抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体的制作方法

抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供以高亲和力特异性结合PD-L1的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。还提供了编码本发明的抗体的核酸分子，用于表达本发明的抗体的表达载体、宿主细胞和方法。还提供了包含本发明的抗体的免疫偶联物、双特异性分子和药物组合物。本发明还公开了检测PD-L1的方法，以及使用抗-PD-L1抗体治疗包括癌症和传染病在内的各种疾病的方法。
【专利说明】抗程序性死亡配体1 (PD-L1)的人单克隆抗体
[0001] 本申请是申请日为2006年06月30日和发明名称为"抗程序性死亡配体I(H)-Ll) 的人单克隆抗体"的200680028238. 9号发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的夺叉参考
[0003] 本申请要求2005年7月1日提交的美国临时专利申请No. 60/696, 426的权利；该 申请全文引入本文作为参考。
[0004] 发明背景
[0005] 程序性死亡I (PD-I)是CD28受体家族的成员，包括CD28、CTLA-4、ICOS、ro-1和 BTLA。该家族的最初成员CD28和ICOS通过对添加单克隆抗体后增强的T细胞增殖的功能 效果而发现（Hutloff 等（1999) Nature 397 :263-266 ;Hansen 等（1980) ImmunogenicslO : 247-260)。已经鉴定了 H)-l的两种细胞表面糖蛋白配体，PD-Ll和TO-L2,已经表明它们 在与I3D-I结合后下调T细胞活化和细胞因子分泌（Freeman等（2000) J Exp Med 192: 1027-34 ;Latchman 等（2001)Nat Immunol 2:261-8 ;Carter 等（2002)Eur J Immunol 32 :634-43 ;0higashi 等（2005)Clin Cancer Res 11:2947-53)。 PD-L1(B7-H1)和 H)-L2(B7-DC)都是可与H)-l结合、但是不与其他⑶28家族成员结合的B7同源物（Blank 等（2004))。也已经显示通过IFN-Y刺激上调细胞表面上H)-L1的表达。
[0006] PD-Ll的表达已经在几种鼠和人类癌症中发现，包括人肺癌、卵巢癌和结肠癌和 各种骨髓瘤（Iwai 等（2002)PNAS 99 :12293-7 ;0higashi 等（2005)Clin Cancer Res 11 : 2947-53)。已经提示H)-L1通过提高抗原特异性T细胞克隆的细胞凋亡而在肿瘤免疫中 起作用（Dong等（2002)Nat Med 8:793-800)。也已经提示I3D-Ll可能与肠粘膜炎症有关， 并且F1D-Ll的抑制防止了与结肠炎有关的萎缩病（wasting disease) (Kanai等（2003) J Tmmun〇1 171 :4156-63)〇
[0007] 发明概沭
[0008] 本发明提供与ro-Ll结合并且表现出许多所需特性的分离的单克隆抗体，特别是 人单克隆抗体。这些特性包括与人ro-Li高亲和力结合。另外，已经显示本发明的抗体在 混合淋巴细胞反应中提高T细胞增殖、IFN- Y分泌和IL-2分泌。
[0009] 在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体 表现出至少一种以下性质：
[0010] (a)以I X KT7M或更低的Kd与人PD-Ll结合；
[0011] (b)在混合淋巴细胞反应（MLR)试验中提高T细胞增殖；
[0012] (c)在MLR试验中提高干扰素-Y产生；
[0013] (d)在MLR试验中提高IL-2分泌；
[0014] (e)刺激抗体应答；或
[0015] (f)逆转T调节细胞对T细胞效应细胞和/或树突细胞的作用。
[0016] 优选地，该抗体为人抗体，但是在替代实施方案中，该抗体也可以是，例如，鼠抗 体、嵌合抗体或人源化抗体。
[0017] 在特定实施方案中，该抗体以5X KT8M或更低的Kd与人ro-Ll结合，以IXKT8M 或更低的Kd与人ro-Ll结合，以5X KT9M或更低的Kd与人ro-Ll结合，以5X KT9M或更低 的Kd与人PD-Ll结合，或以I X KT8M至I X KTkiM之间的Kd与人PD-Ll结合。
[0018] 在另一实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中 该抗体与参比抗体交叉竞争结合F 1D-Ll,所述参比抗体包括：
[0019] (a)包含选自SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的人重链可变 区；和
[0020] (b)包含选自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的人 轻链可变区。
[0021] 在各种实施方案中，所述参比抗体包括：
[0022] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重链可变区；和
[0023] (b)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列的轻链可变区。
[0024] 或所述参比抗体包括：
[0025] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重链可变区；和
[0026] (b)包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列的轻链可变区；
[0027] 或所述参比抗体包括：
[0028] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重链可变区；和
[0029] (b)包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列的轻链可变区；
[0030] 或所述参比抗体包括：
[0031] (a)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的重链可变区；和
[0032] (b)包含SEQ ID NO : 14的氨基酸序列的轻链可变区；
[0033] 或所述参比抗体包括：
[0034] (a)包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重链可变区；和
[0035] (b)包含SEQ ID NO : 15的氨基酸序列的轻链可变区；
[0036] 或所述参比抗体包括：
[0037] (a)包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的重链可变区；和
[0038] (b)包含SEQ ID NO : 16的氨基酸序列的轻链可变区；
[0039] 或所述参比抗体包括：
[0040] (a)包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重链可变区；和
[0041] (b)包含SEQ ID NO : 17的氨基酸序列的轻链可变区；
[0042] 或所述参比抗体包括：
[0043] (a)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的重链可变区；和
[0044] (b)包含SEQ ID NO : 18的氨基酸序列的轻链可变区；
[0045] 或所述参比抗体包括：
[0046] (a)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列的重链可变区；和
[0047] (b)包含SEQ ID NO : 19的氨基酸序列的轻链可变区；
[0048] 或所述参比抗体包括：
[0049] (a)包含SEQ ID NO : 10的氨基酸序列的重链可变区；和
[0050] (b)包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的轻链可变区。
[0051] 在另一方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自 或源自人％ 1-18基因的重链可变区，其中该抗体与ro-Li特异性结合。本发明进一步提供 一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人Vh 1-69基因的重链可变 区，其中该抗体与ro-Li特异性结合。本发明进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原 结合部分或片段，其包含产自或源自人V h 1-3基因的重链可变区，其中该抗体与ro-Ll特 异性结合。本发明进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源 自人V h 3-9基因的重链可变区，其中该抗体与ro-Ll特异性结合。本发明进一步提供一种 分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V k L6基因的轻链可变区，其中 该抗体与H)-L1特异性结合。本发明进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分 或片段，其包含产自或源自人V k L15基因的轻链可变区，其中该抗体与H)-L1特异性结合。 本发明甚至进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源 自人V k A27基因的轻链可变区，其中该抗体与H)-L1特异性结合。本发明甚至进一步提供 一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源自人V k L18基因的轻链 可变区，其中该抗体与I3D-Ll特异性结合。
[0052] 在一个特别优选的实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合 部分或片段，其包含：
[0053] (a)人Vh 1-18基因的重链可变区；和
[0054] (b)人Vk L6的轻链可变区；
[0055] 其中该抗体与ro-Ll特异性结合。
[0056] 在另一优选的实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分 或片段，其包含：
[0057] (a)人Vh 1-69基因的重链可变区；和
[0058] (b)人Vk L6的轻链可变区；
[0059] 其中该抗体与ro-Li特异性结合。
[0060] 在另一优选的实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分 或片段，其包含：
[0061] (a)人Vh 1-3基因的重链可变区；和
[0062] (b)人Vk Ll5的轻链可变区；
[0063] 其中该抗体与ro-Li特异性结合。
[0064] 在另一优选的实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分 或片段，其包含：
[0065] (a)人Vh 1-69基因的重链可变区；和
[0066] (b)人Vk A27的轻链可变区；
[0067] 其中该抗体与ro-Li特异性结合。
[0068] 在另一优选的实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分 或片段，其包含：
[0069] (a)人Vh 3-9基因的重链可变区；和
[0070] (b)人Vk Ll5的轻链可变区；
[0071] 其中该抗体与I3D-Ll特异性结合。
[0072] 在另一优选的实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分 或片段，其包含：
[0073] (a)人Vh 3-9基因的重链可变区；和
[0074] (b)人Vk L18的轻链可变区；
[0075] 其中该抗体与ro-Li特异性结合。
[0076] 在另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包 括：
[0077] 包含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的重链可变区；和包含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的轻 链可变区，其中：
[0078] (a)重链可变区 CDR3 序列包含选自 SEQ ID 勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和 50的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；
[0079] (b)轻链可变区 CDR3 序列包含选自 SEQ ID 勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和 80的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；
[0080] (C)该抗体与人PD-Ll特异性结合。
[0081] 优选地，重链可变区 CDR2 序列包含选自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、 39和40的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。优 选地，重链可变区CDRl序列包含选自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的 氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区⑶Rl序列包含选自SEQ ID NO :51、 52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。
[0082] 在另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链 可变区和轻链可变区，其中：
[0083] (a)重链可变区包含与选自SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列 至少80%同源的氨基酸序列；
[0084] (b)轻链可变区包含与选自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨 基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；并且
[0085] (c)该抗体以I X KT7M或更低的Kd与人PD-Ll结合。
[0086] 在一个优选实施方案中，抗体还包括至少一种以下的性质：
[0087] (a)该抗体在混合淋巴细胞反应（MLR)试验中提高T细胞增殖；
[0088] (b)该抗体在MLR试验中提高干扰素-Y产生；或
[0089] (c)该抗体在MLR试验中提高IL-2分泌。
[0090] 在优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包 括：
[0091] (a)包含选自 SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重 链可变区CDRl ;
[0092] (b)包含选自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重 链可变区CDR2 ;
[0093] (c)包含选自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的重 链可变区CDR3 ;
[0094] (d)包含选自 SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列的轻 链可变区CDRl ;
[0095] (e)包含选自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列的轻 链可变区CDR2 ;和
[0096] (f)包含选自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列的轻 链可变区CDR3 ;
[0097] 其中该抗体特异性结合ro-Ll。
[0098] 一种优选的组合包括：
[0099] (a)包含SEQ ID NO :21的重链可变区CDRl ;
[0100] (b)包含SEQ ID NO :31的重链可变区CDR2 ;
[0101] (c)包含SEQ ID NO :41的重链可变区CDR3 ;
[0102] (d)包含SEQ ID NO :51的轻链可变区CDRl ;
[0103] (e)包含SEQ ID NO :61的轻链可变区CDR2 ;和
[0104] (f)包含SEQ ID NO :71的轻链可变区CDR3。
[0105] 另一种优选的组合包括：
[0106] (a)包含SEQ ID NO :22的重链可变区CDRl ;
[0107] (b)包含SEQ ID NO :32的重链可变区CDR2 ;
[0108] (c)包含SEQ ID NO :42的重链可变区CDR3 ;
[0109] (d)包含SEQ ID NO :52的轻链可变区CDRl ;
[0110] (e)包含SEQ ID NO :62的轻链可变区CDR2 ;和
[0111] (f)包含SEQ ID NO :72的轻链可变区CDR3。
[0112] 另一种优选的组合包括：
[0113] (a)包含SEQ ID NO :23的重链可变区CDRl ;
[0114] (b)包含SEQ ID NO :33的重链可变区CDR2 ;
[0115] (c)包含SEQ ID NO :43的重链可变区CDR3 ;
[0116] (d)包含SEQ ID NO :53的轻链可变区CDRl ;
[0117] (e)包含SEQ ID NO :63的轻链可变区CDR2 ;和
[0118] (f)包含SEQ ID NO :73的轻链可变区CDR3。
[0119] 另一种优选的组合包括：
[0120] (a)包含SEQ ID NO :24的重链可变区CDRl ;
[0121] (b)包含SEQ ID NO :34的重链可变区CDR2 ;
[0122] (c)包含SEQ ID NO :44的重链可变区CDR3 ;
[0123] (d)包含SEQ ID NO :54的轻链可变区CDRl ;
[0124] (e)包含SEQ ID NO :64的轻链可变区CDR2 ;和
[0125] (f)包含SEQ ID NO :74的轻链可变区CDR3。
[0126] 另一种优选的组合包括：
[0127] (a)包含SEQ ID NO :25的重链可变区CDRl ;
[0128] (b)包含SEQ ID NO :35的重链可变区CDR2 ;
[0129] (c)包含SEQ ID NO :45的重链可变区CDR3 ;
[0130] (d)包含SEQ ID NO :55的轻链可变区CDRl ;
[0131] (e)包含SEQ ID NO :65的轻链可变区CDR2 ;和
[0132] (f)包含SEQ ID NO :75的轻链可变区CDR3。
[0133] 另一种优选的组合包括：
[0134] (a)包含SEQ ID NO :26的重链可变区CDRl ;
[0135] (b)包含SEQ ID NO :36的重链可变区CDR2 ;
[0136] (c)包含SEQ ID NO :46的重链可变区CDR3 ;
[0137] (d)包含SEQ ID NO :56的轻链可变区CDRl ;
[0138] (e)包含SEQ ID NO :66的轻链可变区CDR2 ;和
[0139] (f)包含SEQ ID NO :76的轻链可变区CDR3。
[0140] 另一种优选的组合包括：
[0141] (a)包含SEQ ID NO :27的重链可变区CDRl ;
[0142] (b)包含SEQ ID NO :37的重链可变区CDR2 ;
[0143] (c)包含SEQ ID NO :47的重链可变区CDR3 ;
[0144] (d)包含SEQ ID NO :57的轻链可变区CDRl ;
[0145] (e)包含SEQ ID NO :67的轻链可变区CDR2 ;和
[0146] (f)包含SEQ ID NO :77的轻链可变区CDR3。
[0147] 另一种优选的组合包括：
[0148] (a)包含SEQ ID NO :28的重链可变区CDRl ;
[0149] (b)包含SEQ ID NO :38的重链可变区CDR2 ;
[0150] (c)包含SEQ ID NO :48的重链可变区CDR3 ;
[0151] (d)包含SEQ ID NO :58的轻链可变区CDRl ;
[0152] (e)包含SEQ ID NO :68的轻链可变区CDR2 ;和
[0153] (f)包含SEQ ID NO :78的轻链可变区CDR3。
[0154] 另一种优选的组合包括：
[0155] (a)包含SEQ ID NO :29的重链可变区CDRl ;
[0156] (b)包含SEQ ID NO :39的重链可变区CDR2 ;
[0157] (c)包含SEQ ID NO :49的重链可变区CDR3 ;
[0158] (d)包含SEQ ID NO :59的轻链可变区CDRl ;
[0159] (e)包含SEQ ID NO :69的轻链可变区CDR2 ;和
[0160] (f)包含SEQ ID NO :79的轻链可变区CDR3。
[0161] 另一种优选的组合包括：
[0162] (a)包含SEQ ID NO :30的重链可变区CDRl ;
[0163] (b)包含SEQ ID NO :40的重链可变区CDR2 ;
[0164] (c)包含SEQ ID NO :50的重链可变区CDR3 ;
[0165] (d)包含SEQ ID NO :60的轻链可变区CDRl ;
[0166] (e)包含SEQ ID NO :70的轻链可变区CDR2 ;和
[0167] (f)包含SEQ ID NO :80的轻链可变区CDR3。
[0168] 其他本发明优选的抗体或其抗原结合部分包括：
[0169] (a)包含选自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重链可变区； 和
[0170] (b)包含选自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的轻 链可变区；
[0171] 其中该抗体与ro-Li特异性结合。
[0172] -种优选的组合包括：
[0173] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重链可变区；和
[0174] (b)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列的轻链可变区。
[0175] 另一种优选的组合包括：
[0176] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重链可变区；和
[0177] (b)包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列的轻链可变区。
[0178] 另一种优选的组合包括：
[0179] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重链可变区；和
[0180] (b)包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列的轻链可变区。
[0181] 另一种优选的组合包括：
[0182] (a)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的重链可变区；和
[0183] (b)包含SEQ ID NO : 14的氨基酸序列的轻链可变区。
[0184] 另一种优选的组合包括：
[0185] (a)包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重链可变区；和
[0186] (b)包含SEQ ID NO : 15的氨基酸序列的轻链可变区。
[0187] 另一种优选的组合包括：
[0188] (a)包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的重链可变区；和
[0189] (b)包含SEQ ID NO : 16的氨基酸序列的轻链可变区。
[0190] 另一种优选的组合包括：
[0191] (a)包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重链可变区；和
[0192] (b)包含SEQ ID NO : 17的氨基酸序列的轻链可变区。
[0193] 另一种优选的组合包括：
[0194] (a)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的重链可变区；和
[0195] (b)包含SEQ ID NO : 18的氨基酸序列的轻链可变区。
[0196] 另一种优选的组合包括：
[0197] (a)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列的重链可变区；和
[0198] (b)包含SEQ ID NO : 19的氨基酸序列的轻链可变区。
[0199] 另一种优选的组合包括：
[0200] (a)包含SEQ ID NO : 10的氨基酸序列的重链可变区；和
[0201] (b)包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的轻链可变区。
[0202] 在本发明的另一方面，提供了与上述任意抗体竞争结合ro-Ll的抗体或其抗原结 合部分。
[0203] 本发明的抗体可以是，例如，如IgGl或IgG4同种型的全长抗体。或者，这些抗体 可以是抗体片段，如Fab或Fab' 2片段，或单链抗体。
[0204] 本发明也提供一种免疫偶联物，其包含与诸如细胞毒素或放射性同位素等治疗剂 连接的本发明的抗体或其抗原结合部分。本发明也提供一种双特异性分子，其包含与第二 功能部分连接的本发明的抗体或其抗原结合部分，该第二功能部分具有与该抗体或其抗原 结合部分不同的结合特异性。
[0205] 还提供包含本发明的抗体或其抗原结合部分或免疫偶联物或双特异性分子和药 学上可接受的载体的组合物。
[0206] 本发明也包括编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含这些核 酸的表达载体，和包含这些表达载体的宿主细胞。而且，本发明提供一种含有人免疫球蛋白 重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达本发明的抗体，以及由这种小鼠制备的 杂交瘤，其中该杂交瘤产生本发明的抗体。
[0207] 在另一方面，本发明提供一种调节受试者中的免疫应答的方法，包括给该受试者 施用本发明的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答得到调节。优选地，本发明 的抗体增强、刺激或提高受试者中的免疫应答。
[0208] 在另一方面，本发明提供一种抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，包括给该受 试者施用治疗有效量的抗-PD-Ll抗体或其抗原结合部分。本发明的抗体优选地用于该方 法中，尽管也可以使用其他抗-PD-Ll抗体代替（或者与本发明的抗-PD-Ll抗体组合）。例 如，在抑制肿瘤生长的方法中可以使用嵌合、人源化或完全人类抗-PD-Ll抗体。
[0209] 在另一方面，本发明提供一种治疗受试者中的传染病的方法，包括给该受试者施 用治疗有效量的抗-PD-Ll抗体或其抗原结合部分，使得所述受试者的传染病得到治疗。本 发明的抗体优选地用于该方法中，尽管也可以使用其他抗-PD-Ll抗体代替（或者与本发明 的抗-PD-Ll抗体组合）。例如，在治疗传染病的方法中可以使用嵌合、人源化或完全人类 抗-PD-Ll抗体。
[0210] 另外，本发明提供一种增强受试者中对抗原的免疫应答的方法，包括给该受试者 施用：（i)抗原；和（ii)抗-PD-Ll抗体或其抗原结合部分，使得所述受试者中对抗原的免 疫应答得到加强。所述抗原可以是，例如，肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗 原。本发明的抗体优选地用于该方法中，尽管也可以使用其他抗-PD-Ll抗体代替（或者与 本发明的抗-PD-Ll抗体组合）。例如，在增强受试者中对抗原的免疫应答的方法中可以使 用嵌合、人源化或完全人类抗-PD-Ll抗体。
[0211] 本发明也提供基于本文提供的抗-PD-Ll抗体的序列制备"第二代"抗-PD-Ll抗 体的方法。例如，本发明提供一种制备抗-PD-Ll抗体的方法，包括：
[0212] (a)提供：（i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、 27、28、29 和 30 的 CDRl 序列、选自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的〇?2 序列、和选自3￡010勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的〇?3序列 ；或（^)轻链可 变区抗体序列，其包含选自SEQ ID勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的〇)1?1序列、 选自5￡010勵：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的〇)1?2序列、和选自5￡010勵 ：71、 72、73、74、75、76、77、78、79 和 80 的 CDR3 序列；
[0213] (b)改变至少一种可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，所述序列选自重链 可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列，从而产生至少一个改变的抗体序列；和
[0214] (C)将该改变的抗体序列表达为蛋白质。
[0215] 特别地，本发明涉及以下各项：
[0216] 1. 一种分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体特异性结合人 ro-Li，并且其中该抗体表现出至少一种以下性质：
[0217] (a)以I X KT7M或更低的Kd与人PD-Ll结合；
[0218] (b)在混合淋巴细胞反应（MLR)试验中提高T细胞增殖；
[0219] (c)在MLR试验中提高干扰素1产生；或
[0220] (d)在MLR试验中提高白介素-2 (IL-2)分泌。
[0221] 2.如第1项的抗体，其为IgGl、IgG2或IgG4同种型的全长抗体。
[0222] 3.如第1项的抗体，其为抗体片段或单链抗体。
[0223] 4.如第1项的抗体，其中所述抗体以5X KT9M或更低的Kd与人PD-Ll结合。
[0224] 5.如第1项的抗体，其中所述抗体以2X KT9M或更低的Kd与人PD-Ll结合。
[0225] 6. -种分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与参比抗体交叉竞争 结合F1D-Ll,所述参比抗体包括：
[0226] (a)包含选自SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的人重链可变 区；和
[0227] (b)包含选自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的人 轻链可变区。
[0228] 7.如第6项的抗体，其中所述人重链可变区包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列，人 轻链可变区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
[0229] 8.如第6项的抗体，其中所述人重链可变区包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列，人 轻链可变区包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列。
[0230] 9.如第6项的抗体，其中所述人重链可变区包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，人 轻链可变区包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列。
[0231] 10. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括产自或源自AVh 1-18基因 的重链可变区，其中该抗体与ro-Li特异性结合。
[0232] 11. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括产自或源自AVh 1-69基因 的重链可变区，其中该抗体与I3D-Ll特异性结合。
[0233] 12. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括产自或源自AVh 1-3基因 的重链可变区，其中该抗体与I3D-Ll特异性结合。
[0234] 13. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括产自或源自人Vk L6基因的 轻链可变区，其中该抗体与I3D-Ll特异性结合。
[0235] 14. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括产自或源自AVk L15基因 的轻链可变区，其中该抗体与I3D-Ll特异性结合。
[0236] 15. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
[0237] (a)人Vh 1-18基因的重链可变区；和
[0238] (b)人Vk L6的轻链可变区；
[0239] 其中该抗体与I3D-Ll特异性结合。
[0240] 16. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
[0241] (a)人Vh 1-69基因的重链可变区；和
[0242] (b)人Vk L6的轻链可变区；
[0243] 其中该抗体与H)-L1特异性结合。
[0244] 17. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
[0245] (a)人Vh 1-3基因的重链可变区；和
[0246] (b)人Vk Ll5的轻链可变区；
[0247] 其中该抗体与I3D-Ll特异性结合。
[0248] 18. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括包含⑶R1XDR2和⑶R3序 列的重链可变区；和包含⑶RU⑶R2和⑶R3序列的轻链可变区；其中：
[0249] (a)重链可变区 CDR3 序列包含选自 SEQ ID 勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和 50的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；
[0250] (b)轻链可变区 CDR3 序列包含选自 SEQ ID 勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和 80的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；
[0251] (c)该抗体与人PD-Ll特异性结合。
[0252] 19.如第18项的抗体，其中重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO :31、32、33、 34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区⑶R2 序列包含选自SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列及其保守修饰 的氨基酸序列。
[0253] 20.如第19项的抗体，其中重链可变区CDRl序列包含选自SEQ ID NO :21、22、23、 24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区⑶Rl 序列包含选自SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列及其保守修饰 的氨基酸序列。
[0254] 21. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区， 其中：
[0255] (a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列 至少80%同源的氨基酸序列；
[0256] (b)轻链可变区包含与选自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨 基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；并且
[0257] 该抗体以I X KT7M或更低的Kd与人PD-Ll结合。
[0258] 22.如第21项的抗体，其中该抗体进一步包括一种或多种选自以下的性质：
[0259] (a)该抗体在混合淋巴细胞反应（MLR)试验中提高T细胞增殖；
[0260] (b)该抗体在MLR试验中提高干扰素1产生；和
[0261] (c)该抗体在MLR试验中提高IL-2分泌。
[0262] 23. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
[0263] (a)包含选自 SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重 链可变区CDRl ;
[0264] (b)包含选自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重 链可变区CDR2 ;
[0265] (c)包含选自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的重 链可变区CDR3 ;
[0266] (d)包含选自 SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列的轻 链可变区CDRl ;
[0267] (e)包含选自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列的轻 链可变区CDR2 ;和
[0268] (f)包含选自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列的轻 链可变区CDR3 ;
[0269] 其中该抗体与I3D-Ll特异性结合。
[0270] 24.如第23项的抗体，其包括：
[0271] (a)包含SEQ ID NO :21的重链可变区CDRl ;
[0272] (b)包含SEQ ID NO :31的重链可变区CDR2 ;
[0273] (c)包含SEQ ID NO :41的重链可变区CDR3 ;
[0274] (d)包含SEQ ID NO :51的轻链可变区CDRl ;
[0275] (e)包含SEQ ID NO :61的轻链可变区CDR2 ;和
[0276] (f)包含SEQ ID NO :71的轻链可变区CDR3。
[0277] 25.如第23项的抗体，其包括：
[0278] (a)包含SEQ ID NO :22的重链可变区CDRl ;
[0279] (b)包含SEQ ID NO :32的重链可变区CDR2 ;
[0280] (c)包含SEQ ID NO :42的重链可变区CDR3 ;
[0281] (d)包含SEQ ID NO :52的轻链可变区CDRl ;
[0282] (e)包含SEQ ID NO :62的轻链可变区CDR2 ;和
[0283] (f)包含SEQ ID NO :72的轻链可变区CDR3。
[0284] 26.如第23项的抗体，其包括：
[0285] (a)包含SEQ ID NO :23的重链可变区CDRl ;
[0286] (b)包含SEQ ID NO :33的重链可变区CDR2 ;
[0287] (c)包含SEQ ID NO :43的重链可变区CDR3 ;
[0288] (d)包含SEQ ID NO :53的轻链可变区CDRl ;
[0289] (e)包含SEQ ID NO :63的轻链可变区CDR2 ;和
[0290] (f)包含SEQ ID NO :73的轻链可变区CDR3。
[0291] 27. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
[0292] (a)包含选自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重链可变区； 和
[0293] (b)包含选自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的轻 链可变区；
[0294] 其中该抗体与I3D-Ll特异性结合。
[0295] 28.如第27项的抗体，其包括：
[0296] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重链可变区；和
[0297] (b)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列的轻链可变区。
[0298] 29.如第27项的抗体，其包括：
[0299] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重链可变区；和
[0300] (b)包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列的轻链可变区。
[0301] 30.如第27项的抗体，其包括：
[0302] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重链可变区；和
[0303] (b)包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列的轻链可变区。
[0304] 31. -种组合物，其含有如第1-30任一项的抗体或其抗原结合部分，和药学上可 接受的载体。
[0305] 32. -种免疫偶联物，其包含与治疗剂连接的如第1-30任一项的抗体或其抗原结 合部分。
[0306] 33. -种组合物，其含有如第32项的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
[0307] 34.如第32项的免疫偶联物，其中所述治疗剂是细胞毒素。
[0308] 35. -种组合物，其含有如第34项的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
[0309] 36.如第32项的免疫偶联物，其中所述治疗剂是放射性同位素。
[0310] 37. -种组合物，其含有如第34项的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
[0311] 38. -种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的如第1-30任一项的抗体或 其抗原结合部分，该第二功能部分具有与该抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。
[0312] 39. -种组合物，其含有如第38项的双特异性分子和药学上可接受的载体。
[0313] 40. -种分离的核酸分子，其编码如第1-30任一项的抗体或其抗原结合部分。
[0314] 41. 一种表达载体，其包含第40项的核酸分子。
[0315] 42. -种宿主细胞，其包含第41项的表达载体。
[0316] 43. -种含有人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达如 第1-30任一项的抗体。
[0317] 44.由第43项的小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生所述抗体。
[0318] 45. -种调节受试者中的免疫应答的方法，包括给该受试者施用如第1-30任一项 的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答得到调节。
[0319] 46. -种抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，包括给该受试者施用治疗有效量 的抗-PD-Ll抗体或其抗原结合部分。
[0320] 47.如第46项的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。
[0321] 48.如第46项的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
[0322] 49.如第46项的方法，其中所述抗体是完全人类抗体。
[0323] 50.如第46项的方法，其中所述肿瘤细胞是选自黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、 结肠癌和肺癌的癌的肿瘤细胞。
[0324] 51.如第46项的方法，其中所述肿瘤细胞是选自以下癌的肿瘤细胞：骨癌、胰腺 癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸 癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴 瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、 阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴 细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿 管癌、肾盂癌、中枢神经系统（CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑 干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌 症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。
[0325] 52. -种抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，包括给该受试者施用有效抑制肿 瘤生长的量的如第1-30任一项的抗体或其抗原结合部分。
[0326] 53. -种治疗受试者中的传染病的方法，包括给该受试者施用如第1-30任一项的 抗体或其抗原结合部分，使得所述受试者的传染病得到治疗。
[0327] 54.如第53项的方法，其中所述传染病选自：HIV，流行性感冒，疱疹，贾第虫，疟 疾，利什曼原虫，以下病毒引起的病原体感染：肝炎病毒（甲、乙、丙）、疱疹病毒（例如VZV、 HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒）、腺病毒、流感病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯 萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、 细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬 病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒，以下细菌引起的病原体感染：衣原体、立克次氏体菌、 分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏杆菌、变形菌、雷氏 菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱菌、破伤风菌、肉毒杆菌、炭疽杆 菌、鼠疫杆菌、钩端螺旋体、和莱姆病细菌，以下真菌引起的病原体感染：假丝酵母（白假丝 酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母等）、新型隐球菌、曲霉（烟曲霉、黑曲 霉等）、毛霉属（毛霉、犁头霉、根霉）、申克孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢 子菌和夹膜组织胞浆菌，和以下寄生虫引起的病原体感染：溶组织内阿米巴、结肠小袋纤毛 虫、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴属的种、兰伯贾第虫、隐孢子虫属的种、卡氏肺囊虫、间日 疟原虫、果氏巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼原虫、鼠弓形体、巴西日圆线虫。
[0328] 55. -种增强受试者中对抗原的免疫应答的方法，包括给该受试者施用：（i)抗 原；和（ii)如第1-30任一项的抗体或其抗原结合部分，使得所述受试者中对抗原的免疫应 答得到加强。
[0329] 56.如第55项的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原 体的抗原。
[0330] 57. -种治疗或预防受试者中的炎性疾病的方法，包括给该受试者施用如第1-30 任一项的抗体或其抗原结合部分，使得所述受试者的炎性疾病得到治疗。
[0331] 58.如第57项的方法，其中所述炎性疾病是扁平苔藓（LP)。
[0332] 59. -种制备抗-PD-Ll抗体的方法，包括：
[0333] (a)提供：⑴重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、 27、28、29 和 30 的 CDRl 序列、选自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的〇?2 序列、和选自3￡010勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的〇?3序列 ；或（^)轻链可 变区抗体序列，其包含选自SEQ ID勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的〇)1?1序列、 选自5￡010勵：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的〇)1?2序列、和选自5￡010勵 ：71、 72、73、74、75、76、77、78、79 和 80 的 CDR3 序列；
[0334] (b)改变至少一种可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，所述可变区抗体序 列选自重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列，从而产生至少一个改变的抗体序列； 和
[0335] (C)将该改变的抗体序列表达为蛋白质。
[0336] 60.抗I3D-Ll抗体或其抗原结合部分应用于抑制肿瘤细胞生长的方法。
[0337] 61.抗I3D-Ll抗体或其抗原结合部分在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。
[0338] 62.如第1-30任一项的抗体或其抗原结合部分应用于抑制肿瘤细胞生长的方法。
[0339] 63.如第1-30任一项的抗体或其抗原结合部分在制备抑制肿瘤细胞生长的药物 中的用途。
[0340] 64.如第1-30任一项的抗体或其抗原结合部分应用于治疗传染病的方法。
[0341] 65.如第1-30任一项的抗体或其抗原结合部分在制备治疗传染病的药物中的用 途。
[0342] 66.如第1-30任一项的抗体或其抗原结合部分应用于治疗炎性疾病的方法。
[0343] 67.如第1-30任一项的抗体或其抗原结合部分在制备治疗炎性疾病的药物中的 用途。
[0344] 本发明的其他特征和优点通过下面的详述和实施例将是显而易见的，该详述和实 施例不应理解为限制性的。贯穿本申请中引用的所有参考文献、Genbank项、专利和公布的 专利申请的内容均在此处特别引入作为参考。

【专利附图】

【附图说明】
[0345] 图IA显示3G10人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :81)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:1)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:21)、CDR2(SEQ ID N0:31)和 CDR3(SEQ ID NO :41)区，并指出了 V、D和J的种系来源。
[0346] 图IB显示3G10人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :91)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:11)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:51)、CDR2(SEQ ID N0:61)和 CDR3(SEQ ID NO :71)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0347] 图2A显示12A4人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :82)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:2)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:22)、CDR2(SEQ ID N0:32)和 CDR3(SEQ ID NO :42)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0348] 图2B显示12A4人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :92)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:12)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:52)、CDR2(SEQ ID N0:62)和 CDR3(SEQ ID NO :72)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0349] 图3A显示10A5人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :83)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:3)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:23)、CDR2(SEQ ID N0:33)和 CDR3(SEQ ID NO :43)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0350] 图3B显示10A5人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :93)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:13)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:53)、CDR2(SEQ ID N0:63)和 CDR3(SEQ ID NO :73)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0351] 图4A显示5F8人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :84)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:4)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:24)、CDR2(SEQ ID N0:34)和 CDR3(SEQ ID NO :44)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0352] 图4B显示5F8人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :94)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:14)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:54)、CDR2(SEQ ID N0:64)和 CDR3(SEQ ID NO :74)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0353] 图5A显示10H10人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :85)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:5)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:25)、CDR2(SEQ ID 勵：35和〇?3(5￡0 ID NO :45)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0354] 图5B显示10H10人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :95)和氨基 酸序列（5￡0 10勵：15)。勾画出了001?1(5￡0 10勵：55)、〇)1?2(5￡0 10勵：65)和〇)1?3(5￡0 ID NO :75)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0355] 图6A显示1B12人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :86)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:6)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:26)、CDR2(SEQ ID N0:36)和 CDR3(SEQ ID NO :46)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0356] 图6B显示1B12人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :96)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:16)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:56)、CDR2(SEQ ID N0:66)和 CDR3(SEQ ID NO :76)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0357] 图7A显示7H1人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :87)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:7)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:27)、CDR2(SEQ ID N0:37)和 CDR3(SEQ ID NO :47)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0358] 图7B显示7H1人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :97)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:17)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:57)、CDR2(SEQ ID N0:67)和 CDR3(SEQ ID NO :77)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0359] 图8A显示11E6人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :88)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:8)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:28)、CDR2(SEQ ID N0:38)和 CDR3(SEQ ID NO :48)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0360] 图8B显示11E6人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :98)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:18)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:58)、CDR2(SEQ ID N0:68)和 CDR3(SEQ ID NO :78)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0361] 图9A显示12B7人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :89)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:9)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:29)、CDR2(SEQ ID N0:39)和 CDR3(SEQ ID NO :49)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0362] 图9B显示12B7人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :99)和氨基酸 序列（SEQ ID N0:19)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:59)、CDR2(SEQ ID N0:69)和 CDR3(SEQ ID NO :79)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0363] 图10A显示13G4人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO :90)和氨基 酸序列（5￡0 10勵：10)。勾画出了001?1(5￡0 10勵：30)、〇)1?2(5￡0 10勵：40)和〇)1?3(5￡0 ID NO :50)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0364] 图10B显示13G4人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列（SEQ ID NO : 100)和氨基 酸序列（SEQ ID N0:20)。勾画出了 CDR1(SEQ ID N0:60)、CDR2(SEQ ID N0:70)和 CDR3(SEQ ID NO :80)区，并指出了 V和J的种系来源。
[0365] 图11显示13G10的重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :1)与人种系Vh 1-18氨 基酸序列（SEQ ID N0:101)的比对。
[0366] 图12显示12A4的重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :2)与人种系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比对。JH6b种系序列公开为SEQ ID N0:110。
[0367] 图13显示10A5的重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :3)与人种系Vh 1-3氨基 酸序列（SEQ ID N0:103)的比对。JH4b种系序列公开为SEQ ID N0:111。
[0368] 图14显示5F8的重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :4)与人种系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比对。JH4b种系序列公开为SEQ ID N0:111。
[0369] 图15显示10H10的重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :5)与人种系Vh 3-9氨基 酸序列（SEQ ID N0:104)的比对。JH4b种系序列公开为SEQ ID N0:111。
[0370] 图16显示1B12的重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :6)与人种系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比对。JH6b种系序列公开为SEQ ID N0:110。
[0371] 图17显示7H1的重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :7)与人种系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比对。JH6b种系序列公开为SEQ ID N0:110。
[0372] 图18显示11E6的重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :8)与人种系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比对。JH6c种系序列公开为SEQ ID N0:112。
[0373] 图19显示12B7的重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :9)与人种系Vh 1-69氨基 酸序列（SEQ ID N0:102)的比对。JH6b种系序列公开为SEQ ID N0:110。
[0374] 图20显示13G4的重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :10)与人种系Vh 3-9氨基 酸序列（SEQ ID N0:104)的比对。JH4b种系序列公开为SEQ ID N0:113。
[0375] 图21显示3G10的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :11)与人种系Vk L6氨基 酸序列（SEQ ID N0:105)的比对。JKl种系序列公开为SEQ ID N0:114。
[0376] 图22显示12A4的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :12)与人种系Vk L6氨基 酸序列（SEQ ID N0:105)的比对。JKl种系序列公开为SEQ ID N0:115。
[0377] 图23显示10A5的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :13)与人种系Vk L15氨基 酸序列（SEQ ID N0:106)的比对。JK2种系序列公开为SEQ ID N0:116。
[0378] 图24显示5F8的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :14)与人种系Vk A27氨基 酸序列（SEQ ID N0:107)的比对。JKl种系序列公开为SEQ ID N0:114。
[0379] 图25显示10H10的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :15)与人种系Vk L15氨 基酸序列（SEQ ID N0:106)的比对。JK2种系序列公开为SEQ ID N0:116。
[0380] 图26显示1B12的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :16)与人种系Vk L6氨基 酸序列（SEQ ID N0:105)的比对。JKl种系序列公开为SEQ ID N0:115。
[0381] 图27显示7H1的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :17)与人种系Vk L6氨基酸 序列（SEQ ID N0:105)的比对。JKl种系序列公开为SEQ ID N0:115。
[0382] 图28显示11E6的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :18)与人种系Vk A27氨基 酸序列（SEQ ID N0:107)的比对。JK4种系序列公开为SEQ ID N0:117。
[0383] 图29显示llE6a的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :109)与人种系Vk A27氨 基酸序列（SEQ ID N0:107)的比对。JK4种系序列公开为SEQ ID N0:118。
[0384] 图30显示12B7的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :19)与人种系Vk L6氨基 酸序列（SEQ ID N0:105)的比对。JK5种系序列公开为SEQ ID N0:119。
[0385] 图31显示13G4的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO :20)与人种系Vk L18氨基 酸序列（SEQ ID N0:108)的比对。JK3种系序列公开为SEQ ID N0:120。
[0386] 图32A_C显不流式细胞头验结果，该结果证明抗人]3D-Ll的人单克隆抗体3G10、 10A5和12A4与全长人I3D-Ll转染的CHO细胞的细胞表面结合。（A) 3G10的流式细胞分析 图，（B) 10A5的流式细胞分析图，（C) 12A4的流式细胞分析图。
[0387] 图33显示流式细胞实验的结果，该结果证明抗人H)-L1的人单克隆抗体3G10、 10A5和12A4以浓度依赖的方式与全长人H)-L1转染的CHO细胞的细胞表面结合。
[0388] 图34显示ELISA实验的结果，该结果证明抗人H)-L1的人单克隆抗体3G10、10A5 和12A4与ro-Ll-Fc融合蛋白结合。
[0389] 图35显示证明在刺激的人⑶4+T细胞上HuMab滴定的实验的结果。
[0390] 图36显示证明在刺激的食蟹猴PBMC上HuMab滴定的实验的结果。
[0391] 图37A_C显不流式细胞头验的结果，该结果证明抗人]3D-Ll的人单克隆抗体3G10、 10A5和12A4与活化的T细胞表面上的H)-L1结合。（A) 3G10的流式细胞分析图，（B) 10A5 的流式细胞分析图，（C) 12A4的流式细胞分析图。
[0392] 图38证明HuMab与ES-2细胞结合。
[0393] 图39A-D显示实验结果，证明抗人H)-L1的人单克隆抗体在混合淋巴细胞反应试 验中促进T细胞增殖、IFN- Y分泌和IL-2分泌。图39A是显示使用HuMb 10A5的浓度依 赖性T细胞增殖的条图；图39B是显示使用HuMb 10A5的浓度依赖性IFN- Y分泌的条图； 图39C是显示使用HuMb 3G10和12A4的浓度依赖性IFN- Y分泌的条图；图39D是显示使 用HuMb 10A5的浓度依赖性IL-2分泌的条图。
[0394] 图40证明在MLR中使用异基因树突细胞和T细胞（CD4+效应T细胞）树突细胞， 人抗I 3D-Ll抗体对增殖和IFN-Y分泌的影响。
[0395] 图41A-D显示实验结果，证明抗人H)-L1的人单克隆抗体在含有T调节细胞的MLR 中促进T细胞增殖和IFN- Y分泌。图41A是显示使用HuMb 10A5的浓度依赖性T细胞增 殖的条图；图41B是显示使用HuMb 10A5的浓度依赖性IFN-Y分泌的条图。
[0396] 图42证明在存在调节T细胞的混合淋巴细胞反应中抗H)-L1抗体对细胞增殖的 结果。
[0397] 图43证明在存在调节T细胞的混合淋巴细胞反应中抗PD-Ll抗体对细胞因子产 生的结果。
[0398] 图44证明抗PD-Ll抗体对CMV裂解液刺激的人PBMC IFN- Y分泌的结果。
[0399] 图45显示流式细胞实验结果，证明抗人H)-L1的人单克隆抗体阻断H)-L1与表达 ro-i的CHO转染细胞的结合。
[0400] 图46显示抗PD-Ll抗体阻断PD-Ll与IFN- Y处理的ES-2细胞的结合。
[0401] 图47显示抗I3D-Ll抗体对体内肿瘤生长的影响。
[0402] 发明详沭
[0403] 在一个方面，本发明涉及特异性结合ro-Ll的分离的单克隆抗体，特别是人单克 隆抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体表现出一种或多种所需的功能性质，如与人 PD-Ll的高亲和力结合，在混合淋巴细胞反应中增强T细胞增殖、IFN- Y和/或IL-2分泌 的能力，抑制ro-Ll与ro-1受体结合的能力，刺激抗体应答的能力，和/或逆转T调节细胞 的抑制功能的能力。另外或者可替代地，本发明的抗体源自特定重链和轻链种系序列，和/ 或包含特定结构特征，如包含特定氨基酸序列的⑶R区。
[0404] 例如，本发明提供分离的抗体、制备该抗体的方法、含有该抗体的免疫偶联物和双 特异性分子、和含有本发明的抗体、免疫偶联物或双特异性分子的药物组合物。
[0405] 在另一方面，本发明涉及使用抗ro-Li抗体抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法。 本发明也涉及利用该抗体改变免疫应答，以及治疗疾病如癌症或传染病，或刺激保护性自 身免疫应答或刺激抗原特异性免疫应答的方法（例如通过抗ro-Li和目标抗原的共给药）。
[0406] 为了使本发明更容易理解，首先定义了一些术语。其他的定义在发明详述内容中 说明。
[0407] 术语"免疫应答"是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞 或肝脏产生的可溶性大分子（包括抗体、细胞因子和补体）的作用，其导致选择性损伤、破 坏或从人体中清除侵入的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或（在自身免疫或 病理性炎症的情况下）正常人细胞或组织。
[0408] "信号转导途径"是指在信号从一个细胞的一部分向一个细胞的另一部分传送中 起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。本文使用的短语"细胞表面受体"包括，例如， 能够接收信号和跨过细胞质膜传播这种信号的分子和分子复合物。本发明的"细胞表面受 体"的一个例子是ro-Li受体。
[0409] 这里提到的术语"抗体"包括完整抗体及其任何抗原结合片段（即"抗原结合部 分"）或单链。"抗体"是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重（H)链和两条轻 (L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区（在此缩写为V h)和重链恒定 区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和C h3组成。每条轻链由轻链可变区（在此缩写 为')和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域Q组成。V1^P'区可进一步再分为 高变区，称为互补决定区（CDR)，CDR散布在被称为构架区（FR)的更加保守的区域中。每个 V h和八均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1，CDRl， FR2,⑶R2，FR3,⑶R3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗 体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系 统的各种细胞（例如效应细胞）和经典补体系统的第一成分（Clq)。
[0410] 本文所用的术语抗体的"抗原结合部分"（或简称为"抗体部分"）是指保留与抗原 (例如ro-Li)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可 由全长抗体的片段来行使。术语抗体的"抗原结合部分"中所包括的结合片段的例子包括： (1汗 &13片段，即由^11、(^和〇11结构域组成的单价片段；出汗妯'） 2片段，即包含在铰链 区处通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；（iii)由V1^P Chi结构域组成的Fd片段； (iv)由抗体单臂的Vlj和Vh结构域组成的Fv片段；(V)由V h结构域组成的dAb片段（Ward 等（1989)Nature 341 :544-546);和（vi)分离的互补决定区（CDR)。此外，尽管Fv片段的 两个结构域'和Vh由单独的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过合成连接体连接在 一起，该连接体使它们能够制成一条蛋白质链，其中 '和Vh区配对构成单价分子（称为单 链 Fv(scFv);参见，例如 Bird 等（1988) Science 242 :423-426;和 Huston 等（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的"抗原结合部分" 内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对 这些片段的实用性进行筛选。
[0411] 本文使用的"分离的抗体"是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体 (例如，与PD-Ll特异性结合的分离的抗体基本不含与除PD-Ll以外的抗原特异性结合的抗 体）。但是，与ro-Li特异性结合的分离的抗体与诸如来自其他物种的ro-Li分子等其他抗 原可能具有交叉反应性。而且，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
[0412] 本文使用的术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"是指单一分子组成的抗体 分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。
[0413] 本文使用的术语"人抗体"包括具有如下可变区的抗体，在该可变区中，构架区和 CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。而且，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种 系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残 基（例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变）。但是，本 文使用的术语"人抗体"不包括其中源自另一哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已被移 植到人构架序列上的抗体。
[0414] 术语"人单克隆抗体"是指表现单一结合特异性的抗体，其具有其中构架区和CDR 区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产 生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从具有含人重链转基因和轻链 转基因的基因组的转基因非人动物（例如转基因小鼠）中获得。
[0415] 本文使用的术语"重组人抗体"包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有 人抗体，例如：(a)从对于人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物（例如小鼠）或由其 制备的杂交瘤（下文进一步描述）中分离的抗体，（b)从经转化表达人抗体的宿主细胞如 转染瘤中分离的抗体，（c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和（d)通过包括将人免疫 球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这 些重组人抗体具有其中构架区和⑶R区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在 某些实施方案中，这些重组人抗体可以经历体外诱变（或者，当使用人Ig序列的转基因动 物时，经历体内体细胞诱变），因此重组抗体的V h和' 区的氨基酸序列尽管是源自人种系 %和'序列并与之相关的序列，但可能不是在体内天然存在于人抗体种系的所有组成成分 (repertoire)中。
[0416] 本文使用的术语"同种型"是指由重链恒定区基因编码的抗体类别（例如IgM或 IgGl)。
[0417] 短语"识别抗原的抗体"和"抗原特异性抗体"在此与术语"与抗原特异性结合的 抗体"可互换使用。
[0418] 术语"人抗体衍生物"是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和其它试剂或抗体的 偶联物。
[0419] 术语"人源化抗体"是指其中来源于另外一种哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序 列已经被移植到人构架序列上的抗体。在人构架序列内也可以进行其它的构架区修饰。
[0420] 术语"嵌合抗体"是指其中可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一 个物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体。
[0421] 本文使用的术语"与人ro-Ll特异性结合"的抗体是指以IXKT7M或更低、更优选 5 X KT8M或更低、更优选I X KT8M或更低、更优选5 X KT9M或更低、甚至更优选I X KT8M至 I X KTwM或更低的Kd与人PD-Ll结合的抗体。
[0422] 本文使用的术语"Kass。。"或"Ka"是指特定抗体_抗原相互作用的结合速率，而本文 使用的术语"K dis"或"Kd"是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文使用的术语"Kd" 是指解离常数，它是由心与心的比值获得的（即Kd/Ka)，并且表示为摩尔浓度（M)。抗体的 Kd值可能用本领域建立的方法测定。测定抗体Kd的一种优选方法是使用表面等离振子共 振法，优选使用生物传感器系统，如Biacore?系统。
[0423] 本文使用的术语IgG抗体的"高亲和力"是指抗体对于靶抗原的Kd为KT 8M或更 低、更优选KT9M或更低、甚至更优选KTwM或更低。但是对于其他抗体同种型来说，"高亲 和力"结合可能不同。例如，对于IgM同种型来说，"高亲和力"结合是指抗体具有KT 7M或 更低、更优选KT8M或更低、甚至更优选KT9M或更低的K d。
[0424] 本文使用的术语"受试者"包括任何人或非人类动物。术语"非人类动物"包括所 有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖 类动物、爬行类动物等。
[0425] 本申请的各个方面在下面的章节中进一步详细描述。
[0426] 抗-PD-Ll 抗体
[0427] 本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，这些抗体与人I3D-Ll 特异性结合。优选地，本发明的抗体以高亲和力与ro-Ll结合，例如K d为IX KT7M或更低。 本发明的抗-PD-Ll抗体优选地表现出以下一种或多种特性：
[0428] (a)以I X KT7M或更低的Kd与人PD-Ll结合；
[0429] (b)在混合淋巴细胞反应（MLR)试验中提高T细胞增殖；
[0430] (c)在MLR试验中提高干扰素-Y产生；
[0431] (d)在MLR试验中提高IL-2分泌；
[0432] (e)刺激抗体应答；和/或
[0433] (f)逆转T调节细胞对T细胞效应细胞和/或树突细胞的作用。
[0434] 优选地，该抗体以5 X KT8M或更低的Kd与人PD-Ll结合，以I X KT8M或更低的Kd 与人ro-Ll结合，以5X1(T9M或更低的Kd与人ro-Ll结合，以4X1(T9M或更低的K d与人 PD-Ll结合，或以2X KT9M或更低的Kd与人I3D-Ll结合，或以IX KT9M至IX KTkiM或更低 的Kd与人ro-Li结合。
[0435] 评价抗体对I3D-Ll的结合能力的标准试验在本领域中是公知的，包括，例如 ELISA、We Stem印迹分析和RIA。合适的试验在实施例中详细描述。抗体的结合动力学（例 如结合亲和力）也可以通过本领域公知的标准试验（如Biacore?分析）来评价。
[0436] 单克降抗体 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4
[0437] 本发明优选的抗体是如实施例1和2所述分离并进行结构表征的人单克隆抗体 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4。 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 ％氨基酸序列分别显示在 SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9 和10中。3610、12六4、1(^5、5?8、101110、1812、7111、1比6、1287和1364的\氨基酸序列分别 显示在 SEQ ID 吣：11、12、13、14、15、16、17、18、19和20中。
[0438] 假定这些抗体中的每一个都能够与H)-L1结合，则V1^P '序列可以"混合并匹 配"，从而产生本发明的其他的抗-PD-Ll结合分子。PD-Ll与这些"混合并匹配的"抗体的 结合可以用上文及实施例中所述的结合试验（例如ELISA)检测。优选地，当V 1^P'链混 合并匹配时，来自特定VH/\配对的Vh序列被替换为结构上相似的V h序列。同样，优选地， 来自特定VH/\配对的 '序列被替换为结构上相似的' 序列。
[0439] 因此，在一个方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包 括：
[0440] (a)包含选自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重链可变区； 和
[0441] (b)包含选自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的轻 链可变区；
[0442] 其中该抗体与ro-Ll、优选与人ro-Ll特异性结合。
[0443] 优选的重链和轻链组合包括：
[0444] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重链可变区；和（b)包含SEQ ID NO :11的 氨基酸序列的轻链可变区；或
[0445] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重链可变区；和（b)包含SEQ ID NO :12的 氨基酸序列的轻链可变区；或
[0446] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重链可变区；和（b)包含SEQ ID NO :13的 氨基酸序列的轻链可变区；或
[0447] (a)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的重链可变区；和（b)包含SEQ ID NO : 14的 氨基酸序列的轻链可变区；或
[0448] (a)包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重链可变区；和（b)包含SEQ ID NO :15的 氨基酸序列的轻链可变区；或
[0449] (a)包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的重链可变区；和（b)包含SEQ ID NO : 16的 氨基酸序列的轻链可变区；或
[0450] (a)包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重链可变区；和（b)包含SEQ ID NO :17的 氨基酸序列的轻链可变区；或
[0451] (a)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的重链可变区；和（b)包含SEQ ID NO : 18的 氨基酸序列的轻链可变区；或
[0452] (a)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列的重链可变区；和（b)包含SEQ ID NO : 19的 氨基酸序列的轻链可变区；或
[0453] (a)包含SEQ ID NO :10的氨基酸序列的重链可变区；和（b)包含SEQ ID NO :20 的氨基酸序列的轻链可变区。
[0454] 在另一方面，本发明提供包含 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和13G4的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 比12、7111、1比6、1287和1364的￥ 11〇)1?1的氨基酸序列示于5￡0 10吣：21、22、23、24、25、 26、27、28、29 和 30 中。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 Vh CDR2 的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40 中。3G10、12A4、 10八5、5?8、101110、1812、7111、1比6、1287和1364的￥11〇)1?3的氨基酸序列示于5￡0 10吣： 41、42、43、44、45、46、47、48、49和50中。3610、12六4、1(^5、5卩8、101110、1812、7111、1比6、1287 和 13G4 的 Vk CDRl 的氨基酸序列示于 SEQ ID 勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60中。 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 Vk CDR2 的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:61、62、63、64、65、66、67、68、69 和 70 中。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、 7111、1比6、1287和1364的￥1?〇)1?3的氨基酸序列示于5￡0 10吣：71、72、73、74、75、76、77、 78、79 和 80 中。CDR 区用 Kabat 系统（Kabat，E.A?等（1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版号91-3242)勾画出。
[0455] 假如这些抗体均能与H)-L1结合，并且抗原结合特异性主要是由⑶Rl、2和3区 提供的，则V h⑶町、⑶R 2和⑶R 3序列与Vk⑶町、⑶R 2和⑶R 3序列可以"混合并匹 配"（即来自不同抗体的⑶R可以混合并匹配，但是每个抗体必须含有Vh OTR1XDR2和⑶R 3和Vk OTR1XDR 2和⑶R 3)，从而产生本发明的其他的抗-PD-Ll结合分子。PD-Ll与这些 "混合并匹配的"抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验（例如ELISA，Biacore 分析）检测。优选地，当V h OTR序列混合并匹配时，来自特定Vh序列的⑶Rl、⑶R2和/或 ⑶R3序列被替换为结构上相似的⑶R序列。同样，当V k OTR序列混合并匹配时，来自特定 Vk序列的⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3序列优选地被替换为结构上相似的⑶R序列。对于本领 域技术人员而言显而易见的是，通过将一个或多个V h和/或' CDR区序列替换为来自此处 公开的单克隆抗体 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 CDR 序列 的结构上相似的序列，可以产生新的Vh和' 序列。
[0456] 因此，在另一个方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包 括：
[0457] (a)包含选自 SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重 链可变区CDRl ;
[0458] (b)包含选自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重 链可变区CDR2 ;
[0459] (c)包含选自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的重 链可变区CDR3 ;
[0460] (d)包含选自 SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列的轻 链可变区CDRl ;
[0461] (e)包含选自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列的轻 链可变区CDR2 ;和
[0462] (f)包含选自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列的轻 链可变区CDR3 ;
[0463] 其中该抗体与ro-Ll、优选与人ro-Ll特异性结合。
[0464] 在一个优选实施方案中，该抗体包括：
[0465] (a)包含SEQ ID NO :21的重链可变区CDRl ;
[0466] (b)包含SEQ ID NO :31的重链可变区CDR2 ;
[0467] (c)包含SEQ ID NO :41的重链可变区CDR3 ;
[0468] (d)包含SEQ ID NO :51的轻链可变区CDRl ;
[0469] (e)包含SEQ ID NO :61的轻链可变区CDR2 ;和
[0470] (f)包含SEQ ID NO : 71的轻链可变区CDR3。
[0471] 在另一优选实施方案中，该抗体包括：
[0472] (a)包含SEQ ID NO :22的重链可变区CDRl ;
[0473] (b)包含SEQ ID NO :32的重链可变区CDR2 ;
[0474] (c)包含SEQ ID NO :42的重链可变区CDR3 ;
[0475] (d)包含SEQ ID NO :52的轻链可变区CDRl ;
[0476] (e)包含SEQ ID NO :62的轻链可变区CDR2 ;和
[0477] (f)包含SEQ ID NO :72的轻链可变区CDR3。
[0478] 在另一优选实施方案中，该抗体包括：
[0479] (a)包含SEQ ID NO丨3的重链可变区CDRl ;
[0480] (b)包含SEQ ID NO :33的重链可变区CDR2 ;
[0481] (c)包含SEQ ID NO :43的重链可变区CDR3 ;
[0482] (d)包含SEQ ID NO :53的轻链可变区CDRl ;
[0483] (e)包含SEQ ID NO :63的轻链可变区CDR2 ;和
[0484] (f)包含SEQ ID NO J3的轻链可变区CDR 3。
[0485] 在另一优选实施方案中，该抗体包括：
[0486] (a)包含SEQ ID NO丨4的重链可变区CDRl ;
[0487] (b)包含SEQ ID NO : 34的重链可变区CDR2 ;
[0488] (c)包含SEQ ID NO :44的重链可变区CDR 3 ;
[0489] (d)包含SEQ ID NO :54的轻链可变区CDRl ;
[0490] (e)包含SEQ ID NO :64的轻链可变区CDR2 ;和
[0491] (f)包含SEQ ID NO :74的轻链可变区CDR3。
[0492] 在另一优选实施方案中，该抗体包括：
[0493] (a)包含SEQ ID NO :?的重链可变区CDRl ;
[0494] (b)包含SEQ ID NO :35的重链可变区CDR2 ;
[0495] (c)包含SEQ ID NO :4 5的重链可变区CDR3 ;
[0496] (d)包含SEQ ID NO :55的轻链可变区CDRl ;
[0497] (e)包含SEQ ID NO :65的轻链可变区CDR2 ;和
[0498] (f)包含SEQ ID NO J5的轻链可变区CDR 3。
[0499] 在另一优选实施方案中，该抗体包括：
[0500] (a)包含SEQ ID NO :26的重链可变区CDRl ;
[0501] (b)包含SEQ ID NO :36的重链可变区CDR2 ;
[0502] (c)包含SEQ ID NO :46的重链可变区CDR3 ;
[0503] (d)包含SEQ ID NO :56的轻链可变区CDRl ;
[0504] (e)包含SEQ ID NO :66的轻链可变区CDR2 ;和
[0505] (f)包含SEQ ID NO :76的轻链可变区CDR3。
[0506] 在另一优选实施方案中，该抗体包括：
[0507] (a)包含SEQ ID NO :27的重链可变区CDRl ;
[0508] (b)包含SEQ ID NO :37的重链可变区CDR2 ;
[0509] (c)包含SEQ ID NO :47的重链可变区CDR3 ;
[0510] (d)包含SEQ ID NO :57的轻链可变区CDRl ;
[0511] (e)包含SEQ ID NO :67的轻链可变区CDR2 ;和
[0512] (f)包含SEQ ID NO :77的轻链可变区CDR3。
[0513] 在另一优选实施方案中，该抗体包括：
[0514] (a)包含SEQ ID NO :28的重链可变区CDRl ;
[0515] (b)包含SEQ ID NO :38的重链可变区CDR2 ;
[0516] (c)包含SEQ ID NO :48的重链可变区CDR3 ;
[0517] (d)包含SEQ ID NO :58的轻链可变区CDRl ;
[0518] (e)包含SEQ ID NO :68的轻链可变区CDR2 ;和
[0519] (f)包含SEQ ID NO :78的轻链可变区CDR3。
[0520] 在另一优选实施方案中，该抗体包括：
[0521] (a)包含SEQ ID NO :29的重链可变区CDRl ;
[0522] (b)包含SEQ ID NO :39的重链可变区CDR2 ;
[0523] (c)包含SEQ ID NO :49的重链可变区CDR3 ;
[0524] (d)包含SEQ ID NO :59的轻链可变区CDRl ;
[0525] (e)包含SEQ ID NO :69的轻链可变区CDR2 ;和
[0526] (f)包含SEQ ID NO :79的轻链可变区CDR3。
[0527] 在另一优选实施方案中，该抗体包括：
[0528] (a)包含SEQ ID NO :30的重链可变区CDRl ;
[0529] (b)包含SEQ ID NO :40的重链可变区CDR2 ;
[0530] (c)包含SEQ ID NO :50的重链可变区CDR3 ;
[0531] (d)包含SEQ ID NO :60的轻链可变区CDRl ;
[0532] (e)包含SEQ ID NO :70的轻链可变区CDR2 ;和
[0533] (f)包含SEQ ID NO :80的轻链可变区CDR3。
[0534] 本领域公知，不依赖于⑶Rl和/或⑶R2域，单独的⑶R3域即可以决定抗体对于同 源抗原的结合特异性，并且基于共同的CDR3序列可以预测性地产生具有相同结合特异性 的多种抗体。参见，例如，Klimka 等，British J.of Cancer 83(2) :252-260(2000)(描述了 仅使用鼠抗-⑶30抗体Ki-4的重链可变域⑶R3产生人源化抗-⑶30抗体）；Beib 〇er等， J. Mol Biol. 296 :833-849(2000)(描述了仅使用亲本鼠 M0C-31 抗-EGP-2 抗体的重链 CDR3 序列产生重组上皮糖蛋白-2 (EGP-2)抗体）；Rader 等，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 95 : 8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整联蛋白a J3抗体LM609的重链和轻链可变CDR3域 的一组人源化抗整联蛋白a J 3抗体，其中每个成员抗体在CDR3域之外含有不同的序列， 并且能够与亲本鼠抗体结合相同的表位，其亲和力与亲本鼠抗体一样高或更高）；Barbas 等，J. Am. Chem. Soc. 116 :2161-2162(1994)(公开了 CDR3域对抗原结合提供了最重要的贡 献）；Barbas 等，Proc，Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :2529-2533 (I"5)(描述了三种抗人胎盘 DNA的Fab (SI-1，SI-40和SI-32)的重链CDR3序列向抗破伤风类毒素Fab的重链上的移 植，由此替换了存在的重链⑶R3,并且证明单独的⑶R3提供结合特异性）；和Ditzel等， J. Immunol. 157 :739-749(1996)(描述了移植研究，其中仅向单特异性IgG破伤风类毒素结 合Fab p313抗体转移亲本多特异性Fab LNA3的重链⑶R3足以保留亲本Fab的结合特异 性）。上述每一参考文献都全文引入作为参考。
[0535] 因此，在某些方面，本发明提供包含一个或多个来自非人抗体如小鼠或大鼠抗体 的重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD19。在某 些实施方案中，这些本发明的包含一个或多个来自非人抗体的重链和/或轻链CDR3域的抗 体与相应的亲本非人抗体（a)能够竞争结合；(b)保留功能特性；（c)结合相同的表位；和/ 或（d)具有类似的结合亲和力。
[0536] 在其他方面，本发明提供包含一个或多个来自第一人抗体（如从非人动物获得 的人抗体）的重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中该第一人抗体能够特异性结合 CD19,并且其中来自该第一人抗体的CD3域代替了缺乏对H)-L1的结合特异性的人抗体中 的CDR3域，从而产生能够特异性结合H)-L1的第二人抗体。在某些实施方案中，本发明的 包含一个或多个来自第一人抗体的重链和/或轻链CDR3域的抗体与相应的亲本第一人抗 体（a)能够竞争结合；(b)保留功能特性；(c)结合相同的表位；和/或（d)具有类似的结 合亲和力。
[0537] 具有特定种系序列的抗体
[0538] 在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链 可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
[0539] 例如，在一个优选实施方案中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合 部分，其包含产自或源自人V h 1-18基因的重链可变区，其中该抗体与ro-L 1特异性结合。 在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产 自或源自人V h 1-69基因的重链可变区，其中该抗体与H)-L1特异性结合。在另一优选实施 方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源自 人V h 1-3基因的重链可变区，其中该抗体与ro-Li特异性结合。在另一优选实施方案中，本 发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V h 3-9基因的重 链可变区，其中该抗体与ro-Li特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离 的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V k L6基因的轻链可变区，其中该抗 体与H)-L1特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其 抗原结合部分或片段，其包含产自或源自人V k L15基因的轻链可变区，其中该抗体与H)-L1 特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部 分或片段，其包含产自或源自人V k A27基因的轻链可变区，其中该抗体与H)-L1特异性结 合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段， 其包含产自或源自人V k L18基因的轻链可变区，其中该抗体与H)-L1特异性结合。在另一 优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体：
[0540] (a)包含产自或源自人Vh 1-18、1-69、1-3或3-9基因（该基因分别编码SEQ ID NO : 101、102、103和104所示的氨基酸序列）的重链可变区；
[0541] (b)包含产自或源自人Vk L6、L15、A27或Ll基因（该基因分别编码SEQ ID NO : 105、106、107和108所示的氨基酸序列）的轻链可变区；且
[0542] (c)与ro-Ll、优选与人PD-Ll特异性结合。
[0543] 分别具有￥11 1-18和Vk 的抗体的一个例子是3G10。分别具有￥11 1-69 和Vk L6的Vk的抗体的例子是12A4、1B12、7H1和12B7。分别具有Vh 1-3和Vk L15的 Vh和Vk的抗体的一个例子是10A5。分别具有Vh 1-69和Vk A27的Vh和Vk的抗体的例子是 5F8U1E6和llE6a。分别具有V h 3-9和Vk L15的Vh和Vk的抗体的一个例子是10H10。分 另Ij具有Vh 1-3和Vk L15的Vh和Vk的抗体的一个例子是10A5。分别具有Vh 3-9和Vk L18 的Vh和Vk的抗体的一个例子是13G4。
[0544] 在本文中，如果一种人抗体的可变区是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统中获 得的，则该人抗体包含"产自"或"源自"特定种系序列的重链或轻链可变区。这样的系统 包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标抗原筛查展示在噬 菌体上的人免疫球蛋白基因文库。"产自"或"源自"人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以 这样鉴定：将该人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，选择在 序列上最接近于该人抗体序列（即有最高％同一性）的人种系免疫球蛋白序列。"产自"或 "源自"特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与该种系序列相比可能包含氨基酸差异，例如 由于天然发生的体细胞突变或定点突变的有意引入而导致的氨基酸差异。但是，选择的人 抗体在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列通常至少90%相同，并且 含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列（例如鼠种系序列）相比较时确认该人抗 体属于人类抗体的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋 白基因编码的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少96%、97%、98%或99%相同。在某 些实施方案中，源自特定人种系序列的人抗体表现与该人种系免疫球蛋白基因编码的氨基 酸序列有不超过10个氨基酸的差异。在某些其他实施方案中，该人抗体可能表现与该种系 免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过5个、或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的 差异。
[0545] 同源抗体
[0546] 在另一实施方案中，本发明的抗体包含的重链和轻链可变区含有与此处所述优选 抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本发明抗-PD-Ll抗体的所 需功能特性。
[0547] 例如，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区 和轻链可变区，其中 ：
[0548] (a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列 至少80%同源的氨基酸序列；
[0549] (b)轻链可变区包含与选自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨 基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；
[0550] (c)该抗体以I X KT7M或更低的Kd与人PD-Ll结合；
[0551] (d)该抗体在混合淋巴细胞反应（MLR)试验中提高T细胞增殖；
[0552] (e)该抗体在MLR试验中提高干扰素-Y产生；
[0553] (f)该抗体在MLR试验中提高IL-2分泌；
[0554] (g)该抗体刺激抗体应答；且
[0555] (h)该抗体逆转T调节细胞对T细胞效应细胞和/或树突细胞的作用。
[0556] 在另外一些实施方案中，￥11和/或'氨基酸序列可以与上述序列 95 %、96 %、97%、98 %或99 %同源。具有与上述序列的Vh和'区高度（即80 %或更高） 同源的Vh和 '区的抗体可以如下获得：诱变（例如定点诱变或PCR介导的诱变）编码SEQ ID NO :25、26、27、28、29和30的核酸分子，然后用此处所述的功能试验检测编码的被改变 抗体的保留的功能（即以上（c)到（h)所述的功能）。
[0557] 本文使用的两个氨基酸序列之间的百分同源性等同于两个序列之间的百分同一 性。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引入的空位的数目和每个空位的长度后， 两个序列之间的百分同一性是这两个序列共有的相同位点的数目的函数（即％同源性= 相同位点的数目/位点的总数X100)。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可以 如下面的非限制性实施例中所述用数学算法实现。
[0558] 两个氨基酸序列之间的百分同一性可以用已经整合入ALIGN程序（2.0版本） 中的 E. Meyers 和 W. Miller (Comput. Appl. Biosci.，4 :11-17(1988))的算法来确定，其使 用PAM120权重残基表，12的空位长度罚分，4的空位罚分。另外，两个氨基酸序列之间的 百分同一'I"生也可以用已经整合入GCG软件包（可从www. gcg. com获得）的GAP程序中的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48 :444-453 (1970))的算法来确定，其使用 Blossum 62 矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或6的长度权重。
[0559] 在某些情况中，本发明的蛋白质序列可以进一步作为"查询序列"用于进行公共 数据库的检索，例如鉴定相关序列。这种检索可以用Altschul等（1990)J. Mol. Biol. 215: 403-10的XBLAST程序（2. 0版本）进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得 分=50,字长=3,以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目 的的空位比对，可以采用如 Altschul 等（1997)Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402 所 述的空位BLAST。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序（例如XBLAST和 NBLAST)的缺省参数。参见 www. ncbi. nlm. nih. gov。
[0560] 具有保守修饰的抗体
[0561] 在某些实施方案中，本发明的抗体包括含⑶Rl XDR2和⑶R3序列的重链可变区和 含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的轻链可变区，其中这些⑶R序列中的一个或多个包含基于本 文所述优选抗体（例如3610、12八4、1(^5、5?8、101110、1812、7111、11￡6、1287或1364)的特定 氨基酸序列或其保守修饰，并且其中该抗体保留本发明抗-PD-Ll抗体的所需功能特性。因 此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序 列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中 ：
[0562] (a)重链可变区 CDR3 序列包含选自 SEQ ID 勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和 50的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，
[0563] (b)轻链可变区 CDR3 序列包含选自 SEQ ID 勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和 80的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，
[0564] (c)该抗体以I X KT7M或更低的Kd与人PD-Ll结合；
[0565] (d)该抗体在混合淋巴细胞反应（MLR)试验中提高T细胞增殖；
[0566] (e)该抗体在MLR试验中提高干扰素-Y产生；
[0567] (f)该抗体在MLR试验中提高IL-2分泌；
[0568] (g)该抗体刺激抗体应答；且
[0569] (h)该抗体逆转T调节细胞对T细胞效应细胞和/或树突细胞的作用。
[0570] 在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID N0:31、32、33、 34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区⑶R2 序列包含选自SEQ ID勵：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列和其保守修 饰的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，重链可变区⑶Rl序列包含选自SEQ ID NO :21、 22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区 CDRl序列包含选自SEQ ID勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列和其保 守修饰的氨基酸序列。
[0571] 本文使用的术语"保守序列修饰"是指不会显著影响或改变含该氨基酸序列的抗 体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本 领域公知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，向本发明抗体中引入修饰。保守氨基 酸置换是将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的 家族在本领域中已经定义。这些家族包括：具有碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、 酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、￠-分支侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和 芳族侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区 内的一个或多个氨基酸残基可以被置换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以 用此处所述的功能试验检测改变的抗体保留的功能（即以上（c)至（h)所述的功能）。
[0572] 与本发明的抗-PD-Ll抗体结合相同表位的抗体
[0573] 在另一实施方案中，本发明提供与本发明的任意I3D-Ll单克隆抗体结合相同表位 的抗体（即能够与本发明的任意单克隆抗体交叉竞争结合ro-Li的抗体）。在优选实施方案 中，用于交叉竞争研究的参比抗体可以是单克隆抗体3G10 (具有分别如SEQ ID NO :1和11 所示的Vh和 '序列），或单克隆抗体12A4 (具有分别如SEQ ID NO :2和12所示的Vh和' 序列），或单克隆抗体10A5 (具有分别如SEQ ID NO :3和13所示的Vh和 '序列），或单克 隆抗体10A5 (具有分别如SEQ ID NO :3和13所示的Vh和 '序列），或单克隆抗体5F8 (具 有分别如SEQ ID NO :4和14所示的Vh和 '序列），或单克隆抗体10H10 (具有分别如SEQ ID NO :5和15所示的Vh和八序列），或单克隆抗体1B12 (具有分别如SEQ ID NO :6和16 所示的Vh和 '序列），或单克隆抗体7H1 (具有分别如SEQ ID NO :7和17所示的Vh和 '序 列），或单克隆抗体11E6 (具有分别如SEQ ID NO :8和18所示的Vh和 '序列），或单克隆 抗体12B7 (具有分别如SEQ ID NO :9和19所示的Vh和八序列），或单克隆抗体13G4 (具 有分别如SEQ ID NO: 10和20所示的V1^P'序列）。这些交叉竞争抗体可以根据它们在 标准 PD-Ll 结合测定中与 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 或 13G4 交叉 竞争的能力来鉴定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞分析来证明与本 发明抗体的交叉竞争。被测试抗体抑制例如3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、 12B7或13G4与人I 3D-Ll结合的能力证明，该测试抗体可以与3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 1812、7111、11￡6、1287或1364竞争结合人^)-11，因此所结合的人^)-11上的表位与3610、 12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4相同。在一个优选实施方案中，所结合 的人 PD-Ll 上的表位与 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 或 13G4 相同的 抗体是人单克隆抗体。这些人单克隆抗体可以如实施例所述制备和分离。
[0574] 工稈化抗体和修饰的抗体
[0575] 本发明的抗体进一步可以利用具有此处所公开的一种或多种Vh和/或\序列的 抗体作为起始材料来制备，以构建一种修饰的抗体，该修饰的抗体相对于与起始抗体相比 可以具有改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区（即％和/或^例如一个或多个 CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个残基来构建抗体。另外，或者，可以通过 修饰恒定区内的残基来构建抗体，例如改变该抗体的效应功能。
[0576] 可以进行的一种类型的可变区工程化是⑶R移植。抗体主要是通过位于六个重 链和轻链互补决定区（CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内 的氨基酸序列比CDR外的序列在各个抗体之间更加多样化。由于CDR序列负责大多数抗 体-抗原相互作用，因此通过构建如下的表达载体能够表达模拟特定天然存在抗体的特性 的重组抗体：该表达载体包含来自特定天然存在抗体的⑶R序列，该⑶R序列被移植到来 自具有不同特性的不同抗体的构架序列上（参见，例如，Riechmann，L.等（1998)Nature 332 :323-327 Jones，P?等（1986)Nature 321:522-525 ;Queen，C?等（1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 :10029-10033 ;Winter 的美国专利 5, 225, 539,和 Queen 等的美国专利 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。
[0577] 因此，本发明的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 其包括含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的重链可变区，该⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列分别包含选自 5￡〇10恥：21、22、23、24、25、26、27、28、29和30,5￡〇10从） ：31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40,和 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49 和 50 的氨基酸序列，并且包括含 CDRl、 CDR2和CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO :51、 52、53、54、55、56、57、58、59和60,5￡01〇勵：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70，和5￡0 ID勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列。因此，这些抗体含有单克隆抗 体3610、12八4、1(^5、5?8、101110、1812、7111、11￡6、1287或1364的￥ 11和'〇)1?序列，但是可 能含有与这些抗体不同的构架序列。
[0578] 这些构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或发表的参考 文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下资源中发现 ： "VBase"人种系序列数据库（可从因特网上www. mrc~cpe. cam, ac. uk/vbase获得），以及 Rabat, E. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版， U. S. Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242 ;Tomlinson, I. M?等 (1992)"The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol.Biol. 227 :776-798;和 Cox, J. P. L?等（1994)''A Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage"Eur. J. Immunol. 24 :827-836 ;其内容均引入本文作为参考。
[0579] 使用本领域技术人员公知的一种被称为缺口 BLAST(Altschul等（1997)Nucleic Acids Research 25:3389-3402)的序列相似性检索方法，将抗体蛋白质序列与汇编的蛋白 质序列数据库进行比较。BLAST是一种启发式算法，其中抗体序列和数据库序列之间的统计 学显著性比对可能含有所比对的字句的高得分的片段对（HSP)。延伸或修剪不能提高其得 分的片段对被称为命中（hit)。简要地说，翻译VBASE来源的核苷酸序列（vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbasel/list2. php)，而保留FRl至FR3构架区之间并且包括该构架区的区域。 数据库数据的平均长度为98个残基。除去在蛋白质全长上准确匹配的重复序列。使用程 序blastp，除关闭的低复杂性过滤器和BL0SUM62置换矩阵以外应用缺省标准参数对蛋白 质进行BLAST检索，对于排名前5位的命中，过滤器产生序列匹配。在所有6个框架内的核 苷酸序列都翻译，在数据库序列的匹配片段中没有终止密码子的框架被认为是潜在命中。 然后使用BLAST程序tblastx进行证实。该程序翻译所有6个框架内的抗体序列，并且比 较其翻译与在所有6个框架内动态翻译的VBASE核苷酸序列。
[0580] 同一性是抗体序列和蛋白质数据库之间在序列全长上的完全氨基酸匹配。阳性 (同一性+置换匹配）不同，但是氨基酸置换由BL0SUM62置换矩阵指导。如果抗体序列以 相同的同一性匹配两个数据库序列，则阳性最强的命中被判断为匹配序列命中。
[0581] 用于本发明抗体的优选构架序列在结构上类似于所选择的本发明抗体使用的构 架序列，例如，类似于本发明优选的单克隆抗体使用的V h 1-18构架序列（SEQ ID NO :101) 和/*VH 1-69 构架序列（SEQ ID NO: 102)和/或 Vh 1-3 构架序列（SEQ ID NO: 103)和 / *VH 3-9 构架序列（SEQ ID N0:104)和 / 或Vk L6 构架序列（SEQ ID N0:105)和/*VK L15 构架序列（SEQ ID NO :106)和 / 或 Vk A27 构架序列（SEQ ID NO :107)和 / 或 Vk L18 构架序列（SEQ ID NO : 107)。Vh CDRl、CDR 2 和 CDR 3 序列和 Vk CDRl、CDR 2 和 CDR 3 序 列可以被移植到与该构架序列的来源种系免疫球蛋白基因具有相同序列的构架区上，或者 CDR序列可以被移植到与该种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。例如，已经发 现，在某些情况中，将构架区内的残基进行突变对于保持或增强抗体的抗原结合能力是有 利的（参见,例如，Queen 等的美国专利 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。
[0582] 另一种类型的可变区修饰是突变VjP /或Vk CDRUCDR2和/或CDR3区内的氨基 酸残基，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性（例如亲和力）。可以进行定点诱变或 PCR介导的诱变，以引入突变，对抗体结合的影响，或者其他目标功能特性，可以用此处所述 和实施例中提供的体外或体内试验来评价。优选引入（如上文所述的）保守修饰。这些突 变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但是优选置换。而且，一般改变⑶R区内的不超过1、2、 3、4或5个残基。
[0583] 因此，在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗-PD-Ll单克隆抗体或其抗原结 合部分，其包含的重链可变区含有：（a)V H CDRl区，其包含选自SEQ ID N0:21、22、23、24、 25、26、27、28、29和30的氨基酸序列，或与5￡01〇勵：21、22、23、24、25、26、27、28、29和30 相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b) Vh OTR2区，其包含选 自5￡01〇勵：31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列，或与5￡01〇勵：31、32、 33、34、35、36、37、38、39和40相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序 列；（c)V H CDR3 区，其包含选自 SEQ ID 勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序 列，或与5￡0 1〇勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50相比具有1、2、3、4或5个氨基酸 置换、缺失或添加的氨基酸序列；（d)V K CDRl区，其包含选自SEQ ID N0:51、52、53、54、55、 56、57、58、59和60的氨基酸序列，或与5￡01〇勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60相 比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e) Vk OTR2区，其包含选自 5￡01〇勵：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列，或与5￡01〇勵：61、62、63、 64、65、66、67、68、69和70相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列； 和（f)V K CDR3 区，其包含选自 SEQ ID 勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序 列，或与5￡0 1〇勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和80相比具有1、2、3、4或5个氨基酸 置换、缺失或添加的氨基酸序列。
[0584] 本发明的工程化抗体包括例如为了改善抗体特性而对其Vh和/或Vk内的构架残 基进行了修饰的抗体。进行这样的构架修饰一般是为了降低抗体的免疫原性。例如，一种 方法是将一个或多个构架残基"回复突变"为相应的种系序列。更特别地，经历体细胞突变 的抗体可含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与衍生该 抗体的种系序列，可以鉴定这些残基。例如，如下所述，抗-PD-I抗体3G10、12A4、10A5、5F8、 10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的构架区中的大量氨基酸改变不同于亲本种系序列。 为了使构架区序列中的一个或多个氨基酸残基恢复为其种系构型，可以通过（例如）定点 诱变或PCR介导的诱变，将该体细胞突变"回复突变"为种系序列。3G10的V h区与亲本种 系VH1-18序列的比对显示在图11中。12A4的Vh区与亲本种系V h 1-69序列的比对显示在 图12中。10A5的Vh区与亲本种系Vh 1-3序列的比对显示在图13中。5F8的Vh区与亲本 种系Vh 1-69序列的比对显示在图14中。IOHlO的Vh区与亲本种系Vh 3-9序列的比对显 示在图15中。川12的Vh区与亲本种系Vh 1-69序列的比对显示在图16中。7H1的VHg 与亲本种系Vh 1-69序列的比对显示在图17中。11E6的Vh区与亲本种系Vh 1-69序列的 比对显示在图18中。12B7的Vh区与亲本种系Vh 1-69序列的比对显示在图19中。13G4 的Vh区与亲本种系Vh 3-9序列的比对显示在图20中。
[0585] 例如，对于3G10, Vh的氨基酸残基#79 (FR3内）是缬氨酸，而在相应的Vh 1-18种 系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，可以通过（例如）定点 诱变或PCR介导的诱变，将该体细胞突变"回复突变"为种系序列（例如，3G10的V h的残基 #79 (FR3的残基#13)可以从缬氨酸"回复突变"为丙氨酸）。
[0586] 另一个例子是，对于12A4, Vh的氨基酸残基#24(FR1内）是苏氨酸，而在相应的 Vh 1-69种系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 12A4的Vh的残基#24从苏氨酸"回复突变"为丙氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括在 本发明内。
[0587] 另一个例子是，对于12A4, Vh的氨基酸残基#27 (FR1内）是天冬氨酸，而在相应的 Vh 1-69种系序列中该残基为甘氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 12A4的Vh的残基#27从天冬氨酸"回复突变"为甘氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括 在本发明内。
[0588] 另一个例子是，对于12A4, Vh的氨基酸残基#95 (FR3内）是苯丙冬氨酸，而在相应 的Vh 1-69种系序列中该残基为酪氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以 将12A4的￥11的残基#95(FR3的残基#29)从苯丙氨酸"回复突变"为酪氨酸。这种"回复 突变"的抗体也包括在本发明内。
[0589] 另一个例子是，对于5F8,氨基酸残基#24 (FR1内）是缬氨酸，而在相应的Vh 1-69 种系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将5F8的Vh 的残基#24从缬氨酸"回复突变"为丙氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括在本发明内。
[0590] 另一个例子是，对于5F8,氨基酸残基#28 (FR1内）是异亮氨酸，而在相应的Vh 1-69种系序列中该残基为苏氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将5F8 的Vh的残基#28从异亮氨酸"回复突变"为苏氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括在本发 明内。
[0591] 另一个例子是，对于10H10,氨基酸残基#24(FR1内）是缬氨酸，而在相应的Vh 3-9 种系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将10H10的 Vh的残基#24从缬氨酸"回复突变"为丙氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括在本发明内。
[0592] 另一个例子是，对于10H10,可以在氨基酸残基#97 (FR3内）后插入氨基酸。该氨 基酸为缬氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将在10H10的Vh的残基 #97之后插入的氨基酸"回复突变"，从而删除该缬氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括在 本发明内。
[0593] 另一个例子是，对于1B12,氨基酸残基#24(FR1内）是苏氨酸，而在相应的Vh 1-69 种系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将1B12的 Vh的残基#24从苏氨酸"回复突变"为丙氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括在本发明内。
[0594] 另一个例子是，对于1B12,氨基酸残基#27 (FR1内）是天冬氨酸，而在相应的Vh 1-69种系序列中该残基为甘氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 1B12的Vh的残基#27从天冬氨酸"回复突变"为甘氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括 在本发明内。
[0595] 另一个例子是，对于1B12,氨基酸残基#95 (FR3内）是苯丙氨酸，而在相应的Vh 1-69种系序列中该残基为酪氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 1B12的Vh的残基#95 (FR3的残基#29)从苯丙氨酸"回复突变"为酪氨酸。这种"回复突 变"的抗体也包括在本发明内。
[0596] 另一个例子是，对于7H1，氨基酸残基#24 (FR1内）是苏氨酸，而在相应的Vh 1-69 种系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将7H1的Vh 的残基#24从苏氨酸"回复突变"为丙氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括在本发明内。
[0597] 另一个例子是，对于7H1，氨基酸残基#77 (FR3内）是苏氨酸，而在相应的Vh 1-69 种系序列中该残基为丝氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将7H1的Vh 的残基#72(FR3的残基#11)从苏氨酸"回复突变"为丝氨酸。这种"回复突变"的抗体也 包括在本发明内。
[0598] 另一个例子是，对于11E6,氨基酸残基#78(FR3内）是丙氨酸，而在相应的Vh 1-69 种系序列中该残基为苏氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将11E6的 Vh的残基#78 (FR3的残基12)从丙氨酸"回复突变"为苏氨酸。这种"回复突变"的抗体也 包括在本发明内。
[0599] 另一个例子是，对于12B7,氨基酸残基#13 (FR1内）是谷氨酸，而在相应的Vh 1-69 种系序列中该残基为赖氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将12B7的 Vh的残基#13从谷氨酸"回复突变"为赖氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括在本发明内。 [0600] 另一个例子是，对于12B7,氨基酸残基#30 (FR1内）是天冬酰胺，而在相应的Vh 1-69种系序列中该残基为丝氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 12B7的Vh的残基#30从天冬酰胺"回复突变"为丝氨酸。这种"回复突变"的抗体也包括 在本发明内。
[0601] 另一个例子是，对于12B7,氨基酸残基#77 (FR3内）是天冬酰胺，而在相应的Vh 1-69种系序列中该残基为丝氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 12B7的Vh的残基#377 (FR3的残基11)从天冬酰胺"回复突变"为丝氨酸。这种"回复突 变"的抗体也包括在本发明内。
[0602] 另一个例子是，对于12B7,氨基酸残基#82 (FR3内）是天冬氨酸，而在相应的Vh 1-69种系序列中该残基为谷氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 12B7的Vh的残基#82 (FR3的残基#16)从天冬氨酸"回复突变"为谷氨酸。这种"回复突 变"的抗体也包括在本发明内。
[0603] 另一个例子是，对于13G4,氨基酸残基#27 (FR1内）是异亮氨酸，而在相应的Vh 1-69种系序列中该残基为苯丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 12B7的Vh的残基#27从异亮氨酸"回复突变"为苯丙氨酸。这种"回复突变"的抗体也包 括在本发明内。
[0604] 另一种类型的构架修饰涉及对构架区内、乃至一个或多个CDR区内的一个或多个 残基进行突变，以除去T细胞表位，从而降低该抗体的潜在的免疫原性。该方法也被称为 "脱免疫"，在Carr等的公布号为20030153043的美国专利中详细记载。
[0605] 除了在构架区或CDR区内进行的修饰以外，或者作为它的替代方案，也可以将本 发明的抗体改造为在Fc区内包括修饰，一般是为了改变该抗体的一种或多种功能特性，如 血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，也可以将本发明的 抗体化学修饰（例如一个或多个化学部分可以连接到该抗体上），或者修饰改变其糖基化， 以改变该抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案均在下文详细描述。Fc区中残基的编 号是Kabat的EU指数的编号。
[0606] 在一个实施方案中，修饰CHl的铰链区，使该铰链区中半胱氨酸残基的数目改变， 例如增加或减少。该方法在Bodmer等的美国专利No. 5, 677, 425号中详细记载。改变CHl 铰链区中半胱氨酸的数目是为了（例如）促进轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳 定性。
[0607] 在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低该抗体的生物半衰期。 更具体地，向Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得该 抗体与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合比天然Fc-铰链结构域与SpA的结合减弱。该方法在 Ward等的美国专利No. 6, 165, 745号中详细记载。
[0608] 在另一实施方案中，修饰抗体以提高其生物半衰期。可以使用各种方法。例如，如 Ward的美国专利No. 6, 277, 375所述，可以引入一个或多个如下突变：T252L、T254S、T256F。 或者，如Presta等的美国专利No. 5, 869, 046和6, 121，022所述，为了提高生物半衰期，该 抗体可以在CHl或CL区内进行改变，使之含有来自IgG Fc区CH2结构域的两个环的补救 受体结合表位。
[0609] 在其他一些实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基来 改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、 318、320、322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体对效应配体的亲 和力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。其亲和力被改变的效应配体可以是，例如， Fc受体或补体的Cl成分。该方法在Winter等的美国专利No. 5, 624, 821和5, 648, 260中 更详细地描述。
[0610] 在另外一个实施例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基 酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体的Clq结合改变和/或补体依赖性细胞毒性（CDC) 降低或消除。该方法在Idusogie等的美国专利No. 6, 194, 551中更详细地描述。
[0611] 在另外一个实施例中，改变氨基酸位点231和239中的一个或多个氨基酸残基，从 而改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等的PCT公布WO 94/29351中进一步描 述。
[0612] 在另外一个实施例中，为了提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC)的能力和/ 或提高抗体对Fe Y受体的亲和力，通过在下列位点处修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区： 238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、 285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、 324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、 398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法在？代8七&的？(：1'公布冊 00/42072 中进一步描述。而且，人IgGl上对于Fe Y RI、Fe Y RII、Fe Y RIII和FcRn的结合位点已 经作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体（参见，Shields，R.L.等（2001) J. Biol. Chem. 276 :6591-6604)。位点 256、290、298、333、334 和 339 处的特定突变显示改善了与 FcYRIII的结合。另外，下列组合突变体显示改善了与FcYRIII的结合：T256A/S298A， S298A/E333A，S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。
[0613] 在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体（即该 抗体缺乏糖基化）。例如，为了提高抗体对抗原的亲和力，可以改变糖基化。这样的碳水化 合物修饰可以通过（例如）改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以 进行一个或多个氨基酸置换，使一个或多个可变区构架糖基化位点消失，从而消除该位点 处的糖基化。这种无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等的美国专利 No. 5, 714, 350和6, 350, 861中更详细地描述。
[0614] 在某些其他实施方案中，可以制备糖基化类型改变的抗体，如岩藻糖基残基数目 减少的低岩藻糖基化抗体，或等分GlcNac结构增多的抗体。已经证明这种改变的糖基化模 式提高了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可以通过（例如）在糖基化机制改变的宿 主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中已有描述，能够用作宿主细 胞，在其中表达本发明的重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705 和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，FUT8(a (1，6)岩藻糖基转移酶基因），因此在Ms704、 Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物中缺乏岩藻糖。通过使用两种替 代载体定向破坏CH0/DG44细胞中的FUT8基因，产生Ms704、Ms705和Ms709FUT8+细胞系 (参见 Yamane 等的美国专利申请 No. 20040110704 和 Yamane-Ohnuki 等?（2004) Biotechnol Bioeng 87 :614-22)。另一个例子是，Hanai等的EP 1，176, 195描述了具有功能破坏的 FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖转移酶，由于减少或消除了 a (1，6)键相关的酶，在 这种细胞系中表达的抗体表现为低岩藻糖基化。Hanai等也描述了用于向结合抗体Fc区的 N-乙酰葡萄糖胺上添加岩藻糖的酶活性低或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞 系 YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta 的 PCT 公布 WO 03/035835 记载了一种变异 CHO 细胞系， Lecl3细胞，其将岩藻糖连接到Asn (297)-连接的碳水化合物上的能力降低，也导致在该宿 主细胞中表达的抗体为低岩藻糖基化（参见，Shields，R.L.等（2001) J. Biol. Chem. 277 : 26733-26740)。Umana等的PCT公布WO 99/54342记载了表达糖蛋白修饰的糖基转移酶 (例如Ml，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIIl))的工程化细胞系，因此该工程化细 胞系中表达的抗体表现为等分GlcNac结构增加，导致抗体的ADCC活性提高（参见，Umana 等（1999)Nat. Biotech. 17 :176-180)。此外，抗体的岩藻糖残基可以用岩藻糖苷酶切下。例 如，岩藻糖苷酶〇-1-岩藻糖苷酶从抗体上除去岩藻糖残基0^代拉111 〇，尤1.等.（1975) Biochem. 14 :5516-23)。
[0615] 本发明涉及的对此处所述抗体的另一种修饰是PEG化。例如，为了提高抗体的生 物（例如血清）半衰期，可以将该抗体PEG化。为了 PEG化一种抗体，一般在一个或多个 PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，将该抗体或其片段与聚乙二醇（PEG)如PEG的反 应性酯或醒衍生物反应。优选地，通过与反应性PEG分子（或类似的反应性水溶性聚合物） 的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。本文使用的术语"聚乙二醇"包括用来衍生化其他 蛋白质的任何PEG形式，如单（Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰 亚胺。在某些实施方案中，将要PEG化的抗体是一种无糖基化的抗体。将蛋白质PEG化的 方法在本领域中公知，并且可以用于本发明的抗体。参见,例如，Nishimura等的EP 0 154 316 和 Ishikawa 等的 EP 0 401 384。
[0616] 抗体工稈化方法
[0617] 如上所述，能够利用具有此处公开的V1^P Vk序列的抗-PD-Ll抗体，通过修饰Vh 和/或\序列或与之连接的恒定区，产生新的抗-PD-Ll抗体。因此，在本发明的另一方面， 利用本发明的抗-PD-Ll 抗体（例如 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 或 13G4)的结构特征，产生结构上相关的抗-PD-Ll抗体，该结构上相关的抗体保留本发明抗 体的至少一种功能特性，如与人I 3D-Ll结合。如上所述，例如，3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 1B12、7H1、11E6、12B7或13G4的一个或多个⑶R区或其突变可以与已知的构架区和/或其 他⑶R重组组合，从而产生另外的重组工程化的本发明的抗-PD-Ll抗体。其他类型的修饰 包括以上部分所述的修饰。用于工程化方法的起始材料是此处提供的一种或多种％和/或 V k序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不一定必须实际制备（即表达为蛋 白质）具有此处提供的一种或多种Vj^P/*V K序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是 用该序列中所含的信息作为起始材料，产生由原始序列衍生的"第二代"序列，然后制备该 "第二代"序列，并将其表达为蛋白质。
[0618] 因此，在另一实施方案中，本发明提供一种制备抗-PD-Ll抗体的方法，包括：
[0619] (a)提供：（i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、 27、28、29 和 30 的 CDRl 序列、选自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的〇?2 序列、和 / 或选自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49 和 50 的 CDR3 序列；和 / 或 (ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的 CDRl 序列、选自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69 和 70 的 CDR2 序列、和 / 或选自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79 和 80 的 CDR3 序列；
[0620] (b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残 基，从而产生至少一个改变的抗体序列；和
[0621] (C)将该改变的抗体序列表达为蛋白质。
[0622] 可以利用标准分子生物学技术制备和表达所述改变的抗体序列。
[0623] 优选地，由改变的抗体序列编码的抗体保留此处所述抗-PD-Ll抗体的一种、一些 或全部功能特性，该功能特性包括但不限于：
[0624] ⑴以I X KT7M或更低的Kd与人PD-Ll结合；
[0625] (ii)在混合淋巴细胞反应（MLR)试验中提高T细胞增殖；
[0626] (iii)在MLR试验中提高干扰素1产生；
[0627] (iv)在MLR试验中提高IL-2分泌；
[0628] (v)刺激抗体应答；和/或
[0629] (Vi)逆转T调节细胞对T细胞效应细胞和/或树突细胞的作用。
[0630] 改变的抗体的功能特性可以用本领域中使用的和/或此处所述的（如实施例中所 述的）标准试验（例如流式细胞术、结合测定）来评价。
[0631] 在本发明抗体的工程化方法的某些实施方案中，可以沿全部或部分抗-PD-Ll抗 体编码序列随机或选择性引入突变，并可以针对结合活性和/或如此处所述的其他功能特 性，筛选获得的修饰的抗-PD-Ll抗体。突变方法在本领域中已经描述。例如，Short的PCT 公布WO 02/092780记载了利用饱和诱变、合成连接装配或它们的组合产生和筛选抗体突 变的方法。另外，Lazar等的PCT公布WO 03/074679也记载了利用计算筛选方法优化抗体 的生理化学性质的方法。
[0632] 编码本发明的抗体的核酸分子
[0633] 本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。该核酸可以存在于完整细 胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱/SDS处理、CsCl 显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳在内的标准技术和本领域公知的其他方法与其他细胞成分 或其他污染物（例如其他细胞核酸或蛋白质）分离纯化时，核酸是"分离的"或"基本上纯 的，'。参见，F. Ausubel 等 ed. (1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如 DNA 或 RNA, 并且可以含有或者可以不含内含子序列。在一个优选实施方案中，该核酸是cDNA分子。
[0634] 本发明的核酸可以利用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤（例如，由如下文 进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤）表达的抗体，编码由杂 交瘤制备的抗体轻链和重链的cDNA可以用标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免 疫球蛋白基因文库中获得的抗体（例如使用噬菌体展示技术），可以从文库中回收编码该 抗体的一种或多种核酸。
[0635] 本发明优选的核酸分子是编码 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和13G4单克隆抗体的'序列的核酸分子。编码3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、 7111、1比6、1287和1364的￥ 11序列的〇嫩序列分别在5￡0 1〇勵：81、82、83、84、85、86、87、 88、89 和 90 中示出。编码 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的' 序列的 DNA 序列分别在 SEQ ID N0:91、92、93、94、95、96、97、98、99 和 100 中示出。
[0636] -旦获得编码Vh和 '片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这 些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这 些操作中，编码\或V h的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另 一个DNA片段有效连接。如本文使用的术语"有效连接"意思是两个DNA片段连接在一起， 使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。
[0637] 通过将编码Vh的DNA与编码重链恒定区（CHI、CH2和CH3)的另外一种DNA分 子有效连接，可以将分离的编码V h区的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因 的序列在本领域中公知（参见，例如，Kabat，E. A?等（1991) Sequences of Proteins of Immunologicl Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以 是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选的是IgGl或IgG4恒定 区。对于Fab片段重链基因，编码Vh的DNA可以与只编码重链CHl恒定区的另外一种DNA 分子有效连接。
[0638] 通过将编码 '的DNA与编码轻链恒定区CL的另外一种DNA分子有效连接，可以 将分离的编码'区的DNA转化为全长轻链基因（以及Fab轻链基因）。人轻链恒定区基 因的序列在本领域中公知（参见，例如，5^匕&1：，￡.4.等（1991)36911611068〇1^?1'(^6；[11801^ Immunologicl Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。在优选的实施方 案中，轻链恒定区可以是K或A恒定区，但最优选地是 K恒定区。
[0639] 为了产生scFv基因，将编码VdP '的DNA片段与编码柔性连接体例如编码氨基酸 序列（Gly4-Ser) 3的另外一个片段有效连接，使得Vh和'序列可以表达为连续的单链蛋白 质，其'和V h区通过该柔性连接体连接（参见，例如Bird等（1988) Science 242 :423-426 ; Huston 等（1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883 ;McCafTerty 等（1990)Nature 348 :552-554)〇
[0640] 本发明的单克降抗体的产牛
[0641] 本发明的单克隆抗体（mAb)能够通过多种技术制备，包括常规的单克隆抗体方 法，例如，Kohler和Milstein (1975)Nature 256 :495所述的标准体细胞杂交技术。虽然优 选体细胞杂交技术，但是原则上，能使用制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病 毒或致癌转化。
[0642] 用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。用小鼠产生杂交瘤是一种完善建立 的程序。免疫程序和分离用于融合的被免疫脾细胞的技术是本领域公知的。融合配偶体 (例如鼠骨髓瘤细胞）和融合程序也是公知的。
[0643] 本发明的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述获得的鼠单克隆抗体的序列来制 备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子 生物学技术将其改造为含有非鼠（例如人类）免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗 体，可以利用本领域公知的方法将鼠可变区连接到人恒定区上（参见，例如，Cabilly等 的美国专利No. 4, 816, 567)。为了产生人源化抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠CDR 区插入人构架内（参见，例如，Winter的美国专利No. 5, 225, 539,和Queen等的美国专利 No. 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。
[0644] 在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。这种抗I3D-Ll人单克隆 抗体能用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因 和转染色体小鼠包括在此分别被称作HuMab小鼠和KM小鼠?的小鼠，并且在此通称为"人 Ig小鼠"。
[0645] HuMab小鼠? (Medarex, Inc.)包含编码未重排的人重链（ii和Y)和K轻链免 疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使内源U和K链基因座失活的定向突变 (参见，例如，Lonberg等（1994)Nature 368(6474) :856-859)。因此，该小鼠表现为小鼠 IgM或K表达降低，并且响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞 突变，从而产生高亲和力人IgG K单克隆抗体（Lonberg，N?等（1994)，同上；综述Lonberg, N. (1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49-101;Lonberg,N. ^PHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65-93,和 Harding, F?和 Lonberg，N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764 :536-546)。HuMab小鼠的制备和使用，以及该小鼠携带的基因组修饰， 在下面的文献中详细描述：Taylor，L?等（1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen，J?等（1993)International Immunology 5 :647-656 ;Tuaillon 等（1993)Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 :3720-3724 ;Choi 等（1993)Nature Genetics 4:117-123 ;Chen，J?等 (1993)EMB0 J. 12 :82卜830 ;Tuaillon 等（1994)J. Immunol. 152:2912-2920;Taylor， L?等（1994) International Immunology 6 :579-591;和 Fishwild，D?等（1996)Nature Biotechnology 14 :845-851,这些文献的内容全文引入本文作为参考。进一步参见， Lonberg 和 Kay 的美国专利 No. 5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;5, 789, 650 ; 5, 877, 397 ;5, 661，016 ;5, 814, 318 ;5, 874, 299 ;和 5, 770, 429 ;和 Surani 等的美国专利 No. 5, 545, 807 ;Lonberg 和 Kay 的 PCT 公布号 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, TO 98/24884 和 TO 99/45962 ;和 Korman 等的 PCT 公布号 TO 01/14424。
[0646] 在另一实施方案中，可以用转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠， 例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生本发明的人抗体。这种小鼠在此被 称为"KM小鼠?"，在Ishida等的PCT公布WO 02/43478中详细描述。
[0647] 再者，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域中可以获得，能 够用来产生本发明的抗-PD-Ll抗体。例如，可以使用一种被称作Xenomouse (Abgenix， Inc.)的替代转基因系统，这种小鼠在例如Kucherlapati等的美国专利No. 5, 939, 598 ; 6, 075, 181 ;6, 114, 598 ;6, 150, 584 和 6, 162, 963 中描述。
[0648] 而且，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域中可以获得，能 够用来产生本发明的抗-PD-Ll抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色 体的小鼠，其被称作"TC小鼠"；这种小鼠在Tomizuka等（2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :722-727中描述。另外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛（Kuroiwa 等（2002)Nature Biotechnology 20:889-894)，其能够用来产生本发明的抗-PD-Ll抗体。
[0649] 本发明的人单克隆抗体也可以使用用于筛查人免疫球蛋白基因文库的噬菌体 展示方法制备。这种用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域中已经建立。参见，例 如，Ladner 等的美国专利 No. 5, 223, 409 ;5, 403, 484 ;和 5, 571，698 ;Dower 等的美国专利 No. 5, 427, 908 和 5, 580, 717 ;McCafferty 等的美国专利 No. 5, 969, 108 和 6, 172, 197 ;和 Griffiths 等的美国专利 No. 5, 885, 793 ;6, Ml, 404 ;6, 544, 73I ;6, 555, 3I3 ;6, 582, 9I3O, 31，32, 33, 34, 35 和 36, 593, 081。
[0650] 本发明的人单克隆抗体也可以用SCID小鼠制备，该SCID小鼠中重构了人免 疫细胞，因此在免疫时能够产生人抗体应答。这种小鼠在例如Wilson等的美国专利 No. 5, 476, 996 和 5, 698, 767 中描述。
[0651] 人Ig小鼠的免疫
[0652] 当使用人Ig小鼠产生本发明的人抗体时，根据Lonberg，N.等（1994)Nature 368(6474) :856-859 ;Fishwild，D?等（1996)Nature Biotechnology 14 :845-851 JPPCT 公布WO 98/24884和WO 01/14424所述，用纯化的或富集的H)-L1抗原和/或重组H)-L1 或F1D-Ll融合蛋白的制剂免疫该小鼠。优选地，第一次输注时小鼠为6-16周龄。例如，可 以使用纯化的或重组的I 3D-Ll抗原的制剂（5-50 ii g)腹膜内免疫人Ig小鼠。
[0653] 产生抗H)-L1完全人单克隆抗体的详细程序在下面的实施例1中描述。应用各种 抗原积累的经验证明，当最初使用弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内（IP)免疫，接着隔周用弗 氏不完全佐剂中的抗原腹膜内免疫（最多共六次）时，转基因小鼠产生应答。但是，发现弗 氏佐剂之外的佐剂也是有效的。另外，发现在没有佐剂时，全细胞具有高度免疫原性。在免 疫方案进程中用眼眶后取血获得的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如下所述）筛选 血浆，用具有足够抗-PD-Ll人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。用抗原对小鼠进行静脉内 加强免疫，3天后处死并且取出脾脏。预期每次免疫可能需要2-3次融合。每一种抗原一般 免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCol2系都使用。另外，HCo7和HCol2转基因可以杂交， 产生具有两种不同人重链转基因（HC 〇7/HC〇12)的一种小鼠。可替代地或者另外，如实施例 1所述，可以使用KM小鼠?系。
[0654] 产牛本发明的人单克降抗体的杂夺瘤的制各
[0655] 为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，从被免疫的小鼠中分离脾细胞和 /或淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖化细胞系（例如小鼠骨髓瘤细胞系）融合。根据抗 原特异性抗体的产生筛选得到的杂交瘤。例如，可以使用50% PEG，将来自被免疫小鼠的脾 淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8. 653非分泌小鼠骨髓瘤细胞（ATCC， CRL 1580)融合。将细胞以大约2X IO5的密度接种于平底微量滴定板中，接着在含有20% 胎克隆血清，18%"653"条件基质，5%〇1^611(16￡沁，411111-谷氨酰胺，11111丙酮酸钠，51111 HEPES，0. 055mM 2-巯基乙醇，50单位/毫升青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和 lXHAT(Sigma;融合后24小时加入HAT)的选择性培养基中温育两周。大约两周之后，在用 HT替换了 HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA根据人单克隆IgM和IgG抗体筛选各 孔。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天之后观察培养基。将分泌抗体的杂交 瘤再次平板接种，再次筛选，如果对于人IgG仍然是阳性，则可以通过有限稀释将单克隆抗 体至少亚克隆两次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于表 征。
[0656] 为了纯化人单克隆抗体，选择的杂交瘤可以在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇 瓶中生长。过滤上清液，浓缩，之后用蛋白A-sepharose (Pharmacia, Piscataway，N. J.)进 行亲和层析。洗脱下来的IgG通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查以确保纯度。将缓冲 溶液换成PBS，用1. 43的消光系数根据0D280确定浓度。可将单克隆抗体分成等份并且 在-80°C下保存。
[0657] 产牛本发明的单克降抗体的转染瘤的制各
[0658] 利用（例如）本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合（例如， Morrison，S. (1985)science 229:1202)，也能在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。
[0659] 例如，为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术（例如，使用表达 目标抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆），获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并 将该DNA插入到表达载体中，使得基因与转录和翻译控制序列有效连接。在上下文中，术语 "有效连接"意思是抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥它们调 节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择与所用的表达宿主细胞相匹配的表达载体和 表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可被插入到分开的载体中，或者，更通常地， 将两个基因插入到同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中（例如， 抗体基因片段上的互补限制性位点与载体连接，或者如果不存在限制性位点的活，则平端 连接）。通过插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得 Vh区段与载体中的C h区段有效连接，而Vk区段与载体中的Q区段有效连接，可以利用本文 描述的抗体的轻链和重链可变区产生任意抗体同种型的全长抗体基因。另外，或者可替代 地，重组表达载体能编码有利于宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆到载 体中，使得信号肽与该抗体链基因的氨基末端符合阅读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋 白信号肽或异源信号肽（即，来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽）。
[0660] 除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还带有控制该抗体链基因在宿主细胞 中表达的调节序列。术语"调节序列"包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译 的其他表达控制元件（例如，多腺苷酸化信号）。这样的调节序列例如在Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego， CA(1990))中描述。本领域技术人员应当理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，取决 于诸如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞 表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来源 于巨细胞病毒（CMV)、猿病毒40 (SV40)、腺病毒（例如，腺病毒主要晚期启动子（AdMLP))和 多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子 或珠蛋白启动子。另外，调节元件也可由来自诸如SRa启动子系统等不同来源的序列 组成，SRa启动子系统含有来自SV40早期启动子的序列和人1型T细胞白血病病毒的长 末端重复序列（Takebe，Y?等（1988)Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
[0661] 除了抗体链基因和调节序列以外，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序 列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列（例如，复制起点）和选择性标记基因。选择 性标记基因有利于筛选载体已经导入其中的宿主细胞（参见，例如，Axel等的美国专利 No. 4, 399, 216,4, 634, 665和5, 179, 017)。例如，选择性标记基因一般给已经导入载体的宿 主细胞带来抗药性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶 酸还原酶（DHFR)基因（在dhfr-宿主细胞中用于氨甲喋呤选择/扩增）和neo基因（用 于G418选择）。
[0662] 为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细 胞中。术语"转染"的各种形式包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的各种 技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然在理论上可以在原核或真 核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中，最优选在哺乳动物宿主细胞中 表达该抗体，因为这样的真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装和分泌正 确折叠并且具有免疫活性的抗体。据报道，原核表达抗体基因无法高产率地产生活性抗体 (Boss，M. A?和 Wood，C.R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。
[0663] 用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢（CH0细 胞）（包括 Urlaub 和 Chasin，（1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220 中描述的 dhfr-CHO细胞，和DHFR选择性标记一起使用，例如，如R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159 :601-621所述）、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，用于NSO骨 髓瘤细胞的另一种优选表达系统是WO 87/04462、W0 89/01036和EP 338, 841公开的GS基 因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主 细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地，培养足以使抗体分泌到宿主 细胞生长的培养基中的时间，而产生抗体。可应用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗 体。
[0664] 抗体与抗原结合的表征
[0665] 通过（例如）标准ELISA，可以检测本发明的抗体与H)-L1的结合。简要地说，用 0. 25 ii g/ml的纯化H)-L1在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5 %牛血清白 蛋白封闭。向各个孔中加入抗体的稀释液（例如，来自PD-Ll免疫小鼠的血浆的稀释液）， 并且在37°C下温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤培养板，之后和与碱性磷酸酶偶联的第二 试剂（例如，对于人抗体，为山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂）一起在37°C下温育1小 时。洗涤后，培养板用PNPP底物（lmg/ml)显色，并且在OD 405-650下分析。优选地，用表 现出最高效价的小鼠进行融合。
[0666] 如上所述的ELISA分析也可以用来筛选表现出与H)-L1免疫原有阳性反应性的杂 交瘤。将与ro-Li高亲合力结合的杂交瘤进行亚克隆，并且进一步表征。从每个杂交瘤中选 择保留母细胞反应性的一个克隆（通过ELISA)，制备5-10小瓶细胞库，保存在-140°C下， 用于抗体纯化。
[0667] 为了纯化抗-PD-Ll抗体，选择的杂交瘤在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶 中生长。过滤上清液并且浓缩，然后用蛋白A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ)进 行亲和层析。通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。将缓冲溶液换成 PBS，并且使用1. 43的消光系数根据OD28tl确定浓度。将单克隆抗体分成等份并且在-80°C 下保存。
[0668] 为了确定选择的抗-PD-Ll单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用商售试剂 (Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。可以使用如上所述的H)-L1包被的ELISA 板，应用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可以使用链霉抗生物 素蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化mAb的结合。
[0669] 为了确定被纯化的抗体的同种型，可以用对特定同种型抗体具有特异性的试剂进 行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，在4°C下用I y g/ml抗人免疫球 蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用1% BSA封闭之后，平板与I y g/ml或更少的测试单克隆 抗体或纯化的同种型对照物在室温下反应1-2小时。这些孔然后与人IgGl或人IgM特异 性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上所述使平板显色并且分析。
[0670] 可以通过Western印迹法进一步检测抗-PD-Ll人IgG与F1D-Ll抗原的反应性。简 要地说，制备ro-Li并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转 移到硝酸纤维素膜上，用10%胎牛血清封闭，并用待检测的单克隆抗体探查。人IgG的结合 可以用抗人IgG碱性磷酸酶检测，并用BCIP/NBT底物片（Sigma Chem. Co.，St. Louis，Mo.) 显色。
[0671] 抗体的物理件质
[0672] 本发明的抗体可以进一步通过抗I3D-Ll抗体的各种物理性质进行表征。可以利用 各种试验基于这些物理性质检测和/或区分不同类别的抗体。
[0673] 在某些实施方案中，本发明的抗体可以在轻链或重链可变区中含有一个或多个糖 基化位点。可变区中一个或多个糖基化位点的存在可能由于抗原结合改变而导致抗体的 免疫原性提高或者抗体的pK改变（Marshall等（1972)Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA 和 Morrison SL(2004)J Immunol 172 :5489-94 ;Wallick 等人（1988)J Exp Med 168 :1099-109 ;Spiro RG (2002) Glycobiology 12 :43R-56R ;Parekh等（1985) Nature 316 : 452-7 ;Mimura 等人（2000) Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化在含有 N-X-S/T 序列的 基序处发生。可变区糖基化可以用Glycoblot试验进行检测，该试验切割抗体，产生Fab，然 后利用测定高碘酸盐氧化和席夫碱形成的试验检测糖基化。或者，可变区糖基化也可以用 Dionex光层析法（Dionex-LC)检测，该方法从Fab上切下糖成为单糖，并且分析各个糖的含 量。在某些情况中，优选不含可变区糖基化的抗-PD-Ll抗体。这可以通过选择在可变区中 不含糖基化基序的抗体或者利用本领域公知的标准技术突变糖基化基序内的残基来实现。
[0674] 在一个优选实施方案中，本发明的抗体不含天冬酰胺异构化位点。脱酰胺或异天 冬氨酸作用可以分别在N-G或D-G序列上发生。脱酰胺或异天冬氨酸作用导致产生异天冬 氨酸，这通过在侧链羧基末端而不是在主链上产生扭结的结构而降低了抗体的稳定性。异 天冬氨酸的产生可以用iso-quant试验来测定，该试验利用反相HPLC检测异天冬氨酸。
[0675] 每种抗体具有独特的等电点（pi)，但是通常抗体落入6至9. 5的pH范围内。IgGl 抗体的Pl -般落入7-9. 5的pH范围内，IgG4抗体的pi -般落入6-8的pH范围内。抗 体可以具有该范围之外的pi。尽管这种作用通常未知，但是推测Pl落于正常范围之外的 抗体在体内条件下可能具有一定的解折叠和不稳定性。等电点可以用毛细管等电聚焦试 验来测定，该试验产生PH梯度，并且可以利用激光聚焦来提高精确性（Janini等（2002) Electrophoresis 23 :16〇5_11 ;Ma 等（2OOl)Chromatographia 53 :S75-89 ;Hunt 等（I"8) J Chromatogr A 800:355-67)。在某些情况中，优选pi值落入正常范围内的抗H)-L1抗 体。这可以通过选择Pl位于正常范围内的抗体或者通过利用本领域公知的标准技术突变 带电荷的表面残基来实现。
[0676] 每种抗体的烙解温度指示热稳定性（Krishnamurthy R和Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3 :361-71)。较高的热稳定性表示在体内有较高的总体抗体稳定性。抗 体的熔点可以用诸如差示扫描量热法（Chen等（2003)Pharm Res 20 :1952-60 ;Ghirlando 等（1999) Immunol Lett 68 :47-52)等技术来测量。Tm表示抗体最初解折叠的温度。Tm2表 示抗体完全解折叠的温度。通常，优选地本发明的抗体的T m大于60°C，优选大于65°C，甚 至更优选大于70°C。此外，抗体的热稳定性也可以利用圆二色性来测量（Murray等（2002) J. Chromatogr Sci 40 :343-9)。本文公开的抗F1D-Ll抗体的热稳定性总结在表1中。
[0677] 表 1
[0678]

【权利要求】
1. 一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括： (a) 包含具有选自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列的氨基酸的重链可变 区；和 (b) 包含具有选自SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的序列的氨基酸的 轻链可变区； 其中该抗体或其抗原结合部分特异性地结合ro-Li。
2. -种单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括： (a) 包含具有SEQ ID NO :1所示的序列的氨基酸的重链可变区；和 (b) 包含具有SEQ ID NO :11所示的序列的氨基酸的轻链可变区； 其中该抗体或其抗原结合部分特异性地结合ro-Li。
3. -种单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括： (a) 包含具有SEQ ID NO :2所示的序列的氨基酸的重链可变区；和 (b) 包含具有SEQ ID NO :12所示的序列的氨基酸的轻链可变区； 其中该抗体或其抗原结合部分特异性地结合ro-Li。
4. 一种人单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性地结合人ro-Li且表现出至少一种 以下性质： (a) 以1 X 1(T7M或更低的KD与人PD-L1结合； (b) 在混合淋巴细胞反应（MLR)试验中提高T细胞增殖； (c) 在MLR试验中提高干扰素产生；或 ⑷在MLR试验中提高白介素-2 (IL-2)分泌。
5. -种单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与参比抗体或其抗原结合部分交叉 竞争结合人H)-L1，所述参比抗体或其抗原结合部分包括： (a) 包含具有选自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列的氨基酸的重链可变 区；和 (b) 包含具有选自SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的序列的氨基酸的 轻链可变区。
6. -种单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括： (a) 源自人VH 1-18种系基因的重链可变区；和 (b) 源自人VK L6种系基因的轻链可变区； 其中该抗体或其抗原结合部分与ro-Li特异性结合。
7. -种单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括： (a) 源自人VH 1-69种系基因的重链可变区；和 (b) 源自人VK L6种系基因的轻链可变区； 其中该抗体或其抗原结合部分与ro-Li特异性结合。
8. 权利要求1-7任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于抑制受试者中的 肿瘤细胞生长的药物中的用途。
9. 权利要求1-7任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗受试者中的 传染病的药物中的用途。
10. -种制备抗-PD-L1抗体的方法，包括： (a) 提供编码抗体或其抗原结合部分的核酸，该抗体或其抗原结合部分包含：（i)包含 具有选自SEQ ID勵：21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的序列的氨基酸的重链可变区 CDR1、具有选自SEQ ID勵：31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的序列的氨基酸的重链可 变区CDR2、和具有选自SEQ ID N0:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的序列的氨基酸的 重链可变区 CDR3;或（ii)包含具有选自 SEQ ID 勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60 的序列的氨基酸的轻链可变区CDR1、具有选自SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、67、68、69 和70的序列的氨基酸的轻链可变区CDR2、和具有选自SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、 78、79和80的序列的氨基酸的轻链可变区CDR3 ; (b) 改变编码至少一种可变区内的至少一个氨基酸残基的核酸以产生编码包含至少一 个氨基酸改变的经改变的抗体序列或其抗原结合部分； (c) 表达所述改变的抗体序列或其抗原结合部分为蛋白质；和 (d) 评估所述改变的抗体序列或其抗原结合部分的结合活性， 其中所述改变的抗体序列或其抗原结合部分以1 X 1(T7M或更低的KD与人ro-Li特异 性结合。
【文档编号】A61P35/00GK104356236SQ201410639719
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2006年6月30日 优先权日:2005年7月1日
【发明者】A·J·科曼, M·J·塞尔比, 王常宇, M·斯里尼瓦桑, D·B·帕斯莫尔, 黄海春, 陈海斌 申请人:梅达雷克斯有限责任公司