实施方式中，所述冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。所述冷冻干燥剂型也可以包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂、增量剂和/或防腐剂。可用于使所述冷冻干燥的药物制品稳定的蔗糖或麦芽糖的量可以是蛋白质与蔗糖或麦芽糖至少1:2的重量比。在某些实施方式中，所述蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1:2至1:5。在某些实施方式中，在冷冻干燥之前，所述剂型的ph可以通过添加可药用酸和/或碱来设定。在某些实施方式中，所述可药用酸可以是盐酸。在某些实施方式中，所述可药用碱可以是氢氧化钠。在冷冻干燥之前，含有本公开的蛋白质的溶液的ph可以被调整到6至8之间。在某些实施方式中，用于所述冷冻干燥的药物制品的ph范围可以是7至8。在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以以10mm-200mm的量添加。所述盐和/或缓冲剂是可药用的，并源自于各种不同的已知酸(无机和有机酸)和“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲剂，在所述情况下，钠、钾或铵离子可以充当平衡离子。在某些实施方式中，可以添加“增量剂”。“增量剂”是为冻干混合物增添质量并对冻干饼的物理结构有贡献(例如便于生产维持开放孔隙结构的基本上均匀的冻干饼)的化合物。说明性的增量剂包括甘露糖醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冷冻干燥剂型可以含有这些增量剂。防腐剂可以任选地添加到本发明的剂型以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)剂型。在某些实施方式中，所述冷冻干燥的药物制品可以用水性载体构造。本文中感兴趣的水性载体是可药用(例如对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于在冷冻干燥后制备液体剂型的水性载体。说明性稀释剂包括无菌注射用水(swfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。在某些实施方式中，本公开的冷冻干燥的药物制品用usp级无菌注射用水(swfi)或usp级0.9％氯化钠注射液重构。在重构期间，将所述冷冻干燥的粉剂溶解在溶液中。在某些实施方式中，本公开的冷冻干燥的蛋白质产品构造到约4.5ml注射用水，并用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得对特定患者、组合物和施用方式来说有效实现所需治疗响应并且对所述患者无毒的活性成分的量。具体剂量可以是对每位患者来说均一的剂量，例如50-5000mg蛋白质。或者，患者的剂量可以根据所述患者的大致的体重或表面积定制。确定适合剂量的其他因素可以包括待治疗或预防的疾病或病症、疾病的严重性、施用途径和患者的年龄、性别和医疗状况。确定用于治疗的适合剂量所必需的计算的进一步精化由本领域技术人员按常规进行，特别是根据本文中公开的剂量信息和测定法。所述剂量也可以通过使用用于确定使用剂量的已知测定法并联合适合的剂量响应数据来确定。当监测到疾病进展时，个体患者的剂量可以进行调整。可以测量患者中可靶向构建体或复合物的血液水平，以观察是否需要调整剂量来达到或维持有效浓度。可以使用药物基因组学来确定哪些可靶向构建体和/或复合物及其剂量最可能对给定个体有效(schmitz等，clinicachimicaacta308:43-53,2001；steimer等，clinicachimicaacta308:33-41,2001)。一般来说，基于体重的剂量是每kg体重约0.01μg至约100mg，例如约0.01μg至约100mg/kg体重、约0.01μg至约50mg/kg体重、约0.01μg至约10mg/kg体重、约0.01μg至约1mg/kg体重、约0.01μg至约100μg/kg体重、约0.01μg至约50μg/kg体重、约0.01μg至约10μg/kg体重、约0.01μg至约1μg/kg体重、约0.01μg至约0.1μg/kg体重、约0.1μg至约100mg/kg体重、约0.1μg至约50mg/kg体重、约0.1μg至约10mg/kg体重、约0.1μg至约1mg/kg体重、约0.1μg至约100μg/kg体重、约0.1μg至约10μg/kg体重、约0.1μg至约1μg/kg体重、约1μg至约100mg/kg体重、约1μg至约50mg/kg体重、约1μg至约10mg/kg体重、约1μg至约1mg/kg体重、约1μg至约100μg/kg体重、约1μg至约50μg/kg体重、约1μg至约10μg/kg体重、约10μg至约100mg/kg体重、约10μg至约50mg/kg体重、约10μg至约10mg/kg体重、约10μg至约1mg/kg体重、约10μg至约100μg/kg体重、约10μg至约50μg/kg体重、约50μg至约100mg/kg体重、约50μg至约50mg/kg体重、约50μg至约10mg/kg体重、约50μg至约1mg/kg体重、约50μg至约100μg/kg体重、约100μg至约100mg/kg体重、约100μg至约50mg/kg体重、约100μg至约10mg/kg体重、约100μg至约1mg/kg体重、约1mg至约100mg/kg体重、约1mg至约50mg/kg体重、约1mg至约10mg/kg体重、约10mg至约100mg/kg体重、约10mg至约50mg/kg体重、约50mg至约100mg/kg体重。药剂可以每日、每周、每月或每年施用一次或多次，或甚至每2至20年施用一次，本领域普通技术人员可以根据体液或组织中可靶向构建体或复合物的测量到的停留时间和浓度，容易地估算施用的重复率。本发明的施用可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内、通过导管灌注或通过直接病灶内注射。这可以施用每日一次或多次、每周一次或多次、每月一次或多次或每年一次或多次。上面的描述描述了本发明的多个方面和实施方式。本申请具体来说设想了所述方面和实施方式的所有组合和排列。实施例现在正一般性描述的本发明，通过参考下面的实施例将更容易被理解，包括所述实施例仅仅是出于说明本发明的某些方面和实施方式的目的，并且不打算限制本发明。实施例1–nkg2d结合结构域结合到nkg2dnkg2d结合结构域结合到纯化的重组nkg2d将人类、小鼠或食蟹猴nkg2d胞外结构域(ectodomains)的核酸序列与编码人类igg1fc结构域的核酸序列融合，并引入到哺乳动物细胞中进行表达。在纯化后，将nkg2d-fc融合蛋白吸附到微孔板的孔。在用牛血清白蛋白阻断所述孔以防止非特异性结合后，对nkg2d结合结构域进行滴定并将其添加到预先吸附有nkg2d-fc融合蛋白的孔。第一抗体结合使用偶联到辣根过氧化物酶并特异性识别人类κ轻链以避免fc交叉反应性的第二抗体来检测。向所述孔添加辣根过氧化物酶的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)以可视化结合信号，所述信号在450nm处测量并在540nm处校正。向每个孔添加nkg2d结合结构域克隆、同种型对照或阳性对照(包含选自seqidno：101-104的重链和轻链可变结构域，或可以在ebioscience获得的抗小鼠nkg2d抗体克隆mi-6和cx-5)。所述同种型对照显示出与重组nkg2d-fc蛋白极小的结合，而所述阳性对照最强结合到所述重组抗原。由所有克隆产生的nkg2d结合结构域都表现出跨人类、小鼠和食蟹猴重组nkg2d-fc蛋白的结合，尽管在不同克隆之间具有不同的亲和力。总体来说，每种抗nkg2d克隆以相近的亲和力结合到人类(图3)和食蟹猴(图4)重组nkg2d-fc，但结合到小鼠(图5)重组nkg2d-fc的亲和力较低。nkg2d结合结构域结合到表达nkg2d的细胞对el4小鼠淋巴瘤细胞系进行工程化改造，以表达人类或小鼠nkg2d-cd3ζ信号传导结构域嵌合抗原受体。将nkg2d结合克隆、同种型对照或阳性对照以100nm的浓度用于染色在所述el4细胞上表达的细胞外nkg2d。抗体结合使用荧光团偶联的抗人类igg第二抗体来检测。细胞通过流式细胞术进行分析，并使用表达nkg2d的细胞与母体el4细胞的平均荧光强度(mfi)的比较来计算高于背景的倍数(fob)。由所有克隆产生的nkg2d结合结构域都结合到表达人类和小鼠nkg2d的el4细胞。阳性对照抗体(包含选自seqidno：101-104的重链和轻链可变结构域，或可以在ebioscience获得的抗小鼠nkg2d抗体克隆mi-6和cx-5)给出最好的fob结合信号。在表达人类nkg2d(图6)和小鼠(图7)nkg2d的细胞之间，每种克隆的nkg2d结合亲和力相近。实施例2–nkg2d结合结构域阻断天然配体结合到nkg2d与ulbp-6的竞争将重组人类nkg2d-fc蛋白吸附到微孔板的孔，并将所述孔用牛血清白蛋白阻断以降低非特异性结合。向所述孔添加饱和浓度的ulbp-6-his-生物素，然后添加nkg2d结合结构域克隆。在温育2小时后，将孔清洗，并通过链亲合素偶联的辣根过氧化物酶和tmb底物检测仍结合于nkg2d-fc包被的孔的ulbp-6-his-生物素。吸收值在450nm处测量并在540nm处校正。在减去背景后，从被阻断与孔中的nkg2d-fc蛋白结合的ulbp-6-his-生物素的百分率，来计算nkg2d结合结构域与nkg2d-fc蛋白的特异性结合。阳性对照抗体(包含选自seqidno：101-104的重链和轻链可变结构域)和各种不同的nkg2d结合结构域阻断ulbp-6结合到nkg2d，而同种型对照显示出很小的与ulbp-6的竞争(图8)。ulbp-6序列由seqidno：108表示maaaaipalllclpllfllfgwsrarrddphslcyditvipkfrpgprwcavqgqvdektflhydcgnktvtpvsplgkklnvtmawkaqnpvlrevvdilteqlldiqlenytpkepltlqarmsceqkaeghssgswqfsidgqtfllfdsekrmwttvhpgarkmkekwendkdvamsfhyismgdcigwledflmgmdstlepsagaplamssgttqlratattlilcclliilpcfilpgi(seqidno：108)与mica的竞争将重组人类mica-fc蛋白吸附到微孔板的孔，并将所述孔用牛血清白蛋白阻断以降低非特异性结合。向所述孔添加nkg2d-fc-生物素，然后添加nkg2d结合结构域。在温育和清洗后，使用链亲合素-hrp和tmb底物检测仍结合于mica-fc包被的孔的nkg2d-fc-生物素。吸收值在450nm处测量并在540nm处校正。在减去背景后，从被阻断与mica-fc包被的孔结合的nkg2d-fc-生物素的百分率，来计算nkg2d结合结构域与nkg2d-fc蛋白的特异性结合。阳性对照抗体(包含选自seqidno：101-104的重链和轻链可变结构域)和各种不同的nkg2d结合结构域阻断mica结合到nkg2d，而同种型对照显示出很小的与mica的竞争(图9)。与rae-1δ的竞争将重组小鼠rae-1δ-fc(购自r&dsystems)吸附到微孔板的孔，并将所述孔用牛血清白蛋白阻断以降低非特异性结合。向所述孔添加小鼠nkg2d-fc-生物素，然后添加nkg2d结合结构域。在温育和清洗后，使用链亲合素-hrp和tmb底物检测仍结合于rae-1δ-fc包被的孔的nkg2d-fc-生物素。吸收值在450nm处测量并在540nm处校正。在减去背景后，从被阻断与rae-1δ-fc包被的孔结合的nkg2d-fc-生物素的百分率，来计算nkg2d结合结构域与nkg2d-fc蛋白的特异性结合。阳性对照(包含选自seqidno：101-104的重链和轻链可变结构域，或可以在ebioscience获得的抗小鼠nkg2d抗体克隆mi-6和cx-5)和各种不同的nkg2d结合结构域克隆阻断rae-1δ结合到小鼠nkg2d，而同种型对照抗体显示出很小的与rae-1δ的竞争(图10)。实施例3–nkg2d结合结构域克隆激活nkg2d将人类和小鼠nkg2d的核酸序列融合到编码cd3ζ信号传导结构域的核酸序列以获得嵌合抗原受体(car)构建体。然后将所述nkg2d-car构建体使用gibson组装克隆到逆转录病毒载体中，并转染到expi293细胞中用于逆转录病毒生产。将el4细胞用含有nkg2d-car的病毒与8μg/ml聚凝胺一起感染。感染后24小时，通过流式细胞术分析所述el4细胞中nkg2d-car的表达水平，并选择在细胞表面上表达高水平nkg2d-car的克隆。为了确定nkg2d结合结构域是否激活nkg2d，将它们吸附到微孔板的孔，并将nkg2d-carel4细胞在布雷菲德菌素-a和莫能菌素存在下在抗体片段包被的孔上培养4小时。通过流式细胞术测定细胞内tnf-α生产这种nkg2d激活的指示。将tnf-α阳性细胞归一化到用阳性对照处理的细胞。所有nkg2d结合结构域激活人类nkg2d(图11)和小鼠nkg2d(图12)两者。实施例4–nkg2d结合结构域激活nk细胞原代人类nk细胞使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(pbmc)。使用磁珠负选择从pbmc分离nk细胞(cd3-cd56+)，分离到的nk细胞的纯度通常>95％。然后将分离的nk细胞在含有100ng/mlil-2的培养基中培养24-48小时，然后将它们转移到吸附有nkg2d结合结构域的微孔板孔，并在含有荧光团偶联的抗cd107a抗体、布雷菲德菌素-a和莫能菌素的培养基中培养。在培养后，使用荧光团偶联的针对cd3、cd56和ifn-γ的抗体通过流式细胞术测定nk细胞。在cd3-cd56+细胞中分析cd107a和ifn-γ染色，以评估nk细胞激活。cd107a/ifn-γ双阳性细胞的增加指示了通过结合两个激活受体而不是一个受体的更好的nk细胞激活。nkg2d结合结构域和阳性对照(例如由seqidno：101或seqidno：103表示的重链可变结构域，和由seqidno：102或seqidno：104表示的轻链可变结构域)与同种型对照相比显示出变成cd107a+和ifn-γ+的nk细胞的百分率更高(图13和图14代表了来自于两个独立实验的数据，其各自使用不同供体的pbmc用于nk细胞制备)。原代小鼠nk细胞从c57bl/6小鼠获得脾脏并将其通过70μm细胞筛压碎，以获得单细胞悬液。将细胞离心沉淀并重悬浮在ack裂解缓冲液(购自thermofisherscientific#a1049201；155mm氯化铵，10mm碳酸氢钾，0.01mmedta)中，以除去红细胞。将剩余的细胞用100ng/mlhil-2培养72小时，然后收获并准备用于nk细胞分离。然后用磁珠使用反向贫化技术从脾细胞分离nk细胞(cd3-nk1.1+)，通常纯度>90％。将纯化的nk细胞在含有100ng/mlmil-15的培养基中培养48小时，然后将它们转移到吸附有nkg2d结合结构域的微孔板孔，并在含有荧光团偶联的抗cd107a抗体、布雷菲德菌素-a和莫能菌素的培养基中培养。在nkg2d结合结构域包被的孔中培养后，使用荧光团偶联的针对cd3、nk1.1和ifn-γ的抗体通过流式细胞术测定nk细胞。在cd3-nk1.1+细胞中分析cd107a和ifn-γ染色，以评估nk细胞激活。cd107a/ifn-γ双阳性细胞的增加指示了通过结合两个激活受体而不是一个受体的更好的nk细胞激活。nkg2d结合结构域和阳性对照(选自可以在ebioscience获得的抗小鼠nkg2d抗体克隆mi-6和cx-5)与同种型对照相比显示出变成cd107a+和ifn-γ+的nk细胞的百分率更高(图15和图16代表了来自于两个独立实验的数据，其各自使用不同小鼠用于nk细胞制备)。实施例5–nkg2d结合结构域能够引起对靶肿瘤细胞的细胞毒性人类和小鼠原代nk细胞激活测定法证实了在与nkg2d结合结构域温育后nk细胞上的细胞毒性标志物增加。为了研究这是否转变成肿瘤细胞裂解的增加，利用了基于细胞的测定法，其中将每个nkg2d结合结构域开发成单特异性抗体。将fc区用作一个靶向臂，而fab片段区(nkg2d结合结构域)充当另一个靶向臂，以激活nk细胞。将人类起源并表达高水平fc受体的thp-1细胞用作肿瘤靶，并使用perkinelmerdelfia细胞毒性试剂盒。将thp-1细胞用batda试剂标记，并以105/ml重悬浮在培养基中。然后将标记的thp-1细胞与nkg2d抗体和分离的小鼠nk细胞在微孔板的孔中合并，在37℃下温育3小时。在温育后，取出20μl培养上清液，与200μl铕溶液混合，并在暗处振摇温育15分钟。通过装备有时间分辨荧光模块(激发337nm，发射620nm)的pherastar读板器随时间测量荧光，并按照试剂盒说明书计算特异性裂解。阳性对照偶联到fc的ulbp-6、即nkg2d的天然配体，显示出thp-1靶细胞被小鼠nk细胞的特异性裂解的增加。nkg2d抗体也增加了thp-1靶细胞的特异性裂解，而同种型对照抗体显示出特异性裂解的减少。虚线指示在不添加抗体的情况下thp-1细胞被小鼠nk细胞的特异性裂解(图17)。实施例6–nkg2d抗体显示出高的热稳定性使用差示扫描荧光测定法测定nkg2d结合结构域的熔解温度。外推的表观熔解温度相对于典型的igg1抗体来说更高(图18)。实施例7–人类nk细胞被交联的nkg2d和cd16的协同激活原代人类nk细胞激活测定法使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(pbmc)。使用负磁珠(stemcell#17955)从pbmc纯化nk细胞。通过流式细胞术确定nk细胞为>90％cd3-cd56+。然后将分离的nk细胞在含有100ng/mlhil-2(peprotech#200-02)的培养基中扩增48小时，然后用于激活测定法中。将抗体以2μg/ml(抗cd16抗体，biolegend#302013)和5μg/ml(抗nkg2d抗体，r&d#mab139)的浓度，在100μl无菌pbs中在96孔平底板上在4℃包被过夜，然后充分清洗所述孔以除去过量抗体。为了评估脱颗粒，将il-2激活的nk细胞以5×105个细胞/ml重悬浮在增补有100ng/ml人类hil2和1μg/mlapc偶联的抗cd107amab(biolegend#328619)的培养基中。然后将1×105个细胞/孔添加到抗体包被的板上。分别以1:1000和1:270的最终稀释度添加蛋白质转运抑制剂布雷菲德菌素a(bfa，biolegend#420601)和莫能菌素(biolegend#420701)。将铺板的孔在5％co2中在37℃下温育4小时。对于ifn-γ的细胞内染色来说，将nk细胞用抗cd3抗体(biolegend#300452)和抗cd56mab(biolegend#318328)标记，然后固定，通透化，并用抗ifn-γmab(biolegend#506507)标记。在对活的cd56+cd3-细胞进行门选后，通过流式细胞术分析nk细胞的cd107a和ifn-γ表达。为了调查受体组合的相对效能，通过板结合刺激进行了nkg2d或cd16的交联和两种受体的共同交联。如图19(图19a-19c)中所示，cd16和nkg2d的组合刺激产生大大提高的cd107a水平(脱颗粒)(图19a)和/或ifn-γ生产(图19b)。虚线表示每种受体的单独刺激的累加效应。在用抗cd16抗体、抗nkg2d抗体或两种单克隆抗体的组合进行4小时的板结合刺激后，分析il-2激活的nk细胞的cd107a水平和细胞内ifn-γ生产。图指示了平均值(n＝2)±sd。图19a示出cd107a的水平；图19b示出ifnγ的水平；图19c示出cd107a和ifnγ的水平。图19a-19c中示出的数据代表了使用5位不同健康供体的5个独立实验。实施例8–三特异性结合蛋白(trinket)介导的靶细胞的增强的细胞毒性cxcr4在人类癌细胞系上的表达使用流式细胞术筛选人类癌细胞系的cxcr4的表面表达。将可商购的针对人类cxcr4的抗体(克隆12g5)用于细胞染色。从培养物收获细胞系，并将细胞在染色前在facs缓冲液中清洗。将细胞与抗cxcr4抗体或相应的同种型对照抗体在冰上温育20分钟。然后将细胞清洗并重悬浮在facs缓冲液中以备分析。将cxcr4染色与同种型对照抗体进行比较。图35示出了cxcr4在raji人类b细胞淋巴瘤细胞系的表面上的表达。raji细胞证实了与同种型对照抗体相比，当用特异性针对cxcr4的抗体染色时，结合荧光强度中位数(mfi)的对数变化。细胞毒性测定法使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离pbmc。将分离的pbmc洗涤并准备用于nk细胞分离。使用磁珠通过负选择技术分离nk细胞。获得的分离的nk细胞的纯度通常高于90％cd3-cd56+。将分离的nk细胞在不含细胞因子的情况下温育过夜，并在第二天用于细胞毒性测定法中。将被转导以表达cd16-f158v的khyg-1细胞用于研究nkg2d和cd16双重刺激的贡献。khyg-1-cd16v细胞被维持在含有10ng/mlil-2的10％hi-fbs-rpmi-1640中。在杀伤测定法中用作效应细胞前一天，从培养物收获khyg-1-cd16v细胞，并从细胞洗掉含有il-2的培养基。在清洗后，将khyg-1细胞重悬浮在10％hi-fbs-rpmi-1640中，并在没有细胞因子的情况下静息过夜。khyg-1-cd16v细胞毒性测定法图36示出了靶向cxcr4的trinket以剂量依赖性方式提高raji靶细胞的khyg-1杀伤。在10：1的效应细胞与靶细胞比例下，khyg-1细胞对raji细胞显示出弱活性，约6％的靶细胞裂解。针对cxcr4的单克隆抗体hz515h7能够提高khyg-1活性。使用三种不同的nkg2d结合结构域，设计了使用hz515h7cxcr4结合结构域的三种trinket。测试的trinket是a49-trinket-cxcr4-hz515h7(来自于克隆adi-27749的nkg2d结合结构域和源自于hz515h7的cxcr4结合结构域)、a44-trinket-cxcr4-hz515h7(来自于克隆adi-27744的nkg2d结合结构域和源自于hz515h7的cxcr4结合结构域)和c26-trinket-cxcr4-hz515h7(来自于克隆adi-28226的nkg2d结合结构域和源自于hz515h7的cxcr4结合结构域)。与单克隆抗体相比，所有三种trinket对raji靶细胞显示出提高的效能和最大裂解。delfia细胞毒性测定法从培养物收集表达感兴趣的靶的人类癌细胞系，用hbs清洗，并以106个细胞/ml的密度重悬浮在生长培养基中，以备使用batda试剂(perkinelmer,ad0116)进行标记。遵照制造商的说明书进行靶细胞的标记。在标记后，将细胞用hbs清洗三次并以0.5x105个细胞/ml的密度重悬浮在培养基中。为了制备背景孔，将标记的细胞的等分试样放在一边，然后将细胞从培养基中离心出来。向孔一式三份小心地添加100μl培养基，以避免扰动沉积的细胞。向96孔板的每个孔添加100μlbatda标记的细胞。保留用于测量从靶细胞的自发释放的孔，并准备用于通过添加1％triton-x来裂解靶细胞的孔。将针对感兴趣的肿瘤靶的单克隆抗体或trinket在培养基中稀释，并向每个孔添加50μl稀释的mab或trinket。从培养基收获静息nk细胞，清洗，并根据所需的效应细胞与靶细胞比例以1.0x105-2.0x106个细胞/ml的密度重悬浮在培养基中。向所述板的每个孔添加50μlnk细胞，以提供总共200μl培养体积。在测定法显色之前，将所述板在37℃和5％co2下温育2-4小时。在培养2-3小时后，将板从温箱取出，并通过以200xg离心5分钟将细胞沉积。将20μl培养上清液转移到由制造商提供的干净的微孔板，并向每个孔添加200μl室温铕溶液。将板避光并在摇板器上以250rpm温育15分钟。使用i3x仪器(moleculardevices)读板，并计算特异性裂解的％(特异性裂解的％＝((实验释放–自发释放)/(最大释放–自发释放))x100)。原代人类nk细胞毒性测定法图37示出了靶向cxcr4的trinket提高cxcr4阳性肿瘤细胞系raji的原代nk细胞杀伤。在5：1的效应细胞与靶细胞比例下，人类nk细胞对raji细胞显示出弱活性，8％的靶细胞裂解。针对cxcr4的单克隆抗体hz515h7能够将nk细胞活性提高到约15％的裂解。使用三种不同的nkg2d结合结构域，设计了使用hz515h7cxcr4结合结构域的三种trinket。与单克隆抗体相比，所有三种trinket显示出提高的nk细胞介导的裂解。通过参考并入本文中提到的每个专利文献和科学论文的整个公开内容为所有目的通过参考并入本文。等同性本发明可以以其他特定形式体现而不背离其精神或本质特征。因此，前述实施方式应该在所有情况下被认为是说明性的而不是限制本文描述的发明。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是上面的描述指明，并且打算将进入权利要求书的意义和等同性范围之内的所有变化涵盖在其中。序列表<110>蜻蜓疗法股份有限公司<120>结合nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的蛋白质<130>aj4309pt2002<140><141><150>62/608,384<151>2017-12-20<150>62/581,357<151>2017-11-03<150>62/566,828<151>2017-10-02<150>62/558,514<151>2017-09-14<150>62/558,511<151>2017-09-14<150>62/558,510<151>2017-09-14<150>62/558,509<151>2017-09-14<150>62/549,201<151>2017-08-23<160>529<170>patentinversion3.5<210>1<211>117<212>p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