本发明属于脆性胚性愈伤组织培养技术领域，具体涉及一种木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法。
背景技术：
木薯(manihotesculentacrantz)是大戟科木薯属植物，是一种重要的粮食与能源植物。人们通常采用传统育种方式来改良其品质，但是有些性状如抗病虫、降低氰化物含量等只有通过基因工程手段才能改良。而一个有效的再生体系是基因工程手段成功实施的先决条件。脆性胚性愈伤组织是一种直径≤1mm的组织，在液体培养过程中易分散，增殖快，绝大多数细胞具有全能性，由此可以获得的高质量的胚性悬浮培养物。因为其可以增大外源基因插入整合产生大量转化细胞的几率，所以是一种非常理想的基因转化目标组织。脆性胚性愈伤组织已被用来通过基因枪法，电转化法和农杆菌介导法获得转基因木薯植株。木薯胚性愈伤组织的诱导比较复杂。脆性胚性组织的诱导受基因型影响很大，而且发生频率很低，且诱导时间长。因此建立一种快速高效的木薯脆性胚性愈伤组织的诱导培养方法，对木薯转基因育种意义重大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法，该方法快速高效。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
(一)脆性胚性愈伤组织诱导
(1.1)选取木薯体胚块，经预处理后，置于脆性胚性愈伤组织诱导培养基上黑暗培养，诱导产生初生脆性胚性愈伤组织；
(1.2)将初生脆性胚性愈伤组织转接到新鲜的脆性胚性愈伤组织诱导培养基上增殖扩大培养，获得脆性胚性愈伤组织；
(二)脆性胚性愈伤组织再生
(2.1)将脆性胚性愈伤组织收集到液体体胚诱导培养基中，震荡培养后，去除多余的松软非胚性组织，然后倒掉液体体胚诱导培养基，再将脆性胚性愈伤组织置于体胚诱导培养基中继续诱导培养产生体胚；
(2.2)将体胚转接到新鲜体胚诱导培养基上，黑暗条件下对体胚进行扩繁培养，获得扩繁培养后体胚；
(2.3)将扩繁培养后体胚转接到体胚成熟培养基上培养，促进体胚成熟为绿色子叶型胚；
(2.4)将绿色子叶型胚转接到体胚萌发培养基中培养，促进绿色子叶型胚萌发，进而再生成苗，获得木薯植株。
在上述木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法中：
本发明步骤(1.1)中所述预处理包括将木薯体胚块置于含有甘露醇的容器中，用透气封口膜封口，然后将容器置于真空泵中，调节气压下降至0.08mpa时开始计时，15～20min后取出，在灭菌过的工作台中，将上述处理过的木薯体胚块取出，用灭菌滤纸吸干水分后，放置在脆性胚性愈伤组织诱导培养基上黑暗培养20～30天，诱导产生初生脆性胚性愈伤组织，其中甘露醇的浓度为250～300mmol/l。
优选的，本发明步骤(1.1)中所述预处理包括将木薯体胚块置于含有甘露醇的容器中，用透气封口膜封口，然后将容器置于真空泵中，调节气压下降至0.08mpa时开始计时，15min后取出，在灭菌过的工作台中，将上述处理过的体胚块取出，用灭菌滤纸吸干水分后，放置在脆性胚性愈伤组织诱导培养基上黑暗培养30天，诱导产生初生脆性胚性愈伤组织，其中甘露醇的浓度为300mmol/l。
本发明木薯体胚块先经纯化处理，纯化是将体胚块周围的非胚性愈伤组织尽量清除干净。将木薯体胚块置于甘露醇中具有调节体胚块渗透势的作用，调节气压抽真空可以将体胚块与甘露醇充分接触。
本发明中的木薯体胚块优选来源于华南6号木薯，也可以采用华南8号木薯等其它品种的木薯。
本发明步骤(1.1)～(1.2)中脆性胚性愈伤组织诱导培养基(friableembryogeniccallusinductionmedium，fecim)包括以下成分：gd(gresshofanddoybasalmedium)、2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)、蔗糖和琼脂粉，其中1lgd中加入2,4-d8～12mg、蔗糖15～20g、琼脂粉10～15g。
优选的，本发明步骤(1.1)～(1.2)中1l脆性胚性愈伤组织诱导培养基(friableembryogeniccallusinductionmedium，fecim)包括以下成分：gd(gresshofanddoybasalmedium)、2,4-d、蔗糖和琼脂粉，其中1lgd中加入2,4-d8mg、蔗糖15g、琼脂粉10g。
本发明脆性胚性愈伤组织诱导培养基作用是诱导体胚脱分化产生脆性胚性愈伤组织。胚性愈伤组织是松散的，球状，有胚活性的细胞团组织。脆性胚性愈伤组织诱导培养基中gd是为组织生长提供基本的氮磷钾钙、铁盐、微量元素和有机物等营养成分，2,4-d是促进体胚脱分化的类生长素物质。蔗糖为组织的生长提供碳源。琼脂粉是起将培养基固化的作用。
本发明步骤(1.2)中将初生脆性胚性愈伤组织转接到脆性胚性愈伤组织诱导培养基上增殖扩大培养，2～3周(更佳为2周)继代一次可获得大量脆性胚性愈伤组织。
进一步的，该脆性胚性愈伤组织可用于转基因、原生质体提取等。
本发明步骤(2.1)中体胚诱导培养基(somaticembryoinductionmedium，seim)包括以下成分：nms培养基(newmurashigeandskoog)、2,4-d、蔗糖和琼脂粉，其中1lnms培养基中加入有2,4-d8～10mg、蔗糖20～30g、琼脂粉7.5～8.5g。
优选的，本发明步骤(2.1)中1l体胚诱导培养基(somaticembryoinductionmedium，seim)包括以下成分：nms培养基(newmurashigeandskoog)、2,4-d、蔗糖和琼脂粉，其中1lnms培养基中加入有2,4-d8mg、蔗糖25g、琼脂粉7.5g。
其中nms培养基是将ms(murashigeandskoog)培养基中cacl2用量扩大为原来的5倍，其它ms培养基成分不变获得的，使用前调节ph到6.0～6.2，高温高压灭菌20min；液体体胚诱导培养基不包括琼脂粉。
本发明中nms为组织生长提供基本的氮磷钾钙、铁盐、微量元素和有机物等营养成分，2,4-d是促进脆性胚性愈伤组织分化的类生长素物质。蔗糖为组织的生长提供碳源。琼脂粉是起将培养基固化的作用。
本发明步骤(2.1)中将脆性胚性愈伤组织收集到液体体胚诱导培养基中，震荡培养1～2h后(1h更佳)，去除多余的松软非胚性组织，然后倒掉液体体胚诱导培养基，再将脆性胚性愈伤组织置于体胚诱导培养基中继续诱导培养3～4周(更佳为3周)产生体胚，培养温度为25～27℃，黑暗培养。
本发明步骤(2.2)中将体胚转接到新鲜体胚诱导培养基上，调节温度为25～27℃，黑暗条件下对体胚进行扩繁培养，每隔1个月继代一次，获得扩繁培养后的体胚。
扩繁培养时可以根据需求进行，如需要的体胚多，可多继代几次。
本发明步骤(2.3)中体胚成熟培养基包括以下成分：ms、蔗糖和琼脂粉，其中1lms中加入有蔗糖20～30g、琼脂粉7.5～8.5g。
优选的，本发明步骤(2.3)中体胚成熟培养基包括以下成分：ms、蔗糖和琼脂粉，其中1lms中加入有蔗糖25g、琼脂粉7.5g。
其中体胚成熟培养基作用是将体胚诱导成带绿色子叶型体胚。ms为组织生长提供基本的氮磷钾钙、铁盐、微量元素和有机物等营养成分。蔗糖为组织的生长提供碳源。琼脂粉是起将培养基固化的作用。
本发明步骤(2.3)中将扩繁培养后的体胚转接到体胚成熟培养基上培养，培养温度为25～27℃，光照时间为15～17h/天，光照强度为3000～4000lx，培养7～15d，促进体胚成熟为绿色子叶型胚。
优选的，本发明步骤(2.3)中将扩繁培养后的体胚转接到体胚成熟培养基上培养，培养温度为25～27℃，光照时间为16h/天，光照强度为4000lx，光照时间为10d，促进体胚成熟为绿色子叶型胚。
本发明步骤(2.4)中体胚萌发培养基中包括以下组分：ms、6-ba、蔗糖和琼脂粉，其中1lms中加入6-ba0.7～0.9mg、蔗糖20～30g、琼脂粉7.5～8.5g。
优选的，本发明步骤(2.4)中1l体胚萌发培养基中包括以下组分：ms、6-ba、蔗糖和琼脂粉，其中1lms中加入6-ba0.8mg、蔗糖25g、琼脂粉7.5g。
本发明中体胚萌发培养基作用是诱导子叶型胚发芽再生成植株。其中ms为组织生长提供基本的氮磷钾钙、铁盐、微量元素和有机物等营养成分。6-ba是促进芽萌发的细胞分裂素，蔗糖为组织的生长提供碳源。琼脂粉是起将培养基固化的作用。
本发明步骤(2.4)中将绿色子叶型胚转接到体胚萌发培养基中培养，培养温度为25～27℃，光照时间为15～17h/天，光照强度为3000～4000lx，培养25～35d，促进绿色子叶型胚萌发，进而再生成苗，获得木薯植株。
优选的，本发明步骤(2.4)中将绿色子叶型胚转接到体胚萌发培养基中培养，培养温度为25～27℃，光照时间为16h/天，光照强度为4000lx，培养30d，促进绿色子叶型胚萌发，进而再生成苗，获得木薯植株。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法具有脆性胚性愈伤组织诱导产生时间短，产生率高的优点，且木薯优选为华南8号和华南6号等常规栽培品种。
附图说明
图1为实施例1中木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法中获得各组织的图片，其中a体胚块；b：初生脆性胚性愈伤组织；c：脆性胚性愈伤组织；d：脆性胚性愈伤组织诱导产生体胚；e：体胚成熟为子叶型胚；f：子叶型胚萌发成植株。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1
本实施例提供的木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
(一)、脆性胚性愈伤组织诱导
(1.1)将纯化的木薯体胚块置于装有300mmol/l甘露醇的三角瓶中，用透气封口膜封口；将上述三角瓶放入真空泵，打开开关，关闭进气阀，当气压下降至0.08mpa时开始计时，15min后，取出；在灭菌过的超净工作台中，将上述处理过的体胚块取出，用灭菌滤纸吸干水分后，放置在fecim上黑暗培养20d，诱导产生初生脆性胚性愈伤组织；
(1.2)在体视显微镜下，将初生脆性胚性愈伤组织转接到新鲜的fecim上增殖扩大培养，2周继代一次获得大量脆性胚性愈伤组织，可用于转基因、原生质体提取等。
(二)脆性胚性愈伤组织再生
(2.1)将脆性胚性愈伤组织收集到液体seim(就是seim不加琼脂粉)中，震荡培养1h，去除多于的松软非胚性组织，然后倒掉液体seim培养基，将脆性胚性愈伤组织放到seim培养基上，25～27℃，黑暗培养约3周诱导产生体胚；
(2.2)将体胚转接到新鲜seim培养基上，25～27℃，黑暗培养，可对体胚进行扩繁培养，可每隔1个月继代一次；
(2.3)将体胚转接到semm上，25～27℃，16h/每天，3000～4000lx光照，约10d，促进体胚成熟为绿色子叶型胚；
(2.4)将绿色子叶型胚转接到segm上，25～27℃，16h/每天，3000～4000lx光照，约1个月，促进绿色子叶型胚萌发，进而再生成苗。
在上述木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法中：
脆性胚性愈伤组织诱导培养基(friableembryogeniccallusinductionmedium，fecim)包括gd(gresshofanddoybasalmedium)、2,4-d、蔗糖和琼脂粉，其中1lgd中包括10mg2,4-d、蔗糖15g、琼脂粉10g。
体胚诱导培养基(somaticembryoinductionmedium，seim)包括nms、2,4-d、蔗糖和琼脂粉，其中1lnms中加入2,4-d8mg、蔗糖30g、琼脂粉8g，nms为(murashigeandskoog)ms培养基，其中cacl2工作浓度为15mmol/l。
体胚成熟培养基(somaticembryomaturationmedium,semm)包括ms、蔗糖和琼脂粉，其中1lms中包括蔗糖25g、琼脂粉7.5g。
体胚萌发培养基(somaticembryogerminationmedium，segm)包括ms、6-ba、蔗糖和琼脂粉，其中1lms中包括6-ba0.9mg、蔗糖25g、琼脂粉7.5g。
上述培养基，灭菌前调ph到6.0，高温高压灭菌20min。
通过该方法，脆性胚性愈伤组织的初始诱导率达90％以上，且获得的脆性胚性愈伤组织可以再被诱导形成体胚，并萌发再生成植株(如图1中所示)。
实施例2
本实施例提供的木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
(一)、脆性胚性愈伤组织诱导
(1.1)将纯化的木薯体胚块置于装有300mmol/l甘露醇的三角瓶中，用透气封口膜封口；
将上述三角瓶放入真空泵，打开开关，关闭进气阀，当气压下降至0.08mpa时开始计时，20min后，取出；
在灭菌过的超净工作台中，将上述处理过的体胚块取出，用灭菌滤纸吸干水分后，放置在fecim上黑暗培养25d，诱导产生初生脆性胚性愈伤组织；
(1.2)在体视显微镜下，将初生脆性胚性愈伤组织转接到新鲜的fecim上增殖扩大培养，3周继代一次获得大量脆性胚性愈伤组织，可用于转基因、原生质体提取等。
(二)脆性胚性愈伤组织再生
(2.1)将脆性胚性愈伤组织收集到液体seim(就是seim不加琼脂粉)中，震荡培养1h，去除多于的松软非胚性组织，然后倒掉液体seim培养基，将脆性胚性愈伤组织放到seim培养基上，约3周诱导产生体胚，25～27℃，黑暗培养；
(2.2)将体胚转接到新鲜seim培养基上，25～27℃，黑暗培养，可对体胚进行扩繁培养，可每隔1个月继代一次；
(2.3)将体胚转接到semm上，25～27℃，16h，3000～4000lx光照，培养约7d，促进体胚成熟为绿色子叶型胚；
(2.4)将绿色子叶型胚转接到segm上，25～27℃，16h，3000～4000lx光照，约35d，促进绿色子叶型胚萌发，进而再生成苗。
在上述木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法中：
脆性胚性愈伤组织诱导培养基(friableembryogeniccallusinductionmedium，fecim)包括gd(gresshofanddoybasalmedium)、2,4-d、蔗糖和琼脂粉，其中1lgd中包括8mg2,4-d、蔗糖18g、琼脂粉12.5g。
体胚诱导培养基(somaticembryoinductionmedium，seim)包括nms、2,4-d、蔗糖和琼脂粉，其中1lnms中加入2,4-d10mg、蔗糖25g、琼脂粉7.5g，nms为ms(murashigeandskoog)培养基，其中cacl2工作浓度为15mmol/l。
体胚成熟培养基(somaticembryomaturationmedium,semm)包括ms、蔗糖和琼脂粉，其中1lms中包括蔗糖30g、琼脂粉8g。
体胚萌发培养基(somaticembryogerminationmedium，segm)包括ms、6-ba、蔗糖和琼脂粉，其中1lms中包括6-ba0.8mg、蔗糖25g、琼脂粉8g。
上述培养基，灭菌前调ph到6.1，高温高压灭菌20min。
通过该方法，脆性胚性愈伤组织的初始诱导率达90％以上，且获得的脆性胚性愈伤组织可以再被诱导形成体胚，并萌发再生成植株。
实施例3
本实施例提供的木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
(一)、脆性胚性愈伤组织诱导
(1)将纯化的华南8号木薯体胚块置于装有250mmol/l甘露醇的三角瓶中，用透气封口膜封口；
(2)将上述三角瓶放入真空泵，打开开关，关闭进气阀，当气压下降至0.08mpa时开始计时。20min后，取出；
(3)在灭菌过的超净工作台中，将上述处理过的体胚块取出，用灭菌滤纸吸干水分后，放置在fecim上黑暗培养30d，诱导产生初生脆性胚性愈伤组织；
(4)在体视显微镜下，将初生脆性胚性愈伤组织转接到新鲜的fecim上增殖扩大培养，2周继代一次获得大量脆性胚性愈伤组织，可用于转基因、原生质体提取等。
(二)脆性胚性愈伤组织再生
(1)将脆性胚性愈伤组织收集到液体seim(就是seim不加琼脂粉)中，震荡培养1h，去除多于的松软非胚性组织，然后倒掉液体seim培养基，将脆性胚性愈伤组织放到seim培养基上，，25～27℃，黑暗培养，约3周诱导产生出体胚；
(2)将体胚转接到新鲜seim培养基上，25～27℃，黑暗培养，可对体胚进行扩繁培养，可每隔1个月继代一次；
(3)将体胚转接到semm上，25～27℃，16h/每天，3000～4000lx光照，约15d，促进体胚成熟为绿色子叶型胚；
(4)将绿色子叶型胚转接到segm上，25～27℃，16h/每天，3000～4000lx光照，约25d，促进绿色子叶型胚萌发，进而再生成苗。
在上述木薯脆性胚性愈伤组织的培养方法中：
脆性胚性愈伤组织诱导培养基(friableembryogeniccallusinductionmedium，fecim)包括gd(gresshofanddoybasalmedium)、2,4-d、蔗糖和琼脂粉，其中1lgd中包括2,4-d12mg、蔗糖20g、琼脂粉15g。
体胚诱导培养基(somaticembryoinductionmedium，seim)包括nms、2,4-d、蔗糖和琼脂粉，其中1lnms中加入2,4-d9mg、蔗糖20g、琼脂粉8.5g，nms为(murashigeandskoog)ms培养基，其中cacl2工作浓度为15mmol/l。
体胚成熟培养基(somaticembryomaturationmedium,semm)包括ms、蔗糖和琼脂粉，其中1lms中包括蔗糖30g、琼脂粉7.5g。
体胚萌发培养基(somaticembryogerminationmedium，segm)包括ms、6-ba、蔗糖和琼脂粉，其中1lms中包括6-ba0.7mg、蔗糖25g、琼脂粉8g。
上述培养基，灭菌前调ph到6.2，高温高压灭菌20min。
通过该方法，脆性胚性愈伤组织的初始诱导率达90％以上，且获得的脆性胚性愈伤组织可以再被诱导形成体胚，并萌发再生成植株。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。