专利名称：一种小麦幼胚的冷冻储藏方法
技术领域：
本发明涉及一种小麦幼胚的冷冻储藏方法。
背景技术：
小麦是我国重要的粮食作物之一，利用组织离体培养获得再生植株是开展小麦细胞工程育种和转基因育种的重要环节。目前为止，对小麦生长点、幼胚、幼穗、花药、成熟胚、小孢子等外植体材料培养先后获得了再生植株，然而，不同组织、器官之间再生率差异较大。其中，小麦幼胚被认为是再生率最高的外植体类型。为了提高小麦幼胚培养再生植株的效率，国内学者详细研究了影响小麦幼胚培养的因素，包括基因型、植物激素、幼胚大小、培养基组成、碳源、有机添加物、氧气浓度、干燥处理和培养程序等。另外，发现小麦供体植株生长的环境条件，如温度、光照、营养、湿度等，通过影响小麦幼胚的生理状态而影响其再生效果。上述研究结果显著提高了小麦幼胚的再生效率，促进了小麦遗传转化的研究进展。但小麦幼胚供应受季节、生长环境条件的严格制约。例如在我国华北地区，每年用于小麦转基因研究的幼胚主要来自二种环境条件下，一是I月-3月取自温室，二是5月中旬到6月上旬取自大田。来源于人工环境的实验材料数量有限，尤其一些科研单位缺乏人工气候设施，不能满足小麦转化对幼胚材料的需求，小麦幼胚材料主要从自然环境中获得。然而，每年从大田中取样适宜小麦幼胚材料的时间非常短促，在传统低温储藏条件下(4°C )只能储藏3 5天，超过7天后几乎失去了再生潜力，限制了小麦转基因研究的开展和工作效率。探讨冷冻储存小麦幼胚的方法，在保持小麦幼胚再生性能的基础上延长其供应时间，对于开展小麦细胞工程育种和转基因育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦幼胚的冷冻储藏方法，该方法可延长小麦幼胚在组织培养和转基因研究中的供给时间。本发明所提供的小麦幼胚的冷冻储藏方法，具体是将小麦幼穗置于温度-10°C (TC的条件下保存。在所述方法中，所述小麦幼穗为开花授粉13 16天的小麦幼穗。此时，所述小麦幼穗中的小麦幼胚为心形期幼胚。具体的，所述小麦幼胚的大小为1.3 1.5mm。在本发明的一个实施例中，所述小麦具体为小麦品种CB037。在本发明的一个实施例中，所述方法中的所述温度具体为_5°C。相应的，所述保存的时间可达25天，如20天，再如5 15天或10 15天。在本发明的另一个实施例中，所述方法中的所述温度具体为-10°C。相应的，所述保存的时间可达10天,如7 9天。
在所述方法中，所述小麦幼穗是用锡箔纸包裹后进行低温冷冻保存的。既可以减少保存过程中的水分蒸发，又能适当透气。本发明通过利用零下低温储存小麦幼穗，延长了小麦幼胚的供给时间，一定程度上解决了小麦幼胚取材受季节性及人工气候条件限制的问题，对于小麦规模化转基因研究具有重要意义。实验发现-10 0°c是适宜长期储存小麦幼胚的温度条件:-1o°c条件下可保存10天左右，小麦幼胚的再生率与未经低温储藏的对照组小麦幼胚相比无显著差异，而且实生芽率显著降低；-5°C条件下可保存25天左右，特别是保存5 15天时，小麦幼胚的再生率与未经低温储藏的对照组小麦幼胚相比更高，且显著差异，同时实生芽率显著降低。
图1为小麦CB037幼胚经_5°C低温处理不同时间后的组织培养情况。其中，A的处理时间为O天(对照CK);B的处理时间为5天；C的处理时间为10天；D的处理时间为15天；E的处理时间为25天。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。小麦(Triticum aestivum L.)品种CB037:中国农业科学院作物科学研究所小麦分子育种课题组陈孝研究员·等培育，已申请国家农业植物新品种保护权(申请日:2012年2月28日，申请号:20120164.2:公告日:2012年7月I日，公告号:CNA008910E)，涉及该品种的相关文章有:“别晓敏，杜丽璞，徐惠君，叶兴国.培养基中CuSO4和Fe盐浓度对小麦胚培养再生效果的影响，植物遗传资源学报，2011，12 (6):975-981”；“张云龙，王美蚊，张悦，褚翠萍，林志珊，徐琼芳，叶兴国，陈孝，张宪省.不同簇毛麦6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用.作物学报，2012，38(10): 1827-1832”;“别晓敏，佘茂云，杜丽璞，徐惠君，叶兴国.不同生长素类型及组合对小麦幼胚再生效果的影响，核农学报，2011，25(5):1023-1028”。该品种中国农业科学院作物科学研究所小麦分子育种课题组可向社会无偿提供。SD2 培养基:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO41700mg/L、KI0.83mg/L、H3B036.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L，FeSO4.7H2027.8mg/L、Na2-EDTA.2H2037.3mg/L、蔗糖 30g/L、维生素 BJmg/L、谷氨酰胺150mg/L、2，4-D2.0mg/L、Phytagel (植物凝胶)2.4g/L，pH 值为 6.0。以上成分采用 121。。高压湿热灭菌15分钟。以上各浓度均为相应组分在培养基中的终浓度。FHCK 培养基:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO41700mg/L、KI0.83mg/L、H3B036.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L，FeSO4.7Η2027.8mg/L、Na2-EDTA.2Η2037.3mg/L、维生素 B1ImgZUVB60.5mg/L、烟酸 0.5mg/L、甘氨酸 2mg/L、肌醇 100mg/L、鹿糖 20g/L、Phytagel (植物凝胶)2.4g/L,pH 值为 6.0。以上成分采用121°C高压湿热灭菌15分钟。以上各浓度均为相应组分在培养基中的终浓度。实施例1、小麦CB037幼胚_10°C低温储藏试验本实施例中，以小麦品种CB037为试验对象，研究分析了将小麦CB037的幼胚置于-10°c低温储藏不同时间后再进行组织培养的效果。具体如下:
一、小麦幼穗的获得将小麦品种CB037种植在中国农业科学院作物科学研究所实验农场(4 5月份，小麦生长期间温度15 30°C)，开花授粉后13 16天，收集小麦CB037未成熟麦穗，此时小麦幼胚为心形期幼胚，胚的大小为1.3 1.5_。二、-10°C低温处理小麦幼穗不同时间将步骤一得到的小麦CB037幼穗用锡箔纸紧紧包裹，置于塑封袋中，储放在_10°C低温冰箱中不同时间(0、1、5、7、9、11天)。三、组织培养1、诱导培养产生愈伤组织将步骤二中-10°C低温储藏不同时间的小麦幼穗取出，剥离小麦未成熟籽粒，经浓度为15% (体积分数)的次氯酸钠水溶液灭菌、无菌水冲洗后，在无菌滤纸上将小麦幼胚整胚挑出，在无菌滤纸上吸去表面液体，胚轴朝下接种至SD2培养基上培养，每个培养皿接种50 60枚小麦幼胚，25°C、黑暗条件下培养21天诱导胚性愈伤组织。同时以不经低温处理的小麦幼胚作为对照I (CKl)，以经4°C低温处理5天的小麦幼胚作为对照2 (CK2)。2、分化培养得到小麦再生植株将步骤I所得的胚性愈伤组织转移到FHCK培养基上培养15 25天(光照强度为3500Lx，温度为25°C )，分化得到小麦再生绿芽。其间，记录接种幼胚数 ，统计实生芽数、愈伤组织数、胚性愈伤组织数、再生芽数、实生芽率、胚性愈伤组织诱导率、再生率。实验设3次重复，结果取平均值。实生芽率(%)=(实生芽数+接种幼胚数)X 100胚性愈伤组织诱导率(%)=(胚性愈伤组织数+接种幼胚数)XlOO再生率(%)=(再生芽数+接种幼胚数)X 100四、小麦幼胚-10°C低温处理不同时间后组织培养的效果分析小麦CB037幼胚再生效果结果如表I所示。从表中可以看出，对照I (CKl)不经低温处理，小麦CB037幼胚的再生率为137.53%，与经过_10°C低温处理7天和9天的小麦幼胚再生率116.13%和128.69%无显著差异，且优于对照2 (CK2)在普通低温(4°C )条件下储存5天的结果，这表明-10°C低温储存下小麦CB037幼胚至少能储存10天左右，延长了受体材料的供给时间。此外，-1o°c低温处理仅I天就显著降低了幼胚直接萌发成苗率(SP实生芽率)，从而省略了试验中削除胚尖的过程，可加快接种速度，提高工作效率。-1o°c低温处理对胚性愈伤组织诱导率的影响不显著，处理I天胚性愈伤组织诱导率比对照I(CKl)和对照2 (CK2)提高，之后与2个对照相当。表I小麦CB037经_10°C低温处理不同时间组织培养情况
权利要求
1.一种小麦幼胚的冷冻储藏方法，是将小麦幼穗置于温度-10°C o°c的条件下保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述小麦幼穗为开花授粉13 16天的小麦幼穗。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述小麦幼穗中的小麦幼胚为心形期幼胚。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:所述小麦幼胚的大小为1.3 1.Smnin
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于:所述小麦为小麦品种CB037。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述温度为_5°C。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述保存的时间为25天以内。
8.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述温度为-10°C。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于:所述保存的时间为10天以内。
10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，所述小麦幼穗是用锡箔纸包裹后进 行保存的。
全文摘要
本发明公开了一种小麦幼胚的冷冻储藏方法。本发明所提供的小麦幼胚的冷冻储藏方法，是将小麦幼穗置于温度-10℃～0℃的条件下保存。本发明通过利用零下低温储存小麦幼穗，延长了小麦幼胚的供给时间，一定程度上解决了小麦幼胚取材受季节性及人工气候条件限制的问题，对于小麦规模化转基因研究具有重要意义。实验发现-10～0℃是适宜长期储存小麦幼胚的温度条件-10℃条件下可保存10天左右，小麦幼胚的再生率与未经低温储藏的对照组小麦幼胚相比无显著差异，而且实生芽率显著降低；-5℃条件下可保存25天左右，特别是保存5～15天时，小麦幼胚的再生率与未经低温储藏的对照组小麦幼胚相比更高，且显著差异，同时实生芽率显著降低。
文档编号A01N3/00GK103155913SQ20131008749
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者叶兴国, 王新敏, 王轲, 徐惠君, 杜丽璞, 林志珊, 张伟, 李欣 申请人:中国农业科学院作物科学研究所