双特异性抗体产品的连续制造工艺的制作方法

本发明涉及生物技术的方法，具体涉及制造双特异性抗体的连续制造工艺。
背景技术：
：：最快速和最有前景地发展中的治疗剂是基于蛋白质的药物，它已经在几乎所有医学领域中发挥重要作用，并且是临床(前)开发中且作为商业产品增长最快的治疗剂(leader[前导序列],naturereviewsdrugdiscovery[药物发现自然评论]2008年1月7日,21-39)。与小化学药物相比，蛋白质药物在相对低的浓度下具有高特异性和活性，并且通常提供诸如各种癌症、自身免疫疾病和代谢障碍等高影响疾病的疗法(roberts,trendsbiotechnol.[生物技术趋势]2014年7月；32(7):372-80，wang,intjpharm.[国际药剂学杂志]1999年8月20日；185(2):129-88)。由于商业规模纯化工艺的进展，现在可以在首次制造时以高纯度获得基于蛋白质的药物如重组蛋白质。然而，蛋白质仅略微稳定，并且即使在上游制造过程中也极易经受化学和物理降解。化学降解是指涉及共价键的修饰，如脱酰胺基、氧化、裂解或新二硫键的形成、水解、异构化或去糖基化。物理降解包括蛋白质解折叠、不希望的表面吸附和聚集。应对这些物理和化学不稳定性是蛋白质药物开发中最具挑战性的任务之一(chi等人,pharmres[药学研究],第20卷,第9期,2003年9月,第1325-1336页，roberts,trendsbiotechnol.[生物技术趋势]2014年7月；32(7):372-80)。因此，尽管制造方面取得了进展，但新的基于蛋白质的药物需要新的优化制造工艺，以避免产品质量影响如蛋白质聚集。蛋白质聚集会影响上游制造、下游制造、储存和应用。这种新的基于蛋白质的药物包括例如双特异性(单克隆)抗体。双特异性抗体是可以同时结合两种不同类型的抗原的人工蛋白质。已知它们具有几种结构形式，并且目前已经探索了用于癌症免疫疗法和药物递送的应用(fan,gaowei；wang,zujian；hao,mingju；li,jinming(2015).“bispecificantibodiesandtheirapplications”[双特异性抗体及其应用].journalofhematology&oncology[血液学和肿瘤学杂志].8:130)。通常，双特异性抗体可以是igg样即全长双特异性抗体或非igg样双特异性抗体，这些非igg样双特异性抗体不是全长抗体构建体。全长双特异性抗体通常保留两个fab臂和一个fc区的传统单克隆抗体(mab)结构，但两个fab位点结合不同抗原。非全长双特异性抗体缺乏整个fc区。这些非全长双特异性抗体包括化学连接的fab，这些化学连接的fab仅由fab区以及各种类型的二价和三价单链可变片段(scfv)组成。还存在模拟两种抗体的可变结构域的融合蛋白。可能最大程度开发的这些更新形式是双特异性t细胞衔接物(yang,fa；wen,weihong；qin,weijun(2016).“bispecificantibodiesasadevelopmentplatformfornewconceptsandtreatmentstrategies”[双特异性抗体作为用于新概念和治疗策略的开发平台].internationaljournalofmolecularsciences[国际分子科学杂志].18(1):48)。双特异性分子如抗体构建体是由两个柔性连接的抗体衍生的结合结构域制成的重组蛋白构建体。抗体构建体的一个结合结构域对靶细胞上选择的肿瘤相关表面抗原具有特异性；第二结合结构域对cd3具有特异性，cd3是t细胞上t细胞受体复合物的亚基。通过其特定设计，抗体构建体特别适合于使t细胞与靶细胞瞬时连接，并且同时有效激活t细胞对靶细胞的固有细胞溶解潜力。以amg103和amg110的形式开发到临床中的第一代抗体构建体(参见wo99/54440和wo2005/040220)的重要进一步开发是提供在cd3ε链的n-末端结合背景独立表位的双特异性抗体构建体(wo2008/119567)。与该选择的表位结合的抗体构建体不仅显示对人和普通狨、棉冠獠狨或松鼠猴cd3ε链的跨物种特异性，而且由于识别该特异性表位而非先前所述在双特异性t细胞衔接分子中对于cd3结合物的表位，这些抗体构建体不会非特异性地激活t细胞，其程度与对于上一代t细胞衔接抗体所观察到的程度相同。t细胞激活的这种减少与患者中较少或减少的t细胞再分布有关，这被认为是副作用的风险。目前，通过补料分批培养制造工艺生产双特异性抗体。补料分批培养作为生物技术工艺中的操作技术是众所周知的，其中在培养期间将一种或多种营养素(底物)进料(供应)至生物反应器中并且其中一种或多种产品保留在生物反应器中直到运行结束(tsuneoyamanè,shoichishimizu:fed-batchtechniquesinmicrobialprocesses[微生物工艺中的补料分批技术].(1984)advancesinbiochemeng./biotechnol[生物化学工程/生物技术进展],30:147-194)。因此，双特异性抗体产品在补料分批工艺期间积累并且易于出现产品质量损失，例如由于聚集、剪切(clipping)或某些化学降解反应引起的产品质量损失。另外，在运行结束之前无法获得产品。此外，在补料分批工艺期间，工艺相关的杂质如宿主细胞蛋白质(hcp)同样在生物反应器中积累。在下游去除这些杂质通常是具有挑战性的，并且需要额外的措施和资源来确保最终产品质量。由于每次新的运行都需要新的细胞培养生长阶段，因此补料分批的总体生产力会被所述需要的重复生长阶段减弱。此外，为了获得由补料分批设施生产的足够产品量，需要使用大量空间和能量的大型生物反应器。因此，需要一种特别用于生产双特异性抗体的改进的上游制造工艺，其既增加了产品数量又提高了产品质量以在商业规模上提供如下质量的足够产品量，所述质量使得在下游加工中需要丢弃较少的产品。考虑到大规模细胞培养工艺的费用以及对提供给具有严重未满足的医疗需求的患者的生物产品的更大数量和更低成本的不断增长的需求，提供了重组蛋白质生产和回收的渐进式改进的新工艺方法是有价值的。技术实现要素：出人意料的是，本发明可以提供适应连续制造工艺，其确保了改善的双特异性抗体产品数量和产品质量。即使本身已知用于生产蛋白质如抗体的连续制造工艺(例如cattaneo等人，us2017/0204446a1)，此类工艺也不适合于先前在上游制造工艺步骤中具有聚集、剪切和化学降解倾向从而导致较低的产品数量和质量的双特异性抗体的特定需要。因此，在一方面，设想在本发明的上下文中提供用于生产至少包含第一和第二结合结构域的双特异性抗体产品的连续上游制造工艺，其中与该第二结合结构域相比，该第一结合结构域结合不同的靶标，该工艺包括以下步骤：(i)在灌注生物反应器中提供包含至少一种哺乳动物细胞培养物的液体细胞培养基，其中该哺乳动物细胞培养物能够表达该双特异性抗体产品，并且其中这些细胞在该灌注生物反应器中接种时具有至少0.5×10^6个细胞/ml的浓度，(ii)通过应用灌注速率(d)以便以优选连续方式更换该液体细胞培养基、而不从生物反应器中移除细胞来培养该哺乳动物细胞培养物，其中该灌注速率最初对应于至少0.4个容器体积/天(vvd)，然后当达到生物量设定点时连续地、逐渐地或增量式地增加至至少1个生物反应器体积，该生物反应器体积在本文中也理解为容器体积/天(vvd)，其中该生物量设定点等于至少35×10^6个细胞/ml的活细胞密度(vcd)，(iii)当达到该生物量设定点时，通过应用灌注速率(d)以连续地或增量式地更换该液体细胞培养基、优选不从生物反应器中移除细胞来维持灌注培养，其中步骤(iii)中的灌注速率对应于至少1个生物反应器体积，该生物反应器体积在本文中也理解为容器体积/天(vvd)，并且(iv)任选地从该生物反应器排出额外细胞以维持该生物量设定点，其中通过在步骤(ii)至(iv)从该液体细胞培养基连续收获该双特异性抗体产品和/或通过针对vcd调节d，将该生物反应器中的双特异性抗体产品浓度保持为低于3.5g/l。根据所述方面，在步骤(i)中还设想这些细胞在生物反应器中接种时具有至少1×10^6个细胞/ml的浓度，根据所述方面，在步骤(ii)中进一步设想生物量设定点等于至少65×10^6个细胞/ml的vcd。根据所述方面，在步骤(ii)中甚至更多地设想生物量设定点等于至少71×10^6个细胞/ml的vcd。根据所述方面，在步骤(ii)中还设想细胞培养物的培养进行至少4天、优选至少7天、优选至少12天。根据所述方面，在步骤(ii)中进一步设想灌注速率(d)在0.4至7vvd的范围内。根据所述方面，在步骤(ii)中进一步设想灌注速率(d)连续地增加，即非离散地增加。根据所述方面，在步骤(iii)中甚至更多地设想灌注速率(d)在1至7vvd的范围内。根据所述方面，在步骤(iii)中还设想灌注速率(d)在2至6.4vvd的范围内、优选2vvd、最优选2.01vvd。根据所述方面，在步骤(iii)中进一步设想灌注速率(d)是在0.01至0.15nl/细胞-天(每个细胞每天nl)范围内、优选在0.015至0.0315nl/细胞-天的范围内或在0.05至0.1nl/细胞-天的范围内的细胞特异性灌注速率(cspr)。根据所述方面，在步骤(ii)至(iv)中还设想双特异性抗体产品浓度保持低于1.2g/l、优选低于0.5g/l、最优选低于0.12g/l。根据所述方面，还设想在步骤(iii)或(iv)之后收获前双特异性抗体产品在生物反应器中的平均停留时间分别为至多2天、优选至多1天、最优选至多0.5天。根据所述方面，还设想最终ivcd为至少10×10^6个细胞-天/ml、优选至少12、20或50×10^6个细胞-天/ml、更优选至少100、500或甚至1000×10^6个细胞-天/ml。根据所述方面，还设想平均hccf生产力为至少2g/l生物反应器体积，优选至少5、10或15g/l生物反应器体积。根据所述方面，还设想平均hccf日生产力为每天至少10g/l生物反应器体积、优选每天至少50g/l生物反应器体积、更优选每天至少100或甚至至少250g/l生物反应器体积。根据所述方面，进一步设想分离的双特异性抗体产品的单体含量百分比为至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、80％、90％、93％或甚至95％。根据所述方面，进一步设想分离的双特异性抗体产品的高分子量(hmw)种类含量百分比为至多50％、优选至多40％、更优选至多30％、20％、10％、7％或甚至5％。根据所述方面，根据本发明产生的双特异性抗体产品的特征在于，与源自补料分批工艺的相同池相比在第一或第二纯化池中宿主细胞蛋白质含量降低至少60％、优选至少65％、通常至少68％或甚至75％至86％。根据所述方面，根据本发明产生的双特异性抗体产品的特征在于，与源自补料分批工艺的相同池相比在第一或第二纯化池中剪切的蛋白质水平降低至少40％、优选至少44％、通常至少75％或甚至97％。根据所述方面，受剪切影响的根据本发明产生的产品的百分量为至多15％或10％、优选至多7％、更优选至多6％、5％、4％、3％、2％或1％以及最优选至多0.3％。后者优选适用于根据本发明的双特异性抗体，其不是全长抗体，并且优选包含含有seqidno:202的氨基酸序列的第二结构域。根据所述方面，根据本发明产生的双特异性抗体产品的特征在于，与源自补料分批工艺的相同池相比，例如在第一或第二纯化池中化学修饰的氨基酸水平降低至少50％，在产品如脱酰胺化或异构化产品种类中化学修饰的氨基酸水平优选降低至少65％、更优选至少68％或甚至至少80％。根据所述方面，根据本发明产生的双特异性抗体产品的特征在于，与所有产品种类相比脱酰胺化或异构化产品种类的含量百分比为至多2％、优选至多1％、更优选至多0.5％或甚至0.1％。根据所述方面，根据本发明产生的双特异性抗体产品的特征在于，与来自补料分批工艺的相同池相比，在第一或第二纯化池中高分子量种类即具有比纯产品单体更高分子量的构建体降低至少25％，高分子量种类优选降低至少50％或甚至约70％。根据所述方面，根据本发明产生的双特异性抗体产品的特征在于，当与源自补料分批工艺的相同池相比时，通常在第一或第二纯化池中酸性种类水平降低、优选降低至少30％、优选至少35％、通常约38％至49％。根据所述方面，根据本发明产生的双特异性抗体产品的特征在于，与所有产品种类相比，酸性产品种类的含量百分比为至多15％、优选至多12％、更优选至多10％。根据所述方面，还设想双特异性抗体产品是双特异性全长抗体，即通常是包含2个重链和2个轻链的抗体；或者非全长双特异性抗体构建体，包括单链双特异性抗体构建体。根据所述方面，设想了双特异性全长抗体，其中双特异性抗体构建体的第一和/或第二结合结构域结合靶标和/或效应细胞。根据所述方面，设想了双特异性全长抗体，其中双特异性抗体构建体的第一和/或第二结合结构域结合t11a和/或tnf-α。根据所述方面，还设想双特异性抗体构建体包含半衰期延长部分、优选源自igg抗体的基于fc的半衰期延长部分、最优选scfc半衰期延长部分。根据所述方面，进一步设想双特异性抗体构建体是双特异性t细胞衔接物根据所述方面，设想双特异性抗体产品的第一结合结构域结合选自下组的至少一种靶细胞表面抗原，该组由以下组成：cd19、cd33、egfrviii、msln、cdh19、flt3、dll3、cdh3、bcma和psma。根据所述方面，进一步设想双特异性抗体构建体的第二结合结构域结合cd3结合结构域。根据所述方面，还设想第二结合结构域包含含有cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的vh区和含有cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的vl区，该cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3以及cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3选自由以下组成的组：(a)如seqidno:1所示的cdr-h1、如seqidno:2所示的cdr-h2、如seqidno:3所示的cdr-h3、如seqidno:4所示的cdr-l1、如seqidno:5所示的cdr-l2以及如seqidno:6所示的cdr-l3，(b)如seqidno:29所示的cdr-h1、如seqidno:30所示的cdr-h2、如seqidno:31所示的cdr-h3、如seqidno:34所示的cdr-l1、如seqidno:35所示的cdr-l2以及如seqidno:36所示的cdr-l3，(c)如seqidno:42所示的cdr-h1、如seqidno:43所示的cdr-h2、如seqidno:44所示的cdr-h3、如seqidno:45所示的cdr-l1、如seqidno:46所示的cdr-l2以及如seqidno:47所示的cdr-l3，(d)如seqidno:53所示的cdr-h1、如seqidno:54所示的cdr-h2、如seqidno:55所示的cdr-h3、如seqidno:56所示的cdr-l1、如seqidno:57所示的cdr-l2以及如seqidno:58所示的cdr-l3，(e)如seqidno:62所示的cdr-h1、如seqidno:63所示的cdr-h2、如seqidno:64所示的cdr-h3、如seqidno:65所示的cdr-l1、如seqidno:66所示的cdr-l2以及如seqidno:67所示的cdr-l3，(f)如seqidno:83所示的cdr-h1、如seqidno:84所示的cdr-h2、如seqidno:85所示的cdr-h3、如seqidno:86所示的cdr-l1、如seqidno:87所示的cdr-l2以及如seqidno:88所示的cdr-l3，(g)如seqidno:94所示的cdr-h1、如seqidno:95所示的cdr-h2、如seqidno:96所示的cdr-h3、如seqidno:97所示的cdr-l1、如seqidno:98所示的cdr-l2以及如seqidno:99所示的cdr-l3，(h)如seqidno:105所示的cdr-h1、如seqidno:106所示的cdr-h2、如seqidno:107所示的cdr-h3、如seqidno:109所示的cdr-l1、如seqidno:110所示的cdr-l2以及如seqidno:111所示的cdr-l3，(i)如seqidno:115所示的cdr-h1、如seqidno:116所示的cdr-h2、如seqidno:117所示的cdr-h3、如seqidno:118所示的cdr-l1、如seqidno:119所示的cdr-l2以及如seqidno:120所示的cdr-l3，(j)如seqidno:126所示的cdr-h1、如seqidno:127所示的cdr-h2、如seqidno:128所示的cdr-h3、如seqidno:129所示的cdr-l1、如seqidno:130所示的cdr-l2以及如seqidno:131所示的cdr-l3，(k)如seqidno:137所示的cdr-h1、如seqidno:138所示的cdr-h2、如seqidno:139所示的cdr-h3、如seqidno:140所示的cdr-l1、如seqidno:141所示的cdr-l2以及如seqidno:142所示的cdr-l3，(l)如seqidno:152所示的cdr-h1、如seqidno:153所示的cdr-h2、如seqidno:154所示的cdr-h3、如seqidno:155所示的cdr-l1、如seqidno:156所示的cdr-l2以及如seqidno:157所示的cdr-l3，以及(m)如seqidno:167所示的cdr-h1、如seqidno:168所示的cdr-h2、如seqidno:169所示的cdr-h3、如seqidno:170所示的cdr-l1、如seqidno:171所示的cdr-l2以及如seqidno:172所示的cdr-l3。根据所述方面，设想收获的双特异性抗体产品被包含在收获的细胞培养液(hccf)中。根据所述方面，设想hccf从步骤(ii)和(iii)获得或仅从步骤(iii)获得。根据所述方面，设想在室温下例如以1、2、3、4、5、6、12、24、36、48、72、96、120和/或144小时增量或连续地收集hccf，并传递至下游步骤以进行进一步加工，例如捕获该双特异性抗体产品。根据所述方面，设想下游步骤包括捕获色谱、病毒灭活和/或精制步骤。根据所述方面，设想通过以限定的细胞特异性灌注速率进料并从该生物反应器排出额外细胞以维持该生物量设定点，而使该灌注培养连续运行至少7天，优选至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天，最优选至少35天。在本发明的另一个方面，设想提供一种用于执行如图1所示的本发明的连续制造方法的设置或装置，其包含至少具有生物量控制设备、do控制设备和液位控制设备的灌注生物反应器，和具有灌注流速调节设备的入口，以及具有细胞截留设备和hccf流速调节设备的出口。该设置可以包含灌注培养基，其以受控制的灌注流速(灌注速率)泵入生物反应器中。其中控制含氧量(do)、温度、ph、生物量(电容)和液位(水平)。过量细胞可以作为细胞排出而分离。收获的细胞培养液(hccf)通过使流体通过细胞截留设备从生物反应器中分离而获得，该细胞截留设备可以包含0.2μm过滤器。优选地，无细胞hccf可以在被传递至进一步的下游加工之前收集在储存容器中。在本发明的另一个方面，设想了通过本发明的连续上游制造工艺产生的双特异性抗体产品。在本发明的另一个方面，设想了补料分批和灌注的混合方法，但该混合方法在比cm更短的时间内有利地提供了与本文所呈现的质量相当的产品特征。进而，产品数量较低，且与fb大致相当。优选地，生物反应器中较低的产品浓度导致类似于在根据本发明的cm工艺中的更好的产品质量。然而，最小化了细胞培养持续时间。根据本发明的这种混合工艺包括以下工艺步骤：(i)自接种进行补料分批至约第7天，(ii)随后优选使用交变切向流(atf)过滤系统进行短时间的灌注培养(与cm相当)以供收获。优选以与根据本发明的cm工艺类似的方式进行产品的去除，以降低产品浓度和提高产品质量。附图说明图1示出了一种根据本发明的连续制造工艺的设置。该设置包含灌注培养基，其以受控制的灌注流速(灌注速率)泵入生物反应器中。其中控制含氧量(do)、温度、ph、生物量(电容)和液位(水平)。过量细胞可以作为细胞排出而分离。收获的细胞培养液(hccf)通过使流体通过细胞截留设备从生物反应器中分离而获得，该细胞截留设备可以包含0.2μm过滤器。优选地，无细胞hccf可以在被传递至进一步的下游加工之前收集在储存容器中。图2分别示出了随培养时间变化的活细胞密度(vcd)(10^5个细胞/ml)(a)，随培养时间变化的培养细胞系的细胞的活力百分比(b)，以及随关于cd19xcd3bite(r)抗体构建体的补料分批(“+”)和连续制造(空心圆)的培养时间变化的产品浓度(mg/l)(c)。对应地，实线表示cm值的平均值，点划线表示补料分批值的平均值。源自gs-ko宿主的相同cho细胞系用于两种工艺形式。图3分别示出了随培养时间变化的活细胞密度(vcd)(10^5个细胞/ml)(a)，随培养时间变化的培养细胞系的细胞的活力百分比(b)，以及随关于egfrviiixcd3bite(r)抗体构建体的补料分批(“+”)和连续制造(空心圆)的培养时间变化的产品浓度(mg/l)(c)。对应地，实线表示cm值的平均值，点划线表示补料分批值的平均值。源自dhfr缺陷型宿主的相同cho细胞系用于两种工艺形式。图4示出了cm渗透物(空心圆)和fb上清液(“+”)样品中的egfrviiixcd3bite(r)抗体构建体产品单体(％)。对应地，实线表示cm值的平均值，点划线表示补料分批值的平均值。图5分别示出了随培养时间变化的活细胞密度(vcd)(10^5个细胞/ml)(a)，随培养时间变化的培养细胞系的细胞的活力百分比(b)，以及随关于tnf-αxtl1a双特异性抗体的补料分批(“+”)和连续制造(空心圆)的培养时间变化的产品浓度(mg/l)(c)。对应地，实线表示cm值的平均值，点划线表示补料分批值的平均值。源自dhfr缺陷型宿主的相同cho细胞系用于两种工艺形式。图6分别示出了随培养时间变化的活细胞密度(vcd)(10^5个细胞/ml)(a)，随培养时间变化的培养细胞系的细胞的活力百分比(b)，以及随关于cd33xcd3bite(r)抗体构建体的补料分批(空心三角)和连续制造(cm-a:○；cm-b:+,cm-c:◇；cm-d:×)的培养时间变化的产品浓度(mg/l)(c)。连续制造下的vcd设定点分别为12.8*10^5(cm-a)、32.0*10^5(cm-b)、49.2*10^5(cm-c)和64.8*10^5(cm-d)个细胞点，以达到四种不同的产品浓度。每个工艺的平均值分别用实线、虚线或点划线表示。源自gs-ko宿主的相同cho细胞系(克隆a)用于两种工艺形式。图7示出了随cm渗透物和fb上清液样品中产品浓度变化的cd33xcd3bite(r)抗体构建体的产品单体(％)。cm工艺包括四种不同的生物量设定点(cm-a:○；cm-b:+,cm-c:◇；cm-d:×)以达到四种不同的产品浓度。图8示出了通过补料分批(fb)或通过分别采用12.8*10^5(cm-a)、32.0*10^5(cm-b)、49.2*10^5(cm-c)和64.8*10^5(cm-d)个细胞的vcd设定点以达到四种不同的浓度的连续制造(cm-x)产生的cd33xcd3bite(r)抗体构建体(克隆a)的高分子量级分百分比(a)、低分子量级分百分比(b)和主峰级分百分比(c)。源自gs-ko宿主的相同cho细胞系(克隆a)用于两种工艺形式。图9示出了对于五种双特异性抗体产品：cd33xcd3抗体构建体、cd19xcd3hle抗体构建体、egfrviiixcd3抗体构建体、cd19xcd3hle抗体构建体和dll3xcd3抗体构建体，增加的高分子量(hmw，％)与增加的产品浓度之间的相关性。图10示出了cd33xcd3抗体构建体(cho细胞系克隆b)fb和cm工艺的比较。(a)随培养时间变化的活细胞密度；(b)随培养时间变化的活力；(c)随培养时间变化的产品浓度。图11示出了fb和cm工艺中cd33xcd3抗体构建体(克隆b)sec高分子量(hmw)和低分子量(lmw)的比较。图12示出了cd33xcd3抗体构建体(克隆b)混合-3d-1vvd10天和传统fb工艺的比较。(a)随培养时间变化的活细胞密度；(b)随培养时间变化的活力。图13示出了bcmaxcd3-hle抗体构建体fb和cm工艺的比较。(a)随培养时间变化的活细胞密度；(b)随培养时间变化的活力；(c)随培养时间变化的产品浓度。图14示出了dll3xcd3-hlefb和cm工艺的比较。(a)随培养时间变化的活细胞密度；(b)随培养时间变化的活力；(c)随培养时间变化的产品浓度。图15示出了来自历经细胞培养持续时间(天)的三种抗体构建体的cm工艺的渗透物hccf和生物反应器上清液样品(来自细胞培养液)中的产品浓度和sechmw水平的比较。从生物反应器上清液(○空心圆)或从过滤器渗透物hccf(●实心圆)中采集样品。具体实施方式本文提供了制造治疗性蛋白质特别是双特异性抗体的连续工艺。设想本发明使上游工艺适合于制造双特异性抗体的特定需要。与本领域已知的标准补料分批制造解决方案相比，所述上游工艺不仅仅有助于提高生产力和减少对空间的需求。更进一步，本发明的连续制造工艺-优选连续上游制造工艺-特别适用于双特异性抗体，并且被设想导致更高的产品质量，即在更高的单体含量方面相对于补料分批制造而言更少聚集的双特异性抗体。另外，本发明的连续制造工艺有利地提供比技术人员已知的补料分批制造工艺更少的化学修饰、更少的剪切、更少的工艺相关的杂质。作为特定的制造优势，基于相同的细胞类型的随时间的输出在本文中也称为平均hccf日生产力，其与技术人员已知的补料分批工艺相比优选增加至少2倍、优选至少3倍、更优选至少4倍以及甚至更优选至少6倍。发现生物反应器中特定的低产品浓度决定性地有助于避免聚集体，即有助于产品的更高的相对和/或绝对单体浓度。这对于确保产品质量和提高整个工艺的经济效益至关重要。上游产生的聚集体越少，下游需要去除的非质量产品就越少。产品浓度低于3.5g/l与聚集的可能性较小有关。如果在整个上游工艺中最大产品浓度保持为低于1.2g/l，则产品质量甚至会更好。甚至更优选产品浓度低于0.5或甚至0.3g/l。通过确保1vvd或更优选至少2vvd或更高的足够高的灌注速率，可以实现优选无聚集体产品的经济有利的生产率。这适用于所有双特异性抗体产品，不论是全长抗体还是非全长抗体如(单链)双特异性抗体构建体。在本发明的上下文中另一个出人意料的方面是以下事实：对于双特异性抗体产品，灌注速率关于vcd的适应性是优选的，以获得有利的产品质量和数量。在这一方面，接种后灌注速率连续地、逐渐地或增量式地增加，直至达到优选的设定点。通常，当生物量设定点等于至少35×10^6个细胞/ml、优选至少65×10^6个细胞/ml、更优选至少71×10^6个细胞/ml以及最优选至少85×10^6个细胞/ml的平均活细胞密度(vcd)时，达到所述设定点。通常，灌注速率设置为低的值，只要vcd低于同一工艺中达到的最大vcd。例如，当vcd等于约0.5×10^6个细胞时，灌注速率可低至约0.4vvd。然而，随着vcd由于生物反应器中的细胞生长而增加，当达到例如35×10^6个细胞/ml的生物量设定点时，灌注速率可以例如连续地、逐渐地或增量式地从0.4vvd增加至2vvd。优选地，灌注速率增加越多，生物量设定点越高。例如，当生物量设定点为例如至少65×10^6个细胞/ml、更优选至少71×10^6个细胞/ml以及最优选至少85×10^6个细胞/ml时，vvd可设置为至少2、优选至少2.01、3、4、5、6或甚至6.4。还优选地，在本发明的步骤(iii)中达到生物量设定点之后，vcd保持恒定，因此灌注速率同样优选保持恒定。在本发明的上下文中还设想，在整个连续制造工艺中根据连续测量的vcd调节灌注速率。vcd被理解为易于访问且可靠的参数。综合活细胞密度(ivcd)在本文中被理解为随时间变化的vcd的曲线下面积。由此，例如可以优选地维持恒定的细胞特异性灌注速率(cspr，每个细胞每天nl)，这进而可有助于生物反应器中受控制的产品浓度，以避免对产品质量产生负面影响。因此，在整个连续上游制造工艺中确保受控制的且优选低的产品浓度，例如对于全长双特异性抗体优选低于1.2g/l，对于hle双特异性抗体构建体优选低于0.4g/l，并且对于根据本发明的非hle双特异性抗体构建体优选低于0.12g/l，该连续上游制造工艺导致较少的产品受聚集、剪切或其他化学降解的影响。在本发明的上下文中，cspr被理解为灌注速率d(生物反应器体积/天)与平均vcd(cv，即平均活细胞数/毫升)的比率：在本发明的上下文中还应理解，无论细胞密度如何，优选向细胞培养物中的细胞提供均匀的微环境。因此，优选以与细胞密度成正比的速率更换培养基。通过应用基于优选cspr的灌注速率，灌注速率与细胞密度相适应。在本发明的上下文中，cspr可以通过具有在线生物量测量的控制站自动应用。这优选地允许响应于cv变化对d进行微小和/或稳定的调节。可优选这种稳定的即连续的响应，而不是逐步的即增量式的或离散的d的变化。最小cspr是递送满足细胞需要的最小量的营养素并支持高生产力的速率。在高细胞密度下例如在高细胞密度培养物(hcdc)中应用最小cspr或接近最小cspr的cspr具有特别重要的实践意义。在本发明的上下文中，hcdc例如涉及具有至少65×10^6个细胞/ml、优选至少71×10^6个细胞/ml或甚至至少85×10^6个细胞/ml的vcd的细胞培养。还设想hcdc可具有至少100×10^6个细胞/ml的vcd。在本发明的上下文中，典型的最小cspr是0.01nl/细胞-天。在所有双特异性抗体共有的优选边界内，一些双特异性抗体确实具有甚至更优选的值以获得最佳产品质量。例如，在本发明的上下文中，cd19xcd3抗体构建体的cspr优选低于0.04nl/细胞-天、更优选等于或低于0.028nl/细胞-天。对于包含靶向cd3的i2c结构域(seqidno26)的双特异性抗体构建体如cd33xcd3抗体构建体，cspr优选等于或低于0.028nl/细胞-天或至少0.051nl/细胞-天、更优选0.06至0.1nl/细胞-天。对于全长双特异性抗体如tnf-αxtl1a双特异性抗体，cspr优选等于或低于0.028nl/细胞-天或至少0.051nl/细胞-天、更优选0.06-0.1nl/细胞-天。在本发明的上下文中，“细胞培养”或“培养”意指细胞在多细胞生物或组织外的生长和繁殖。对于哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域已知的。参见例如animalcellculture:apracticalapproach[动物细胞培养：一种实用的方法],d.rickwood,编辑,oxforduniversitypress[牛津大学出版社],纽约(1992)。哺乳动物细胞可以在悬浮液中培养或附着至固体基质时培养。术语“哺乳动物细胞”意指来自或源自任何哺乳动物(例如人、仓鼠、小鼠、绿猴、大鼠、猪、牛或兔)的任何细胞。例如，哺乳动物细胞可以是永生化细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞是分化细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞是未分化的细胞。本文描述了哺乳动物细胞的非限制性实例。在本发明的上下文中，优选的哺乳动物细胞类型是gs-ko细胞。哺乳动物细胞的其他实例是本领域已知的。如本文所用，术语“细胞培养基”(也称为“培养基”、“细胞培养基”、“组织培养基”)是指用于培养细胞例如动物或哺乳动物细胞的任何营养液，并且其通常提供以下至少一种或多种组分：能源(通常为碳水化合物形式，如葡萄糖)；全部必需氨基酸且通常是二十种碱性氨基酸以及半胱氨酸中的一种或多种；通常所需的低浓度下的维生素和/或其他有机化合物；脂质或游离脂肪酸；以及微量元素，例如通常所需的在极低浓度下(通常在微摩尔范围内)的无机化合物或天然存在的元素。细胞培养基包括通常用于和/或已知用于任何细胞培养工艺(例如但不限于细胞的分批、延长分批、补料分批和/或灌注或连续培养)的那些培养基。“生长”细胞培养基或加料培养基是指这样一种细胞培养基，其通常用于指数生长期间(“生长阶段”)的细胞培养中，并且足以完全在该阶段期间支持细胞培养。生长细胞培养基还可含有选择剂，其赋予对掺入宿主细胞系中的可选择标志物的抗性或存活。这些选择剂包括但不限于遗传霉素(g4118)、新霉素、潮霉素b、嘌呤霉素、博莱霉素、甲硫氨酸亚砜亚胺、甲氨蝶呤、无谷氨酰胺的细胞培养基、缺乏甘氨酸的细胞培养基、次黄嘌呤和胸苷、或单独的胸苷。“生产”细胞培养基或加料培养基是指这样一种细胞培养基，其通常用于当指数生长即将结束时的转变过程中以及随后的转变过程和/或蛋白质生产结束时的生产阶段中的细胞培养中。这种细胞培养基足以完全维持该阶段中所需的细胞密度、活力和/或产品滴度。“灌注”细胞培养基或加料培养基是指这样一种细胞培养基，其通常用于通过灌注或连续培养方法维持的细胞培养物中，并且在该工艺中足以完全支持细胞培养。灌注细胞培养基制剂可以比基础细胞培养基制剂更丰富或更浓缩，以适应于用于去除废培养基的方法。灌注细胞培养基可在生长和生产阶段期间使用。术语“0.5×体积”意指体积的约50％。术语“0.6×体积”意指体积的约60％。同样地，0.7×、0.8×、0.9×和1.0×分别意指体积的约70％、80％、90％或100％。术语“培养”或“细胞培养”意指在一组受控制的物理条件下哺乳动物细胞的维持或增殖。术语“哺乳动物细胞的培养物”意指含有在一组受控制的物理条件下维持或增殖的多个哺乳动物细胞的液体培养基。术语“液体培养基”意指含有足够营养素以允许细胞(例如哺乳动物细胞)在体外生长或增殖的流体。例如，液体培养基可含有以下各项中的一种或多种：氨基酸(例如，20种氨基酸)、嘌呤(例如，次黄嘌呤)、嘧啶(例如，胸苷)、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸、生物素、钙、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、胸苷、氰钴胺、丙酮酸、硫辛酸、镁、葡萄糖、钠、钾、铁、铜、锌和碳酸氢钠。在一些实施例中，液体培养基可含有来自哺乳动物的血清。在一些实施例中，液体培养基不含有来自哺乳动物的血清或其他提取物(确定的液体培养基)。在一些实施例中，液体培养基可含有微量金属、哺乳动物生长激素和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的另一个实例是基本培养基(例如，仅含有无机盐、碳源和水的培养基)。本文描述了液体培养基的非限制性实例。液体培养基的其他实例是本领域已知的并且是可商购的。液体培养基可含有任何密度的哺乳动物细胞。例如，如本文所用，从生物反应器中移取的一定体积的液体培养基可以基本上不含哺乳动物细胞。在本发明的上下文中，“生物反应器”是指适于进行灌注细胞培养的容器，其中至少进行本发明的步骤(i)至(iii)。生物反应器可以是一次性容器，例如，由塑料材料或可重复使用的容器制成，例如由不锈钢制成。术语“搅动”意指在生物反应器中搅拌或以其他方式移动一部分液体培养基。进行搅动的目的是例如增加生物反应器中液体培养基中溶解的o2浓度。搅动可以使用任何本领域已知的方法例如工具或螺旋桨来进行。可用于在生物反应器中进行一部分液体培养基的搅动的示例性设备和方法是本领域已知的。术语“连续工艺”意指通过系统的至少一部分连续供给流体的工艺。例如，在本文所述的任何示例性连续生物制造系统中，在系统运行时含有重组治疗性蛋白质的液体培养基连续进料至该系统中，并且治疗性蛋白质药品从该系统中运出。术语“补料分批生物反应器”是本领域的术语，意指在第一液体培养基中含有多种细胞(例如哺乳动物细胞)的生物反应器，其中生物反应器中存在的细胞的培养包括向第一液体培养基中定期或连续添加第二液体培养基，而不从细胞培养物中大量或显著去除第一液体培养基或第二液体培养基。第二液体培养基可以与第一液体培养基相同。在补料分批培养的一些实例中，第二液体培养基是第一液体培养基的浓缩形式。在补料分批培养的一些实例中，第二液体培养基作为干粉加入。术语“剪切”意指通常通过蛋白质水解部分切割表达的蛋白质。术语“降解”通常是指将较大的实体如肽或蛋白质分解成至少两个较小的实体，其中一个实体可以显著大于另一个实体。术语“脱酰胺化”意指其中氨基酸侧链中的酰胺官能团(通常为天冬酰胺或谷氨酰胺)被去除或转化为另一官能团的任何化学反应。通常，天冬酰胺被转化为天冬氨酸或异天冬氨酸。术语“聚集”通常是指分子之间的直接相互吸引，例如通经由范德华力或化学键合。特别地，聚集被理解为蛋白质积聚和凝聚在一起。聚集体可包括无定形聚集体、寡聚体和淀粉样蛋白原纤维，并且通常被称为高分子量(hmw)种类，即具有比作为非聚集分子的纯产品分子更高分子量的分子，其在本文中通常也称为低分子量(lmw)种类或单体。本文通常将酸性种类理解为包含在通过基于带电的分离技术(如等电聚焦(ief)凝胶电泳、毛细管等电聚焦(cief)凝胶电泳、阳离子交换色谱法(cex)和阴离子交换色谱法(aex))分析抗体时通常所观察到的变体中。与主要种类相比，这些变体被称为酸性或碱性种类。当使用基于ief的方法分析抗体时，酸性种类通常是具有较低表观pi的变体，而碱性种类是具有较高表观pi的变体。术语“停留时间”通常是指特定产品分子存在于生物反应器中的时间，即从其生物技术生成到其从生物反应器内腔分离的时间。通常通过剪切、降解、脱酰胺化和/或聚集的存在或不存在来评估“产品质量”。例如，包含低于40％、优选低于35％或甚至30％、25％或20％的hmw种类的含量百分比的产品(分子)可被认为是产品质量优选的。另外，优选的产品质量伴随着基本不存在残留宿主细胞蛋白(hcp)和基本不存在剪切、降解和脱酰胺化，或伴随着与通过不同于本发明工艺的工艺(如补料分批工艺)制造的产品相比hcp浓度、剪切、降解和/或脱酰胺化的显著降低。本领域已知的用于评估本发明上下文中的产品质量的方法包括用于电荷变体分析的阳离子交换-高效液相色谱法(cex-hplc)、用于化学修饰的胰蛋白酶消化肽图谱、宿主细胞蛋白(hcp)elisa还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rce-sds)和尺寸排阻-高效液相色谱法(se-hplc)。术语“抗体产品”是指“分泌性蛋白”或“分泌性重组蛋白”，并且意指当在哺乳动物细胞内翻译并且通过至少部分地酶促切割哺乳动物细胞中的分泌信号序列而至少部分地分泌至细胞外空间(例如，液体培养基)中时最初含有至少一个分泌信号序列的蛋白质(例如，重组蛋白质)。技术人员将理解“分泌性”蛋白不需要完全从细胞中解离才被认为是分泌性蛋白。术语双特异性抗体产品包括双特异性抗体如全长抗体，例如基于igg的抗体及其片段，该基于igg的抗体及其片段通常在本文中称为双特异性抗体构建体。术语“抗体构建体”是指一种分子，其中结构和/或功能基于抗体例如全长或整个免疫球蛋白分子(通常由两个未被截短的重链和两个轻链组成)的结构和/或功能，和/或从抗体或其片段的可变重链(vh)和/或可变轻链(vl)结构域中提取。因此，抗体构建体能够与其特异性靶标或抗原结合。此外，根据本发明结合其结合配偶体的结构域在本文中理解为根据本发明的抗体构建体的结合结构域。通常，根据本发明的结合结构域包含允许靶标结合的抗体的最低结构要求。该最低要求可以是例如通过至少三个轻链cdr(即vl区的cdr1、cdr2和cdr3)和/或三个重链cdr(即vh区的cdr1、cdr2和cdr3)、优选全部六个cdr的存在来确定的。用于确定抗体的最低结构要求的替代性方法是特异性靶标的结构内抗体表位(分别是构成表位区域(表位簇)的靶蛋白的蛋白质结构域)的确定，或参考特异性抗体与确定的抗体表位的竞争。根据本发明的构建体所基于的抗体包括例如单克隆、重组、嵌合、去免疫、人源化和人抗体。根据本发明的抗体构建体的结合结构域可以例如包括以上提到的cdr组。优选地，那些cdr包含在抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)的框架中；但是，二者不必均包含。例如，fd片段具有两个vh区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体片段、抗体变体或结合结构域的形式的附加实例包括(1)fab片段，一种具有vl、vh、cl和ch1结构域的单价片段；(2)f(ab')2片段，一种具有在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(3)具有两个vh和ch1结构域的fd片段；(4)具有抗体单臂的vl和vh结构域的fv片段，(5)dab片段(ward等人,(1989)nature[自然]341:544-546)，其具有vh结构域；(6)分离的互补决定区(cdr)，以及(7)单链fv(scfv)，后者是优选的(例如，源自scfv文库)。根据本发明的抗体构建体的实施例的实例例如描述在以下参考文献中：wo00/006605、wo2005/040220、wo2008/119567、wo2010/037838、wo2013/026837、wo2013/026833、us2014/0308285、us2014/0302037、wo2014/144722、wo2014/151910和wo2015/048272。另外，在“结合结构域”或“结合……的结构域”的定义内的是全长抗体的片段，如vh、vhh、vl、(s)dab、fv、fd、fab、fab’、f(ab')2或“rigg”(“半抗体”)。根据本发明的抗体构建体还可以包括修饰的抗体片段(也称为抗体变体，如scfv、二scfv或双(s)-scfv、scfv-fc、scfv-拉链、scfab、fab2、fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(tandab)、串联二scfv、串联三scfv)、“多抗体”如三抗体或四抗体以及仅包含一个可变结构域(它可能是vhh、vh或vl)的单结构域抗体(如纳米抗体或单可变结构域抗体，其可能独立于其他v区或结构域特异性地结合抗原或表位)。如本文所用，术语“单链fv”、“单链抗体”或“scfv”是指单个多肽链抗体片段，其包含来自重链和轻链的可变区但缺乏恒定区。通常，单链抗体进一步包含在vh与vl结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得该单链抗体能够形成允许抗原结合的所需结构。pluckthun在thepharmacologyofmonoclonalantibodies[单克隆抗体的药理学],第113卷,rosenburg和moore编辑springer-verlag[施普林格出版社],纽约,第269-315页(1994)中详细讨论了单链抗体。生成单链抗体的多种方法是已知的，包括以下参考文献中描述的那些方法：美国专利号4,694,778和5,260,203；国际专利申请公开号wo88/01649；bird(1988)science[科学]242:423-442；huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；ward等人(1989)nature[自然]334:54454；skerra等人(1988)science[科学]242:1038-1041。在特定的实施例中，单链抗体也可以是双特异性的、多特异性的、人的和/或人源化的和/或合成的。此外，术语“抗体构建体”的定义包括单价、二价和多价(polyvalent/multivalent)构建体，因此，双特异性构建体仅特异性地结合两种抗原结构，并且多特异性(polyspecific/multispecific)构建体通过不同的结合结构域特异性地结合多于两种抗原结构，例如三种、四种或更多种抗原结构。此外，术语“抗体构建体”的定义包括仅由一个多肽链组成的分子以及由多于一个多肽链组成的分子，这些链可以是相同的(同源二聚体、同源三聚体或同源寡聚体)或不同的(异源二聚体、异源三聚体或异源寡聚体)。上述鉴定的抗体及其变体或衍生物的实例尤其描述在以下参考文献中：harlow和lane,antibodiesalaboratorymanual[抗体：实验室手册],cshlpress[冷泉港实验室出版社](1988)和usingantibodies:alaboratorymanual[使用抗体：实验室手册],cshlpress[冷泉港实验室出版社](1999)，kontermann和dübel,antibodyengineering[抗体工程],springer[施普林格],第2版2010以及little,recombinantantibodiesforimmunotherapy[重组抗体用于免疫疗法],cambridgeuniversitypress[剑桥大学出版社]2009。如本文所用的术语“双特异性”是指“至少双特异性”的抗体构建体，即，其包含至少第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合一种抗原或靶标(例如，靶细胞表面抗原)且第二结合结构域结合另一抗原或靶标(例如cd3)。因此，根据本发明的抗体构建体包含对于至少两种不同抗原或靶标的特异性。例如，第一结构域优选不结合如本文所述的一种或多种物种的cd3ε的细胞外表位。术语“靶细胞表面抗原”是指由细胞表达的抗原结构，其存在于细胞表面，使得其可接近本文所述的抗体构建体。它可以是蛋白质(优选蛋白质的细胞外部分)或碳水化合物结构(优选蛋白质如糖蛋白的碳水化合物结构)。它优选为肿瘤抗原。本发明的术语“双特异性抗体构建体”还包括多特异性抗体构建体如三特异性抗体构建体(后者包括三个结合结构域)或具有多于三种(例如四种、五种……)特异性的构建体。鉴于根据本发明的抗体构建体是(至少)双特异性的，它们不是天然存在的，并且它们明显不同于天然存在的产品。因此，“双特异性”抗体构建体或免疫球蛋白是含有具有不同特异性的至少两个不同结合面的人工杂交抗体或免疫球蛋白。双特异性抗体构建体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或fab'片段的连接。参见例如，songsivilai和lachmann,clin.exp.immunol.[中国实验临床免疫学杂志]79:315-321(1990)。本发明的抗体构建体的至少两个结合结构域和可变结构域(vh/vl)可以包括或可以不包括肽接头(间隔肽)。根据本发明，术语“肽接头”包括氨基酸序列，本发明抗体构建体的一个(可变和/或结合)结构域和另一个(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列通过该氨基酸序列彼此连接。肽接头也可用于将第三结构域融合至本发明抗体构建体的其他结构域。这种肽接头的必要技术特征是它不包含任何聚合活性。合适的肽接头是美国专利4,751,180和4,935,233或wo88/09344中描述的那些肽接头。肽接头也可用于将其他结构域或模块或区域(如半衰期延长结构域)附接至本发明的抗体构建体。本发明的抗体构建体优选为“体外生成的抗体构建体”。该术语是指根据上述定义的抗体构建体，其中在非免疫细胞选择中生成全部或部分可变区(例如，至少一个cdr)，例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或可以测试候选序列结合抗原的能力的任何其他方法。因此，该术语优选排除仅通过动物的免疫细胞中的基因组重排生成的序列。“重组抗体”是通过使用重组dna技术或基因工程制备的抗体。如本文使用的，术语“单克隆抗体”(mab)或单克隆抗体构建体是指从基本上均质抗体群体中获得的抗体，即构成群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)。与通常包括针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相反，单克隆抗体是高度特异性的，其针对抗原上的单个抗原侧或决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们通过杂交瘤培养合成，因此不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示获得自基本上均质的抗体群体的抗体的特征，并且不应理解为要求通过任何具体方法产生抗体。为了制备单克隆抗体，可以使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。例如，待使用的单克隆抗体可通过koehler等人,nature[自然],256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法或可以通过重组dna方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备。用于产生人单克隆抗体的其他技术的实例包括三瘤技术、人b细胞杂交瘤技术(kozbor,immunologytoday[今日免疫学]4(1983),72)和ebv-杂交瘤技术(cole等人,monoclonalantibodiesandcancertherapy[单克隆抗体和癌症疗法],alanr.liss,inc.(1985),77-96)。然后可以使用标准方法如酶联免疫吸附测定(elisa)和表面等离子体共振(biacoretm)分析来筛选杂交瘤，以鉴定产生与特定抗原特异性地结合的抗体的一种或多种杂交瘤。任何形式的相关抗原可用作免疫原，例如重组抗原、天然存在的形式、其任何变体或片段及其抗原肽。biacore系统中使用的表面等离子体共振可用于提高结合靶标细胞表面抗原表位的噬菌体抗体的效率(schier,humanantibodieshybridomas[人类抗体杂交瘤]7(1996),97-105；malmborg,j.immunol.methods[免疫学方法杂志]183(1995),7-13)。制备单克隆抗体的另一种示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体展示或核糖体展示文库。噬菌体展示描述在例如ladner等人,美国专利号5,223,409；smith(1985)science[科学]228:1315-1317、clackson等人,nature[自然],352:624-628(1991)以及marks等人,j.mol.biol.[分子生物学杂志],222:581-597(1991)中。除了使用展示文库外，相关抗原可用于免疫非人动物，例如啮齿动物(如小鼠、仓鼠、兔或大鼠)。在一个实施例中，非人动物至少包括人免疫球蛋白基因的一部分。例如，可以采用人ig(免疫球蛋白)基因座的大片段来工程化在小鼠抗体产生方面有缺陷的小鼠品系。通过使用杂交瘤技术，可以产生和选择源自具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见例如，xenomousetm、green等人(1994)naturegenetics[自然遗传学]7:13-21、us2003-0070185、wo96/34096以及wo96/33735。单克隆抗体也可以从非人动物获得，然后使用本领域已知的重组dna技术进行修饰，例如人源化、去免疫、呈现嵌合等。修饰的抗体构建体的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟的”抗体(参见例如hawkins等人j.mol.biol.[分子生物学杂志]254,889-896(1992)和lowman等人,biochemistry[生物化学]30,10832-10837(1991))和具有一种或多种改变的效应子功能的抗体突变体(参见例如，美国专利5,648,260、在上述引文中的kontermann和dübel(2010)以及在上述引文中的little(2009))。在免疫学中，亲和力成熟是b细胞在免疫应答过程中产生具有对抗原增加的亲和力的抗体的工艺。通过反复暴露于相同抗原，宿主将产生相继更大亲和力的抗体。与天然原型一样，体外亲和力成熟基于突变和选择的原理。体外亲和力成熟已成功用于优化抗体、抗体构建体和抗体片段。使用辐射、化学诱变剂或易错pcr引入cdr内的随机突变。此外，通过链改组可以增加遗传多样性。使用噬菌体展示等展示方法进行两轮或三轮突变和选择通常会产生具有低纳摩尔范围亲和力的抗体片段。抗体构建体的优选类型的氨基酸取代变异包括取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的一种或多种所得变体相对于生成它们的亲本抗体将具有改善的生物学特性。用于生成此类取代变体的便利方式包括使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，使几个高变区侧(例如6-7侧)突变以在每一侧生成所有可能的氨基酸取代。由此生成的抗体变体从丝状噬菌体颗粒以单价方式展示为与每个颗粒内包装的m13的基因iii产物的融合物。然后针对如本文所披露的噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)对其进行筛选。为了鉴定用于修饰的候选高变区侧，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定显著有助于抗原结合的高变区残基。可替代地/另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定结合结构域与例如人靶细胞表面抗原之间的接触点可能是有益的。根据本文详述的技术，此类接触残基和相邻残基是取代的候选物。一旦生成这样的变体，对变体组进行如本文所述的筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体以用于进一步开发。本发明的单克隆抗体和抗体构建体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，而一个或多个链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，以及这些抗体的片段，只要它们展现出所希望的生物活性即可(美国专利号4,816,567；morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊],81:6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“优先化”抗体，其包含源自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。已经描述了多种制备嵌合抗体的方法。参见例如，morrison等人,proc.natl.acad.sciu.s.a.[美国国家科学院院刊]81:6851,1985；takeda等人,nature[自然]314:452,1985、cabilly等人,美国专利号4,816,567；boss等人,美国专利号4,816,397；tanaguchi等人,ep0171496；ep0173494；和gb2177096。抗体、抗体构建体、抗体片段或抗体变体也可以通过例如wo98/52976或wo00/34317中披露的方法通过人t细胞表位的特定缺失(称为“去免疫”的方法)进行修饰。简而言之，可以分析抗体的重链和轻链可变结构域中与mhcii类结合的肽；这些肽表示潜在的t细胞表位(如wo98/52976和wo00/34317中所定义)。为了检测潜在的t细胞表位，可以应用称为“肽穿线”的计算机建模方法，此外，可以在人mhcil类结合肽的数据库中搜索vh和vl序列中存在的基序，如wo98/52976和wo00/34317中所述。这些基序与18种主要的mhcil类dr同种异型中的任何一种结合，因此构成潜在的t细胞表位。检测到的潜在t细胞表位可以通过取代可变结构域中的少量氨基酸残基来消除，或者优选地通过单个氨基酸取代来消除。通常，进行保守取代。通常但非唯一地，可以使用人种系抗体序列中的位置所共有的氨基酸。人种系序列披露在例如tomlinson,等人(1992)j.moi.biol.[分子生物学杂志]227:776-798；cook,g.p.等人(1995)immunol.today[今日免疫学]第16卷(5):237-242；和tomlinson等人(1995)emboj.[欧洲分子生物学杂志]14:14:4628-4638中。vbase目录提供了人类免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由英国剑桥tomlinson,la.等人mrccentreforproteinengineering[mrc蛋白质工程中心]编辑)。这些序列可用作例如框架区和cdr的人序列的来源。也可以使用共有的人框架区，例如如美国专利号6,300,064中所述。“人源化”抗体、抗体构建体、其变体或片段(如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)是大多数人序列的抗体或免疫球蛋白，其含有一个或多个源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(也称cdr)的残基被来自非人(例如啮齿动物)物种(如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)的具有所需特异性、亲和力和容量的高变区(供体抗体)的残基替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应的非人类残基替代。此外，如本文所用的“人源化抗体”还可以包括受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。人源化抗体还可以包含典型地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分。对于进一步的细节，参见jones等人,nature[自然],321:522-525(1986)；reichmann等人,nature[自然],332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.[结构生物学评论],2:593-596(1992)。可以通过用来自人fv可变结构域的等价序列替代不直接参与抗原结合的fv可变结构域的序列来生成人源化抗体或其片段。用于生成人源化抗体或其片段的示例性方法由以下参考文献提供：morrison(1985)science[科学]229:1202-1207；oi等人(1986)biotechniques[生物技术]4:214；和us5,585,089；us5,693,761；us5,693,762；us5,859,205；以及us6,407,213。那些方法包括分离、操作和表达编码来自重链或轻链中的至少一种的全部或部分免疫球蛋白fv可变结构域的核酸序列。这种核酸可以如上所述通过产生针对预定靶标的抗体从杂交瘤获得以及从其他来源获得。然后可以将编码人源化抗体分子的重组dna克隆至合适的表达载体中。人源化抗体也可以使用转基因动物如表达人重链和轻链基因但不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的小鼠产生。winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例性cdr移植方法(美国专利号5,225,539)。特定人抗体的全部cdr可以用至少一部分非人cdr替代，或者仅一些cdr可以用非人cdr替代。仅需要替代人源化抗体与预定抗原结合所需的cdr数量。可以通过引入保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变来优化人源化抗体。这种改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的几种技术(例如，teng等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊],80:7308-7312,1983；kozbor等人,immunologytoday[今日免疫学],4:7279,1983；olsson等人,meth.enzymol.[酶学方法],92:3-16,1982以及ep239400)中的任何一种来制备。术语“人抗体”、“人抗体构建体”和“人结合结构域”包括抗体、抗体构建体和具有抗体区域(如可变区和恒定区)的结合结构域或基本上对应于本领域已知的人种系免疫球蛋白序列的结构域，该人种系免疫球蛋白序列包括例如kabat等人(1991)(在上述引文中)描述的那些。本发明的人抗体、抗体构建体或结合结构域可包括例如在cdr3中，特别是在cdr3中不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或侧特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体、抗体构建体或结合结构域可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个被氨基酸残基替代的位置，该氨基酸残基不由人种系免疫球蛋白序列编码。然而，如本文所用的人抗体、抗体构建体和结合结构域的定义也涵盖“完全人抗体”，其仅包括非人工和/或遗传改变的人抗体序列，因为那些人抗体序列可通过使用技术或系统如xenomouse得到。优选地，“完全人抗体”不包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基。在一些实施例中，本发明的抗体构建体是“分离的”或“基本上纯的”抗体构建体。当用于描述本文披露的抗体构建体时，“分离的”或“基本上纯的”意指已经从其生产环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体构建体。优选地，抗体构建体不含来自其生产环境的所有其他组分或基本上不与来自其生产环境的所有其他组分相关。其生产环境的污染组分(如由重组转染细胞产生的污染组分)是通常会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且该物质可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。按重量计，抗体构建体可以例如占给定样品中总蛋白质的至少约5％或至少约50％。应当理解，按重量计，分离的蛋白质可根据情况占总蛋白质含量的5％至99.9％。可以通过使用诱导型启动子或高表达启动子以制备显著更高浓度的多肽，使得制备增加的浓度水平的多肽。该定义包括在本领域已知的多种生物和/或宿主细胞中产生抗体构建体。在优选的实施例中，将抗体构建体(1)纯化至足以通过使用旋转杯测序仪获得至少15个n-末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(2)通过sds-page在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色来纯化至均匀。然而，通常，分离的抗体构建体通过至少一个纯化步骤来制备。与本发明有关的术语“结合结构域”表征了一种结构域，该结构域(特异性地)结合/相互作用/识别靶分子(抗原)上给定的靶表位或给定的靶侧，分别例如cd33和cd3。第一结合结构域的结构和功能(识别例如cd33)且优选第二结合结构域的结构和/或功能(识别例如cd3)是基于抗体例如全长或整个免疫球蛋白分子的结构和/或功能，和/或从抗体或其片段的可变重链(vh)和/或可变轻链(vl)结构域中提取。优选地，第一结合结构域的特征在于三个轻链cdr(即vl区的cdr1、cdr2和cdr3)和/或三个重链cdr(即vh区的cdr1、cdr2和cdr3)的存在。第二结合结构域还优选包含允许靶标结合的抗体的最低结构要求。更优选地，第二结合结构域包含至少三个轻链cdr(即vl区的cdr1、cdr2和cdr3)和/或三个重链cdr(即vh区的cdr1、cdr2和cdr3)。设想第一和/或第二结合结构域由噬菌体展示或文库筛选方法产生或可通过噬菌体展示或文库筛选方法获得，而不是通过将cdr序列从预先存在的(单克隆)抗体移植到支架中产生或获得。根据本发明，结合结构域是一种或多种多肽的形式。此类多肽可包括蛋白质部分和非蛋白质部分(例如化学接头或化学交联剂，如戊二醛)。蛋白质(包括其片段、优选生物活性片段，以及通常具有少于30个氨基酸的肽)包含经由共价肽键彼此偶联的两个或更多个氨基酸(产生氨基酸链)。如本文所用的术语“多肽”描述了一组分子，其通常由多于30个氨基酸组成。多肽可以进一步形成多聚体，如二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由多于一种多肽分子组成。形成这种二聚体、三聚体等的多肽分子可以相同或不同。因此，这种多聚体的相应高序结构称为同源或异源二聚体、同源或异源三聚体等。异源多聚体的实例是抗体分子，其天然存在的形式由两条相同的多肽轻链和两条相同的多肽重链组成。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”也指天然修饰的肽/多肽/蛋白质，其中修饰例如通过诸如糖基化、乙酰化、磷酸化等翻译后修饰来实现。当在本文中提及时，“肽”、“多肽”或“蛋白质”也可以是化学修饰的，如聚乙二醇化的。此类修饰在本领域中是熟知的并且在下文中描述。优选地，结合靶细胞表面抗原的结合结构域和/或结合cd3ε的结合结构域是人结合结构域。包含至少一种人结合结构域的抗体和抗体构建体避免了与具有非人如啮齿动物(例如鼠、大鼠、仓鼠或兔)可变区和/或恒定区的抗体或抗体构建体相关的一些问题。这种啮齿动物来源的蛋白质的存在可以导致抗体或抗体构建体的快速清除，或者可以导致患者生成针对抗体或抗体构建体的免疫应答。为了避免使用啮齿动物来源的抗体或抗体构建体，可以通过将人抗体功能引入啮齿动物中来生成人或完全人抗体/抗体构建体，使得啮齿动物产生完全人抗体。在yac中克隆和重建兆碱基大小的人类基因座并将它们引入小鼠种系的能力提供了一种强有力的方法，用于阐明非常大或粗略作图的基因座的功能组分以及生成有用的人类疾病模型。此外，使用这种技术将小鼠基因座取代为其人类等同物可以提供关于对人类基因产物在发育期间的表达和调节、它们与其他系统的交流以及它们参与疾病诱导和进展的独特见解。这种策略的一个重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(ig)基因座引入其中内源ig基因已经失活的小鼠中提供了研究抗体的程序化表达和组装的机制以及它们在b细胞发育中的作用的机会。此外，这种策略可以提供产生完全人单克隆抗体(mab)的理想来源-这是关于实现抗体治疗人类疾病的重要里程碑。预期完全人抗体或抗体构建体使小鼠或小鼠衍生的mab固有的免疫原性和过敏反应最小化，从而提高给予的抗体/抗体构建体的功效和安全性。可以预期使用完全人抗体或抗体构建体在治疗需要重复化合物给予的慢性和复发性人类疾病如炎症、自身免疫和癌症方面提供了显著优势。实现该目标的一种方法是用人ig基因座的大片段工程化在小鼠抗体产生方面有缺陷的小鼠品系，预期这样的小鼠在没有小鼠抗体的情况下会产生大量的人抗体。大的人ig片段将保留大的可变基因多样性以及对抗体产生和表达的适当调节。通过利用小鼠的抗体多样化和选择机制以及缺乏对人蛋白质的免疫耐受性，这些小鼠品系中的再生人抗体库应产生针对任何感兴趣的抗原(包括人抗原)的高亲和力抗体。通过使用杂交瘤技术，可以容易地产生和选择具有所需特异性的抗原特异性人mab。这种一般策略与第一代xenomouse小鼠品系有关(参见green等人naturegenetics[自然遗传学]7:13-21(1994))。xenomouse品系采用分别含有人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段的酵母人工染色体(yac)进行工程化，所述种系构型片段含有核心可变区和恒定区序列。证明含有人ig的yac与小鼠系统关于抗体的重排和表达是相容的，并且能够取代失活的小鼠ig基因。这通过它们诱导b细胞发育、产生成人样的人类完全人抗体库以及生成抗原特异性人mab的能力来证明。这些结果还表明，引入含有更多v基因、附加调节元件和人ig恒定区的更大部分的人ig基因座可能基本上概括具有感染和免疫的人体液反应特征的完整库。green等人的工作最近扩展到通过分别引入人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的种系构型yac片段来引入大于约80％的人抗体库。参见mendez等人naturegenetics[自然遗传学]15:146-156(1997)和美国专利申请序列号08/759,620。xenomouse小鼠的产生在以下参考文献中进一步讨论和描述：美国专利申请序列号07/466,008、序列号07/610,515、序列号07/919,297、序列号07/922,649、序列号08/031,801、序列号08/112,848、序列号08/234,145、序列号08/376,279、序列号08/430,938、序列号08/464,584、序列号08/464,582、序列号08/463,191、序列号08/462,837、序列号08/486,853、序列号08/486,857、序列号08/486,859、序列号08/462,513、序列号08/724,752和序列号08/759,620；和美国专利号6,162,963；6,150,584；6,114,598；6,075,181和5,939,598以及日本专利号3068180b2、3068506b2和3068507b2。还参见mendez等人naturegenetics[自然遗传学]15:146-156(1997)以及green和jakobovitsj.exp.med.[实验医学学报]188:483-495(1998)、ep0463151b1、wo94/02602、wo96/34096、wo98/24893、wo00/76310和wo03/47336。在替代性方法中，包括genpharm国际公司在内的其他公司已经采用了“迷你基因座”方法。在迷你基因座方法中，通过包含来自ig基因座的碎片(单独基因)来模拟外源ig基因座。因此，一个或多个vh基因、一个或多个dh基因、一个或多个jh基因、mu恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成用于插入动物中的构建体。该方法描述在以下参考文献中：surani等人的美国专利号5,545,807；以及lonberg和kay的美国专利号5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458；krimpenfort和berns的美国专利号5,591,669和6,023.010；berns等人的美国专利号5,612,205、5,721,367和5,789,215；以及choi和dunn的美国专利号5,643,763；以及genpharm国际美国专利申请序列号07/574,748、序列号07/575,962、序列号07/810,279、序列号07/853,408、序列号07/904,068、序列号07/990,860、序列号08/053,131、序列号08/096,762、序列号08/155,301、序列号08/161,739、序列号08/165,699、序列号08/209,741。还参见ep0546073b1、wo92/03918、wo92/22645、wo92/22647、wo92/22670、wo93/12227、wo94/00569、wo94/25585、wo96/14436、wo97/13852和wo98/24884以及美国专利号5,981,175。进一步参见taylor等人(1992)、chen等人(1993)、tuaillon等人(1993)、choi等人(1993)、lonberg等人(1994)、taylor等人(1994)以及tuaillon等人(1995)、fishwild等人(1996)。kirin还证明了从小鼠中生成人抗体，在该小鼠中通过微细胞融合已经引入了大的染色体碎片或整个染色体。参见欧洲专利申请号773288和843961。xenerex生物科学正在开发一种可能生成人类抗体的技术。在该技术中，scid小鼠用人淋巴细胞例如b和/或t细胞重组。然后用抗原免疫小鼠并可以生成针对抗原的免疫应答。参见美国专利号5,476,996；5,698,767；和5,958,765。人抗小鼠抗体(hama)反应已引导该行业制备嵌合抗体或其他人源化抗体。然而，预期将观察到特别是在抗体的长期或多剂量利用中某些人抗嵌合抗体(haca)反应。因此，期望提供抗体构建体，其包含针对靶细胞表面抗原的人结合结构域和针对cd3ε的人结合结构域，以解决hama或haca反应的问题和/或影响。术语“(特异性地)结合”、“(特异性地)识别”、“(特异性地)针对”和“(特异性地)反应”根据本发明意指结合结构域与靶分子(抗原)上的给定表位或给定靶侧相互作用或特异性地相互作用，所述靶分子在此处分别是靶细胞表面抗原和cd3ε。术语“表位”是指抗原上的一侧，该抗原是结合结构域如抗体或免疫球蛋白或者抗体或免疫球蛋白的衍生物、片段或变体所特异性地结合的。“表位”是抗原性的，因此术语表位有时在本文中也称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此，结合结构域是“抗原相互作用侧”。所述结合/相互作用也被理解为定义为“特异性识别”。“表位”可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。“线性表位”是一种表位，其中氨基酸一级序列包含识别的表位。线性表位通常包括独特序列中的至少3个或至少4个、以及更通常至少5个或至少6个或至少7个例如约8个至约10个氨基酸。与线性表位相反，“构象表位”是一种表位，其中包含该表位的氨基酸的一级序列不是识别的表位的唯一限定组分(例如，一种表位，其中氨基酸的一级序列不一定由结合结构域识别)。通常，构象表位相对于线性表位包含增加数量的氨基酸。关于构象表位的识别，结合结构域识别抗原的三维结构，优选肽或蛋白质或其片段(在本发明的上下文中，一种结合结构域的抗原结构包含在靶细胞表面抗原蛋白内)。例如，当蛋白质分子折叠形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架被并置，使得抗体能够识别表位。确定表位构象的方法包括但不限于x射线晶体学、二维核磁共振(2d-nmr)光谱和定点自旋标记和电子顺磁共振(epr)光谱。用于表位作图的方法描述如下：当人靶细胞表面抗原蛋白中的区域(连续氨基酸序列段)被更换/替代为其非人和非灵长类动物靶细胞表面抗原(例如，小鼠靶细胞表面抗原，但也可以想象诸如鸡、大鼠、仓鼠、兔等其他动物靶细胞表面抗原)的相应区域时，预期会发生结合结构域的结合减少，除非结合结构域对于所使用的非人、非灵长类动物靶细胞表面抗原是交叉反应的。与结合人靶细胞表面抗原蛋白中的相应区域相比，所述的减少优选为至少10％、20％、30％、40％或50％；更优选至少60％、70％或80％、最优选90％、95％或甚至100％，由此与人靶细胞表面抗原蛋白中的相应区域的结合被设定为100％。设想前述人靶细胞表面抗原/非人靶细胞表面抗原嵌合体在cho细胞中表达。还设想人靶细胞表面抗原/非人靶细胞表面抗原嵌合体与不同膜结合蛋白如epcam的跨膜结构域和/或细胞质结构域融合。在表位作图的替代或另外的方法中，可以生成几种截短形式的人靶细胞表面抗原细胞外结构域，以确定由结合结构域识别的特异性区域。在这些截短形式中，从n-末端开始逐步缺失不同的细胞外靶细胞表面抗原结构域/子结构域或区域。设想截短的靶细胞表面抗原形式可以在cho细胞中表达。还设想截短的靶细胞表面抗原形式可以与不同膜结合蛋白如epcam的跨膜结构域和/或细胞质结构域融合。还设想截短的靶细胞表面抗原形式可以在其n-末端包含信号肽结构域，例如源自小鼠igg重链信号肽的信号肽。进一步设想截短的靶细胞表面抗原形式可以在其n-末端(在信号肽之后)包含v5结构域，其允许验证它们在细胞表面上的正确表达。预期那些截短的靶细胞表面抗原形式会发生结合的减少或丧失，所述截短的靶细胞表面抗原形式不再包含结合结构域所识别的靶细胞表面抗原区域。结合的减少优选为至少10％、20％、30％、40％、50％，更优选至少60％、70％、80％，且最优选90％、95％或甚至100％，由此与整个人靶细胞表面抗原蛋白(或其细胞外区域或结构域)的结合被设定为100。确定靶细胞表面抗原的特异性残基对通过抗体构建体或结合结构域识别的贡献的进一步方法是丙氨酸扫描(参见例如morrisonkl和weissga.curopinchembiol.[化学生物学新见]2001年6月；5(3):302-7)，其中待分析的每个残基例如经由定点诱变被丙氨酸替代。使用丙氨酸是因为它具有非庞大的、化学惰性的甲基官能团，但仍模仿许多其他氨基酸所具有的二级结构参考。有时，在需要保持突变残基大小的情况下，可以使用庞大的氨基酸如缬氨酸或亮氨酸。丙氨酸扫描是一项已经使用了很长一段时间的成熟技术。结合结构域与表位或包含该表位的区域之间的相互作用意味着结合结构域对表位/包含特定蛋白质或抗原(此处分别为靶细胞表面抗原和cd3)上的表位的区域显示出明显的亲和力，并且通常不显示与除靶细胞表面抗原或cd3之外的蛋白质或抗原显著的反应性。“明显的亲和力”包括以约10-6m(kd)或更强的亲和力的结合。优选地，当结合亲和力为约10-12至10-8m、10-12至10-9m、10-12至10-10m、10-11至10-8m，优选约10-11至10-9m时，结合被认为是特异性的。结合结构域是否与靶标特异性地反应或结合可以尤其通过以下方式容易地测试：比较所述结合结构域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域与除靶细胞表面抗原或cd3之外的蛋白质或抗原的反应。优选地，本发明的结合结构域本质上或基本上不结合除靶细胞表面抗原或cd3之外的蛋白质或抗原(即，第一结合结构域优选不能结合除靶细胞表面抗原之外的蛋白质，并且第二结合结构域不能结合除cd3之外的蛋白质。根据本发明的抗体构建体的设想特征是与其他hle形式相比具有优异的亲和力特征。因此，这种优异的亲和力表明体内延长的半衰期。根据本发明的抗体构建体的较长半衰期可以减少给予的持续时间和频率，这通常有助于改善患者依从性。这是特别重要的，因为本发明的抗体构建体对高度虚弱或甚至多病态癌症患者特别有益。术语“本质上/基本上不结合”或“不能结合”意指本发明的结合结构域不结合除靶细胞表面抗原或cd3之外的蛋白质或抗原，即，显示与除靶细胞表面抗原或cd3之外的蛋白质或抗原的反应性不超过30％、优选不超过20％、更优选不超过10％、特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％，借此与靶细胞表面抗原或cd3的结合被分别设定为100％。认为特异性结合受结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特定基序的影响。因此，由于它们的一级、二级和/或三级结构以及所述结构的二次修饰的结果，实现了结合。抗原相互作用侧与其特异性抗原的特异性相互作用可导致所述侧与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用侧与其特异性抗原的特异性相互作用可以替代地或另外地导致例如由于诱导抗原构象的改变、抗原的寡聚化等引起的信号的启动。术语“可变的”是指抗体或免疫球蛋白结构域的部分，其在序列中显示出可变性，并且涉及确定特定抗体(即“一种或多种可变结构域”)的特异性和结合亲和力。可变重链(vh)和可变轻链(vl)的配对一起形成单个抗原结合侧。可变性不是均匀分布在抗体的可变结构域中；它集中在重链和轻链可变区中的每一个的子结构域中。这些子结构域称为“高变区”或“互补决定区”(cdr)。可变结构域的更保守(即，非高变)部分称为“框架”区(frm或fr)，并为三维空间中的六个cdr提供支架以形成抗原结合表面。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个frm区(fr1、fr2、fr3和fr4)，其主要采用β-片层构型，通过三个高变区连接，这三个高变区形成连接β-片层结构的环，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过frm紧密地保持在一起，并且来自另一条链的高变区有助于形成抗原结合侧(参见在上述引文中的kabat等人)。术语“cdr”及其复数“cdr”是指互补决定区，其中三个组成轻链可变区(cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)的结合特征且三个组成重链可变区(cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)的结合特征。cdr包含负责抗体与抗原的特异性相互作用的大多数残基，因此有助于抗体分子的功能活性：它们是抗原特异性的主要决定因素。确切的明确cdr边界和长度受不同的分类和编号系统的限制。因此，cdr可以通过kabat、chothia、接触或任何其他边界定义来指代，包括本文所述的编号系统。尽管边界不同，但这些系统中的每一个具有在构成可变序列内所谓的“高变区”的一定程度的重叠。因此，根据这些系统的cdr定义可以在长度和相对于相邻框架区域的边界区域方面不同。参见例如kabat(基于跨物种序列可变性的方法)、chothia(基于抗原抗体复合物的晶体学研究的方法)和/或maccallum(在上述引文中的kabat等人；chothia等人,j.moi.biol[分子生物学杂志],1987,196:901-917；以及maccallum等人,j.moi.biol[分子生物学杂志],1996,262:732)。用于表征抗原结合侧的又另一个标准是oxfordmolecular的abm抗体建模软件所使用的abm定义。参见例如，proteinsequenceandstructureanalysisofantibodyvariabledomains[抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析].在antibodyengineeringlabmanual[抗体工程实验室手册](编辑：duebel,s.和kontermann,r.，施普林格出版社(springer-verlag)，海德尔堡)中。就两种残基识别技术定义重叠的区域而非相同区域而言，它们可以组合以定义杂交cdr。但是根据所谓的kabat系统的编号是优选的。通常，cdr形成环结构，其可以被分类为规范结构。术语“规范结构”是指抗原结合(cdr)环所采用的主链构象。从比较结构研究中，已发现六个抗原结合环中的五个仅具有有限的可用构象库。每个规范结构可以通过多肽骨架的扭转角来表征。因此，抗体之间的对应环可能具有非常相似的三维结构，尽管环的大部分区域具有高氨基酸序列可变性(chothia和lesk,j.moi.biol.[分子生物学杂志],1987,196:901；chothia等人,nature[自然],1989,342:877；martin和thornton,j.moi.biol[分子生物学杂志],1996,263:800)。此外，采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类的构象由环的长度和位于环内以及保守框架内(即环的外部)关键位置的氨基酸残基来决定。因此，可以基于这些关键氨基酸残基的存在来对特定规范类进行分配。术语“规范结构”还可以包括关于抗体线性序列的考虑，例如如kabat所编目的(在上述引文中的kabat等人)。kabat编号方案(系统)是以一致的方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的广泛采用的标准，并且是如本文其他地方所述的本发明中应用的优选方案。附加的结构考虑也可用于确定抗体的规范结构。例如，kotat编号未完全反映的那些差异可以通过chothia等人的编号系统来描述和/或通过其他技术例如晶体学和二维或三维计算建模来揭示。因此，可以将给定的抗体序列置于规范类中，其允许鉴定适当的底盘序列(chassissequence)(例如，基于在文库中包括多种规范结构的期望)等。在文献中描述了上述引文中的chothia等人描述的抗体氨基酸序列的kabat编号和结构考虑及其对于构建抗体结构的规范方面的意义。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型是本领域熟知的。关于抗体结构的综述，参见antibodies:alaboratorymanual[抗体：实验室手册],coldspringharborlaboratory,eds.[冷泉港实验室，编辑]harlow等人,1988。轻链的cdr3，特别是重链的cdr3可构成轻链和重链可变区内抗原结合中最重要的决定簇。在一些抗体构建体中，重链cdr3似乎构成抗原与抗体之间的主要接触区域。其中cdr3单独变化的体外选择方案可用于改变抗体的结合特性或确定哪些残基有助于抗原的结合。因此，cdr3通常是抗体结合侧中分子多样性的最大来源。例如，h3可以短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。在经典的全长抗体或免疫球蛋白中，每条轻(l)链通过一个共价二硫键与重(h)链连接，而两条h链通过一个或多个二硫键彼此连接，这取决于h链同种型。最接近vh的ch结构域通常称为ch1。恒定(“c”)结构域不直接参与抗原结合，但显示出各种效应功能，如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体激活。抗体的fc区包含在重链恒定结构域内，并且例如能够与位于细胞表面的fc受体相互作用。组装和体细胞突变后的抗体基因序列变化很大，估计这些不同的基因编码1010个不同的抗体分子(immunoglobulingenes,2nded.[免疫球蛋白基因，第2版],jonio等人编辑,academicpress[学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州],1995)。因此，免疫系统提供了免疫球蛋白库。术语“库”是指至少一种核苷酸序列，其完全或部分源自编码至少一种免疫球蛋白的至少一种序列。该一种或多种序列可以通过重链的v、d和j区段以及轻链的v和j区段在体内重排来生成。可替代地，该一种或多种序列可以由细胞响应于例如体外刺激发生重排来生成。可替代地，该一种或多种序列的部分或全部可通过dna剪接、核苷酸合成、诱变和其他方法获得，参见例如美国专利5,565,332。库可以仅包含一种序列或可以包含多种序列，包括遗传多样化集合中的序列。与本发明有关的术语“fc部分”或“fc单体”意指多肽，其包含至少一种具有ch2结构域功能的结构域和至少一种具有免疫球蛋白分子的ch3结构域功能的结构域。从术语“fc单体”清楚的是，包含那些ch结构域的多肽是“多肽单体”。fc单体可以是多肽，其至少包含免疫球蛋白的恒定区的片段的多肽，不包括重链的第一恒定区免疫球蛋白结构域(ch1)，但至少保持一个ch2结构域的功能部分和一个ch3结构域的功能部分，其中ch2结构域是ch3结构域的氨基末端。在该定义的优选方面，fc单体可以是包含ig-fc铰链区的一部分的多肽恒定区、ch2区和ch3区，其中铰链区是ch2结构域的氨基末端。设想本发明的铰链区促进二聚化。此类fc多肽分子可通过例如但不限于免疫球蛋白区域的木瓜蛋白酶消化(当然产生两个fc多肽的二聚体)来获得。在该定义的另一个方面，fc单体可以是包含ch2区和ch3区的一部分的多肽区。此类fc多肽分子可通过例如但不限于免疫球蛋白分子的胃蛋白酶消化来获得。在一个实施例中，fc单体的多肽序列与以下区域的fc多肽序列基本类似：igg1fc区、igg2fc区、igg3fc区、igg4fc区、igmfc区、igafc区、igdfc区和igefc区。(参见例如，padlan,molecularimmunology[分子免疫学],31(3),169-217(1993))。由于免疫球蛋白之间存在一些变化，并且仅为了清楚起见，fc单体是指iga、igd和igg的最后两个重链恒定区免疫球蛋白结构域，以及ige和igm的最后三个重链恒定区免疫球蛋白结构域。如上所述，fc单体还可以包括这些结构域的柔性铰链n-末端。对于iga和igm，fc单体可包括j链。对于igg，fc部分包含免疫球蛋白结构域ch2和ch3以及前两个结构域与ch2之间的铰链。尽管fc部分的边界可以变化，但包含功能性铰链、ch2和ch3结构域的人igg重链fc部分的实例可定义为例如包含残基d231(铰链结构域的-对应于下表1中的d234)至p476，对应地为ch3结构域的羧基末端的l476(对于igg4)，其中编号根据kabat。经由肽接头彼此融合的两个fc部分或fc单体限定了本发明的抗体构建体的第三结构域，其也可以定义为scfc结构域。在本发明的一个实施例中，设想本文披露的scfc结构域，即对应地彼此融合的fc单体仅包含在抗体构建体的第三结构域中。根据本发明，可以使用表1中列出的kabat编号通过类推来鉴定igg铰链区。与上文一致，设想本发明的铰链结构域/区域包含对应于根据kabat编号的d234至p243的igg1序列段的氨基酸残基。同样设想本发明的铰链结构域/区域包含igg1铰链序列dkthtcppcp(seqidno:182)或由其组成(还设想了对应于如下表1中所示的序列段d234至p243-所述序列的变体，只要铰链区仍然促进二聚化)。在本发明优选的实施例中，抗体构建体的第三结构域中ch2结构域的kabat位置314处的糖基化位点通过n314x取代去除，其中x是除q之外的任何氨基酸。所述取代优选为n314g取代。在更优选的实施例中，所述ch2结构域另外包含以下取代(根据kabat的位置)：v321c和r309c(这些取代在kabat位置309和321处引入结构域内半胱氨酸二硫键)。还设想本发明的抗体构建体的第三结构域以氨基到羧基的顺序包含以下各项或由以下各项组成：dkthtcppcp(seqidno:182)(即铰链)-ch2-ch3-接头-dkthtcppcp(seqidno:182)(即铰链)-ch2-ch3。上述抗体构建体的肽接头在优选的实施例中，其特征在于氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser即gly4ser(seqidno:187)，或其聚合物即(gly4ser)x，其中x是5或更大的整数(例如5、6、7、8等或更大)，优选6((gly4ser)6)。所述构建体可以进一步包含上述取代n314x、优选n314g，和/或其他取代v321c和r309c。在如上文所定义的本发明抗体构建体的优选实施例中，设想第二结构域结合人和/或猕猴cd3ε链的细胞外表位。表1：铰链区氨基酸残基的kabat编号在本发明的进一步实施例中，铰链结构域/区域包含以下各项或由以下各项组成：igg2亚型铰链序列erkccvecppcp(seqidno:183)、igg3亚型铰链序列elktpldtthtcprcp(seqidno:184)或elktplgdtthtcprcp(seqidno:185)和/或igg4亚型铰链序列eskygppcpscp(seqidno:186)。igg1亚型铰链序列可以是以下一种epkscdkthtcppcp(如表1和seqidno:183所示)。因此，在本发明的上下文中也设想了这些核心铰链区。iggch2和iggcd3结构域的位置和序列可以使用表2中列出的kabat编号通过类推来鉴定：表2：iggch2和ch3区的氨基酸残基的kabat编号在本发明的一个实施例中，第一或两个fc单体的ch3结构域中强调的粗体氨基酸残基是缺失的。肽接头-第三结构域的多肽单体(“fc部分”或“fc单体”)经由它彼此融合-优选包含至少25个氨基酸残基(25、26、27、28、29、30等)。更优选地，该肽接头包含至少30个氨基酸残基(30、31、32、33、34、35等)。接头还优选包含多达40个氨基酸残基、更优选多达35个氨基酸残基、最优选恰好30个氨基酸残基。这种肽接头的优选实施例的特征在于氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser即gly4ser(seqidno:187)，或其聚合物即(gly4ser)x，其中x是5或更大的整数(例如6、7或8)。该整数优选为6或7，该整数更优选为6。如果使用接头将第一结构域与第二结构域融合或将第一结构域或第二结构域与第三结构域融合，则该接头优选具有优选足以确保第一和第二结构域中的每一个都能够彼此独立地保持其差异结合特异性的长度和序列。对于连接本发明抗体构建体中至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽接头，优选那些仅包含少量氨基酸残基例如12个氨基酸残基或更少的肽接头。因此，优选具有12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽接头。设想的具有少于5个氨基酸的肽接头包含4、3、2或一个氨基酸，其中优选富含gly的接头。用于融合第一和第二结构域的肽接头的优选实施例描述于seqidno:1中。用于融合第二和第三结构域的肽接头的优选接头实施例是(gly)4-接头，其分别为g4-接头。在上述“肽接头”之一的上下文中特别优选的“单一”氨基酸是gly。因此，所述肽接头可以由单个氨基酸gly组成。在本发明的优选实施例中，肽接头的特征在于氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser即gly4ser(seqidno:187)，或其聚合物即(gly4ser)x，其中x是1或更大的整数(例如2或3)。优选的接头描述于seqidno:1至12中。包括不存在二级结构的促进作用的所述肽接头的特征是本领域已知的，并且描述于例如dall’acqua等人(biochem.[生物化学](1998)37,9266-9273)、cheadle等人(molimmunol[分子免疫学](1992)29,21-30)以及raag和whitlow(faseb[美国实验生物学会联合会](1995)9(1),73-80)。此外，优选不促进任何二级结构的肽接头。所述结构域彼此的连接可以例如通过基因工程提供，如实例中所述。制备融合和可操作地连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达它们的方法是本领域熟知的(例如wo99/54440或sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册],coldspringharborlaboratorypress[冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港],2001)。在抗体构建体或本发明的优选实施例中，第一和第二结构域以选自由(scfv)2、scfv单结构域mab、双抗体和任何这些形式的寡聚体组成的组的形式形成抗体构建体。根据特别优选的实施例，并且如所附实例中所述，本发明的抗体构建体的第一和第二结构域是“双特异性单链抗体构建体”、更优选双特异性“单链fv”(scfv)。尽管fv片段的两个结构域vl和vh由独立基因编码，但是使用重组方法可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白质链产生的合成接头(如上文所述)连接，在所述单条多肽链中vl和vh区配对形成单价分子；参见例如，huston等人(1988)proc.natl.acad.sciusa[美国国家科学院院刊]85:5879-5883。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以按照与完整或全长抗体相同的方式评价片段的功能。因此，单链可变片段(scfv)是免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)的可变区的融合蛋白，其通常与约10至约25个氨基酸、优选约15至20个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔韧性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以使vh的n-末端与vl的c-末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白质保留了原始免疫球蛋白的特异性。双特异性单链抗体构建体是本领域已知的，并描述于wo99/54440、mack,j.immunol.[免疫学杂志](1997),158,3965-3970、mack,pnas[美国国家科学院院刊],(1995),92,7021-7025、kufer,cancerimmunol.immunother.[癌症免疫与免疫疗法],(1997),45,193-197、blood[血液],(2000),95,6,2098-2103、brühl,immunol.[免疫学],(2001),166,2420-2426、kipriyanov,j.mol.biol.[分子生物学杂志],(1999),293,41-56。描述用于产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778、在上述引文中的kontermann和dübel(2010)以及在上述引文中的little(2009))可以适于产生特异性地识别一种或多种所选的靶标的单链抗体构建体。二价(bivalent或divalent)或双特异性单链可变片段(具有(scfv)2形式的二scfv或双scfv)可以通过连接两个scfv分子(例如，如上文所述的接头)而被工程化。如果这两种scfv分子具有相同的结合特异性，则所得(scfv)2分子优选称为二价(即，对于相同的靶表位，其具有二价)。如果两种scfv分子具有不同的结合特异性，则所得(scfv)2分子优选称为双特异性。可以通过产生具有两个vh区和两个vl区的单条肽链来进行连接，从而产生串联scfv(参见例如，kuferp.等人,(2004)trendsinbiotechnology[生物技术趋势]22(5):238-244)。另一种可能性是产生具有接头肽的scfv分子，这些接头肽对于两个可变区而言太短(例如约5个氨基酸)而不能折叠在一起，从而迫使scfv二聚化。这种类型称为双抗体(参见例如hollinger,philipp等人,(1993年7月)proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica[美国国家科学院院刊]90(14):6444-8)。根据本发明，第一、第二或第一和第二结构域可以包含单结构域抗体，其分别为单结构域抗体的可变结构域或至少cdr。单结构域抗体仅包含一种(单体)抗体可变结构域，其能够独立于其他v区或结构域选择性地结合特异性抗原。第一单结构域抗体由骆驼科动物中发现的重链抗体进行工程化，并且这些第一单结构与抗体被称为vhh片段。软骨鱼类也具有重链抗体(ignar)，从这种重链抗体中可以获得称为vnar片段的单结构域抗体。替代性方法将来自常见免疫球蛋白例如来自人或啮齿动物的二聚体可变结构域分成单体，从而获得作为单结构域ab的vh或vl。虽然大多数针对单结构域抗体的研究目前基于重链可变结构域，但是也已经显示源自轻链的纳米抗体特异性地结合靶表位。单结构域抗体的实例称为sdab、纳米抗体或单可变结构域抗体。因此，(单结构域mab)2是由(至少)两种单结构域单克隆抗体构成的单克隆抗体构建体，所述单结构域单克隆抗体单独地选自包含vh、vl、vhh和vnar的组。接头优选为肽接头的形式。类似地，“scfv单结构域mab”是由如上所述的至少一种单结构域抗体和如上所述的一种scfv分子构成的单克隆抗体构建体。同样，接头优选为肽接头的形式。可以在竞争测定(如竞争性elisa或基于细胞的竞争测定)中确定抗体构建体是否竞争与另一给定抗体构建体的结合。也可以使用亲和素偶联的微粒(珠粒)。与亲和素包被的elisa板类似，当与生物素化的蛋白质反应时，这些珠粒中的每一个都可以用作在其上可以进行测定的基底。将抗原包被在珠粒上，然后用第一抗体预包被。加入第二抗体并测定任何附加的结合。读出的可能手段包括流式细胞术。t细胞或t淋巴细胞是一种淋巴细胞类型(本身就是一种白细胞类型)，其在细胞介导的免疫中起着重要作用。t细胞有几个子集，每个子集具有不同的功能。通过在细胞表面上t细胞受体(tcr)的存在，可以将t细胞与其他淋巴细胞(如b细胞和nk细胞)区分开。tcr负责识别与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的抗原，并由两条不同的蛋白质链构成。在95％的t细胞中，tcr由alpha(α)和beta(β)链组成。当tcr与抗原肽和mhc(肽/mhc复合物)结合时，t淋巴细胞通过由相关酶、共受体、特化衔接分子和激活或释放的转录因子介导的一系列生化事件被激活。cd3受体复合物是蛋白质复合物，并由四条链构成。在哺乳动物中，复合物含有cd3γ(gamma)链、cd3δ(delta)链和两条cd3ε(epsilon)链。这些链与t细胞受体(tcr)和所谓的ζ(zeta)链缔合，形成t细胞受体cd3复合物，并在t淋巴细胞中产生活化信号。cd3γ(gamma)、cd3δ(delta)和cd3ε(epsilon)链是含有单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。cd3分子的细胞内尾部含有称为基于免疫受体酪氨酸激活的激活基序或简称itam的单一保守基序，其对于tcr的信号传导能力是必需的。cd3ε分子是人体中由位于11号染色体上的cd3e基因编码的多肽。cd3ε的最优选表位包含在人cd3ε细胞外结构域的氨基酸残基1-27内。设想根据本发明的抗体构建体通常且有利地显示较少的非特异性t细胞激活，这在特异性免疫疗法中是不希望的。这可以降低副作用的风险。经由通过多特异性、至少双特异性抗体构建体募集t细胞的重定向裂解靶细胞包括细胞溶解性突触形成以及穿孔素和颗粒酶的递送。所衔接的t细胞能够连续进行连续的靶细胞裂解，并且不受干扰肽抗原加工和呈递的免疫逃逸机制或克隆t细胞分化的影响；参见例如，wo2007/042261。可以以各种方式测量由本发明的抗体构建体介导的细胞毒性。效应细胞可以是例如刺激的富集的(人)cd8阳性t细胞或未刺激的(人)外周血单核细胞(pbmc)。如果靶细胞是猕猴来源的，或表达由第一结构域结合的猕猴靶细胞表面抗原或采用由第一结构域结合的猕猴靶细胞表面抗原转染，则效应细胞也应该是猕猴来源的，如猕猴t细胞系，例如4119lnpx。靶细胞应表达靶细胞表面抗原(的至少细胞外结构域)，例如人或猕猴靶细胞表面抗原。靶细胞可以是用靶细胞表面抗原稳定或瞬时转染的细胞系(如cho)，例如人或猕猴靶细胞表面抗原。可替代地，靶细胞可以是靶细胞表面抗原阳性天然表达细胞系。通常，预计ec50值较低，其中靶细胞系在细胞表面表达较高水平的靶细胞表面抗原。效应子与靶细胞(e:t)之比通常为约10:1，但也可以变化。靶细胞表面抗原xcd3双特异性抗体构建体的细胞毒活性可以在51cr释放测定(孵育时间为约18小时)或基于facs的细胞毒性测定(孵育时间为约48小时)中测量。测定孵育时间(细胞毒性反应)的修改也是可能的。测量细胞毒性的其他方法是本领域技术人员熟知的，并且包括mtt或mts测定、基于atp的测定(包括生物发光测定)、磺酰罗丹明b(srb)测定、wst测定、克隆形成测定和ecis技术。由本发明的靶细胞表面抗原xcd3双特异性抗体构建体介导的细胞毒活性优选在基于细胞的细胞毒性测定中测量。它也可以在51cr释放测定中测量。该细胞毒活性由ec50值表示，其对应于半数最大有效浓度(诱导在基线与最大值中间的细胞毒性反应的抗体构建体的浓度)。优选地，靶细胞表面抗原xcd3双特异性抗体构建体的ec50值≤5000pm或≤4000pm、更优选≤3000pm或≤2000pm、甚至更优选≤1000pm或≤500pm、甚至更优选≤400pm或≤300pm、甚至更优选≤200pm、甚至更优选≤100pm、甚至更优选≤50pm、甚至更优选≤20pm或≤10pm以及最优选≤5pm。上述给定的ec50值可以在不同的测定中测量。技术人员意识到，与未刺激的pbmc相比，当刺激/富集的cd8+t细胞用作效应细胞时，可以预期ec50值更低。此外可以预期，与低靶表达大鼠相比，当靶细胞表达大量靶细胞表面抗原时ec50值较低。例如，当刺激/富集的人cd8+t细胞用作效应细胞(并且靶细胞表面抗原转染的细胞如cho细胞或靶细胞表面抗原阳性人细胞系用作靶细胞)时，靶细胞表面抗原xcd3双特异性抗体构建体的ec50值优选≤1000pm、更优选≤500pm、甚至更优选≤250pm、甚至更优选≤100pm、甚至更优选≤50pm、甚至更优选≤10pm以及最优选≤5pm。当人pbmc用作效应细胞时，靶细胞表面抗原xcd3双特异性抗体构建体的ec50值优选≤5000pm或≤4000pm(特别当靶细胞是靶细胞表面抗原阳性人细胞系时)、更优选≤2000pm(特别当靶细胞是靶细胞表面抗原转染的细胞如cho细胞时)、更优选≤1000pm或≤500pm、甚至更优选≤200pm、甚至更优选≤150pm、甚至更优选≤100pm以及最优选≤50pm或更低。当猕猴t细胞系如lnpx4119用作效应细胞，并且猕猴靶细胞表面抗原转染的细胞系如cho细胞用作靶细胞系时，靶细胞表面抗原xcd3双特异性抗体构建体的ec50值优选≤2000pm或≤1500pm、更优选≤1000pm或≤500pm、甚至更优选≤300pm或≤250pm、甚至更优选≤100pm以及最优选≤50pm。优选地，本发明的靶细胞表面抗原xcd3双特异性抗体构建体不诱导/介导裂解或本质上不诱导/介导靶细胞表面抗原阴性细胞如cho细胞的裂解。术语“不诱导裂解”、“基本上不诱导裂解”、“不介导裂解”或“基本上不介导裂解”意指本发明的抗体构建体诱导或介导靶细胞表面抗原阴性细胞不超过30％的裂解、优选不超过20％、更优选不超过10％、特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％，由此靶细胞表面抗原阳性人细胞系的裂解被设定为100％。这通常适用于浓度高达500nm的抗体构建体。技术人员了解如何不费周折地测量细胞裂解。此外，本说明书教导了如何测量细胞裂解的具体说明。单独靶细胞表面抗原xcd3双特异性抗体构建体的单体和二聚体同种型之间的细胞毒活性的差异被称为“效力间隙”。这种效力间隙可以例如计算为分子的单体和二聚体形式的ec50值之间的比。本发明的靶细胞表面抗原xcd3双特异性抗体构建体的效力间隙优选≤5、更优选≤4、甚至更优选≤3、甚至更优选≤2以及最优选≤1。本发明的抗体构建体的一种或多种第一和/或第二(或任何其他)结合结构域优选对灵长类动物的哺乳动物目成员具有跨物种特异性。跨物种特异性cd3结合结构域例如描述于wo2008/119567中。根据一个实施例，第一和/或第二结合域除了分别与人靶细胞表面抗原和人cd3结合外，还将结合灵长类动物的靶细胞表面抗原/cd3，灵长类动物包括(但不限于)新世界灵长类动物(如普通狨、棉冠獠狨或松鼠猴)、旧世界灵长类动物(如狒狒和猕猴)、长臂猿和非人类人亚科。在本发明抗体构建体的一个实施例中，第一结构域结合人靶细胞表面抗原并进一步结合猕猴靶细胞表面抗原如食蟹猴的靶细胞表面抗原，并且更优选结合在表面猕猴细胞上表达的猕猴靶细胞表面抗原。第一结合结构域对猕猴靶细胞表面抗原的亲和力优选≤15nm、更优选≤10nm、甚至更优选≤5nm、甚至更优选≤1nm、甚至更优选≤0.5nm、甚至更优选≤0.1nm以及最优选≤0.05nm或甚至≤0.01nm。优选地，根据本发明的抗体构建体对于结合猕猴靶细胞表面抗原相对于人靶细胞表面抗原的亲和间隙[ma靶细胞表面抗原:hu靶细胞表面抗原](例如通过biacore或通过scatchard分析所测定的)<100、优选<20、更优选<15、进一步优选<10、甚至更优选<8、更优选<6以及最优选<2。根据本发明的抗体构建体对于结合猕猴靶细胞表面抗原相对于人靶细胞表面抗原的亲和间隙的优选范围为在0.1与20之间、更优选在0.2与10之间、甚至更优选在0.3与6之间、甚至更优选在0.5与3之间或在0.5与2.5之间以及最优选在0.5与2之间或在0.6与2之间。本发明的抗体构建体的第二(结合)结构域结合人cd3ε和/或猕猴cd3ε。在优选的实施例中，第二结构域进一步结合普通狨、棉冠獠狨或松鼠猴cd3ε。普通狨、saguinus45yophil均是属于狨猴科的新世界灵长类动物，而松鼠猴是属于卷尾猴科的新世界灵长类动物。对于本发明的抗体构建体，结合人和/或猕猴cd3的细胞外表位的第二结构域优选包含vl区，该vl区包含选自以下各项的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3：(a)wo2008/119567的seqidno:27中所示的cdr-l1、wo2008/119567的seqidno:28中所示的cdr-l2以及wo2008/119567的seqidno:29中所示的cdr-l3；(b)wo2008/119567的seqidno:117中所示的cdr-l1、wo2008/119567的seqidno:118中所示的cdr-l2以及wo2008/119567的seqidno:119中所示的cdr-l3；以及iwo2008/119567的seqidno:153中所示的cdr-l1、wo2008/119567的seqidno:154中所示的cdr-l2以及wo2008/119567的seqidno:155中所示的cdr-l3。在本发明抗体构建体的另一个优选的实施例中，结合人和/或猕猴cd3ε链的细胞外表位的第二结构域包含vh区，该vh区包含选自以下各项的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3：(a)wo2008/119567的seqidno:12所示的cdr-h1、wo2008/119567的seqidno:13所示的cdr-h2以及wo2008/119567的seqidno:14所示的cdr-h3；(b)wo2008/119567的seqidno:30所示的cdr-h1、wo2008/119567的seqidno:31所示的cdr-h2以及wo2008/119567的seqidno:32所示的cdr-h3；iwo2008/119567的seqidno:48所示的cdr-h1、wo2008/119567的seqidno:49所示的cdr-h2以及wo2008/119567的seqidno:50所示的cdr-h3；(d)wo2008/119567的seqidno:66所示的cdr-h1、wo2008/119567的seqidno:67所示的cdr-h2以及wo2008/119567的seqidno:68所示的cdr-h3；iwo2008/119567的seqidno:84所示的cdr-h1、wo2008/119567的seqidno:85所示的cdr-h2以及wo2008/119567的seqidno:86所示的cdr-h3；(f)wo2008/119567的seqidno:102所示的cdr-h1、wo2008/119567的seqidno:103所示的cdr-h2以及wo2008/119567的seqidno:104所示的cdr-h3；(g)wo2008/119567的seqidno:120所示的cdr-h1、wo2008/119567的seqidno:121所示的cdr-h2以及wo2008/119567的seqidno:122所示的cdr-h3；(h)wo2008/119567的seqidno:138所示的cdr-h1、wo2008/119567的seqidno:139所示的cdr-h2以及wo2008/119567的seqidno:140所示的cdr-h3；(i)wo2008/119567的seqidno:156所示的cdr-h1、wo2008/119567的seqidno:157所示的cdr-h2以及wo2008/119567的seqidno:158所示的cdr-h3；以及(j)wo2008/119567的seqidno:174所示的cdr-h1、wo2008/119567的seqidno:175所示的cdr-h2以及wo2008/119567的seqidno:176所示的cdr-h3。在本发明抗体构建体的优选实施例中，将上述三组vlcdr与第二结合结构域内的上述十组vhcdr组合以形成(30)组，每组包含cdr-l1-3和cdr-h1-3。对于本发明的抗体构建体，结合cd3的第二结构域优选包含选自下组的vl区，该组由以下组成：wo2008/119567的seqidno:17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179或183所示或seqidno:200所示的vl区。结合cd3的第二结构域还优选包含选自下组的vh区，该组由以下组成：wo2008/119567的seqidno:15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181所示或seqidno:201所示的vh区。更优选地，本发明的抗体构建体的特征在于结合包含选自下组的vl区和vh区的cd3的第二结构域，该组由以下组成：(a)wo2008/119567的seqidno:17或21所示的vl区和wo2008/119567的seqidno:15或19所示的vh区；(b)wo2008/119567的seqidno:35或39所示的vl区和wo2008/119567的seqidno:33或37所示的vh区；iwo2008/119567的seqidno:53或57所示的vl区和wo2008/119567的seqidno:51或55所示的vh区；(d)wo2008/119567的seqidno:71或75所示的vl区和wo2008/119567的seqidno:69或73所示的vh区；iwo2008/119567的seqidno:89或93所示的vl区和wo2008/119567的seqidno:87或91所示的vh区；(f)wo2008/119567的seqidno:107或111所示的vl区和wo2008/119567的seqidno:105或109所示的vh区；(g)wo2008/119567的seqidno:125或129所示的vl区和wo2008/119567的seqidno:123或127所示的vh区；(h)wo2008/119567的seqidno:143或147所示的vl区和wo2008/119567的seqidno:141或145所示的vh区；(i)wo2008/119567的seqidno:161或165所示的vl区和wo2008/119567的seqidno:159或163所示的vh区；以及(j)wo2008/119567的seqidno:179或183所示的vl区和wo2008/119567的seqidno:177或181所示的vh区。关于本发明的抗体构建体还优选的是结合cd3的第二结构域，该cd3包含seqidno:200所示的vl区和seqidno:201所示的vh区。根据本发明抗体构建体的优选实施例，第一和/或第二结构域具有以下形式：vh区和vl区的对为单链抗体(scfv)的形式。vh和vl区以vh-vl或vl-vh的顺序排列。优选地，vh区位于接头序列的n-末端且vl区位于接头序列的c-末端。本发明的上述抗体构建体的优选实施例的特征在于结合包含选自下组的氨基酸序列的cd3的第二结构域，该组由以下组成：wo2008/119567的seqidno:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187所示或seqidno:202所示。抗体构建体的共价修饰也包括在本发明的范围内，并且通常但不总是在翻译后进行。例如，通过使抗体构建体的特定氨基酸残基与能够与选择的侧链或n-或c-末端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体构建体的几种类型的共价修饰引入分子中。半胱氨酰残基最常见的是与α-卤代乙酸盐(和相应的胺)如氯乙酸或氯乙酰胺反应，得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰残基也通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸酯、n-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物，对氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应而衍生化。组氨酰基残基通过与ph5.5-7.0的焦碳酸二乙酯反应而衍生化，因为该试剂对组氨酰基侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；反应优选在ph6.0的0.1m二甲胂酸钠中进行。赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其他羧酸酸酐反应。用这些试剂衍生化具有逆转赖氨酰残基电荷的作用。用于衍生化含α-氨基的残基的其他合适试剂包括亚氨酸酯如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼；三硝基苯磺酸；邻甲基异脲；2,4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸反应。通过与一种或几种常规试剂反应来修饰精氨酰基残基，其中包括苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。由于胍官能团的pka高，因此精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基基团反应。可以进行酪氨酰基残基的特定修饰，特别感兴趣的是通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰基残基中。最常见的是，n-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成邻乙酰基酪氨酰基种类和3-硝基衍生物。使用125i或131i碘化酪氨酰基残基以制备用于放射免疫测定的标记蛋白质，上述氯胺t方法是合适的。通过与碳二亚胺(r’—n＝c＝n–r’)反应选择性地修饰羧基侧基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)，其中r和r'任选地是不同的烷基基团，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮杂-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。用双功能试剂衍生化可用于将本发明的抗体构建体与水不溶性支持基质或表面交联以用于多种方法。通常使用的交联剂包括例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、n-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮基水杨酸的酯、同型双功能亚氨酸酯，该同型双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚胺酯如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)以及双功能马来酰亚胺如双-n-马来酰亚胺基-1,8-辛烷。衍生化试剂如甲基-3-[(对叠氮基苯基)二硫代]丙酰亚胺酯产生可光活化的中间体，其能够在光的存在下形成交联。可替代地，反应性水不溶性基质如溴化氰活化的碳水化合物和如美国专利号3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中所述的反应性底物用于蛋白质固定。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基通常分别脱酰胺成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。可替代地，这些残基在温和的酸性条件下脱酰胺。这些残基的任何一种形式都属于本发明的范围。其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(t.e.creighton,proteins:structureandmolecularproperties[蛋白质：结构和分子特性]、w.h.freeman公司,旧金山,1983,第79-86页)，n-末端胺的乙酰化和任何c-末端羧基的酰胺化。包括在本发明范围内的另一种类型的抗体构建体的共价修饰包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域所知，糖基化模式可取决于蛋白质的序列(例如，下文讨论的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)或产生蛋白质的宿主细胞或生物。下面讨论特定的表达系统。多肽的糖基化通常是n-连接的或o-连接的。n-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x是除脯氨酸之外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在的糖基化位点。o-连接糖基化是指将糖n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接到羟基氨基酸上，最通常为丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列使其含有一种或多种上述三肽序列(对于n-连接的糖基化位点)，可方便地完成向抗体构建体中添加糖基化位点。也可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加至起始序列或被一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代(对于o-连接的糖基化位点)来进行改变。为了方便起见，优选通过dna水平的变化来改变抗体构建体的氨基酸序列，特别是通过使在预选的碱基处编码多肽的dna突变，使得生成将翻译为所需氨基酸的密码子。增加抗体构建体上碳水化合物部分的数量的另一种方法是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。这些方法是有利的，因为它们不需要在具有对于n-和o-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。根据所用的偶联模式，一种或多种糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基基团、(c)游离巯基基团如半胱氨酸的那些巯基基团、(d)游离羟基基团如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些羟基基团，i芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些i芳香族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述于wo87/05330以及aplin和wriston,1981,crccrit.rev.biochem.[crc生物化学评论],第259-306页。存在于起始抗体构建体上的碳水化合物部分的去除可以通过化学或酶促完成。化学去糖基化需要将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等效的化合物中。该处理导致除连接糖(n-乙酰葡糖胺或n-乙酰半乳糖胺)之外的大多数或所有糖的裂解，同时使多肽保持完整。化学去糖基化由hakimuddin等人,1987,arch.biochem.biophys.[生物化学与生物物理学集刊]259:52和edge等人,1981,anal.biochem.[分析生物化学]118:131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促切割可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如thotakura等人,1987,meth.enzymol.[酶学方法]138:350所述。可以通过使用化合物衣霉素来防止潜在糖基化位点处的糖基化，如duskin等人,1982,j.biol.chem.[生物化学杂志]257:3105所述。衣霉素阻断蛋白质-n-糖苷连接的形成。本文还考虑了抗体构建体的其他修饰。例如，抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括以美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所述的方式将抗体构建体与各种非蛋白质聚合物连接，包括但不限于各种多元醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇)、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。另外，如本领域已知的，氨基酸取代可以在抗体构建体内的不同位置进行，例如以便促进聚合物如peg的添加。在一些实施例中，本发明的抗体构建体的共价修饰包括添加一种或多种标记。标记基团可以经由各种长度的间隔臂与抗体构建体偶联，以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法是本领域已知的，并且可用于实施本发明。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标记。一般而言，根据检测标记的测定，这些标记属于各种类别，以下实例包括但不限于：a)同位素标记，其可以是放射性或重同位素，如放射性同位素或放射性核素(例如，3h、14c、15n、35s、89zr、90y、99tc、111in、125i、131i)b)磁性标记(例如，磁性颗粒)c)氧化还原活性部分d)光学染料(包括但不限于发色团、荧光粉和荧光团)，如荧光基团(例如fitc、罗丹明、镧系元素荧光粉)、化学发光基团和荧光团，所述荧光团可以是“小分子”荧光或蛋白质荧光e)酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)f)生物素化基团g)由二级报告物(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合侧、金属结合结构域、表位标记等)识别的预定多肽表位“荧光标记”意指可经由其固有荧光特性检测的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、51yophilisat、香豆素、甲基香豆素、芘、malacite绿、芪、荧光黄、cascadebluej、德克萨斯红、iaedans、edans、bodipyfl、lc红640、cy5、cy5.5、lc红705、俄勒冈绿、alexa-fluor染料(alexafluor350、alexafluor430、alexafluor488、alexafluor546、alexafluor568、alexafluor594、alexafluor633、alexafluor660、alexafluor680)、级联蓝、级联黄和r-藻红蛋白(pe)(分子探针公司，尤金，俄勒冈州)、fitc、罗丹明和德克萨斯红(pierce，罗克福德，伊利诺伊州)、cy5、cy5.5、cy7(amersham生命科学公司，匹兹堡，宾夕法尼亚州)。包括荧光团在内的合适的光学染料描述于richardp.haugland的molecularprobeshandbook[分子探针手册]中。合适的蛋白质荧光标记还包括但不限于绿色荧光蛋白，包括gfp的海肾、ptilosarcus或多管水母物种(chalfie等人,1994,science[科学]263:802-805)、egfp(clontech实验室公司，genbank登录号u55762)、蓝色荧光蛋白(bfp，加拿大h3h1j9魁北克蒙特利尔，松纳夫大道西1801号8层，量子生物技术有限公司(1801demaisonneuveblvd.west,8thfloor,montreal,quebec,canadah3h1j9)；stauber,1998,biotechniques[生物技术]24:462-471；heim等人,1996,curr.biol.[当代生物学]6:178-182)、增强的黄色荧光蛋白(eyfp，clontech实验室公司)、荧光素酶(ichiki等人,1993,j.immunol.[免疫学杂志]150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(nolan等人,1988,proc.natl.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊]85:2603-2607)和renilla(wo92/15673、wo95/07463、wo98/14605、wo98/26277、wo99/49019；美国专利号5,292,658、5,418,155、5,683,888、5,741,668、5,777,079、5,804,387、5,874,304、5,876,995、5,925,558)。本发明的抗体构建体还可以包含附加的结构域，该附加的结构域例如有助于分子的分离或与分子的适应的药代动力学特征有关。可以从肽动机或二次引入的部分中选择有助于分离抗体构建体的结构域，所述肽动机或二次引入的部分可以在分离方法例如分离柱中捕获。非限制性实施例的这种附加结构域包括肽动机，其称为myc标记、hat-标记、ha标记、tap标记、gst标记、几丁质结合结构域(cbd标记)、麦芽糖结合蛋白(mbp-tag)、flag标记、strep标记及其变体(例如strepii标记)和his标记。本文披露的所有抗体构建体的特征在于鉴定的cdr可以包括his标记结构域，其通常被称为分子的氨基酸序列中的连续his残基、优选为五个且更优选为六个his残基(六组氨酸)的重复序列。his标记可以位于例如在抗体构建体的n-或c-末端，它优选位于c-末端。最优选地，六组氨酸标记(hhhhhh)(seqidno:199)经由肽键与根据本发明的抗体构建体的c-末端连接。另外，plga-peg-plga的缀合物系统可以与聚组氨酸标记组合用于持续释放应用和改善的药代动力学特征。还考虑了本文描述的抗体构建体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体构建体的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将合适的核苷酸变化引入抗体构建体核酸中或通过肽合成来制备抗体构建体的氨基酸序列变体。所有下文描述的氨基酸序列修饰应该产生仍然保留未修饰的亲本分子的所需生物活性(结合靶细胞表面抗原和cd3)的抗体构建体。术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有其本领域公认定义的氨基酸如选自下组的氨基酸，该组由以下组成：丙氨酸(ala或a)、精氨酸(arg或r)、天冬酰胺(asn或n)、天冬氨酸(asp或d)、半胱氨酸(cys或c)、谷氨酰胺(gin或q)、谷氨酸(giu或e)、甘氨酸(giy或g)、组氨酸(his或h)、异亮氨酸(he或i)、亮氨酸(leu或l)、赖氨酸(lys或k)、甲硫氨酸(met或m)、苯丙氨酸(phe或f)、脯氨酸(pro或p)、丝氨酸(ser或s)、苏氨酸(thr或t)、色氨酸(trp或w)、酪氨酸(tyr或y)和缬氨酸(val或v)，尽管可以根据需要使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸。通常，氨基酸可以分组为具有非极性侧链(例如，ala、cys、he、leu、met、phe、pro、vai)；带负电的侧链(例如，asp、giu)；带正电的侧链(例如，arg、his、lys)；或不带电的极性侧链(例如，asn、cys、gin、giy、his、met、phe、ser、thr、trp和tyr)。氨基酸修饰包括例如抗体构建体的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需的特征。氨基酸变化也可以改变抗体构建体的翻译后工艺，如改变糖基化位点的数量或位置。例如，可以在每个cdr中插入、取代或缺失1、2、3、4、5或6个氨基酸(当然，取决于它们的长度)，而在每个fr中可以插入、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。优选地，抗体构建体中的氨基酸序列插入物包括与含有上百或更多个残基的多肽的在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基的长度范围内的氨基酸和/或羧基末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。相应的修饰也可以在本发明的抗体构建体的第三结构域内进行。本发明的抗体构建体的插入变体包括与酶的抗体构建体的n-末端或c-末端的融合物或与多肽的融合物。最感兴趣的置换诱变位点包括(但不限于)重链和/或轻链的cdr，特别是高变区，但也考虑重链和/或轻链中的fr改变。取代优选为如本文所述的保守取代。优选地，在cdr中可以取代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，而在框架区(fr)中可以取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。例如，如果cdr序列包含6个氨基酸，则设想这些氨基酸中的一个、两个或三个被取代。类似地，如果cdr序列包含15个氨基酸，则设想这些氨基酸中的一个、两个、三个、四个、五个或六个被取代。用于鉴定作为诱变优选位置的抗体构建体的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如cunningham和wells在science[科学],244:1081-1085(1989)中所述。此处，鉴定抗体构建体内的残基或靶残基基团(例如带电残基如arg、asp、his、lys和glu)，并将其用中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代以影响氨基酸与表位的相互作用。然后通过在取代位点处引入或针对取代位点引入另外或其他变体来改进证明对取代具有功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，尽管预先确定了用于引入氨基酸序列变异的位点或区域，但突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析或优化给定位点突变的性能，可以在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选表达的抗体构建体变体以获得所需活性的最佳组合。在具有已知序列的dna中的预定位点处进行取代突变的技术是熟知的，例如m13引物诱变和pcr诱变。使用抗原结合活性(例如靶细胞表面抗原或cd3结合)的测定进行突变体的筛选。通常，如果氨基酸在重链和/或轻链的一个或多个或所有cdr中被取代，则随后获得的“取代的”序列优选与“原始”cdr序列至少60％或65％、更优选70％或75％、甚至更优选80％或85％以及特别优选90％或95％相同。这意味着它与“取代的”序列相同的程度取决于cdr的长度。例如，具有5个氨基酸的cdr优选与其取代的序列80％相同，以具有至少一个氨基酸取代。因此，抗体构建体的cdr可以与它们的取代序列具有不同的一致性程度，例如cdrl1可以具有80％，而cdrl3可以具有90％。优选的取代(或替代)是保守取代。然而，如果抗体构建体保留其经由第一结构域结合靶细胞表面抗原以及经由第二结构域结合cd3(分别为cd3ε)的能力，和/或其cdr具有对于随后取代的序列的一致性(与“原始”cdr序列至少60％或65％、更优选70％或75％、甚至更优选80％或85％以及特别优选90％或95％相同)，则可以设想任何取代(包括非保守取代或来自下表3中列出的“示例性取代”中的一个或多个)。保守取代示于表3中“优选取代”标题下。如果这样的置换导致生物活性的变化，则可以将在表3中命名为“示例性取代”的、或如在下文进一步参考氨基酸类别所述的更多实质性改变引入，并且针对所需特征筛选产品。表3：氨基酸取代本发明的抗体构建体的生物学特性的实质性修改是通过选择取代来实现的，所述取代在其维持以下方面显著不同：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如作为片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的主体。基于共同的侧链特性将天然存在的残基分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；以及(6)芳香族：trp、tyr、phe。非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。任何不参与维持抗体构建体的适当构象的半胱氨酸残基可以通常被丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将半胱氨酸键添加至抗体中以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段如fv片段的情况下)。对于氨基酸序列，序列一致性和/或相似性通过使用本领域已知的标准技术测定，包括但不限于smith和waterman,1981,adv.appl.math.[应用数学进展]2:482的局部序列一致性算法、needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443的序列一致性比对算法、pearson和lipman,1988,proc.nat.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性搜索方法、这些算法的计算机实现(wisconsingeneticssoftwarepackage[威斯康辛州遗传学软件包],geneticscomputergroup[遗传学计算机组],575sciencedrive[科学驱动],madison,wis.中的gap、bestfit、fasta和tfasta)、devereux等人,1984,nucl.acidres.[核酸研究]12:387-395所述的最佳匹配序列算法，优选使用默认设置或通过检查。优选地，通过基于以下参数的fastdb计算一致性百分比：错配罚分1、空位罚分1、空位大小罚分0.33以及加入罚分30，“currentmethodsinsequencecomparisonandanalysis,”[目前序列比较和分析的方法]macromoleculesequencingandsynthesis[大分子测序和合成],selectedmethodsandapplications[选择的方法和应用],第127-149页(1988),alanr.liss公司。有用算法的实例是pileup。pileup使用渐进式双序列比对从一组相关序列创建多序列比对。它还可以绘制显示用于创建比对的聚类关系的树突。pileup使用feng和doolittle,1987,j.mol.evol.[分子进化杂志]35:351-360的渐进式比对方法的简化方法；该方法类似于higgins和sharp,1989,cabios5:151-153所述的方法。有用的pileup参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权末端空位。有用算法的另一个实例是blast算法，其描述在以下参考文献中：altschul等人,1990,j.mol.biol.[分子生物学杂志]215:403-410；altschul等人,1997,nucleicacidsres.[核酸研究]25:3389-3402；以及karin等人,1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊]90:5873-5787。特别有用的blast程序是wu-blast-2程序，其获自altschul等人,1996,methodsinenzymology[酶学方法]266:460-480。wu-blast-2使用多个搜索参数，其中大多数都设置为默认值。可调参数设置为以下值：重叠跨度＝1、重叠分数＝0.125、词阈值(t)＝ii。hsps和hsps2参数是动态值，并且由程序自身根据特定序列的组成和特定数据库(在其中搜索感兴趣的序列)的组成建立；但是可以调整这些值以增加灵敏度。另一种有用的算法是如altschul等人,1993,nucl.acidsres.[核酸研究]25:3389-3402所报道的有空位的blast。有空位的blast使用blosum-62取代得分呢；阈值t参数设定为9；触发无空位扩展的双击方法，将k的空位长度记为10+k；xu设定为16，xg在数据库搜索阶段设定为40且在算法的输出阶段设定为67。有空位的比对由对应于约22位的得分触发。通常，本文描述的序列的单独变体cdr或vh/vl序列之间的氨基酸同源性、相似性或一致性为至少60％，并且通常优选至少65％或70％的渐增的同源性或一致性，更优选至少75％或80％、甚至更优选85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及几乎100％。以类似的方式，相对于本文鉴定的结合蛋白的核酸序列的“核酸序列一致性百分比(％)”定义为候选序列中与抗体构建体的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。一种特定的方法利用设定为默认参数的wu-blast-2的blastn模块，其中重叠跨度和重叠分数分别设定为1和0.125。通常，编码单独变体cdr或vh/vl序列的核苷酸序列与本文描述的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或一致性为至少60％，并且更通常优选具有至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以及几乎100％的渐增的同源性或一致性。因此，“变体cdr”或“变体vh/vl区”与本发明的亲本cdr/vh/vl具有特定同源性、相似性或一致性，并且共有生物功能，包括但不限于亲本cdr或vh/vl的特异性和/或活性的至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施例中，根据本发明的抗体构建体的人种系的一致性百分比≥70％或≥75％、更优选≥80％或≥85％、甚至更优选≥90％以及最优选≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％或甚至≥96％。与人抗体种系基因产物的一致性被认为是降低治疗性蛋白质在治疗期间引起患者对药物的免疫应答风险的重要特征。hwang和foote(“immunogenicityofengineeredantibodies”[工程化抗体的免疫原性]；methods[方法]36(2005)3-10)表明药物抗体构建体的非人类部分的减少导致在治疗期间诱导患者中抗药物抗体的风险降低。通过比较详尽数量的临床评估的抗体药物和相应的免疫原性数据，趋势显示抗体v区的人源化使得蛋白质的免疫原性低于(平均5.1％的患者)携带未改变的非人v区的抗体(平均23.59％的患者)。因此，对于抗体构建体形式的基于v区的蛋白质治疗剂，期望具有与人序列的更高程度的一致性。为了确定种系一致性，vl的v区可以与使用载体nti软件的人种系v区段和j区段的氨基酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)和通过相同氨基酸残基除以vl的氨基酸残基总数再乘以百分数计算的氨基酸序列进行比对。对于vh区段(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)也是如此，不同之处在于vhcdr3可能由于其高度多样性和缺乏现有的人种系vhcdr3比对配偶体而被排除。然后可以使用重组技术增加与人抗体种系基因的序列一致性。在进一步实施例中，本发明的双特异性抗体构建体在标准研究规模条件下，例如在标准的两步纯化工艺中表现出高单体产量。优选地，根据本发明的抗体构建体的单体产量≥0.25mg/l上清液、更优选≥0.5mg/l、甚至更优选≥1mg/l以及最优选≥3mg/l上清液。同样地，可以确定二聚体抗体构建体同种型的产量，并且因此可以确定抗体构建体的单体百分比(即单体：(单体+二聚体))。单体和二聚体抗体构建体的生产力和计算的单体百分比可以例如在来自滚瓶中的标准化研究规模生产的培养上清液的sec纯化步骤中获得。在一个实施例中，抗体构建体的单体百分比≥80％、更优选≥85％、甚至更优选≥90％以及最优选≥95％。在一个实施例中，抗体构建体的优选血浆稳定性(具有血浆的ec50与没有血浆的ec50之比)≤5或≤4、更优选≤3.5或≤3、甚至更优选≤2.5或≤2以及最优选≤1.5或≤1。抗体构建体的血浆稳定性可以通过在37℃下将构建体在人血浆中孵育24小时，然后在51铬释放细胞毒性测定中进行ec50测定来测试。细胞毒性测定中的效应细胞可以是刺激的富集的人cd8阳性t细胞。靶细胞可以例如是用人靶细胞表面抗原转染的cho细胞。效应细胞与靶细胞(e:t)之比可以选择为10:1。用于此目的的人血浆库来源于通过edta包被的注射器收集的健康供体的血液。通过离心去除细胞组分，收集上层血浆相并随后合并。作为对照，在rpmi-1640培养基中的细胞毒性测定之前立即稀释抗体构建体。血浆稳定性计算为ec50(血浆孵育后)与ec50(对照)的比。此外，优选本发明抗体构建体的单体到二聚体的低转化率。可以在不同条件下测量转化率并通过高效尺寸排阻色谱法分析。例如，抗体构建体的单体同种型的孵育可以在培养箱中在37℃和例如100μg/ml或250μg/ml的浓度下进行7天。在这些条件下，优选本发明的抗体构建体显示二聚体百分比≤5％、更优选≤4％、甚至更优选≤3％、甚至更优选≤2.5％、甚至更优选≤2％、甚至更优选≤1.5％以及最优选≤1％或≤0.5％或甚至0％。还优选的是，本发明的双特异性抗体构建体在多次冷冻/解冻循环后呈现非常低的二聚体转化率。例如，将抗体构建体单体例如，在一般配制缓冲液中调节至250μg/ml的浓度，并进行三次冷冻/解冻循环(在-80℃下冷冻30min，然后在室温下解冻30min)，然后进行高效sec以确定已转化为二聚体抗体构建体的最初单体抗体构建体的百分比。优选地，双特异性抗体构建体的二聚体百分比≤5％、更优选≤4％、甚至更优选≤3％、甚至更优选≤2.5％、甚至更优选≤2％、甚至更优选≤1.5％以及最优选≤1％或甚至≤0.5％，例如在三次冷冻/解冻循环后。本发明的双特异性抗体构建体优选显示出良好的热稳定性，其中聚集温度45℃或≥50℃、更优选≥52℃或≥54℃、甚至更优选≥56℃或≥57℃以及最优选≥58℃或≥59℃。关于抗体聚集温度的热稳定性参数可以如下确定：将浓度为250μg/ml的抗体溶液转移至单次使用的比色杯中并置于动态光散射(dls)设备中。样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热至70℃，并持续获取测量的半径。表明蛋白质的熔化和聚集的半径的增加用于计算抗体的聚集温度。可替代地，熔化温度曲线可通过差示扫描量热法(dsc)测定，以测定抗体构建体的内在生物物理蛋白质稳定性。使用microcalllc(北安普顿，马萨诸塞州，美国)vp-dsc设备进行这些实验。与仅含有配制缓冲液的样品相比，含有抗体构建体的样品的能量吸收记录为20℃至90℃。将抗体构建体调节至例如在sec运行缓冲液中终浓度为250μg/ml。为了记录相应的熔化曲线，逐步增加整个样品温度。在每个温度下，记录样品和配制缓冲液参考的t能量吸收。将样品的能量吸收cp(kcal/mole/℃)减去参考值的差相对于各自的温度作图。熔化温度定义为第一个能量吸收最大值时的温度。还设想本发明的靶细胞表面抗原×cd3双特异性抗体构建体的浊度(在纯化的单体抗体构建体浓缩至2.5mg/ml并且过夜孵育后通过od340测量的)≤0.2、优选≤0.15、更优选≤0.12、甚至更优选≤0.1以及最优选≤0.08。在进一步实施例中，根据本发明的抗体构建体在生理或略低的ph下是稳定的，即约ph7.4至6.0。抗体构建体在非生理ph例如约ph6.0下表现得越耐受，从离子交换柱洗脱的抗体构建体相对于负载蛋白质的总量的回收率越高。在约ph6.0下来自离子(例如，阳离子)交换柱的抗体构建体的回收率优选≥30％、更优选≥40％、更优选≥50％、甚至更优选≥60％、甚至更优选≥70％、甚至更优选≥80％、甚至更优选≥90％、甚至更优选≥95％以及最优选≥99％。进一步设想本发明的双特异性抗体构建体显示出治疗功效或抗肿瘤活性。这可以例如在以下晚期人类肿瘤异种移植模型的实例中披露的研究中进行评估：技术人员了解如何修改或调整本研究的某些参数，如注射的肿瘤细胞的数量、注射部位、移植的人t细胞的数量、待给予的双特异性抗体构建体的量以及时间线，同时仍然获得有意义且可重现的结果。优选地，肿瘤生长抑制t/c[％]≤70或≤60、更优选≤50或≤40、甚至更优选≤30或≤20以及最优选≤10或≤5或甚至≤2.5。在本发明抗体构建体的优选实施例中，抗体构建体是单链抗体构建体。此外，在本发明抗体构建体的优选实施例中，所述第三结构域以氨基到羧基的顺序包含：铰链-ch2-ch3-接头-铰链-ch2-ch3。此外，在本发明的一个实施例中，第三结构域的一个或优选每个(两个)多肽单体的ch2结构域包含结构域内半胱氨酸二硫桥。如本领域所知，术语“半胱氨酸二硫桥”是指具有一般结构r–s–s–r的官能团。该连接也称为ss键或二硫键，并且通过半胱氨酸残基的两个硫醇基团偶联衍生。对于本发明的抗体构建体，特别优选将在成熟抗体构建体中形成半胱氨酸二硫桥的半胱氨酸引入对应于309和321(kabat编号)的ch2结构域的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中，去除ch2结构域的kabat位置314中的糖基化位点。优选通过n314x取代实现糖基化位点的去除，其中x是除q之外的任何氨基酸。所述取代优选为n314g取代。在更优选的实施例中，所述ch2结构域另外包含以下取代(根据kabat的位置)：v321c和r309c(这些取代在kabat位置309和321处引入结构域内半胱氨酸二硫键)。假定本发明的抗体构建体与例如本领域已知的双特异性异源fc抗体构建体(图1b)相比的优选特征可特别涉及在ch2结构域中引入上述修饰。因此，对于本发明的构建体，优选本发明的抗体构建体的第三结构域中的ch2结构域包含kabat位置309和321处的结构域内半胱氨酸二硫桥和/或kabat位置314处的糖基化位点如上所述通过n314x取代去除，优选通过n314g取代去除。在本发明的进一步优选的实施例中，本发明抗体构建体的第三结构域中的ch2结构域包含kabat位置309和321处的结构域内半胱氨酸二硫桥，并且kabat位置314处的糖基化位点通过n314g取代去除。在一个实施例中，本发明提供了抗体构建体，其中：(182)第一结构域包含两个抗体可变结构域，且第二结构域包含两个抗体可变结构域；(ii)第一结构域包含一个抗体可变结构域，且第二结构域包含两个抗体可变结构域；(iii)第一结构域包含两个抗体可变结构域，且第二结构域包含一个抗体可变结构域；或(iv)第一结构域包含一个抗体可变结构域，且第二结构域包含一个抗体可变结构域。因此，第一和第二结构域可以是各自包含两个抗体可变结构域如vh和vl结构域的结合结构域。这种结合结构域的实例包括两个上文所述的抗体可变结构域并且包括例如上文所述的fv片段、scfv片段或fab片段。可替代地，这些结合结构域中的一个或两个可以仅包含单个可变结构域。上文所述的这种单结构域结合结构域的实例包括例如纳米抗体或单可变结构域抗体，该纳米抗体或单可变结构域抗体仅包含一个可变结构域，其可以是独立于其他v区或结构域特异性地结合抗原或表位的vhh、vh或vl。在本发明抗体构建体的优选实施例中，第一和第二结构域通过肽接头与第三结构域融合。优选的肽接头已在上文描述，并且其特征在于氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser即gly4ser(seqidno:187)，或其聚合物即(gly4ser)x，其中x是1或更大的整数(例如2或3)。用于融合第一和第二结构域与第三结构域的特别优选的接头如seqidno:1所示。在优选的实施例中，本发明的抗体构建体的特征在于以氨基到羧基的顺序包含：(a)第一结构域；(b)肽接头，其具有选自由seqidno:187-189组成的组的氨基酸序列；i第二结构域；(d)肽接头，其具有选自由seqidno:187、188、189、195、196、197和198组成的组的氨基酸序列；i第三结构域的第一多肽单体；(f)肽接头，其具有选自由seqidno:191、192、193和194组成的组的氨基酸序列；以及(g)第三结构域的第二多肽单体。在本发明的一个方面，由第一结构域结合的靶细胞表面抗原是肿瘤抗原、对免疫疾病具有特异性的抗原或病毒抗原。如本文所用的术语“肿瘤抗原”可以理解为存在于肿瘤细胞上的那些抗原。这些抗原可以呈递在细胞表面的细胞外部分，其通常与分子的跨膜和细胞质部分组合。这些抗原有时只能由肿瘤细胞呈递，而不能由正常细胞呈递。与正常细胞相比，肿瘤抗原可以仅仅在肿瘤细胞上表达或者可能表示与正常细胞相比的肿瘤特异性突变。在这种情况下，它们被称为肿瘤特异性抗原。更常见的是由肿瘤细胞和正常细胞呈递的抗原，并且它们被称为肿瘤相关抗原。与正常细胞相比，这些肿瘤相关抗原可以过表达，或者由于与正常组织相比肿瘤组织的结构不那么紧密，因此肿瘤细胞中可出现抗体结合。本文使用的肿瘤抗原的非限制性实例是cdh19、msln、dll3、flt3、egfrviii、cd33、cd19、cd20、cd70、bcma和psma。在本发明的上下文中，对于免疫病症特异性的靶细胞表面抗原包括例如tl1a和tnf-α。所述靶标优选通过本发明的双特异性抗体构建体来解决，其优选为全长抗体。在非常优选的实施例中，本发明的抗体是异源igg抗体。在本发明抗体构建体的优选实施例中，肿瘤抗原选自由cdh19、msln、dll3、flt3、egfrviii、cd33、cd19、cd20、cd70、bcma和psma组成的组。在本发明的一个方面，抗体构建体以氨基到羧基的顺序包含：(a)第一结构域，其具有选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：seqidno:7、8、17、27、28、37、38、39、40、41、48、49、50、51、52、59、60、61、62、63、64、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、89、90、91、92、93、100、101、102、103、104、113、114、121、122,123、124、125、131、132、133、134、135、136、143、144、145、146、147、148、149、150、151、158、159、160、161、162、163、164、165、166、173、174、175、176、177、178、179、180、181(b)肽接头，其具有选自由seqidno:187-189组成的组的氨基酸序列；i第二结构域，其具有选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：wo2008/119567的seqidno:seqidno:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187或seqidno:202；(d)肽接头，其具有选自由seqidno:187、188、189、195、196、197和198组成的组的氨基酸序列；i第三结构域的第一多肽单体，其具有选自由wo2017/134140的seqidno:17-24组成的组的肽序列；(f)肽接头，其具有选自由seqidno:191、192、193和194组成的组的氨基酸序列；以及(g)第三结构域的第二多肽单体，其具有选自由wo2017/134140的seqidno:17-24组成的组的肽序列。在一个方面，本发明的双特异性抗体构建体的特征在于具有选自下组的氨基酸序列并且针对各自的靶细胞表面抗原，该组由以下组成：(a)seqidno:27、28、37至41；cd33(b)seqidno:48至52中的每一个；egfrviii(c)seqidno:59至64中的每一个；msln(d)seqidno:71至82中的每一个cdh19(e)seqidno:100至104中的每一个dll3(f)seqidno:7、8、17、113和114cd19(g)seqidno:89至93中的每一个flt3(h)seqidno:121至125中的每一个cdh3(i)seqidno:132至136中的每一个bcma以及(j)seqidno:143至151、158至166和173至181中的每一个psma本发明进一步提供了编码本发明抗体构建体的多核苷酸/核酸分子。多核苷酸是由13个或更多个在链中共价键合的核苷酸单体构成的生物聚合物。dna(如cdna)和rna(如mrna)是具有不同生物学功能的多核苷酸的实例。核苷酸是有机分子，其充当核酸分子如dna或rna的单体或亚基。核酸分子或多核苷酸可以是双链和单链、线性和环状。它优选包含在载体中，该载体优选包含在宿主细胞中。例如，所述宿主细胞在用本发明的载体或多核苷酸转化或转染后能够表达抗体构建体。为了这个目的，多核苷酸或核酸分子与控制序列可操作地连接。遗传密码是一组规则，通过这些规则将遗传物质(核酸)中编码的信息翻译成蛋白质。活细胞中的生物解码通过核糖体使用trna分子携带氨基酸并一次读取mrna三个核苷酸来实现，核糖体以mrna指定的顺序连接氨基酸。该密码规定了这些核苷酸三联体的序列(称为密码子)如何在蛋白质合成期间指定接下来将添加哪种氨基酸。除了一些例外，核酸序列中的三-核苷酸密码子指定单个氨基酸。因为绝大多数基因用完全相同的密码编码，所以这种特定密码通常被称为规范或标准遗传密码。虽然遗传密码决定了给定编码区的蛋白质序列，但其他基因组区域可以影响这些蛋白质的产生时间和地点。此外，本发明提供了包含本发明的多核苷酸/核酸分子的载体。载体是用作将(外源)遗传物质转移到细胞中的运载体的核酸分子。术语“载体”包括但不限于质粒、病毒、粘粒和人工染色体。一般而言，工程化载体包含复制的起点、多克隆位点和可选择标志物。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入片段(转基因)的dna序列和用作载体“骨架”的较大序列。现代载体可以包括除转基因插入片段和骨架之外的其他特征：启动子、基因标志物、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标记。称为表达载体(表达构建体)的载体特异性地用于在靶细胞中表达转基因，并且通常具有控制序列。术语“控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必需的dna序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合侧。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。当核酸被放置成与另一核酸序列有功能关系时，其为“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与多肽的dna可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合侧被定位以便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指被连接的dna序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读相。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点接合来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适配子或接头。“转染”是故意将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的工艺。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。转导通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及打开细胞膜中的瞬时孔或“洞”，以允许吸收物质。转染可以使用磷酸钙，通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与该物质混合以产生脂质体来进行，这些脂质体与细胞膜融合并将其载荷物沉积在其中。术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)非病毒转移至细菌中，以及非动物真核细胞(包括植物细胞)中。因此，转化是由于通过一个或多个细胞膜从其周围环境直接吸收并随后掺入外源遗传物质(核酸分子)而产生的细菌或非动物真核细胞的遗传改变。转化可以通过人工方式实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于能力状态，这可能是对环境条件如饥饿和细胞密度的时间限制性反应。此外，本发明提供了用多核苷酸/核酸分子或用本发明的载体转化或转染的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”或“受体细胞”旨在包括可以是或已经是载体、外源核酸分子和编码本发明的抗体构建体的多核苷酸的受体；和/或抗体构建体本身的受体的任何单独细胞或细胞培养物。通过转化、转染等方法将相应材料引入细胞中。术语“宿主细胞”还旨在包括单细胞的后代或潜在后代。由于后代可能会因自然、偶然或刻意突变或因环境影响而发生某些修饰，因此这种后代实际上可能与亲本细胞不完全相同(在形态或基因组或总dna补体中)，但仍包含在本文所用术语的范围内。合适的宿主细胞包括原核或真核细胞，并且还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞(如昆虫细胞和哺乳动物细胞(例如鼠、大鼠、猕猴或人))。本发明的抗体构建体可以在细菌中产生。表达后，将本发明的抗体构建体从可溶性级分中的大肠杆菌细胞糊中分离，并可通过例如亲和色谱法和/或尺寸排阻来纯化。最后的纯化可以类似于纯化例如在cho细胞中表达的抗体的工艺进行。除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是本发明抗体构建体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母或常见的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株通常可适用于且可用于本文，如粟酒裂殖酵母、克鲁维酵母属宿主(如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(atcc12424)、保加利亚克鲁维酵母(atcc16045)、k.wickeramii(atcc24178)、k.waltii(atcc56500)、k.drosophilarum(atcc36906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母)；耶氏酵母属(ep402226)；毕赤酵母(ep183070)；假丝酵母属；trichodermareesia(ep244234)；粗糙脉孢菌；许旺酵母属如许旺酵母；和丝状真菌如脉孢菌属、青霉菌属、弯颈霉属和曲霉属宿主(如构巢曲霉和黑曲霉)。用于表达本发明的糖基化抗体构建体的合适宿主细胞源自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及来自宿主的相应的许可性昆虫宿主细胞，宿主例如草地贪夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕。用于转染的多种病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾npv的l-1变体和家蚕npv的bm-5毒株，并且这些病毒在本文中可以根据本发明用作特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染的病毒。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见例如hiatt等人,nature[自然](1989)342:76-78、owen等人(1992)bio/technology[生物科技]10:790-794、artsaenko等人(1995)theplantj[植物学报]8:745-750以及fecker等人(1996)plantmolbiol[植物分子生物学]32:979-986。然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，并且脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由sv40转化的猴肾cv1细胞系(cos-7,atcccrl1651)；人胚胎肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，graham,j.genvirol.[普通病毒学杂志]36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(bhk,atccccl10)；中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr(cho,urlaub等人,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]77:4216(1980))；小鼠支持细胞(tm4,mather,biol.reprod.[生殖生物学]23:243-251(1980))；猴肾细胞(cviatccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76,atcccrl1587)；人宫颈癌细胞(hela,atccccl2)；犬肾细胞(mdck,atccccl34)；水牛大鼠肝细胞(brl3a,atcccrl1442)；人肺细胞(w138,atccccl75)；人肝细胞(hepg2,14138065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562,atccccl51)；tri细胞(mather等人,annalsn.yacad.sci.[纽约科学院年鉴](1982)383:44-68)；mrc5细胞；fs4细胞；和人肝癌细胞(hepg2)。在进一步实施例中，本发明提供了用于产生本发明抗体构建体的工艺，所述工艺包括在允许表达本发明抗体构建体的条件下培养本发明的宿主细胞，并从培养物中回收所产生的抗体构建体。如本文所用，术语“培养”是指细胞在合适条件下在培养基中的体外维持、分化、生长、增殖和/或繁殖。术语“表达”包括涉及产生本发明抗体构建体的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。当使用重组技术时，抗体构建体可以在细胞内、在周质空间中产生或直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生抗体构建体，那么作为第一步骤，例如通过离心或超滤来去除宿主细胞或溶解的片段的颗粒状碎片。carter等人,bio/technology[生物技术]10:163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的程序。简而言之，细胞糊在乙酸钠(ph3.5)、edta和苯甲基磺酰氟(pmsf)的存在下经约30分钟解冻。可以通过离心去除细胞碎片。在将该抗体分泌到培养基中的情况下，一般首先使用可商购的蛋白质浓缩过滤器，例如艾美康(amicon)或佩利康(milliporepellicon)超滤单元，对来自这些表达系统的上清液进行浓缩。蛋白酶抑制剂如pmsf可以包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。可以使用例如羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法回收或纯化由宿主细胞制备的本发明的抗体构建体。取决于有待回收的抗体，也可使用其他用于蛋白质纯化的技术，如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相hplc、在二氧化硅上进行色谱法、在肝素sepharosetm上进行的色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行的琼脂糖凝胶色谱法、68yophili-focusing、sds-page及硫酸铵沉淀。当本发明的抗体构建体包含ch3结构域时，bakerbondabx树脂(j.t.baker，新泽西菲利普斯堡)可用于纯化。亲和色谱法是优选的纯化技术。亲和配体所连接的基质通常是琼脂糖，但也可以使用其他基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质如受控制孔径的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可实现更快的流速和更短的加工时间。此外，本发明提供了药物化合物，其包含本发明的抗体构建体或根据本发明的工艺产生的抗体构建体。对于本发明的药物组合物，优选抗体构建体的同质性≥80％、更优选≥81％、≥82％、≥83％、≥84％或≥85％、进一步优选≥86％、≥87％、≥88％、≥89％或≥90％、更优选≥91％、≥92％、≥93％、≥94％或≥95％以及最优选≥96％、≥97％、≥98％或≥99％。如本文所用，术语“药物组合物”涉及适用于给予患者、优选人类患者的组合物。本发明特别优选的药物组合物优选以治疗有效量包含一种或多种的一个或多个本发明的抗体构建体。优选地，药物组合物进一步包含一种或多种(药学上有效的)载体、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的合适制剂。在所用的剂量和浓度下，组合物的可接受成分优选对受体无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。本发明的组合物可以包含药学上可接受的载体。一般而言，如本文所用，“药学上可接受的载体”意指任何和全部水性和非水性溶液、无菌溶液、溶剂、缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液)、水、悬浮液、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、脂质体、分散介质和涂层，它们与药物给予特别是与肠胃外给予相容。在药物组合物中使用这些介质和试剂是本领域熟知的，并且包含这些载体的组合物可以通过熟知的常规方法配制。某些实施例提供了包含本发明的抗体构建体和另外的一种或多种赋形剂(如本章节和本文其他地方说明性地描述的那些赋形剂)的药物组合物。赋形剂关于这一方面可在本发明中用于多种目的，如调节制剂的物理、化学或生物学特性(如调节粘度)，和或用于提高效力和或稳定这种制剂的工艺以及对抗由于例如在制造、运输、储存、使用前制备、给予及其后的工艺中发生的应力引起的降解和腐败的工艺。在某些实施例中，药物组合物可能含有用于以下目的的配制材料，即用于修改、维持或保留例如ph、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌、稳定性、溶解或释放速率、组合物的吸附或渗透(参见remington’spharmaceuticalsciences,18”edition[雷明顿药学大全，第18版],(a.r.genrmo,编辑),1990,麦克出版公司)。在这种实施例中，合适的配制材料可包括但不限于：·氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、2-苯丙氨酸，包括带电的氨基酸，优选赖氨酸、赖氨酸乙酸盐、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸·抗微生物剂，如抗细菌剂和抗真菌剂·抗氧化剂如抗坏血酸、甲硫氨酸、sodium69yophili或亚硫酸氢钠；·缓冲液、缓冲系统和缓冲剂，其用于将组合物维持在生理ph或略低的ph；缓冲液的实例是硼酸盐、碳酸氢盐、tris-hcl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸、琥珀酸盐、磷酸盐和组氨酸；例如，ph约7.0-8.5的tris缓冲液；·非水性溶剂如丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射用有机酯如油酸乙酯；·水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质；·可生物降解的聚合物如聚酯；·膨胀剂如甘露醇或甘氨酸；·螯合剂如乙二胺四乙酸(edta)；·等渗和吸收延迟剂；·络合剂如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)·填充剂；·单糖；双糖；和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可以是非还原糖，优选海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨醇或木糖醇；·(低分子量)蛋白质、多肽或蛋白质载体，如人或牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，优选人来源的；·着色剂和调味剂；·含硫还原剂，如谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、[α]-一硫代甘油和硫代硫酸钠·稀释剂；·乳化剂；·亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮·成盐抗衡离子如钠；·防腐剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等；实例是苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙基醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；·金属络合物如zn-蛋白质复合物；·溶剂和共溶剂(如70yophilis、丙二醇或聚乙二醇)；·糖和糖醇，如海藻糖、蔗糖、硫酸氢盐、甘露醇、山梨醇或木糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖，核糖、myoinisitose、半乳糖，乳糖醇、核糖醇、myoinisitol、半乳糖醇、甘油、环醇(如肌醇)、聚乙二醇；和多元糖醇；·悬浮剂；·表面活性剂或润湿剂如普朗尼克、peg、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、tyloxapal；表面活性剂可以是洗涤剂(优选具有分子量>1.2kd)和/或聚醚(优选具有分子量>3kd)；优选洗涤剂的非限制性实例是吐温20、吐温40、吐温60、吐温80和吐温85；优选聚醚的非限制性实例是peg3000、peg3350、peg4000和peg5000；·稳定性增强剂如蔗糖或山梨醇；·张力增强剂如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇、山梨醇；·肠胃外递送运载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油；·静脉内递送运载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)。对于本领域技术人员清楚的是，药物组合物的不同成分(例如，上面列出的那些)可以具有不同的作用，例如，氨基酸可以充当缓冲液、稳定剂和/或抗氧化剂；甘露醇可充当膨胀剂和/或张力增强剂；氯化钠可以充当递送运载体和/或张力增强剂；等等。设想本发明的组合物除了本文定义的本发明的多肽外，还可以根据该组合物的预期用途而包含其他生物活性剂。这些试剂可能是作用于胃肠道系统的药物、充当细胞抑制剂的药物、防止71yophilisatio的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎性反应的药物、作用于循环系统的药物和/或试剂如本领域已知的细胞因子。还设想本发明的抗体构建体应用于联合疗法中，即与另一种抗癌药物一起应用。在某些实施例中，最佳药物组成将由本领域技术人员根据例如给予的预期途径、递送形式和所需剂量来确定。参见例如，remington'spharmaceuticalsciences[雷明顿药学大全],同上。在某些实施例中，此类组合物可影响本发明抗体构建体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施例中，药物组合物中的主要运载体或载体可以是水性或非水性的。例如，合适的运载体或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，其可能补充有肠胃外给予组合物中常见的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性运载体。在某些实施例中，本发明组合物的抗体构建体可以通过将选择的具有所需纯度的组合物与任选的制剂(remington'spharmaceuticalsciences[雷明顿药学大全]，同上)以冻干饼或水溶液的形式混合来制备以供储存。此外，在某些实施例中，可以使用合适的赋形剂如蔗糖将本发明的抗体构建体配制成冻干物。当考虑肠胃外给予时，用于本发明的治疗组合物可以以包含本发明的所需抗体构建体的无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式提供于药学上可接受的运载体中。用于肠胃外注射的特别合适的运载体是无菌蒸馏水，在该无菌蒸馏水中将本发明的抗体构建体配制成适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施例中，该制备可以包括用试剂配制所需分子，该试剂如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体，它们可提供可经由积存注射递送的产品的控制释放或持续释放。在某些实施例中，也可以使用透明质酸，其具有促进在循环中的持续时间的作用。在某些实施例中，可植入的药物递送设备可用于引入所需的抗体构建体。其他药物组合物对于本领域技术人员来说是清楚的，包括将本发明的抗体构建体包含在持续或控制递送/释放制剂中的制剂。用于配制各种其他持续或控制递送方式(如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)的技术也是本领域技术人员已知的。参见例如，国际专利申请号pct/us93/00829，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制品可包括成形制品形式的半透性聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公开号ep058481中所披露的)、l-谷氨酸和γ-乙基-l-谷氨酸的共聚物(sidman等人,1983,biopolymers[生物聚合物]2:547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(langer等人,1981,j.biomed.mater.res.[生物医学研究杂志]15:167-277和langer,1982,chem.tech.[化学技术]12:98-105)、乙酸醋酸乙烯酯(langer等人,1981,同上)或聚-d(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开号ep133,988)。持续释放组合物还可包括可通过本领域已知的几种方法中的任一种制备的脂质体。参见例如，eppstein等人,1985,proc.natl.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊]82:3688-3692；欧洲专利申请公开号ep036,676、ep088,046和ep143,949。该抗体构建体也可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合反应包入在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或72yophil-微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中。这些技术披露于remington’spharmaceuticalsciences,16thedition[雷明顿药学大全，第16版],oslo,a.,编辑,(1980)。用于体内给予的药物组合物通常作为无菌制品提供。灭菌可以通过经由无菌滤膜的过滤来完成。在该组合物是冻干的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用该方法进行灭菌。用于肠胃外给予的组合物可以以冻干形式或以溶液储存。肠胃外组合物通常置于具有无菌进入口的容器中，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。本发明的另一方面包括本发明制剂的自缓冲抗体构建体，其如国际专利申请wo06138181a2(pct/us2006/022599)中所述可用作药物组合物。关于在这方面有用的蛋白质稳定和配制材料以及方法，可以获得各种各样的说明，如arakawa等人,“solventinteractionsinpharmaceuticalformulations,”[药物制剂中的溶剂相互作用]pharmres.[药学研究]8(3):285-91(1991)；kendrick等人,“physicalstabilizationofproteinsinaqueoussolution”[蛋白质在水溶液中的物理稳定],rationaldesignofstableproteinformulations:theoryandpractice[稳定的蛋白质制剂的合理设计：理论与实践],carpenterandmanning,编辑pharmaceuticalbiotechnology[药物生物技术].13:61-84(2002)以及randolph等人,“surfactant-proteininteractions”[表面活性剂蛋白质相互作用],pharmbiotechnol.[药物生物技术]13:159-75(2002)，特别参见关于根据本发明的自缓冲蛋白质制剂的相同赋形剂和方法的部分，尤其是关于兽医和/或人类医学用途的蛋白质药物产品和方法。根据本发明的某些实施例盐类可用于例如调节制剂的离子强度和/或等渗性和/或改善蛋白质或根据本发明的组合物的其他成分的溶解性和/或物理稳定性。众所周知，离子可以通过与蛋白质表面上的带电残基结合以及通过屏蔽蛋白质中的带电和极性基团并降低其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通过结合特别是蛋白质的变性肽键(-conh)来稳定蛋白质的变性状态。此外，离子与蛋白质中带电和极性基团的相互作用还可以减少分子间静电相互作用，从而防止或减少蛋白质聚集和不溶性。离子种类对蛋白质的影响差异很大。已经开发了离子及其对蛋白质的影响的许多分类排名，所述蛋白质可用于配制根据本发明的药物组合物。一个实例是hofmeister系列，其通过离子和极性非离子溶质对溶液中蛋白质的构象稳定性的影响对该离子和极性非离子溶质进行排名。稳定性溶质被称为“亲液的(kosmotropic)”。去稳定性溶质被称为“离液的(chaotropic)”。亲液剂通常以高浓度(例如>1摩尔硫酸铵)使用以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。离液剂通常用于变性和/或溶解蛋白质(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性定义了它们在hofmeister系列中的位置。根据本发明的各种实施例，游离氨基酸作为填充剂、稳定剂和抗氧化剂以及其他标准用途可用于本发明制剂的抗体构建体中。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定制剂中的蛋白质。甘氨酸可用于冷冻干燥以确保恰当的饼结构和特性。在液体和冻干制剂中，精氨酸可用于抑制蛋白质聚集。甲硫氨酸可用作抗氧化剂。多元醇包括糖(例如甘露醇、蔗糖和山梨醇)和多羟基醇(例如甘油和丙二醇)以及出于本文讨论的目的，包括聚乙二醇(peg)和相关物质)。多元醇是亲液的。它们是液体和冻干制剂中有用的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的影响。多元醇也可用于调节制剂的张力。可用于本发明的选择实施例的多元醇是甘露醇，其通常用于确保冻干制剂中饼的结构稳定性。它确保了对于饼的结构稳定性。甘露醇通常与冻干保护剂一起使用，例如蔗糖。山梨醇和蔗糖是用于调节张力的优选试剂并且用作在运输期间或制造工艺期间制备散剂期间防止冻融应力的稳定剂。还原糖(其含有游离醛或酮基团)如葡萄糖和乳糖可以74yophili表面赖氨酸和精氨酸残基。因此，它们通常不是根据本发明使用的优选多元醇。此外，形成这种反应性种类的糖如蔗糖在酸性条件下水解成果糖和葡萄糖并因此产生糖化，这种糖在这一方面也不是本发明优选的多元醇。peg可用于稳定蛋白质和用作冷冻保护剂，并且在这一方面可用于本发明。本发明制剂的抗体构建体的实施例进一步包含表面活性剂。蛋白质分子可能易于在表面上吸附并且易于在气-液、固-液和液-液界面处变性和随后聚集。这些效应通常与蛋白质浓度成反比。这些有害的相互作用通常与蛋白质浓度成反比，并且通常通过物理搅动(如在运输和处理产品的过程产生的物理搅动)加剧。表面活性剂通常用于防止、最小化或减少表面吸附。在这一方面，本发明中有用的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯和泊洛沙姆188。表面活性剂也常用于控制蛋白质构象稳定性。在这一方面，表面活性剂的使用是蛋白质特异性的，因为任何给定的表面活性剂通常会稳定一些蛋白质而使其他蛋白质不稳定。聚山梨醇酯易受氧化降解的影响，并且通常如所提供的含有足够量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链(尤其是甲硫氨酸)的氧化。因此，应小心使用聚山梨醇酯，使用时应使用最低有效浓度。在这一方面，聚山梨醇酯例证了赋形剂应以其最低有效浓度使用的一般规则。本发明制剂的抗体构建体的实施例进一步包含一种或多种抗氧化剂。在一定程度上，通过维持适当水平的环境氧和温度并避免光照，可以防止药物制剂中蛋白质的有害氧化。抗氧化赋形剂也可用于防止蛋白质的氧化降解。在这一方面，有用的抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质制剂的抗氧化剂优选为水溶性的并且在产品的整个保质期内保持其活性。在这一方面，edta是根据本发明的优选抗氧化剂。抗氧化剂可以破坏蛋白质。例如，还原剂如谷胱甘肽特别可以破坏分子内二硫连接。因此，用于本发明的抗氧化剂除其他方面外被选择用于消除或充分降低它们自身损害制剂中蛋白质的可能性。根据本发明的制剂可包含金属离子，其是蛋白质辅因子并且是形成蛋白质配位络合物所必需的，如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子也可以抑制一些降解蛋白质的过程。然而，金属离子也催化降解蛋白质的物理和化学过程。镁离子(10-120mm)可用于抑制天冬氨酸异构化为异天冬氨酸。ca+2离子(高达100mm)可以增加人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，mg+2、mn+2和zn+2可使rhdnase不稳定。类似地，ca+2和sr+2可以稳定因子viii，它可以被mg+2、mn+2和zn+2、cu+2和fe+2去稳定化，并且该稳定因子的聚集可以通过al+3离子强化。本发明制剂的抗体构建体的实施例进一步包含一种或多种防腐剂。当开发涉及从同一容器中多于一次取出的多剂量肠胃外制剂时，防腐剂是必需的。它们的主要功能是在药物产品的整个保质期或使用期限内抑制微生物生长并确保产品无菌。常用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。虽然防腐剂与小分子肠胃外药物一起使用已经很长的历史，但包含防腐剂的蛋白质制剂的开发可能具有挑战性。防腐剂几乎总是对蛋白质具有不稳定作用(聚集)，并且这已经成为限制它们在多剂量蛋白质制剂中的使用的主要因素。迄今为止，大多数蛋白质药物仅配制成一次性使用。然而，当多剂量制剂成为可能时，它们具有使患者方便和增加适销性的附加优点。一个很好的实例是人类生长激素(hgh)的防腐剂，其中保存制剂的开发已导致更方便、多用途的注射笔呈现的商业化。目前市场上可提供至少四种含有保存的hgh制剂的这种笔设备。norditropin(液体，诺和诺德公司)、nutropinaq(液体，基因泰克公司)和genotropin(冻干双腔盒，法玛西亚普强公司)含有苯酚，而somatrope(礼来公司)用间甲酚配制。在保存剂型的配制和开发过程中需要考虑几个方面。必须优化药物产品中的有效防腐剂浓度。这需要在剂型中测试给定防腐剂的浓度范围，该防腐剂的浓度范围赋予了抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性。如可以预期的，含有防腐剂的液体制剂的开发比冻干制剂更具挑战性。冷冻干燥的产品可以在没有防腐剂的情况下冻干，并在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，从而显著降低了相关的稳定性风险。在液体制剂的情况下，防腐剂的有效性和稳定性应在整个产品保质期(约18至24个月)内保持。需要注意的一点是，防腐剂的有效性应该在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中证实。本文披露的抗体构建体也可以配制为76yophi-脂质体。“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的小囊泡，其可用于将药物递送至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。含有抗体构建体的脂质体通过本领域已知的方法制备，如epstein等人,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊],82:3688(1985)；hwang等人,proc.natlacad.sci.usa[美国国家科学院院刊],77:4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；以及w097/38731中描述的方法。具有增加的循环时间的脂质体在美国专利号5,013,556中披露。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发方法用包括磷脂酰胆碱、胆固醇、以及peg衍生化磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂类组合物来产生。使脂质体挤出通过具有限定孔径的滤器以产生具有所希望的直径的脂质体。本发明的抗体构建体的fab'片段可以与如martin等人j.biol.chem.[生物化学杂志]257:286-288(1982)中所述的脂质体经由二硫化物互换反应缀和。化学治疗剂任选地包含在脂质体内。参见gabizon等人j.nationalcancerinst.[国家癌症研究所杂志]81(19)1484(1989)。一旦配制好药物组合物，它可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类制剂可以以即用形式或以在给予之前重构的形式(例如，冻干的)储存。本文定义的药物组合物的生物活性可以例如通过如wo99/54440中或schlereth等人(cancerimmunol.immunother.[癌症免疫学与免疫治疗]20(2005),1-12)在以下实例中所述的细胞毒性测定来确定。如本文所用的“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化的nci反应标准的对本发明的药物组合物的疗法的反应。使用本发明的药物组合物的疗法的成功或体内功效是指组合物对其预期目的的有效性，即组合物产生其所需效果的能力，即病理细胞例如肿瘤细胞的耗竭。可以通过针对各个疾病实体的已建立的标准方法监测体内功效，所述标准方法包括但不限于白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选、骨髓抽吸。此外，可以使用各种疾病特异性临床化学参数和其他已建立的标准方法。此外，可以使用计算机辅助断层摄影、x射线、核磁共振断层摄影(例如用于基于国家癌症研究所标准的反应评估[chesonbd,horningsj,coiffierb,shippma,fisherri,connorsjm,listerta,vosej,grillo-lopeza,hagenbeeka,cabanillasf,klippenstend,hiddemannw,castellinor,harrisnl,armitagejo,carterw,hopper,canellosgp.reportofaninternationalworkshoptostandardizeresponsecriteriafornon-hodgkin’slymphomas.[标准化非霍奇金淋巴瘤的反应标准的国际研讨会报告]ncisponsoredinternationalworkinggroup.[nci赞助的国际工作小组]jclinoncol.[临床肿瘤学杂志]1999年4月；17(4):1244])、正电子发射断层摄影扫描、白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选、骨髓抽吸、淋巴结活检/组织学以及各种淋巴瘤特异性临床化学参数(例如乳酸脱氢酶)以及其他已建立的标准方法。开发药物如本发明的药物组合物的另一个主要挑战是药代动力学特性的可预测的调节。为此，可以建立药物候选物的药代动力学曲线，即影响特定药物治疗给定病况的能力的药代动力学参数的曲线。影响药物治疗某种疾病实体的能力的药物的药代动力学参数包括但不限于半衰期、分布体积、肝脏首过代谢和血清结合程度。给定药物试剂的功效可受上述每个参数的影响。具有特定fc形式的本发明抗体构建体的设想特征是它们包括例如药代动力学行为的差异。与“经典”非hle形式的所述抗体构建体相比，根据本发明的半衰期延长的靶向抗体构建体优选地显示出出人意料地增加的体内停留时间。“半衰期”意指50％的给予药物通过生物工艺(例如代谢、排泄等)消除的时间。“肝脏首过代谢”意指药物在首次与肝脏接触时即在其首次通过肝脏期间代谢的倾向。“分布体积”意指药物在身体的全部各个隔室(例如细胞内和细胞外空间、组织和器官等)中的保留程度以及药物在这些隔室内的分布。“血清结合程度”意指药物与血清蛋白如白蛋白相互作用和结合从而导致药物生物活性的降低或丧失的倾向。药代动力学参数还包括给予的给定量的药物的生物利用度、滞后时间(tlag)、tmax、吸收率、更多的起效和/或cmax。“生物利用度”意指血液隔室中药物的量。“滞后时间”意指药物的给予与其在血液或血浆中的检测和可测量性之间的时间延迟。“tmax”是达到药物的最大血液浓度后的时间，且“cmax”是给定药物最大程度地获得的血液浓度。达到其生物效应所需的药物的血液或组织浓度的时间受所有参数的影响。显示出跨物种特异性的双特异性抗体构建体的药代动力学参数也描述在例如schlereth等人的出版物(cancerimmunol.immunother.[癌症免疫学与免疫疗法]20(2005),1-12)中，所述药代动力学参数可以在如上所述的非黑猩猩灵长类动物的临床前动物实验中测定。在本发明的优选方面，药物组合物在约-20℃下稳定至少四周。从所附实例中清楚的是，可以使用不同的系统测试本发明的抗体构建体的质量与相应的现有抗体构建体的质量。这些测试被理解为符合“ichharmonisedtripartiteguideline:stabilitytestingofbiotechnological/biologicalproductsq5c[ich协调三方指南：生物技术/生物产品q5c的稳定性测试]和specifications:testproceduresandacceptancecriteriaforbiotechbiotechnological/biologicalproductsq6b[说明：biotech生物技术/生物产品q6b的测试程序和验收标准]”，并因此被选择用于提供稳定性指示曲线，该曲线提供检测到产品的特性、纯度和效力变化的确定性。人们普遍认为术语纯度是一个相对术语。由于糖基化、脱酰胺化或其他异质性的影响，生物技术/生物产品的绝对纯度通常应通过多于一种方法评估，并且得到的纯度值取决于方法。出于稳定性测试的目的，纯度测试应集中于测定降解产品的方法。为了评估包含本发明的抗体构建体的药物组合物的质量，可以通过分析溶液中可溶性聚集体的含量来进行分析(每次尺寸排阻的hmws)。在约-20℃下至少四周的稳定性的特征优选在于小于1.5％hmws的含量，优选小于1％hmws。本文优选的产品质量分析方法是尺寸排阻高效液相色谱法(se-hplc)。se-hplc通常使用尺寸排阻柱和uhplc系统进行，例如watersbeh200尺寸排阻柱(4.6x150mm,1.7μm)和watersuhplc系统。将蛋白质样品纯净地注射并使用例如含有nacl盐的磷酸盐缓冲液在例如0.4ml/min的流速下等度地分离(流动相为ph6.8下的100mm磷酸钠、250mmnacl)，并通过在280nm处的uv吸光度监测洗脱液。通常，加载约6μg的样品。在cm工艺开始之前，通常将含有表达双特异性抗体构建体的cho细胞的小瓶解冻。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于灌注生产生物反应器(例如10l或50l规模或更大)。一旦将细胞以本文规定的浓度范围接种到生产生物反应器中，存在持续数天的初始细胞生长阶段，通常为约7至28天，以使细胞密度和生物量增加至本文所述和通过电容探针(hamiltonbonaduzag，瑞士)所测量的优选设定点。将生产生物反应器控制在优选的ph(通常为约6至7.4，例如ph6.85)，例如64mmhg的溶解氧和约36℃下。在细胞生长阶段数天后，通常在第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天或第10天，优选第4天，使用具有过滤器如聚醚砜0.2-μm过滤器(例如通用电气医疗集团，匹兹堡，宾夕法尼亚州)的交替切向流(atf)过滤系统(例如，改进技术公司(refinetechnologies)，新泽西汉诺威)和专有化学成分确知的灌注培养基在本文所述的vvd灌注速率下例如在0.4生物反应器vvd灌注速率下开始灌注培养。灌注速率通常逐渐增加，例如从第4天的0.4vvd增加至第12天的2vvd。一旦在逐渐增加vvd的最后一天达到生物量设定点，通常将细胞培养温度降低至例如33.5℃，开始收集hccf(即，含有双特异性抗体构建体的无细胞渗透物)，并且通过以设定的灌注速率(通常为逐渐增加所达到的最高vvd灌注速率(即稳定状态细胞特异性灌注速率cspr，例如0.02-0.03nl/细胞-天))进料并排出额外细胞以维持优选的生物量设定点，灌注培养如本文所述持续一段时间，例如另外持续至少7、14、28或40天，优选至少28天。通常在整个培养持续时间内测量细胞密度(通过cdv(例如诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)测量)、代谢物(例如通过novaflex(诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)测量)和渗透物滴度(通过hplc分析测量)。优选在室温下连续地或以例如6、12、24、48、72、96、120或144小时的增量收集hccf，并加工用于蛋白质l捕获色谱法。例如对在第26、27、34、40天来自蛋白质-l的洗脱液使用分析型阳离子交换色谱法(cex-hplc)、肽图谱和/或hcpelisa分析产品质量属性和与工艺相关的杂质。用于化学修饰的胰蛋白酶消化肽图谱双特异性抗体构建体蛋白质样品采用基于过滤器的方法使用例如milliporemicrocon30k设备进行消化。将蛋白质样品添加到过滤器上，离心去除样品基质，然后在例如含有甲硫氨酸的6m盐酸胍(guhcl)(例如赛默飞世尔科技公司，罗克福德，伊利诺伊州)缓冲液中变性，用例如500mm二硫苏糖醇(dtt)(例如sigma-aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)在例如37℃下还原30min，并随后通过在室温下黑暗中与例如500mm碘乙酸(iaa)(例如sigma-aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)孵育例如20min来进行烷基化。通过添加dtt淬灭未反应的iaa。上述所有步骤均在过滤器上进行。随后通过离心将样品缓冲更换为消化缓冲液(例如ph7.8的含有甲硫氨酸的50mmtris)以去除任何残留的dtt和iaa。胰蛋白酶消化使用1:20(w/w)的酶与蛋白质的比率在过滤器上37℃下进行例如1hr。通过离心收集消化混合物，然后例如通过在ph4.7的乙酸盐缓冲液中加入8mguhcl淬灭。液相色谱-质谱(lc-ms)分析使用直接与质谱仪(例如thermoscientificq-exactive)偶联的超高效液相色谱(uplc)系统例如thermou-3000进行。使用agilentzorbaxc18rrhd柱(2.1×150mm，1.8μm)通过反相分离蛋白质消化物，其中柱温保持在50℃。流动相a由在水中的0.020％(v/v)甲酸(fa)组成，且流动相b为在乙腈(i)中的0.018％(v/v)fa。将约5μg消化的双特异性抗体构建体注射至柱。使用梯度(例如经145min从0.5％至36％b)在例如0.2ml/min的流速下分离肽。通过ms监测洗脱的肽。对于肽鉴定和修饰分析，通常使用数据依赖性串联ms(ms/ms)实验。通常获取例如在正离子模式下从200到2000m/z的完整扫描，然后进行例如6个数据依赖性ms/ms扫描以鉴定肽的序列。定量基于使用以下等式的所选离子监测的质谱数据：其中修饰％是修饰肽的水平，a修饰是修饰肽的提取离子色谱图面积，a未修饰是未修饰肽的提取离子色谱图面积。宿主细胞蛋白(hcp)elisa将微量滴定板用兔抗hcp免疫球蛋白g(igg)(安进公司，内部抗体)包被。在洗涤并封闭板后，将测试样品、对照和hcp校准标准品加入板中并孵育。从板上洗去未结合的蛋白质，并将合并的兔抗hcpigg生物素(安进公司，内部抗体)加入板中并孵育。在又一次洗涤后，将streptavidintm辣根过氧化物酶缀合物(hrp缀合物)(例如amersham-ge，白金汉郡，英国)加入板中并孵育。最后一次洗涤板，并将显色底物四甲基联苯胺(tmb)(例如kirkegaardandperrylaboratories，盖瑟斯堡，马里兰州)加入板中。用1m磷酸抑制显色，并用分光光度计测量光密度。作为药物组合物的抗体构建体的优选制剂可以例如包含如下所述的制剂组分：·制剂：ph6.0下的磷酸钾、l-精氨酸盐酸盐、海藻糖、聚山梨醇酯80在所附的实例4-12中提供了评估在药物组合物形式中的本发明抗体构建体的稳定性的其他实例。在那些实例中，针对不同药物制剂中的不同应激条件测试本发明抗体构建体的实施例，并将结果与本领域已知的双特异性t细胞衔接抗体构建体的其他半衰期延长(hle)形式进行比较。一般而言，设想与具有不同hle形式和不具有任何hle形式的抗体构建体相比，具有根据本发明的特定fc形式的抗体构建体通常均在广泛范围的应激条件(如温度和光应激)下更稳定。所述温度稳定性可能与降低(低于室温，包括冷冻)和增加(高于室温，包括高达或高于体温的温度)的温度有关。如本领域技术人员将认识到的，在临床实践中难以避免的这种改善的关于应激的稳定性使得抗体构建体更安全，因为在临床实践中将出现较少的降解产物。因此，所述增加的稳定性意味着增加的安全性。一个实施例提供本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体，以用于预防、治疗或改善增殖性疾病、肿瘤疾病、病毒性疾病或免疫病症。本文所述的制剂可用作在有需要的患者中治疗、改善和/或预防本文所述病理医学病况的药物组合物。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施。治疗包括将制剂应用或给予至来自具有疾病/病症、疾病/病症的症状或对疾病/病症的倾向的患者的身体、分离的组织或细胞，目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、减轻、改善或影响疾病、疾病的症状或向疾病的倾向。如本文所用的术语“减轻”是指通过向有需要的受试者给予根据本发明的抗体构建体，对患有如本文所述的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者的疾病状态的任何改善。这种改善还可以被视为减缓或停止患者的肿瘤或癌症或转移性癌症的进展。本文所用的术语“预防”意指通过向有需要的受试者给予根据本发明的抗体构建体，避免患有如下文所述的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者的发病或复发。术语“疾病”是指将受益于用本文所述的抗体构建体或药物组合物治疗的任何病况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论的疾病的那些病理状况。“赘生物”是组织的异常生长，通常但不总是形成肿块。当还形成肿块时，通常将其称为“肿瘤”。赘生物或肿瘤或可以是良性的、潜在恶性(癌前)或恶性的。恶性肿瘤通常被称为癌症。它们通常侵入并破坏周围组织并可形成转移瘤，即它们扩散到身体的其他部位、组织或器官。因此，术语“转移癌”包括原始肿瘤之外的其他组织或器官的转移瘤。淋巴瘤和白血病是淋巴样肿瘤。出于本发明的目的，它们也包括由术语“肿瘤”或“癌症”涵盖。术语“病毒性疾病”描述了疾病，其是受试者的病毒感染的结果。如本文所用的术语“免疫病症”根据该术语的常见定义描述免疫病症，如自身免疫疾病、过敏症、免疫缺陷。在一个实施例中，本发明提供了治疗或改善增殖性疾病、肿瘤性疾病、病毒性疾病或免疫病症的方法，包括向有需要的受试者给予本发明或根据本发明的工艺产生的抗体构建体的步骤。术语“有需要的受试者”或“需要治疗”的那些术语包括已经患有该病症的那些受试者，以及要预防该病症的那些受试者。有需要的受试者或“患者”包括接受预防性或治疗性处理的人和其他哺乳动物受试者。本发明的抗体构建体通常以生物利用度和持久性的范围等被设计用于特定的给予途径和方法、特定的给予剂量和频率、特定疾病的特定治疗。组合物的材料优选以给予部位可接受的浓度配制。因此，可以根据本发明设计制剂和组合物用于通过任何合适的给予途径递送。在本发明的上下文中，给予途径包括但不限于·局部途径(如表皮、吸入、鼻腔、83yophilisa、耳(auricular/aural)、阴道、粘膜)；·肠内途径(如口服、胃肠道、舌下，唇下、口腔、直肠)；以及·肠胃外途径(如静脉内、动脉内、骨内、肌肉内、脑内、脑室内、硬膜外、鞘内、皮下、腹膜内、羊膜外、关节内、心内、真皮内、病灶内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、透皮、鼻内、经粘膜、滑膜内、管腔内)。本发明的药物组合物和抗体构建体特别适用于肠胃外给药，例如皮下或静脉内递送，例如通过注射如弹丸注射或通过输注如连续输注。可以使用医疗设备给予药物组合物。用于给予药物组合物的医疗设备的实例描述于美国专利号4,475,196、4,439,196、4,447,224、4,447,233、4,486,194、4,487,603、4,596,556、4,790,824、4,941,880、5,064,413、5,312,335、5,312,335、5,383,851和5,399,163。特别地，本发明提供了合适组合物的不间断给予。作为非限制性实例，不间断或基本上不间断的，即连续的给予可以通过患者佩戴的用于计量流入患者体内的治疗剂的小泵系统实现。包含本发明的抗体构建体的药物组合物可以通过使用所述泵系统给予。这种泵系统在本领域中通常是已知的，并且通常依赖于含有待输注的治疗剂的药筒的定期更换。当在这种泵系统中更换药筒时，治疗剂不间断流入患者体内可能会发生暂时中断。在这种情况下，在更换药筒之前的给予阶段和更换药筒之后的给予阶段仍将被认为是在本发明的药学手段和方法的含义内，其共同构成这种治疗剂的一种“不间断的给予”。本发明的抗体构建体的可以通过流体递送设备或小泵系统来静脉内或皮下连续或不间断给予，所述流体递送设备或小泵系统包括用于驱动流体离开储器的流体驱动机构和用于驱使驱动机构的驱使机构。用于皮下给予的泵系统可包括用于穿透患者皮肤并将合适的组合物递送到患者体内的针或套管。所述泵系统可以独立于静脉、动脉或血管直接固定或连接至患者的皮肤，从而允许泵系统与患者皮肤之间的直接接触。泵系统可以连接至患者的皮肤上24小时至数天。泵系统可以是小尺寸的，其中储器适用于小体积。作为非限制性实例，待给予的合适药物组合物的储器的体积可以为0.1至50ml。连续给予也可以通过佩戴在皮肤上的贴剂进行透皮给予，并且每隔一段时间更换一次。本领域技术人员了解适用于该目的的用于药物递送的贴剂系统。值得注意的是，透皮给予尤其适用于不间断的给予，因为第一次耗尽的贴剂的更换可以有利地与例如在紧邻第一次耗尽的贴剂的皮肤表面上放置新的第二贴剂同时地且在去除第一次耗尽的贴剂之前立即完成。不会出现流量中断或电池故障的问题。如果药物组合物已经冻干，则冻干材料首先在给予之前在合适的液体中重构。冻干的材料可以在例如抑菌性注射用水(bwfi)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)或蛋白质在冻干之前所存在的相同制剂中重构。本发明的组合物可以以合适的剂量给予受试者，所述合适的剂量可以例如通过给予渐增剂量的本发明的抗体构建体(其显示出对于非黑猩猩灵长类动物例如猕猴的跨物种特异性)的剂量递增研究来确定。如上所述，显示出本文所述的跨物种特异性的本发明的抗体构建体可有利地以相同形式用于非黑猩猩灵长类动物的临床前试验中以及作为药物用于人类。剂量方案将由主治医师和临床因素确定。如在医学领域中熟知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给予的时间和途径、一般健康状况以及同时给予的其他药物。术语“有效剂量”(“effectivedose”或“effectivedosage”)定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以在已经患有该疾病的患者中治疗或至少部分地阻止疾病及其并发症的量。对此用途有效的量或剂量将取决于待治疗的病况(适应症)、递送的抗体构建体、治疗背景和目标、疾病的严重程度、在先疗法、患者的临床病史和对治疗剂的反应、给予的途径、患者的体型(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康)以及患者自身免疫系统的一般状态。可以根据主治医师的判断调整适当的剂量，使得其可以向患者一次给予或经一系列给药进行给予，并且目的是获得最佳治疗效果。根据上述因素，典型的剂量可以为约0.1μg/kg至最高约30mg/kg或更高。在特定的实施例中，剂量可以为1.0μg/kg至约20mg/kg，任选10μg/kg至约10mg/kg或100μg/kg至约5mg/kg。治疗有效量的本发明的抗体构建体优选导致疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率或持续时间增加或预防由于疾病痛苦引起的损伤或残疾。对于治疗表达靶细胞抗原的肿瘤，治疗有效量的本发明的抗体构建体例如抗靶细胞抗原/抗cd3抗体构建体优选将相对于未治疗的患者抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可以在预测功效的动物模型中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。药物组合物可以作为唯一的治疗剂给予，或者根据需要与其他疗法如抗癌疗法(例如其他蛋白质和非蛋白质药物)一起给予。这些药物可以与包含本文所定义的本发明的抗体构建体的组合物同时给予，或者在给予所述抗体构建体之前或之后分别以时间限定的间隔和剂量给予。如本文所用的术语“有效和无毒剂量”是指耐受剂量的本发明抗体构建体，其足够高以引起病理细胞耗竭、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定而不具有或本质上不具有主要毒性作用。这样的有效和无毒剂量可以例如通过本领域描述的剂量递增研究来确定，并且该有效和无毒剂量应低于诱导严重不良事件的剂量(剂量限制性毒性，dlt)。如本文所用的术语“毒性”是指在不良事件或严重不良事件中表现的药物的毒性作用。这些副作用可能是指给予后药物通常缺乏耐受性和/或缺乏局部耐受性。毒性可能还包括由药物引起的致畸或致癌作用。本文所用的术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义了在给予后没有立即引起严重不良事件(局部耐受)和在较长的用药期间不引起严重不良事件的情况下药物的给予。可以例如在治疗期间和随访期间定期评估“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”。测量包括临床评估(例如器官表现)和实验室异常筛查。可以进行临床评估，并根据nci-ctc和/或meddra标准记录/编码与正常发现的偏差。器官表现可包括诸如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝血等标准，如例如在不良事件的通用术语标准v3.0(ctcae)中所述。可以测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血谱和尿液分析以及其他体液(如血清、血浆、淋巴或脊髓液、液体等)的检查。因此可以评估安全性，例如通过体检、成像技术，即超声、x射线、ct扫描、核磁共振成像(mri)、采用技术设备的其他措施(即心电图)、生命体征、通过测量实验室参数和记录不良事件。例如，可以通过组织病理学和/或组织化学方法检查非黑猩猩灵长类动物在根据本发明的用途和方法中的不良事件。上述术语也在例如preclinicalsafetyevaluationofbiotechnology-derivedpharmaceuticalss6[生物技术产生的药物s6的临床前安全性评估]；ichharmonisedtripartiteguideline[ich协调三方指南]；1997年7月16日举行的ichsteeringcommitteemeeting[ich指导委员会会议]中提及。最后，本发明提供了包含本发明或根据本发明的方法产生的抗体构建体的试剂盒、本发明的药物组合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞。在本发明的上下文中，术语“试剂盒”意指一起包装在容器、器皿等中的两种或更多种组分，其中一种对应于本发明的抗体构建体、药物组合物、载体或宿主细胞。因此，试剂盒可以被描述为足以实现特定目标的一组产品和/或器具，其可以作为单个单元销售。该试剂盒可以包含具有任何适当的形状、大小和材料(优选防水，例如塑料或玻璃)的一个或多个器皿(例如小瓶、安瓿、容器、注射器、瓶子、袋子)，该一个或多个器皿含有合适的给予剂量(见上文)的本发明的抗体构建体或药物组合物。试剂盒可另外包含使用说明书(例如以单页或安装手册的形式)、用于给予本发明的抗体构建体的装置(如注射器、泵、输注器等)、用于重构本发明的抗体构建体的装置和/或用于稀释本发明的抗体构建体的装置。本发明还提供了用于单剂量给予单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可以含有包含干燥/冻干的抗体构建体的第一器皿和包含水性制剂的第二器皿。在本发明的某些实施例中，提供了包含单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。...........................................应注意，如在此使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如提及“试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，并且对“该方法”的提及包括提及本领域普通技术人员已知的可以修改或替代本文所述方法的等同步骤和方法。除非另外指明，在一系列元素前面的术语“至少”应被理解为指系列中的每一个元素。使用不超过常规的实验，本领域的普通技术人员应认识到或能够确认在此所述的本发明的具体实施例的很多等效物。此类等效物旨在由本发明所涵盖。本文使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任何其他组合”的含义。如本文所用的术语“约”或“大约”意指给定值或范围的20％内、优选10％内以及更优选5％内。然而，它还包括具体数字，例如约20包括20。术语“小于”或“大于”包括具体数字。例如，小于20意指小于或等于。类似地，多于或大于分别意指多于或等于，或大于或等于。贯穿本说明书及其后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”以及变型诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应当被理解成是指包含一个提及的整体或步骤或者多个整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者多个整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”替代，或者有时在本文中替换为术语“具有”。当在本文中使用时，“由……组成”排除在权利要求书中未指定的任何元件、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”包括不会实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文的每个实例中，术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的人一个可以用其他两个术语中的任一个替代。应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，并因此可以变化。本文所使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是上文还是下文，均通过引用以其全文并入本文。本文没有任何内容应解释为承认本发明无权由于先前发明而早于这些披露内容。通过引用并入的材料在一定程度上与本说明书发生冲突或不一致时，本说明书将替代任何此类材料。通过仅用于说明目的而提供的以下实例可以更好地理解本发明及其优点。这些实例并不旨在以任何方式限制本
发明内容的范围。实例1：用于生产cd19xcd3抗体构建体的补料分批与连续生产模式的比较cd19xcd3抗体构建体补料分批工艺(fb)通过解冻含有表达cd19xcd3抗体构建体的中国仓鼠卵巢(cho)细胞的小瓶来启动fb工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于生产补料分批生物反应器(2l或500l规模)。一旦将细胞以1.5×106个细胞/ml的细胞密度接种至生产生物反应器中，在第2天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天向培养物中进料限定量的专有化学成分确知的加料培养基。培养物保持在ph6.85、溶解氧64mmhg和36℃，其中在大约第7天温度变为33.5℃。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和滴度(hplc分析)。生产15天后，经由离心和过滤进行收获和澄清，以产生收获的细胞培养液(hccf)，将其加工用于蛋白质l捕获色谱法，并使用分析型阳离子交换色谱法(cex-hplc)、肽图谱和宿主细胞蛋白(hcp)elisa来分析洗脱液的产品质量属性和工艺相关杂质。cd19xcd3抗体构建体连续制造工艺(cm)在开始cm工艺之前，解冻含有表达cd19xcd3抗体构建体的cho细胞的小瓶。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于灌注生产生物反应器(10l或50l规模)。一旦将细胞以0.7×106个细胞/ml接种至生产生物反应器中，初始细胞生长阶段持续12天，以将细胞密度和生物量增加至70pf/cm的设定点(60-80×106个细胞/ml)，如通过电容探针(hamiltonbonaduzag，瑞士)所测量的。将生产生物反应器控制在ph6.85、溶解氧64mmhg和36℃。在细胞生长阶段的第4天，使用具有聚醚砜0.2-μm过滤器(通用电气医疗集团，匹兹堡，宾夕法尼亚州)的交替切向流(atf)过滤系统(改进技术公司(refinetechnologies)，汉诺威，新泽西州)和专有化学成分确知的灌注培养基在0.4个生物反应器体积/天(vvd)灌注速率下开始灌注培养。灌注速率逐渐增加，从第4天的0.4vvd增加至第12天的2vvd。一旦在第12天达到生物量设定点，将细胞培养温度降至33.5℃，开始收集hccf(即，含有cd19xcd3抗体构建体的无细胞渗透物)，并且通过以2vvd灌注速率(稳态细胞特异性灌注速率cspr为0.02-0.03nl/细胞-天)进料并排出额外细胞以维持生物量设定点来继续灌注培养另外28天。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和渗透物滴度(hplc分析)。在室温下以24小时的增量收集hccf，并加工用于蛋白质l捕获色谱法。在第26、27、34、40天来自蛋白质-l的洗脱液使用分析型阳离子交换色谱法(cex-hplc)、肽图谱和hcpelisa分析产品质量属性和与工艺相关的杂质。与cd19xcd3抗体构建体fb工艺相比，cd19xcd3抗体构建体cm的细胞培养物性能(图2，表4)、产品质量属性和与工艺相关的杂质水平(表4)得到改善。cd19xcd3抗体构建体上游cm工艺显示了更高的体积生产力、更少的化学和物理产物降解以及更低的工艺相关杂质。表4中所示的归一化值对应于所有绝对数的平均值除以fb中所有绝对数的平均值；对于fb，该归一化值对应于1；对于cm，该归一化值为对应于所描述的比率的一个数。产品质量分析方法用于电荷变体分析的阳离子交换高效液相色谱法(cex-hplc)使用thermoscientifictmpropacwcx-10柱(4.0×250mm，10μm)和agilenthplc1100系列进行弱阳离子交换(cex)分离。使用配制缓冲液将蛋白质样品稀释至22.5μg/ml，然后在加样前用2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液(ph5.8)调节，并使用渐增的nacl梯度在设定温度30℃下分离。流动相a为ph5.8下的20mmmes，且流动相b为ph5.8下的20mmmes和1.0mnacl。在55min内以0.5ml/min的流速从7％b至54％b进行线性梯度。注入约1.5μg的样品，并用fl检测(在280nm处激发，在345nm处发射)监测信号。用于化学修饰的胰蛋白酶消化肽图谱cd19xcd3抗体构建体蛋白质样品采用基于过滤器的方法使用milliporemicrocon30k设备进行消化。将蛋白质样品添加到过滤器上，离心去除样品基质，然后在含有甲硫氨酸的6m盐酸胍(guhcl)(赛默飞世尔科技公司，罗克福德，伊利诺伊州)缓冲液中变性，用500mm二硫苏糖醇(dtt)(sigma-aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)在37℃下还原30min，并随后通过在室温下黑暗中与500mm碘乙酸(iaa)(sigma-aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)孵育20min来进行烷基化。通过添加dtt淬灭未反应的iaa。上述所有步骤均在过滤器上进行。随后通过离心将样品缓冲更换为消化缓冲液(ph7.8的含有甲硫氨酸的50mmtris)以去除任何残留的dtt和iaa。胰蛋白酶消化使用1:20(w/w)的酶与蛋白质的比率在过滤器上37℃下进行1hr。通过离心收集消化混合物，然后通过在ph4.7的乙酸盐缓冲液中加入8mguhcl淬灭。使用直接与thermoscientificq-exactive质谱仪偶联的thermou-3000超高效液相色谱(uplc)系统进行液相色谱-质谱(lc-ms)分析。使用agilentzorbaxc18rrhd柱(2.1×150mm，1.8μm)通过反相分离蛋白质消化物，其中柱温保持在50℃。流动相a由在水中的0.020％(v/v)甲酸(fa)组成，且流动相b为在乙腈(i)中的0.018％(v/v)fa。将约5μg消化的cd19xcd3抗体构建体注射至柱。使用梯度(经145min从0.5％至36％b)在0.2ml/min的流速下分离肽。通过ms监测洗脱的肽。对于肽鉴定和修饰分析，使用数据依赖性串联ms(ms/ms)实验。获取在正离子模式下从200至2000m/z的完整扫描，然后进行6个数据依赖性ms/ms扫描以鉴定肽的序列。定量基于使用以下等式的所选离子监测的质谱数据：其中修饰％是修饰肽的水平，a修饰是修饰肽的提取离子色谱图面积，a未修饰是未修饰肽的提取离子色谱图面积。宿主细胞蛋白(hcp)elisa将微量滴定板用兔抗hcp免疫球蛋白g(igg)(安进公司，内部抗体)包被。在洗涤并封闭板后，将测试样品、对照和hcp校准标准品加入板中并孵育。从板上洗去未结合的蛋白质，并将合并的兔抗hcpigg生物素(安进公司，内部抗体)加入板中并孵育。在又一次洗涤后，将streptavidintm辣根过氧化物酶缀合物(hrp缀合物)(amersham-ge，白金汉郡，英国)加入板中并孵育。最后一次洗涤板，并将显色底物四甲基联苯胺(tmb)(kirkegaardandperrylaboratories，盖瑟斯堡，马里兰州)加入板中。用1m磷酸抑制显色，并用分光光度计测量光密度。表4使用源自gs-ko宿主的相同cho细胞系的cd19xcd3抗体构建体cm工艺与fb工艺的比较。ivcd在本文中和在本发明的上下文中被理解为整合的活细胞密度。实例2：用于生产egfrviiixcd3抗体构建体的补料分批与连续生产模式的比较egfrviiixcd3抗体构建体补料分批工艺(fb)通过解冻含有表达egfrviiixcd3抗体构建体的cho细胞的小瓶来启动fb工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于生产补料分批生物反应器(2l规模)。一旦将细胞以1.0×106个细胞/ml的细胞密度接种至生产生物反应器中，在第3天、第6天和第8天向培养物中进料限定量的专有化学成分确知的加料培养基。培养物保持在ph6.9、溶解氧64mmhg和36℃恒定。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和滴度(hplc分析)。生产12天后，用固定化金属亲和色谱法(imac)纯化细胞培养上清液，并使用尺寸排阻色谱法(se-hplc)分析洗脱液的产品质量属性。egfrviiixcd3抗体构建体连续制造工艺(cm)通过解冻含有表达egfrviiixcd3抗体构建体的cho细胞的小瓶来启动cm工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于灌注生产生物反应器(2l规模)。一旦将细胞以5–10×106个细胞/ml接种至生产生物反应器中，初始细胞生长阶段持续约6天，以将细胞密度和生物量增加至80pf/cm的设定点(60-80×106个细胞/ml)，如通过电容探针(hamiltonbonaduzag，瑞士)所测量的。将生产生物反应器控制在ph6.9、溶解氧64mmhg和36℃。在细胞生长阶段的大约第1天，使用具有聚醚砜0.2-μm过滤器(通用电气医疗集团，匹兹堡，宾夕法尼亚州)的交替切向流(atf)过滤系统(改进技术公司(refinetechnologies)，汉诺威，新泽西州)和专有化学成分确知的灌注培养基在每天0.5vvd灌注速率下开始灌注培养。灌注速率逐渐增加，从第1天的0.5vvd增加至第4天的2vvd。一旦在大约第6天达到生物量设定点，开始收集hccf(即，含有egfrviiixcd3抗体构建体的无细胞渗透物)，并通过以2vvd灌注速率(稳态cspr为0.02-0.03nl/细胞-天)进料并排出额外细胞以维持生物量设定点来继续灌注培养另外29天。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和渗透物滴度(hplc分析)。使用固定化金属亲和色谱法(imac)纯化来自第5天、第10天、第15天、第20天、第25天、第30天和第35天的渗透物样品，并使用尺寸排阻色谱法(se-hplc)分析洗脱液的产品质量属性。表5中所示的归一化值对应于所有绝对数的平均值除以fb中所有绝对数的平均值；对于fb，该归一化值对应于1；对于cm，该归一化值为对应于所描述的比率的一个数。与使用相同cho细胞系的egfrviiixcd3抗体构建体fb工艺相比，egfrviiixcd3抗体构建体cm工艺的细胞培养性能(图3，表5)和产品质量属性(表5)得到改善。特别地，与fb工艺相比，cm工艺渗透物中的较低浓度与较低的高分子量(hmw)种类水平和较高的产品单体相关(图4)。egfrviiixcd3抗体构建体上游cm工艺显示了更高的体积生产力和更少的物理产物降解。作为产品质量分析方法尺寸排阻-高效液相色谱法(se-hplc)se-hplc使用watersbeh200尺寸排阻柱(4.6x150mm,1.7μm)和watersuhplc系统进行。将蛋白质样品纯净地注射并使用含有nacl盐的磷酸盐缓冲液在0.4ml/min的流速下等度地分离(流动相为ph6.8下的100mm磷酸钠、250mmnacl)，并通过在280nm处的uv吸光度监测洗脱液。加载约6μg的样品。表5.使用源自dhfr缺陷型宿主的相同cho细胞系的egfrviiixcd3抗体构建体cm工艺与fb工艺的比较实例3：用于生产tnf-αxtl1a双特异性抗体的补料分批与连续生产模式的比较tnf-αxtl1a双特异性抗体补料分批工艺(fb)通过解冻含有表达tnf-αxtl1a双特异性抗体(全长)的cho细胞的小瓶来启动fb工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于生产补料分批生物反应器(2l规模)。一旦将细胞以1.0×106个细胞/ml的细胞密度接种至生产生物反应器中，在第3天、第6天和第8天向培养物中进料限定量的专有化学成分确知的加料培养基。培养物保持在ph6.9、溶解氧64mmhg和36℃恒定。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和滴度(hplc分析)。生产12天后，经由离心和过滤进行收获和澄清以产生收获的细胞培养液(hccf)，将其加工用于蛋白-a捕获色谱法，然后采用nacl梯度洗脱进行强阳离子交换(cex)色谱步骤。使用还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rce-sds)、分析型阳离子交换色谱法(cex-hplc)、肽图谱和宿主细胞蛋白(hcp)elisa分析cex洗脱液的产品质量属性和工艺相关杂质。tnf-αxtl1a双特异性抗体连续制造工艺(cm)通过解冻含有表达tnf-αxtl1a双特异性抗体的cho细胞的小瓶来启动cm工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于灌注生产生物反应器(2l规模)。一旦将细胞以5×106个细胞/ml接种至生产生物反应器中，初始细胞生长阶段持续6天，以将细胞密度和生物量增加至80pf/cm的设定点(60-80×106个细胞/ml)，如通过电容探针(hamiltonbonaduzag，瑞士)所测量的。将生产生物反应器控制在ph6.9、溶解氧64mmhg和36℃。在细胞生长阶段的第1天，使用具有聚醚砜0.2-μm过滤器(通用电气医疗集团，匹兹堡，宾夕法尼亚州)的交替切向流(atf)过滤系统(改进技术公司(refinetechnologies)，汉诺威，新泽西州)和专有化学成分确知的灌注培养基在每天0.5vvd灌注速率下开始灌注培养。灌注速率逐渐增加，从第1天的0.5vvd增加至第6天的2vvd。一旦在第6天达到生物量设定点，开始收集hccf(即，含有tnf-αxtl1a双特异性抗体的无细胞渗透物)，并且通过以2vvd灌注速率(稳态细胞cspr为0.02-0.03nl/细胞-天)进料并排出额外细胞以维持生物量设定点来继续灌注培养另外28天。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和渗透物滴度(hplc分析)。从第8天至第10天以及从第29天至第31天收集hccf，并加工用于蛋白质a捕获色谱法，然后采用nacl梯度洗脱进行强阳离子交换(cex)色谱步骤。使用还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rce-sds)、分析型阳离子交换色谱法(cex-hplc)、肽图谱和宿主细胞蛋白(hcp)elisa分析cex洗脱液的产品质量属性和工艺相关杂质。表6中所示的归一化值对应于所有绝对数的平均值除以fb中所有绝对数的平均值；对于fb，该归一化值对应于1；对于cm，该归一化值为对应于所描述的比率的一个数。与tnf-αxtl1a双特异性抗体fb工艺相比，tnf-αxtl1a双特异性抗体cm工艺的细胞培养性能(图5，表6)、产品质量属性和工艺相关杂质(表6)得到改善。tnf-αxtl1a双特异性抗体上游cm工艺显示了更高的体积生产力、更少的化学和物理产物降解以及更低的工艺相关杂质。产品质量分析方法用于电荷变体分析的阳离子交换高效液相色谱法(cex-hplc)使用ymc-bioprosp-f；100x4.6mml.d；5μm柱和agilenthplc1100系列进行强阳离子交换(cex)分离。在加样之前使用流动相a将蛋白质样品稀释至3.0mg/ml，并使用渐增的nacl梯度在25℃的设定温度下分离。流动相a是ph6.9下的20mm磷酸钠，且流动相b是ph6.9下的20mm磷酸钠和0.5mnacl。在10分钟内以0.6ml/min的流速从2％b至25％b进行线性梯度。注入约90μg的样品，并用280nm处的uv检测监测信号。还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rce-sds)在beckmancoulterproteomelabpa800plusce系统上进行还原ce-sds。用水将蛋白质样品稀释至0.5mg/ml，然后在beckmansds样品缓冲液中用β-巯基乙醇(β-me)在70℃下还原10min(贝克曼库尔特公司(beckmancoulter)，贝瑞阿，加利福尼亚州)。将还原和变性的蛋白质样品电动注射(5kv，持续20sec)至裸熔融石英毛细管(50μmid×30.0cm有效长度)中，使用sds凝胶缓冲液分离(在15kv下分离30min)，并通过光电二极管阵列检测器使用220nm处的uv获得检测。胰蛋白酶消化肽图谱将tnf-αxtl1a双特异性抗体蛋白样品在水中稀释至3mg/ml的工作体积，然后在含有乙二胺四乙酸(edta)的4mguhcl缓冲液中变性，用500mmdtt在37℃下还原30分钟，然后通过在室温下在黑暗中与500mmiaa孵育20分钟进行烷基化。通过添加dtt淬灭未反应的iaa。将样品脱盐并用通过重力流的nap-5柱(通用电气医疗基团，英国)缓冲更换为消化缓冲液(ph7.8的含有甲硫氨酸的50mmtris)。胰蛋白酶消化以1:10的比率进行，并在37℃下孵育35分钟。使用10％甲酸淬灭消化。液相色谱-质谱(lc-ms)分析使用直接与thermo-scientificq-exactive以及质谱仪偶联的配备有二元泵、柱加热室、带有温控的自动注射器和自动进样器的watersacquity系列进行。使用agilentzorbaxc18rrhd柱(2.1×150mm，1.8um)通过反相分离蛋白质消化物，其中柱温保持在50℃。流动相a由在水中的0.1％甲酸组成，且流动相b为在乙腈(i)中的0.1％甲酸。使用梯度(经79分钟从1％至36％b)在0.25ml/min的流速下分离肽。通过ms监测洗脱的肽。对于肽鉴定和修饰分析，使用数据依赖性串联ms(ms/ms)实验。获取在阳性模式下从200-2000m/z的完整扫描，然后进行8个数据依赖性ms/ms扫描以鉴定肽的序列。定量基于使用以下等式的所选离子监测的质谱数据：其中修饰％是修饰肽的水平，a修饰是修饰肽的提取离子色谱图面积，a未修饰是未修饰肽的提取离子色谱图面积。宿主细胞蛋白(hcp)elisa将微量滴定板用兔抗hcp免疫球蛋白g(igg)(安进公司，内部抗体)包被。在洗涤并封闭板后，将测试样品、对照和hcp校准标准品加入板中并孵育。从板上洗去未结合的蛋白质，并将合并的兔抗hcpigg生物素(安进公司，内部抗体)加入板中并孵育。在又一次洗涤后，将streptavidintm辣根过氧化物酶缀合物(hrp缀合物)(amersham-ge，白金汉郡，英国)加入板中并孵育。最后一次洗涤板，并将显色底物四甲基联苯胺(tmb)(kirkegaardandperrylaboratories，盖瑟斯堡，马里兰州)加入板中。用1m磷酸抑制显色，并用分光光度计测量光密度。表6.tnf-αxtl1a双特异性抗体cm工艺与使用源自dhfr缺陷型宿主的相同cho细胞系的fb工艺的比较实例4：用于生产cd33xcd3抗体构建体的补料分批与连续生产模式的比较cd33xcd3抗体构建体补料分批工艺(fb)通过解冻含有表达cd33xcd3抗体构建体的cho细胞(克隆a)的小瓶来启动fb工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于生产补料分批生物反应器(2l规模)。一旦将细胞以1.0×106个细胞/ml的细胞密度接种至生产生物反应器中，在第3天、第6天、第8天和第10天向培养物中进料限定量的专有化学成分确知的加料培养基。培养物保持在ph6.9、溶解氧64mmhg和36℃恒定。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和滴度(hplc分析)。生产12天后，用固定化金属亲和色谱法(imac)纯化细胞培养上清液，并使用尺寸排阻色谱法(se-hplc)分析洗脱液的产品质量属性。cd33xcd3抗体构建体连续制造工艺(cm)通过解冻含有表达cd33xcd3抗体构建体的cho细胞的小瓶来启动cm工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于灌注生产生物反应器(2l规模)。将细胞以1×106个细胞/ml接种至生产生物反应器中，并且用如通过电容探针(hamiltonbonaduzag，瑞士)测量的渐增的生物量设定点(表7)研究灌注培养的四个后续阶段。将生产生物反应器控制在ph6.9、溶解氧64mmhg和36℃。在第3天，使用具有聚醚砜750kda过滤器(通用电气医疗集团，匹兹堡，宾夕法尼亚州)的交替切向流(atf)过滤系统(改进技术公司(refinetechnologies)，汉诺威，新泽西州)和专有化学成分确知的灌注培养基在每天1vvd灌注速率下开始灌注培养。在灌注培养期间，灌注速率恒定维持在1vvd，而生物量设定点逐渐增加以实现四种不同的cspr(表7)。hccf的收集在第4天开始(即，含有cd33xcd3抗体构建体的无细胞渗透物)，并且通过以1vvd灌注速率进料并排出额外细胞从而维持所述四种生物量组来继续灌注培养至第25天。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和渗透物滴度(hplc分析)。用固定化金属亲和色谱法(imac)纯化每日渗透物样品，并使用尺寸排阻色谱法(se-hplc)分析洗脱液的产品质量属性。cd33xcd3抗体构建体cm工艺的产品浓度低于cd33xcd3抗体构建体fb工艺(图6)。如在每日单体质量中测量的，cm中增加的vcd增加了产品浓度和体积生产力(表8)。然而，较低的产品浓度与较高的单体水平和较低的hmw相关(图7和图8)。相关性可在几种bite产品中找到(图9)。更进一步地，更高的细胞特异性灌注速率和相应的更低产品浓度与cd33xcd3抗体构建体聚集减少相关。为了随着vcd的增加最大化单体和每日单体质量百分比，可以使用更高的灌注速率6.4vvd和64.8×106个细胞/ml的vcd(表7)。产品质量分析方法尺寸排阻-高效液相色谱法(se-hplc)se-hplc使用watersbeh200尺寸排阻柱(4.6x150mm,1.7μm)和watersuhplc系统进行。将蛋白质样品纯净地注射并使用含有nacl盐的磷酸盐缓冲液在0.4ml/min的流速下等度地分离(流动相为ph6.8下的100mm磷酸钠、250mmnacl)，并通过在280nm处的uv吸光度监测洗脱液。加载约6μg的样品。表7.使用源自gs-ko宿主的相同cho细胞系的cd33xcd3抗体构建体fb和cm工艺的工艺条件表8.对于使用源自gs-ko宿主的相同cho细胞系的fb和cm工艺的cd33xcd3抗体构建体单体生产力计算。#基于cm-a中相同产品单体和cm-d中相同的滴度的计算生产力除以6.4；n/a＝不适用实例5：用于生产cd33xcd3抗体构建体的补料分批与连续生产模式的进一步比较cd33xcd3bite抗体构建体补料分批工艺(fb)通过解冻含有表达cd33xcd3抗体构建体的中国仓鼠卵巢(cho)细胞的小瓶来启动fb工艺(克隆b)。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于生产补料分批生物反应器(3l规模)。一旦将细胞以0.8×106个细胞/ml的细胞密度接种至生产生物反应器中，在第3天、第6天和第8天向培养物中进料限定量的专有化学成分确知的加料培养基。将培养物保持在ph6.9、溶解氧48mmhg和36℃。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和滴度(hplc分析)。在生产结束时，进行收获和澄清以产生收获的细胞培养液(hccf)，将其加工用于蛋白质l捕获色谱法，并使用尺寸排阻色谱法(se-hplc)分析洗脱液的产品质量属性。cd33xcd3抗体构建体连续制造工艺(cm)通过解冻含有表达cd33xcd3抗体构建体的cho细胞的小瓶来启动cm工艺(克隆b)。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于灌注生产生物反应器(3l规模)。一旦将细胞以0.7×106个细胞/ml接种至生产生物反应器中，初始细胞生长阶段持续12天，以将细胞密度和生物量增加至70pf/cm的设定点(70-90×106个细胞/ml)，如通过电容探针(hamiltonbonaduzag，瑞士)所测量的。将生产生物反应器控制在ph6.85、溶解氧64mmhg和36℃。在细胞生长阶段的第4天，使用具有聚醚砜0.2-μm过滤器(通用电气医疗集团，匹兹堡，宾夕法尼亚州)的交替切向流(atf)过滤系统(改进技术公司(refinetechnologies)，汉诺威，新泽西州)和专有化学成分确知的灌注培养基在0.5个生物反应器体积/天(vvd)灌注速率下开始灌注培养。灌注速率逐渐增加，从第4天的0.5vvd增加至第8天的1.8vvd。一旦达到生物量设定点，将细胞培养温度降至33.0℃，在第12天开始收集hccf(即，含有cd33xcd3抗体构建体的无细胞渗透物)，并通过以2vvd灌注速率(稳态细胞特异性灌注速率cspr为0.02-0.03nl/细胞-天)进料并排出额外细胞以维持生物量设定点来继续灌注培养另外30天。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和渗透物滴度(hplc分析)。在室温下以24小时的增量收集hccf，并加工用于蛋白质l捕获色谱法。使用尺寸排阻色谱法(se-hplc)分析来自蛋白质l的洗脱液的产品质量属性。表9中所示的归一化值对应于所有绝对数的平均值除以fb中所有绝对数的平均值；对于fb，该归一化值对应于1；对于cm，该归一化值为对应于所描述的比率的一个数。与cd33xcd3抗体构建体fb工艺相比，cd33xcd3抗体构建体cm的细胞培养性能(图10，表9)和产品质量属性水平(图11，表9)得到改善。cd33xcd3抗体构建体上游cm工艺显示了更高的体积生产力、更少的化学和物理产物降解。产品质量分析方法尺寸排阻-高效液相色谱法(se-hplc)se-hplc使用watersbeh200尺寸排阻柱(4.6x150mm,1.7μm)和watersuhplc系统进行。将蛋白质样品纯净地注射并使用含有nacl盐的磷酸盐缓冲液在0.4ml/min的流速下等度地分离(流动相为ph6.8下的100mm磷酸钠、250mmnacl)，并通过在280nm处的uv吸光度监测洗脱液。加载约6μg的样品。表9使用源自gs-ko宿主的相同cho细胞系(克隆b)的cd33xcd3抗体构建体cm工艺与fb工艺的比较。ivcd在本文中和在本发明的上下文中被理解为整合的活细胞密度。实例6：对于生产cd33xcd3抗体构建体的传统的15天补料分批与混合10天补料分批模式的比较为了从cm工艺中获得较低的产品浓度和更好的产品质量，但最大限度地缩短培养时间，测试了混合补料分批工艺。为此，将该工艺从接种到第7天进行分批补料，然后使用交替切向流(atf)过滤系统进行短期灌注培养以供收获。以与cm工艺类似的方式移取产品降低了产品浓度并提高了产品质量。cd33xcd3抗体构建传统的15天补料分批工艺(传统fb)通过解冻含有表达cd33xcd3抗体构建体的中国仓鼠卵巢(cho)细胞的小瓶来启动fb工艺(克隆b)。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于生产补料分批生物反应器(3l规模)。一旦将细胞以0.8×106个细胞/ml的细胞密度接种至生产生物反应器中，在第3天、第6天和第8天向培养物中进料限定量的专有化学成分确知的加料培养基。将培养物保持在ph6.9、溶解氧48mmhg和36℃。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和滴度(hplc分析)。在不同的生产持续时间(10天或15天)下，进行基于离心的收获和澄清以产生收获的细胞培养液(hccf)，将其加工用于蛋白质l捕获色谱法并且使用尺寸排阻色谱法(se-hplc)和阳离子交换色谱法(cex-hplc)分析洗脱液中的产品质量属性。cd33xcd3抗体构建体混合10天补料分批工艺(混合fb)混合fb工艺使用与传统fb相同的放大和生产条件和采样。对于第3天的1vvd微滤混合fb工艺(混合3d-1vvd)，在第3天和第6天向培养物中进料限定量的专有化学成分确知的加料培养基。在第7天，使用具有聚醚砜750kda的过滤器(通用电气医疗集团，匹兹堡，宾夕法尼亚州)的交替切向流(atf)过滤系统(改进技术公司(refinetechnologies)，新泽西汉诺威)向培养物中以1个容器体积/天(1vvd)的灌注速率灌注专有化学成分确知的灌注培养基持续3天。将cd33xcd3bite抗体产品渗透通过过滤器并在第7天至第10天收集为hccf。将hccf加工用于蛋白质l捕获色谱法，并使用尺寸排阻色谱法(se-hplc)和阳离子交换色谱法(cex-hplc)分析洗脱液的产品质量属性。表10中所示的归一化值对应于所有绝对数的平均值除以fb中所有绝对数的平均值；对于fb，该归一化值对应于1；对于cm，该归一化值为对应于所描述的比率的一个数。与cd33xcd3抗体构建体传统15天fb工艺相比，cd33xcd3抗体构建体混合3d-1vvd工艺的细胞培养性能(图12，表10)和产品质量属性水平(表10)得到改善。混合3d-1vvd10天fb显示出与传统的15天fb工艺相似的体积生产力，但前者持续时间更短、日体积生产力更高且产品质量更好(表10)。特别地，cd33xcd3bite抗体构建体混合3d-1vvd10天fb工艺显示出更低的hccf浓度、更少的产品聚集以及更少的化学和物理产物降解。产品质量分析方法尺寸排阻-高效液相色谱法(se-hplc)se-hplc使用watersbeh200尺寸排阻柱(4.6x150mm,1.7μm)和watersuhplc系统进行。将蛋白质样品纯净地注射并使用含有nacl盐的磷酸盐缓冲液在0.4ml/min的流速下等度地分离(流动相为ph6.8下的100mm磷酸钠、250mmnacl)，并通过在280nm处的uv吸光度监测洗脱液。加载约6μg的样品。用于电荷变体分析的阳离子交换高效液相色谱法(cex-hplc)使用watersprotein-pakhirescm4.6×100mm柱和waters超高效液相色谱(uhplc)系统进行弱阳离子交换(cex)分离。在加样之前，用配制缓冲液10mm磷酸钾、8％蔗糖、0.01％(w/v)聚山梨醇酯80、1％(w/v)captisol(ph6.1±0.04)预处理蛋白质样品。在三个流动相(a、b和c)的多个梯度下，在设定温度26℃、流速为0.ml/min下分离样品。流动相a是ph6.0下的50mm磷酸钠，流动相b是ph8.0下的50mmtris-hcl、250mm氯化钠，且流动相c是ph8.0下的50mmtris-hcl、500mm氯化钠。注入约8.0μg的样品，并用fld检测(在280nm处激发，在345nm处发射)监测信号。表10使用cd33xcd3抗体构建体传统的15天fb工艺与源自gs-ko宿主的相同cho细胞系(克隆b)的混合10天fb工艺(混合3d-1vvd)的比较。ivcd在本文中和在本发明的上下文中被理解为整合的活细胞密度。实例7：用于生产bcmaxcd3bite(r)-hle的补料分批与连续生产模式的比较bcmaxcd3bite(r)-hle补料分批工艺(fb)通过解冻含有表达bcmaxcd3bite(r)-hle的中国仓鼠卵巢(cho)细胞的小瓶来启动fb工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于生产补料分批生物反应器(2l规模)。一旦将细胞以1.0×106个细胞/ml的细胞密度接种至生产生物反应器中，在第3天、第6天和第8天向培养物中进料限定量的专有化学成分确知的加料培养基。培养物保持在ph6.9、溶解氧64mmhg和36℃，其中在大约第6天温度变为34℃。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和滴度(hplc分析)。生产12天后，经由离心和过滤进行收获和澄清，以产生收获的细胞培养液(hccf)，将其加工用于蛋白-a捕获色谱法，并使用分析型阳离子交换色谱法(cex-hplc)、肽图谱、还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠、还原宿主细胞蛋白(hcp)elisa和dna(qpcr)来分析洗脱液的产品质量属性和工艺相关杂质。bcmaxcd3bite(r)-hle连续制造工艺(cm)通过解冻含有表达bcmaxcd3bite(r)-hle的cho细胞的小瓶来启动cm工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于灌注生产生物反应器(10l或50l规模)。一旦将细胞以0.7×106个细胞/ml接种至生产生物反应器中，初始细胞生长阶段持续12天，以将细胞密度和生物量增加至70pf/cm的设定点(40-60×106个细胞/ml)，如通过电容探针(hamiltonbonaduzag，瑞士)所测量的。将生产生物反应器控制在ph6.9、溶解氧64mmhg和36℃。在细胞生长阶段的第4天，使用具有聚醚砜0.2-μm过滤器(通用电气医疗集团，匹兹堡，宾夕法尼亚州)的交替切向流(atf)过滤系统(改进技术公司(refinetechnologies)，新泽西汉诺威)和专有化学成分确知的灌注培养基在0.4个生物反应器体积/天(vvd)灌注速率下开始灌注培养。灌注速率逐渐增加，从第4天的0.4vvd增加至第12天的2vvd。一旦在第12天达到生物量设定点，将细胞培养温度降至34℃，开始收集hccf(即，含有bcmaxcd3bite(r)-hle的无细胞渗透物)，并且通过以2vvd灌注速率(稳态细胞特异性灌注速率cspr为0.03-0.05nl/细胞-天)进料并排出额外细胞以维持生物量设定点来继续灌注培养另外28天。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和渗透物滴度(hplc分析)。在室温下以24小时的增量收集hccf，并加工用于蛋白质a捕获色谱法。使用分析型阳离子交换色谱法(cex-hplc)、肽图谱、还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠、还原宿主细胞蛋白(hcp)elisa和dna(qpcr)，分析第19天和第40天(稳态第7天和第28天)来自蛋白质a的洗脱液的产品质量属性和工艺相关杂质。与bcmaxcd3bite(r)-hlefb工艺相比，bcmaxcd3bite(r)-hlecm的细胞培养物性能(图13，表11)、产品质量属性和与工艺相关的杂质水平(表11)得到改善。bcmaxcd3bite(r)-hle上游cm工艺显示了更高的体积生产力、更少的化学和物理产物降解以及更低的工艺相关杂质。表11中所示的归一化值对应于所有绝对数的平均值除以fb中所有绝对数的平均值；对于fb，该归一化值对应于1；对于cm，该归一化值为对应于所描述的比率的一个数。产品质量分析方法用于电荷变体分析的阳离子交换高效液相色谱法(cex-hplc)使用thermoscientifictmpropacwcx-10柱(4.0×250mm，10μm)和agilenthplc1100系列进行弱阳离子交换(cex)分离。使用流动相a将蛋白质样品稀释至500μg/ml，并使用渐增的nacl梯度在30℃的设定温度下进行分离。流动相a是ph6.0下的50mm磷酸钠，且流动相b是ph6.0下的50mm磷酸钠、500mmnacl。在50min内以0.5ml/min的流速从10％b至40％b进行线性梯度。注入约50μg的样品，并通过可变波长检测器用220nm处的uv检测监测信号。用于化学修饰的胰蛋白酶/弹性蛋白酶肽图谱蛋白质样品采用基于过滤器的方法使用milliporemicrocon30k设备进行消化。将蛋白质样品添加到过滤器上，离心去除样品基质，然后在含有甲硫氨酸的6m盐酸胍(guhcl)(赛默飞世尔科技公司；罗克福德，伊利诺伊州)缓冲液中变性，用37.5mm二硫苏糖醇(dtt)(sigma-aldrich公司；圣路易斯，密苏里州)在37℃下还原30min，并随后通过在室温下黑暗中与87.5mm碘乙酸(iaa)(sigma-aldrich公司；圣路易斯，密苏里州)孵育20min来进行烷基化。通过添加dtt淬灭未反应的iaa。上述所有步骤均在过滤器上进行。随后通过离心将样品缓冲更换为消化缓冲液(ph7.8的含有甲硫氨酸的50mmtris)以去除任何残留的dtt和iaa。胰蛋白酶消化使用1:20(w/w)的酶与蛋白质的比率在过滤器上37℃下进行1hr。通过离心收集小的胰蛋白酶消化物，并在过滤器上在37℃下使用酶与蛋白质比率1:20(w/w)进行弹性蛋白酶消化30min。通过离心收集消化混合物，然后通过在ph4.7的250mm乙酸盐缓冲液中加入8mguhcl淬灭。使用直接与thermoscientificq-exactive质谱仪偶联的agilent1260infinityii高效液相色谱(hplc)系统进行液相色谱-质谱(lc-ms)分析。使用wateracquityuplc肽behc18柱(2.1×150mm，1.7μm)通过反相分离蛋白质消化物，其中柱温保持在50℃。流动相a由在水中的0.10％(v/v)甲酸(fa)组成，且流动相b为在乙腈(acn)中的0.1％(v/v)fa。将约6.25μg消化的蛋白质注射至柱。使用梯度(经78min从1％至36％b)在0.25ml/min的流速下分离肽。通过ms监测洗脱的肽。对于肽鉴定和修饰分析，使用数据依赖性串联ms(ms/ms)实验。获取在正离子模式下从200至2000m/z的完整扫描，然后进行5个数据依赖性ms/ms扫描以鉴定肽的序列。定量基于使用以下等式的所选离子监测的质谱数据：等式1.其中修饰％是修饰肽的水平，a修饰是修饰肽的提取离子色谱图面积，a未修饰是未修饰肽的提取离子色谱图面积。还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(还原ce-sds)在beckmancoulterproteomelabpa800plusce系统上进行还原ce-sds。用水将蛋白质样品稀释至0.5mg/ml，然后在beckmansds样品缓冲液中用β-巯基乙醇(β-me)在70℃下还原10min(贝克曼库尔特公司(beckmancoulter)，贝瑞阿，加利福尼亚州)。将还原和变性的蛋白质样品电动注射(5kv，持续20sec)至裸熔融石英毛细管(50μmid×30.0cm有效长度)中，使用sds凝胶缓冲液分离(在15kv下分离40min)，并通过光电二极管阵列检测器使用220nm处的uv获得检测。宿主细胞蛋白(hcp)elisa将微量滴定板用兔抗hcp免疫球蛋白g(igg)(安进公司，内部抗体)包被。在洗涤并封闭板后，将测试样品、对照和hcp校准标准品加入板中并孵育。从板上洗去未结合的蛋白质，并将合并的兔抗hcpigg生物素(安进公司，内部抗体)加入板中并孵育。在又一次洗涤后，将streptavidintm辣根过氧化物酶缀合物(hrp缀合物)(amersham-ge；白金汉郡，英国)加入板中并孵育。最后一次洗涤板，并将显色底物四甲基联苯胺(tmb)(kirkegaardandperrylaboratories；盖瑟斯堡，马里兰州)加入板中。用1m磷酸抑制显色，并用分光光度计测量光密度。dna方法(qpcr)通过用蛋白酶k消化，然后进行dna提取和异丙基醇沉淀来制备样品。设计引物以扩增cho细胞特异性重复dna序列(称为repa)，并设计特异性探针以在它们之间退火。探针在其5'端用荧光报告染料fam(6-羧基荧光素)标记，在其3'端用淬灭染料tamra(6-羧基四甲基罗丹明)标记。当退火的探针完整时，报告染料的荧光通过淬灭染料的接近而淬灭。在每个pcr循环的延伸阶段期间，taqdna聚合酶切割退火的探针，以从探针释放报告染料，从而导致荧光增加。荧光的这种增加与反应中存在的扩增的靶dna的量成正比，并且在整个pcr反应中通过实时pcr仪器连续监测。在扩增的指数期内，产品序列的量与dna的起始量成正比。将从cho细胞分离的已知量的基因组dna的标准曲线用于将荧光水平与原始样品中的基因组dna浓度相关联。表11使用源自dhfr缺陷型宿主的相同cho细胞系的bcmaxcd3bite(r)-hlecm工艺与fb工艺的比较实例8：用于生产dll3xcd3bite(r)-hle的补料分批与连续生产模式的比较dll3xcd3bite(r)-hle补料分批工艺(fb)通过解冻含有表达dll3xcd3bite(r)-hle的cho细胞的小瓶来启动fb工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于生产补料分批生物反应器(2l规模)。一旦将细胞以1.0×106个细胞/ml的细胞密度接种至生产生物反应器中，在第3天、第6天和第8天向培养物中进料限定量的专有化学成分确知的加料培养基。培养物保持在ph6.9、溶解氧64mmhg和36℃恒定。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和滴度(hplc分析)。生产12天后，用蛋白质a色谱法纯化细胞培养上清液，并使用尺寸排阻色谱法(se-hplc)分析洗脱液的产品质量属性。dll3xcd3bite(r)-hle连续制造工艺(cm)通过解冻含有表达dll3xcd3bite(r)-hle的cho细胞的小瓶来启动cm工艺。在放大期间，将细胞以目标活细胞密度(vcd)重悬于新鲜的选择生长培养基中。在摇瓶或生物反应器中连续扩大培养物体积以生成足够的细胞质量，以最终接种于灌注生产生物反应器(2l规模)。一旦将细胞以1.5106个细胞/ml接种至生产生物反应器中，初始细胞生长阶段持续约10天，以将细胞密度和生物量增加至70pf/cm的设定点(40-60×106个细胞/ml)，如通过电容探针(hamiltonbonaduzag，瑞士)所测量的。将生产生物反应器控制在ph6.9、溶解氧64mmhg和36℃。在细胞生长阶段的大约第3天，使用具有聚醚砜0.2-μm过滤器(通用电气医疗集团，匹兹堡，宾夕法尼亚州)的交替切向流(atf)过滤系统(改进技术公司(refinetechnologies)，汉诺威，新泽西州)和专有化学成分确知的灌注培养基在每天0.5vvd灌注速率下开始灌注培养。灌注速率逐渐增加，从第3天的0.5vvd增加至第10天的2vvd。一旦在大约第10天达到生物量设定点，开始收集hccf(即，含有dll3xcd3bite(r)-hle的无细胞渗透物)，并且通过以2vvd灌注速率(稳态细胞cspr为0.03-0.05nl/细胞-天)进料并排出额外细胞以维持生物量设定点来继续灌注培养另外13天。在整个培养持续时间内测量细胞密度(cdv，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、代谢物(novaflex，诺瓦生物医学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和渗透物滴度(hplc分析)。使用蛋白质a色谱法纯化来自第10天至第23天的渗透物样品，并使用尺寸排阻色谱法(se-hplc)分析洗脱液的产品质量属性。与使用相同的cho细胞系的dll3xcd3bite(r)-hlefb工艺相比，dll3xcd3bite(r)-hlecm工艺的细胞培养性能(图14，表12)和产品质量属性(表12)得到改善。表12中所示的归一化值对应于所有绝对数的平均值除以fb中所有绝对数的平均值；对于fb，该归一化值对应于1；对于cm，该归一化值为对应于所描述的比率的一个数。dll3xcd3bite(r)-hle上游cm工艺显示了更高的体积生产力和更少的物理产物降解或聚集。对于dll3xcd3bite(r)-hlecm和其他cm工艺，atf过滤收获工艺本身有利于生产与保留在生物反应器中的细胞培养液相比具有较低浓度和较低hmw种类的渗透物hccf(图15)。产品质量分析方法尺寸排阻-高效液相色谱法(se-hplc)se-hplc使用watersbeh200尺寸排阻柱(4.6x150mm,1.7μm)和watersuhplc系统进行。将蛋白质样品纯净地注射并使用含有nacl盐的磷酸盐缓冲液在0.4ml/min的流速下等度地分离(流动相为ph6.8下的100mm磷酸钠、250mmnacl)，并通过在220nm处的uv吸光度监测洗脱液。加载约10μg的样品。还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(还原ce-sds)在beckmancoulterproteomelabpa800plusce系统上进行还原ce-sds。用配制缓冲液将蛋白质样品稀释至1.0mg/ml，然后在beckmansds样品缓冲液中用β-巯基乙醇(β-me)在70℃下还原10min(贝克曼库尔特公司(beckmancoulter)，贝瑞阿，加利福尼亚州)，以达到最终浓度0.48mg/ml。将还原和变性的蛋白质样品电动注射(10kv，持续30sec)至裸熔融石英毛细管(50μmid×20.0cm有效长度)中，使用sds凝胶缓冲液分离(在15kv下分离40min)，并通过光电二极管阵列检测器使用220nm处的uv获得检测。表12.使用源自dhfr缺陷型宿主的相同cho细胞系的dll3xcd3bite(r)-hlecm工艺与fb工艺的比较序列表<110>安进公司<120>双特异性抗体产品的连续制造工艺<130>32243/54278a/pc<150>us62/597,250<151>2017-12-11<160>202<170>patentin3.5版<210>1<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd19vlcdr1<400>1lysalaserglnservalasptyraspglyaspsertyrleuasn151015<210>2<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd19vlcdr2<400>2aspalaserasnleuvalser15<210>3<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd19vlcdr3<400>3glnglnserthrgluaspprotrpthr15<210>4<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd19vhcdr1<400>4sertyrtrpmetasn15<210>5<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd19vhcdr2<400>5glniletrpproglyaspglyaspthrasntyrasnglylysphelys151015gly<210>6<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd19vhcdr3<400>6arggluthrthrthrvalglyargtyrtyrtyralametasptyr151015<210>7<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd19vl<400>7aspileglnleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercyslysalaserglnservalasptyrasp202530glyaspsertyrleuasntrptyrglnglnileproglyglnpropro354045lysleuleuiletyraspalaserasnleuvalserglyilepropro505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleuasnilehis65707580provalglulysvalaspalaalathrtyrhiscysglnglnserthr859095gluaspprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105110<210>8<211>124<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd19vh<400>8glnvalglnleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyser151015servallysilesercyslysalaserglytyralaphesersertyr202530trpmetasntrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glyglniletrpproglyaspglyaspthrasntyrasnglylysphe505560lysglylysalathrleuthralaaspgluserserserthralatyr65707580metglnleuserserleualasergluaspseralavaltyrphecys859095alaargarggluthrthrthrvalglyargtyrtyrtyralametasp100105110tyrtrpglyglnglythrthrvalthrvalserser115120<210>9<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd3vhcdr1<400>9argtyrthrmethis15<210>10<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd3vhcdr2<400>10tyrileasnproserargglytyrthrasntyrasnglnlysphelys151015asp<210>11<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd3vhcdr3<400>11tyrtyraspasphistyrcysleuasptyr1510<210>12<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd3vlcdr1<400>12argalaserserservalsertyrmetasn1510<210>13<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd3vlcdr2<400>13aspthrserlysvalalaser15<210>14<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd3vlcdr3<400>14glnglntrpserserasnproleuthr15<210>15<211>119<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd3vh<400>15aspilelysleuglnglnserglyalagluleualaargproglyala151015servallysmetsercyslysthrserglytyrthrphethrargtyr202530thrmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glytyrileasnproserargglytyrthrasntyrasnglnlysphe505560lysasplysalathrleuthrthrasplysserserserthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargtyrtyraspasphistyrcysleuasptyrtrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserser115<210>16<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd3vl<400>16valaspaspileglnleuthrglnserproalailemetseralaser151015proglyglulysvalthrmetthrcysargalaserserservalser202530tyrmetasntrptyrglnglnlysserglythrserprolysargtrp354045iletyraspthrserlysvalalaserglyvalprotyrargpheser505560glyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglu65707580alagluaspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnpro859095leuthrpheglyalaglythrlysleugluleulys100105<210>17<211>504<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽<220><221>尚未归类的特征<223>cd19xcd3scfvblincyto包括接头和his标记<400>17aspileglnleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercyslysalaserglnservalasptyrasp202530glyaspsertyrleuasntrptyrglnglnileproglyglnpropro354045lysleuleuiletyraspalaserasnleuvalserglyilepropro505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleuasnilehis65707580provalglulysvalaspalaalathrtyrhiscysglnglnserthr859095gluaspprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelysgly100105110glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglnval115120125glnleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyserserval130135140lysilesercyslysalaserglytyralaphesersertyrtrpmet145150155160asntrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpileglygln165170175iletrpproglyaspglyaspthrasntyrasnglylysphelysgly180185190lysalathrleuthralaaspgluserserserthralatyrmetgln195200205leuserserleualasergluaspseralavaltyrphecysalaarg210215220arggluthrthrthrvalglyargtyrtyrtyralametasptyrtrp225230235240glyglnglythrthrvalthrvalserserglyglyglyglyserasp245250255ilelysleuglnglnserglyalagluleualaargproglyalaser260265270vallysmetsercyslysthrserglytyrthrphethrargtyrthr275280285methistrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpilegly290295300tyrileasnproserargglytyrthrasntyrasnglnlysphelys305310315320asplysalathrleuthrthrasplysserserserthralatyrmet325330335glnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcysala340345350argtyrtyraspasphistyrcysleuasptyrtrpglyglnglythr355360365thrleuthrvalserservalgluglyglyserglyglyserglygly370375380serglyglyserglyglyvalaspaspileglnleuthrglnserpro385390395400alailemetseralaserproglyglulysvalthrmetthrcysarg405410415alaserserservalsertyrmetasntrptyrglnglnlyssergly420425430thrserprolysargtrpiletyraspthrserlysvalalasergly435440445valprotyrargpheserglyserglyserglythrsertyrserleu450455460thrilesersermetglualagluaspalaalathrtyrtyrcysgln465470475480glntrpserserasnproleuthr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