一种相思开放式组培方法与流程

本发明属于植物组培技术领域，特别涉及一种相思开放式组培方法。

背景技术：

无性繁殖能最大限度保持其优良母株的优良性状，利于优树优良性状的固定，从而利于良种快速扩繁、推广应用。扦插和组培是目前应用最广泛的两种林木快繁技术。许多树种已能通过扦插技术进行大量苗木的快繁，该技术虽然操作简单、容易掌握，但需要较大面积的土地来营建采穗圃以提供插条，而现今土地资源严重紧缺，使得该技术的推广应用受到极大的限制；另外，仍有不少树种扦插生根困难，无法以该方式获得大量苗木。组培技术不受环境和季节的限制，繁殖后代的性状与母本保持完全一致，组培苗生长周期短，对采穗圃的面积要求较小，能在有限的时间和空间内高质量、高产量地发展林木种苗生产，促进良种质资源的保存、利用以及推广种植。

但传统组培技术存在褐化率高，易出现玻璃化现象，污染率高，成本较高等难题。新的组培技术为解决组培难题提供了新思路，但又存在一些新的亟待解决的问题。

光自养培养技术由于特殊培养容器及光照条件的应用，改善了组培苗的培养环境，使得组培苗的生长更接近于自然生长，利于降低玻璃化现象，简化了驯化过程，一定程度上改善了组培技术，但其仍未脱离无菌操作，同时一般生产环境难以满足其特殊培养条件，使得组培成本实际上并未降下来。

开放组培技术又进一步着眼于组培技术的简化，致力于组培无菌操作的变革，不再强调培养环境的绝对无菌状态，从培养基自身的抑菌能力入手，省去了高温高压灭菌步骤和超净工作台的使用，从耗电和操作步骤方面降低了组培成本。但目前的研究还尚未建立完善的技术体系，存在的主要问题是：使用的抑菌剂成分复杂、不易获取(人工提取或者成本较高)、效果不佳，不利于推广应用。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种相思开放式组培方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种相思开放式组培方法，包括如下步骤：

(1)取4～10月份当年生腋芽饱满枝条为外植体，消毒，然后在开放式芽诱导培养基中进行培养，得到腋芽；

(2)将步骤(1)得到的腋芽在开放式生根培养基中进行开放式瓶内生根培养，得到生根苗；

为了更好的实现本发明的目的，还包括：

(3)将步骤(2)的生根苗剪成具有至少一个芽的小节为继代外植体，继续在开放式生根培养基中进行开放式瓶内生根培养，连续多代生根实现增殖的目的。

所述的相思为马大杂种相思(a.mangium×a.auriculiformis)、马占相思(a.mangium)或大叶相思(a.auriculiformis)；优选为马大杂种相思(a.mangium×a.auriculiformis)。

将4～10月份当年生腋芽饱满枝条，洗衣粉水浸泡，刷净后流水冲洗，剪成长2.0～3.0cm带腋芽的茎段。优选取中部带叶茎段(即第3～5腋芽带叶茎段)。

所述的洗衣粉水浸泡的时间优选为10～60min；所述的流水冲洗的时间优选为1～3h。

进一步的，所述的洗衣粉水浸泡的时间为30min；所述的流水冲洗的时间为2h。

所述的消毒是以多菌灵进行消毒；

所述的多菌灵的浓度为0.2～1.0g·l^-1；消毒的时间为1～15min。

进一步的，所述的多菌灵的浓度为0.8g·l^-1；消毒的时间为3min。

所述的开放式芽诱导培养基为0～1/8ms+6-ba0.25～1mg·l^-1+百菌清0.2～0.8g·l^-1+琼脂5～8g·l^-1；其中，1/8ms是指ms全部元素的1/8。

进一步的，所述的开放式芽诱导培养基为0～1/8ms+6-ba0.5～1mg·l^-1+百菌清0.2～0.6g·l^-1+琼脂5～8g·l^-1；

更进一步的，所述的开放式芽诱导培养基为1/8ms+6-ba0.5mg·l^-1+百菌清0.2g·l^-1+琼脂7g·l^-1；

所述的开放式生根培养基为iba1.0～1.5mg·l^-1+naa0.5～1.5mg·l^-1+百菌清0.2～0.8g·l^-1+琼脂5～8g·l^-1；

进一步的，所述的开放式生根培养基为iba1.25～1.5mg·l^-1+naa0.5～1.0mg·l^-1+百菌清0.2～0.6g·l^-1+琼脂5～8g·l^-1；

更进一步的，所述的开放式生根培养基为iba1.5mg·l^-1+naa0.5mg·l^-1+百菌清0.2g·l^-1+琼脂7g·l^-1；

所述的连续多代生根优选为连续2～4代生根；进一步的，为连续3～4代生根；更进一步的，为连续4代生根；

步骤(1)、(2)、(3)中所述的培养的条件为：培养温度为25℃±2℃，光照时长12h·d^-1，光照强度2500lx。

本发明的机理是：本发明通过系统研究，筛选确定了简单且极易于获取的抑菌剂，抑菌效果十分理想，并建立了适宜于马大杂种相思的开放式组培技术。对今后有效降低组培生产成本，工厂化大量生产马大杂种相思苗木，提供了重要的技术支撑。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明使用的抑菌剂百菌清，成分简单、成本低、易于购买(一般的农药商店即可购买)，0.2g·l^-1即可达到良好抑菌效果，通过对外植体类型、消毒方式、外植体采集季节、芽诱导培养基等筛选研究，芽诱导率高达99.54％；生根率97.62％，连续多代生根的增殖倍数可达3.58，完全可以满足工厂化生产需求。

附图说明

图1是百菌清对马大杂种相思外植体的影响；其中，百菌清不同浓度(由左至右分别为0.8，0.6，0.4，0.2g·l^-1)。

图2是适宜的外植体(中部带叶茎段)。

图3是以1/8ms培养基加入不同浓度的6-ba对马大杂种相思出芽率的影响。

图4是采条季节对马大杂种相思芽诱导的影响。

图5是iba、naa不同浓度组合对马大杂种相思开放组培生根的影响

图6是马大杂种相思连续多代生根的增殖倍数。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1材料

参考施琼等(2015)方法，从中国林业科学研究院热带林业研究所马大杂种相思18年生试验林中选取优良单株，在优良单株上采集枝条，先通过扦插繁殖，建立采穗圃，从一年生的采穗圃中采集腋芽饱满的枝条为研究材料。

2方法

芽诱导外植体：于8月剪取马大杂种相思采穗圃的当年生腋芽饱满枝条，枝条剪去叶片，洗衣粉水浸泡30min，毛笔刷净后流水冲洗2h，剪成长2.0～3.0cm带腋芽的茎段。

1)抑菌剂种类和浓度的筛选

抑菌剂：百菌清、多菌灵。两种抑菌剂分别设4个浓度：0.2，0.4，0.6，0.8g·l^-1。共8个处理，每个处理接种24个茎段，重复3次。

2)外植体类型和消毒方式

将马大杂种相思当年生腋芽饱满枝条的第1～2腋芽茎段(上段)、第3～5腋芽茎段(中段)、分别剪成带叶、不带叶两种类型的长2.0～3.0cm带腋芽茎段，分别以不同的方式对外植体进行消毒后接种于培养基中，具体设置如下(表1)。每个处理接种21个茎段，重复3次。

表1外植体类型以及消毒方式

3)芽诱导培养基选择

设置营养素及6-ba2个变量，营养素5个水平：1/2ms、改良ms(大量元素减半)、1/4ms、1/8ms，以及空白对照，6-ba3个水平：0、0.5、1.0mg·l^-1。共15个处理。其中，1/2ms是指全部元素减半；1/4ms、1/8ms同理。

以1/8ms培养基加入不同浓度的6-ba，进一步探究6-ba的适宜浓度，设置四个浓度水平：0.25、0.5、1.0、1.5mg·l^-1。共4个处理。

以上芽诱导培养基选择实验每个处理接种24个茎段，3个重复。

4)采条季节的选择

于1月，4月，7月，10月采集当年生腋芽饱满枝条，用之前确定的最佳诱导体系进行芽诱导培养。共4个处理，每个处理接种24个茎段，3次重复。

5)组培苗生根

生根培养外植体：剪取芽诱导培养中生长健壮的芽为外植体。

iba、naa不同浓度组合对生根的影响

加入naa0.5mg·l^-1，设置iba5个浓度水平；加入iba1.0mg·l^-1，设置naa5个浓度水平，探究iba、naa浓度对马占相思开放式瓶内生根的影响，具体设置见表2。

表2iba，naa的浓度

6)连续多代生根实现增殖

生根培养40d后即将生根苗剪成2.0cm左右具有至少一个芽的小节为继代外植体，进行生根培养，记录每一代的接种数及生根培养后获得的可继续进行生根培养的小节数，每次继代接种8个外植体，重复3次。

7)培养条件

以上实验均使用开放式接种，即不使用超净工作台，直接在实验室操作台上接种。所有培养基均无糖，且不经高温高压灭菌，除特殊说明外培养基均琼脂7g·l^-1，加百菌清0.2g·l^-1分装至组培玻璃瓶内。分别于培养至15d，30d，45d观察并记录。

开放式组培及扦插均在组培室内进行培养，抑菌剂加入前将ph值调至6.0，培养温度为25℃±2℃，光照时长12h·d^-1，光强：2500lx。

8)数据处理

使用excel，spss19.0对数据进行处理和方差分析，以最小显著差数法(lsd)评价差异的显著性。

污染率＝污染数÷接种数×100％；

褐化率＝褐化数/接种数×100％；

存活率＝存活数/接种数×100％；

出芽率＝出芽数/存活数×100％；

生根率＝生根外植体数/存活数×100％；

增殖倍数＝增殖苗数/接种外植体数。

3结果与分析

3.1开放式芽诱导培养

1)抑菌剂浓度及种类筛选

从表3可以看出，培养基中加入多菌灵的污染率较百菌清的高，多菌灵不适宜作为马大杂种相思开放式芽诱导的抑菌剂。

而百菌清对外植体的影响(图1)，随着浓度的升高，褐化率增加，污染率的变化不太明显(仅在百菌清0.8g·l^-1时，污染率较为严重，为20.83％)，外植体存活率也显著降低。

综合来看，百菌清浓度为0.2g·l^-1时，外植体存活率最高，为80.55％。

表3抑菌剂种类和浓度对马大杂种相思芽诱导的影响^①

①同列数据小写字母不同表示lsd检验差异显著(p<0.05)，下同。

2)外植体类型和消毒方式

马大杂种相思不同外植体类型，采用不同的消毒方式，其褐化率、污染率和存活率均有显著性差异(表4)。其中，上部带叶、中部不带叶茎段，无论采用哪种消毒方式，其褐化率均显著高于中部带叶的茎段；而存活率则显著低于中部带叶的茎段。因此，中部带叶的茎段(图2)是马大杂种相思适宜的外植体。

外植体为中部带叶茎段，采用不同方式消毒，褐化率、污染率和存活率部分有显著差异，多菌灵处理3min的效果最好，存活率为96.83％。

表4外植体类型及消毒方式对马大杂种相思芽诱导的影响^①

3)开放式芽诱导培养基选择

如表5所示，培养基为1/8ms时对应的出芽率总体高于其它处理，其中6-ba为0.5mg·l^-1时出芽率最高。基础培养基对褐化率有显著影响，培养基中营养元素含量越高，褐化率越高，使用改良ms时褐化率高达94.44％，培养基中无营养元素时褐化率整体低于其它处理，但6-ba浓度增加时出芽率显著降低。综合考虑，初步确定1/8ms为马大杂种相思开放式芽诱导基础培养基。

表5培养基及6-ba浓度对马大杂种相思开放式芽诱导的影响^①

以1/8ms为基础培养基，进一步对6-ba浓度进行筛选，结果如图3所示，6-ba对芽诱导率有显著影响，6-ba0.5mg·l^-1时出芽率最高，为97.22％，这与前一步的实验结果相一致。故而马大杂种相思开放式芽诱导培养基为：1/8ms+6-ba0.5mg·l^-1。

4)采条季节的选择

如图4所示，不同季节的出芽率有显著差异，1月的出芽率(66.21％)最低，10月的出芽率最高，为99.54％，显著高于其它处理。4、7月采集外植体对应的出芽率略低于10月的，但均高于95.0％，故而一年中4～10月均可采集外植体做芽诱导培养。

3.2开放式瓶内生根

iba、naa不同浓度组合对开放式瓶内生根的影响

如图5所示，iba、naa对马大杂种相思开放式瓶内生根均有显著影响，处理1～5：naa浓度为0.5mg·l^-1时，随着iba浓度的增加生根率程上升趋势，处理6～10：iba浓度为1.0mg·l^-1时，生根率先上升后下降。处理5：iba1.5mg·l^-1+naa0.5mg·l^-1时生根率最高，为97.62％。初步推测高浓度iba易于生根，naa的适宜浓度范围则在0.5～1.0mg·l^-1之间。

结果表明，iba1.5mg·l^-1+naa0.5mg·l^-1为开放式瓶内生根的最佳处理，生根率为97.62％。

3.3连续多代生根实现增殖

由于是开放式培养，为防止各种细菌、真菌污染，培养基中不能添加糖，这对增殖来说，是不利因素。为实现增殖的目的，采用3.2的最佳处理，通过连续多代生根的方式实现增殖。

马大杂种相思生根培养45d后，生根苗即可长到5.0cm左右，1棵生根苗可剪取2～3个外植体用于生根，通过连续多代生根的方式即可达到增殖的目的。如图6所示增殖倍数随着继代次数的增加而显著增加。第四次继代对应的增殖倍数最高，为3.58，显著高于其它处理。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。