本发明属于植物组织培养方法领域，具体涉及一种红皮花生的幼胚培养方法。
背景技术：
花生是世界上重要的经济作物和油料作物。我国花生产量居世界第一，种植面积居世界第二，在世界花生生产上具有举足轻重的地位。传统育种可以有效的提高花生在产量、抗旱等方面的特性，但基因工程育种比传统育种方法更能有效地对一些有益目的性状进行保留、筛选。花生的遗传基础较弱，可用的有效资源有限，利用基因工程技术进行花生遗传转化，关键在于建立一个高效的受体系统，即需要建立一个高效的花生植株组织培养方法。
花生作为一种大粒豆科植物，国内外已有成功实现花生离体再生的报道：McKently等以带胚子叶以及去胚子叶为外植体诱导丛生芽，发现带胚子叶为最适外植体，经过258d长成完整植株，但上述研究中外植体取材过程复杂且对种子需求量较大；Charleen和Venkatachala分别以胚小叶为外植体，通过体细胞胚再生途径成功诱导出胚性愈伤组织，但是存在分化成株困难的问题；Mroginski等以3-5d苗龄的不成熟小叶为外植体诱导丛生芽并获得完整植株；Tiwari等以未成熟胚小叶为外植体研究预培养时间、培养基及基因型对胚小叶再生的影响，整个过程再生率可达80%，耗时4个月，但上述以胚小叶为外植体的再生体系依然存在着成株困难以及重复性低的问题，同时再生频率低以及周期长的问题还有待解决，同时研究表明植株离体再生对基因型有很强的依赖性。
花生果实含有蛋白质、脂肪、糖类、维生素A、维生素B6、维生素E、维生素K，以及矿物质钙、磷、铁等营养成分，含有8种人体所需的氨基酸及不饱和脂肪酸，含卵磷脂、胆碱、胡萝卜素、粗纤维等物质。[4-5]脂肪含量为44%-45%，蛋白质含量为24-36%，含糖量为20%左右。含有丰富的维生素B2、PP、A、D、E，钙和铁等。并含有硫胺素、核黄素、尼克酸等多种维生素，具有抗老化、凝血止血、促进发育、增强记忆、预防肿瘤的作用。
利用组织培养方法进行花生扩繁具有以下优势：首先，可短时间大量繁殖，对繁育稀缺品种以及目前的花生转基因工作具有十分重要的意义；其次，占用空间小，不受地区、季节限制；另外，培养条件人为可控，条件均一，便于稳定地进行培养生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于：针对上述存在的不足，本发明提供了红皮花生的培养方法，通过本发明的培养方法对花生进行组织培养，可在15周内得到完整的花生植株，大大缩短了组培所需周期，可短时间大量繁殖，对繁育稀缺品种以及目前的花生转基因工作具有十分重要的意义；其次，培养条件人为可控，不受地区、季节限制，便于稳定地进行培养生产，为花生组织培养和遗传转化的发展奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种红皮花生的幼胚培养方法，其技术方案包括以下步骤：
（1）先对花生种子进行表面消毒，再浸种，得到无菌花生胚小叶；
（2）取步骤（1）得到的无菌花生胚小叶，接种到丛生芽诱导培养基上，培养20-25d，诱导胚小叶产生丛生芽或丛生芽组织块，得到组培苗；
（3）切取步骤（2）得到的组培苗，接种到壮苗培养基A上培养15-20d，7-10d更换一次培养基，将长至1.5cm以上的组培苗分成单株，移至壮苗培养基B上培养20-25d，8-11d更换一次培养基，得到幼苗；
（4）将步骤（3）长至2-3cm长的幼苗，转移到生根培养基上培养20-25d，得到完整的植株；
（5）将步骤（4）所述完整的植株经过炼苗后移栽。
进一步地，所述的一种红皮花生的幼胚培养方法，在步骤（1）所述表面消毒是指：将花生成熟荚果去果皮，选取颗粒饱满、表面光滑的种子，用水冲洗后吸干表面水分，依次浸于体积百分比为75%的乙醇溶液中1-3min、质量百分比为0.1%的氯化汞溶液中9-13min，再用无菌水漂洗4-8次；所述浸种为将经表面消毒的花生种子剥去种皮，浸泡于无菌水中6-10h。
进一步地，所述的一种红皮花生的幼胚培养方法，在步骤（2）所述丛生芽诱导培养基为MS+0.1-0.3mg/L NAA+5-7mg/L6-BA，pH=5.8的固体培养基。
进一步地，所述的一种红皮花生的幼胚培养方法，在步骤（3）壮苗培养基A为MS+0.1-0.3mg/LNAA+1-4mg/L6-BA，pH=5.8的固体培养基；所述壮苗培养基B为MS+0.1-0.3mg/LNAA+3-6mg/L6-BA+1-3mg/LGA3，pH=5.8的固体培养基。
进一步地，所述的一种红皮花生的幼胚培养方法，在步骤（4）所述生根培养基为1/2MS+2-4mg/LIBA+0.1-0.5mg/LNAA，pH=5.8的固体培养基，其厚度为2-2.5cm。
进一步地，所述的一种红皮花生的幼胚培养方法，在步骤（4）所述完整的植株为长出至少4条根且主根长度大于2cm。
进一步地，所述的一种红皮花生的幼胚培养方法，所述诱导培养、壮苗培养、生根培养的温度为25±1℃，光照时间为16h/d，光照强度为800-1200Lx。
进一步地，所述的一种红皮花生的幼胚培养方法，在步骤（3）若组培苗在壮苗培养基A上培养20d后还未长至1.5cm，则切除组培苗底部与培养基接触形成的黑褐色部分，底部茎端没入培养基2-3mm培养，更换壮苗培养基A，再继续培养5-7d。
进一步地，所述的一种红皮花生的幼胚培养方法，在步骤（4）生根培养到25天后，若生根情况仍达不到要求，需要在原培养基上层再倒0.6-1cm厚生根培养基，新加培养基需用水浴凉至34-36℃，将组培瓶倾斜沿瓶壁缓缓倒入。
上述所述丛生芽诱导培养基、壮苗培养基、生根培养基中的MS为国际通用配方，6-BA为细胞分裂素，IBA和NAA为生长素，GA3为赤霉酸。
综上所述，本发明由于采用了上述方案，具有以下有益效果：通过本发明的培养方法对花生进行组织培养，可在15周内得到完整的花生植株，大大缩短了组培所需周期，可短时间大量繁殖，对繁育稀缺品种以及目前的花生转基因工作具有十分重要的意义；其次，培养条件人为可控，不受地区、季节限制，便于稳定地进行培养生产，为花生组织培养和遗传转化的发展奠定了基础，社会效益和科研价值显著。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明一种红皮花生的幼胚培养方法，作进一步说明。本发明所使用的各种原料均为常规市售产品，均能够通过市场购买得到。
实施例1：
一种红皮花生的幼胚培养方法，其技术方案包括以下步骤：
（1）将花生成熟荚果去果皮，选取颗粒饱满、表面光滑的种子，用水冲洗后吸干表面水分，依次浸于体积百分比为75%的乙醇溶液中1min、质量百分比为0.1%的氯化汞溶液中9min，再用无菌水漂洗4次，再将花生种子剥去种皮，浸泡于无菌水中6h，得到无菌花生胚小叶；
（2）取步骤（1）得到的无菌花生胚小叶，接种到丛生芽诱导培养基上，所述丛生芽诱导培养基为MS+0.1mg/L NAA+5mg/L6-BA，pH=5.8的固体培养基，培养20d，诱导胚小叶产生丛生芽或丛生芽组织块，得到组培苗；
（3）切取步骤（2）得到的组培苗，接种到壮苗培养基A上培养15-20d，所述壮苗培养基A为MS+0.1mg/LNAA+1mg/L6-BA，pH=5.8的固体培养基，7d更换一次培养基；将长至1.5cm以上的组培苗分成单株，移至壮苗培养基B上，所述壮苗培养基B为MS+0.1mg/LNAA+3mg/L6-BA+1mg/LGA3，pH=5.8的固体培养基，培养20-25d，8d更换一次培养基，得到幼苗；若组培苗在壮苗培养基A上培养20d后还未长至1.5cm，则切除组培苗底部与培养基接触形成的黑褐色部分，底部茎端没入培养基2-3mm培养，更换壮苗培养基A，再继续培养5-7d；
（4）将步骤（3）长至2-3cm长的幼苗，转移到生根培养基上，所述生根培养基为1/2MS+2mg/LIBA+0.1mg/LNAA，pH=5.8的固体培养基，其厚度为2-2.5cm，培养20-25d，长出至少4条根且主根长度大于2cm，得到完整的植株；生根培养到25天后，若生根情况仍达不到要求，需要在原培养基上层再倒0.6-1cm厚生根培养基，新加培养基需用水浴凉至34-36℃，将组培瓶倾斜沿瓶壁缓缓倒入；
（5）将步骤（4）所述完整的植株经过炼苗后移栽。
进一步地，所述诱导培养、壮苗培养、生根培养的温度为25±1℃，光照时间为16h/d，光照强度为900Lx。
红皮花生经过幼胚培养方法，200无菌花生种子可在15周内得到191株完整的花生植株，191株组培苗进入生根阶段，生根率为100%，并且至移至生根培养基25天，99%的组培苗全部生出3条以上的根，根长超过2cm，达到移栽要求，移栽成活率达到92%以上。
而普通的培养方法，200无菌花生种子最多可得到153株完整的花生植株，而且需要的时间远远超过15周，进入生根阶段，只有43%的组培苗生出3条以上的根，根长一般在0.5-1.2cm，达到移栽要求的，移栽成活率低于50%。
实施例2
一种红皮花生的幼胚培养方法，其技术方案包括以下步骤：
（1）将花生成熟荚果去果皮，选取颗粒饱满、表面光滑的种子，用水冲洗后吸干表面水分，依次浸于体积百分比为75%的乙醇溶液中3min、质量百分比为0.1%的氯化汞溶液中13min，再用无菌水漂洗8次，再将花生种子剥去种皮，浸泡于无菌水中10h，得到无菌花生胚小叶；
（2）取步骤（1）得到的无菌花生胚小叶，接种到丛生芽诱导培养基上，所述丛生芽诱导培养基为MS+0.3mg/L NAA+7mg/L6-BA，pH=5.8的固体培养基，培养25d，诱导胚小叶产生丛生芽或丛生芽组织块，得到组培苗；
（3）切取步骤（2）得到的组培苗，接种到壮苗培养基A上培养15-20d，所述壮苗培养基A为MS+0.3mg/LNAA+4mg/L6-BA，pH=5.8的固体培养基，10d更换一次培养基；将长至1.5cm以上的组培苗分成单株，移至壮苗培养基B上，所述壮苗培养基B为MS+0.3mg/LNAA+6mg/L6-BA+3mg/LGA3，pH=5.8的固体培养基，培养20-25d，11d更换一次培养基，得到幼苗；若组培苗在壮苗培养基A上培养20d后还未长至1.5cm，则切除组培苗底部与培养基接触形成的黑褐色部分，底部茎端没入培养基2-3mm培养，更换壮苗培养基A，再继续培养5-7d；
（4）将步骤（3）长至2-3cm长的幼苗，转移到生根培养基上，所述生根培养基为1/2MS+4mg/LIBA+0.5mg/LNAA，pH=5.8的固体培养基，其厚度为2-2.5cm，培养20-25d，长出至少4条根且主根长度大于2cm，得到完整的植株；生根培养到25天后，若生根情况仍达不到要求，需要在原培养基上层再倒0.6-1cm厚生根培养基，新加培养基需用水浴凉至34-36℃，将组培瓶倾斜沿瓶壁缓缓倒入；
（5）将步骤（4）所述完整的植株经过炼苗后移栽。
进一步地，所述诱导培养、壮苗培养、生根培养的温度为25±1℃，光照时间为16h/d，光照强度为1200Lx。
红皮花生经过幼胚培养方法，200无菌花生种子可在15周内得到195株完整的花生植株，195株组培苗进入生根阶段，生根率为100%，并且至移至生根培养基20天，99%的组培苗全部生出3条以上的根，根长超过2cm，达到移栽要求，移栽成活率达到93%以上。
而普通的培养方法，200无菌花生种子最多可得到153株完整的花生植株，而且需要的时间远远超过15周，进入生根阶段，只有43%的组培苗生出3条以上的根，根长一般在0.5-1.2cm，达到移栽要求的，移栽成活率低于50%。
实施例3
一种红皮花生的幼胚培养方法，其技术方案包括以下步骤：
（1）将花生成熟荚果去果皮，选取颗粒饱满、表面光滑的种子，用水冲洗后吸干表面水分，依次浸于体积百分比为75%的乙醇溶液中2min、质量百分比为0.1%的氯化汞溶液中11min，再用无菌水漂洗6次，再将花生种子剥去种皮，浸泡于无菌水中8h，得到无菌花生胚小叶；
（2）取步骤（1）得到的无菌花生胚小叶，接种到丛生芽诱导培养基上，所述丛生芽诱导培养基为MS+0.2mg/L NAA+6mg/L6-BA，pH=5.8的固体培养基，培养23d，诱导胚小叶产生丛生芽或丛生芽组织块，得到组培苗；
（3）切取步骤（2）得到的组培苗，接种到壮苗培养基A上培养15-20d，所述壮苗培养基A为MS+0.2mg/LNAA+2.5mg/L6-BA，pH=5.8的固体培养基，9d更换一次培养基；将长至1.5cm以上的组培苗分成单株，移至壮苗培养基B上，所述壮苗培养基B为MS+0.2mg/LNAA+4.5mg/L6-BA+2mg/LGA3，pH=5.8的固体培养基，培养20-25d，9d更换一次培养基，得到幼苗；若组培苗在壮苗培养基A上培养20d后还未长至1.5cm，则切除组培苗底部与培养基接触形成的黑褐色部分，底部茎端没入培养基2-3mm培养，更换壮苗培养基A，再继续培养5-7d；
（4）将步骤（3）长至2-3cm长的幼苗，转移到生根培养基上，所述生根培养基为1/2MS+3mg/LIBA+0.3mg/LNAA，pH=5.8的固体培养基，其厚度为2-2.5cm，培养20-25d，长出至少4条根且主根长度大于2cm，得到完整的植株；生根培养到25天后，若生根情况仍达不到要求，需要在原培养基上层再倒0.6-1cm厚生根培养基，新加培养基需用水浴凉至34-36℃，将组培瓶倾斜沿瓶壁缓缓倒入；
（5）将步骤（4）所述完整的植株经过炼苗后移栽。
进一步地，所述诱导培养、壮苗培养、生根培养的温度为25±1℃，光照时间为16h/d，光照强度为1000Lx。
红皮花生经过幼胚培养方法，200无菌花生种子可在15周内得到192株完整的花生植株，192株组培苗进入生根阶段，生根率为100%，并且至移至生根培养基22天，99%的组培苗全部生出3条以上的根，根长超过2cm，达到移栽要求，移栽成活率达到94%以上。
而普通的培养方法，200无菌花生种子最多可得到153株完整的花生植株，而且需要的时间远远超过15周，进入生根阶段，只有43%的组培苗生出3条以上的根，根长一般在0.5-1.2cm，达到移栽要求的，移栽成活率低于50%。
综上所述，通过本发明的培养方法对花生进行组织培养，可在15周内得到完整的花生植株，大大缩短了组培所需周期，可短时间大量繁殖，对繁育稀缺品种以及目前的花生转基因工作具有十分重要的意义；其次，培养条件人为可控，不受地区、季节限制，便于稳定地进行培养生产，为花生组织培养和遗传转化的发展奠定了基础，社会效益和科研价值显著。
以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。