一种免提取直接扩增极微量样品dna条形码的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】发明公开了一种免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法及试剂盒。本发明通过加入裂解液和缓冲液且所加入的缓冲液与裂解液的体积比为0～9：1，得到极微量样品的DNA溶液，采用正向引物LCO1490和反向引物HCO2198进行PCR扩增，即得到极微量样品的DNA条形码序列。本发明通过优化裂解液和缓冲液的配方及两者的使用比例，同时优化了反应体系和反应条件，能够避免将多头极微小动物单个个体混合提取模板DNA，从而保证了DNA模板来源的单一性，本发明的方法稳定性好、扩增效率高，具有极大的可靠性和适应性。
【专利说明】—种免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法及试剂
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法及试剂盒。
【背景技术】:
[0002]螨为重要的医学媒介生物，传播多种疾病，对人类的身体健康威胁很大。螨的个体非常微小，通常小于1mm，利用现有的DNA提取方法或者商业试剂盒很难得到浓度足够高的模板DNA，后续的特定基因的PCR扩增很难进行，现在普遍的做法是将多个个体甚至几十个个体混合在一起，提取基因组DNA，不能保证模板DNA来源的种类单一性，为后续的分子分析造成很大的麻烦，因此很有必要研制一种操作简单的、高效的一种从螨等极微小动物单个个体免提取直接扩增DNA条形码序列的方法及试剂盒。
[0003]DNA条形码技术是近几年新兴的利用生物本身普遍具有的一段保守性适中、容易获得的基因片段作为标准，建立在现代先进的DNA扩增、测序和比对技术基础之上的一种物种鉴定手段。与传统的形态鉴定相比，利用DNA条形码进行物种鉴定具有以下优势:对物种的鉴定将不再受物种发育状态的限制，克服了卵、幼虫、蛹等无法直接鉴定的缺点；对鉴定者的经验和专业背景知识大大降低，减少主观判断的干扰；物种的鉴定更加准确快速，数据共享使构建生物全球分子鉴定平台成为可能。DNA条形码技术由于目前数据库中有效数据严重不足，在实际中的应用往往不能达到准确种类鉴定的目的，因此DNA条形码数据库中的数据急需补充，DAN条形码数据的建立，凭证标本即DNA数据的来源标本非常重要，以备以后数据和标本的查证，为了保证凭证标本的形态完整性，在取组织时，尽量减小组织块的大小。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的是提供一种免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法及试剂盒。
[0005]本发明的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006](I )、DNA模板的制备:取一只极微小动物个体或动物个体部分组织，加入裂解液，研磨，95°C放置10min，4000rpm短暂离心5s，然后加入缓冲液，所加入的缓冲液与裂解液的体积比为O?9:1,95°C放置lOmin, 12000rpm离心lmin,弃沉淀,所得的上清液即为极微量样品的DNA溶液；所述裂解液为10?IOOmM的NaOH溶液，所述缓冲液，其成分及制备方法为:1OOmM Tris, IM KCl，IOmM EDTA，调 pH 为 9.5，高压灭菌。
[0007](2)、DNA条形码序列的扩增:以步骤(I)的极微量样品的DNA溶液为模板，采用正向引物 LCO1490 (5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，)和反向引物 HC02198 (5’_TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ )进行PCR扩增，即得到极微量样品的DNA条形码序列。[0008]所述的步骤(I)的动物个体部分组织，其重量优选为10 μ g。
[0009]所述步骤(2)的PCR扩增，其扩增反应体系优选为:2XK0D FX DNA聚合酶buffer(含 Mg2+) 25 μ l,2mM dNTP 10 μ 1，KOD FX DNA 聚合酶 I μ l,20mM 正向引物 LC01490 和 20mM反向引物HC02198各1μ 1，DNA模板2μ 1，加ddH20补足至50 μ I。
[0010]所述步骤(2)的PCR扩增，其扩增反应条件为:95°C 3min ；98°C 10s, 50°C 30s，68°C lmin, 35 个循环；68°C 7min。
[0011]所述的缓冲液与裂解液的体积比优选为1:9。
[0012]所述的极微量样品，优选为螨、蚤、蜱的单个个体或蝇的部分组织。
[0013]本发明的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的试剂盒，包括裂解液、缓冲液、DNA 聚合酶 buffer (含 Mg2+)、正向引物 LC01490、反向引物 HC02198、dNTP、K0D FX DNA 聚合酶，其特征在于，所述的裂解液为10?IOOmM的NaOH溶液，所述的缓冲液其成分及制备方法为:IOOmM Tris, IM KCl，IOmM EDTA，调 pH 为 9.5，高压灭菌。
[0014]所述的裂解液，优选为50mM的NaOH溶液。
[0015]本发明通过优化裂解液和缓冲液的配方及两者的使用比例，同时优化了反应体系和反应条件，能够避免将多头极微小动物单个个体混合提取模板DNA，从而保证了 DNA模板来源的单一性，本发明的方法稳定性好、扩增效率高，具有极大的可靠性和适应性。
【专利附图】
【附图说明】:
[0016]图1是使用不同浓度裂解液制备的DNA模板扩增DNA条形码序列的结果，其中，泳道I为阴性对照，泳道2为180 μ IlOmM裂解液+20 μ I缓冲液，泳道3为180 μ 125mM裂解液+20 μ I缓冲液，泳道4为180 μ 150mM裂解液+20 μ I缓冲液，泳道5为180 μ 175mM裂解液+20 μ I缓冲液，泳道6为180 μ IlOOmM裂解液+20 μ I缓冲液，泳道M为Marker II (购自TIANGEN公司，目录号:MD102)；
[0017]图2是按照不同体积比混合缓冲液和裂解液制备DNA模板扩增DNA条形码序列的结果，其中，泳道I为阴性对照，泳道2为20μ I裂解液+180μ I缓冲液，泳道3为60 μ I裂解液+140 μ I缓冲液，泳道4为120 μ I裂解液+80 μ I缓冲液，泳道5为180 μ I裂解液+20 μ I缓冲液，泳道6仅为200 μ I裂解液，泳道M为Marker II (购自TIANGEN公司，目录号:MD102)；
[0018]图3是不同退火温度下扩增DNA条形码序列的结果，其中，泳道I为32°C，泳道2为34°C，泳道3为36°C，泳道4为38°C，泳道5为40°C，泳道6为42°C，泳道7为44°C，泳道8为46°C，泳道9为48°C，泳道10为50°C，泳道11为52°C，泳道12为54°C，泳道13为560C，泳道 14 为 58°C，泳道 15 为 60°C，泳道 16 为 62°C，泳道 M 为 Marker II(购自 TIANGEN公司，目录号:MD102)；
[0019]图4是不同DNA模板浓度下扩增DNA条形码序列的结果，其中，泳道I为没有稀释过的DNA模板，泳道2为稀释I倍的DNA模板，泳道3为稀释2倍的DNA模板，泳道4为稀释10倍的DNA模板，泳道5为稀释100倍的DNA模板，泳道6为稀释1000倍的DNA模板，泳道M为Marker II (购自TIANGEN公司，目录号:MD102);
[0020]图5是不同极微量样品DNA条形码序列的扩增结果，其中，泳道I为阴性对照，泳道2为蝇1/5后足跗节，泳道3为螨，泳道4为蚤，泳道5为蜱，泳道M为Marker II (购自TIANGEN 公司，目录号:MD102)o【具体实施方式】:
[0021]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0022]KOD FX DNA聚合酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。
[0023]引物的合成由宝生物工程(大连)有限公司完成，DNA测序由上海立菲生物技术有限公司完成。
[0024]实施例1:不同浓度裂解液制备的DNA模板扩增DNA条形码序列
[0025]分别配制浓度为10、25、50、75、IOOmM的NaOH溶液各100ml，高压灭菌备用。
[0026]配制缓冲液:将1.22g Tris, 7.46g KCl，0.3g EDTA加去离子水定容至100ml，调pH至9.5,高压灭菌备用。
[0027]取5个蝇1/5后足跗节(约为10 μ g)分别放入5个1.5ml离心管中，加入液氮，用研磨棒研磨成粉状，向5个离心管中分别加入10、25、50、75、IOOmM的NaOH溶液180 μ 1，95°C放置IOmin后400·0rpm短暂离心5s，然后加入20 μ I缓冲液，95°C放置lOmin，12000rpm离心lmin，弃沉淀，所得的上清即为蝇的DNA溶液。
[0028]以本实施例所制备的蝇的DNA溶液为模板，采用正向引物LCO1490和反向引物HC02198进行PCR扩增，扩增反应体系:2XK0D FX DNA聚合酶buffer (含Mg2+) 25 μ 1，2mMdNTPlOy I,KOD FX DNA 聚合酶 I μ 1，20mM 正向引物 LC01490 和 20mM 反向引物 HC02198 各I μ 1，DNA 模板 2 μ 1，加 ddH20 补足至 50 μ I。
[0029]扩增反应条件为:95°C3min ；98°C 10s,50°C 30s，68°C lmin，35个循环；68°C 7min。
[0030]扩增结果如图1所示，阴性对照是以ddH20为模板进行扩增的结果，为了排除PCR体系中的污染。由此可见，通过本实施例的方法制备出的极微量样品DNA模板所扩增出的DNA条形码序列是非常清晰准确的，而采用50mM的NaOH溶液的制备效果是最优的。
[0031]通过本实施例的方法扩增出的产物经测序得到的长度为658bp (去除引物序列)，如SEQ ID N0.1所示，GenBank登录号为KF437544，与NCBI比对，最高相似结果与Genbank登录号为FJ614823的瘦叶带绿蚬(Hemipyrellia Iigurriens)序列相似性为100%。由此说明，本实施例的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法是准确可行的。
[0032]实施例2:不同体积比混合缓冲液和裂解液制备DNA模板扩增DNA条形码序列
[0033]裂解液和缓冲液的配制方法和实施例1相同。
[0034]取5个蝇1/5后足跑节(约为10 μ g)分别放入5个1.5ml离心管中，加入液氮,用研磨棒研磨成粉状，向5个离心管中分别加入50mM的NaOH溶液20、60、120、180、200 μ 1，95°C放置IOmin后4000rpm短暂离心5s，然后分别加入180、140、80、20、0 μ I缓冲液，95°C放置lOmin, 12000rpm离心lmin,弃沉淀,所得的上清即为蝇的DNA溶液。
[0035]PCR扩增反应体系和反应条件与实施例1相同。
[0036]扩增结果如图2所示，阴性对照是以ddH20为模板进行扩增的结果，为了排除PCR体系中的污染。由此可见，通过本实施例的方法制备出的极微量样品DNA模板所扩增出的DNA条形码序列是非常清晰准确的，而缓冲液与裂解液的体积比为1:9的比例所制备出来的DNA模板扩增效果是最优的。
[0037]通过本实施例的方法扩增出的产物经测序得到的长度为658bp (去除引物序列)，如SEQ ID N0.1所示，GenBank登录号为KF437544，与NCBI比对，最高相似结果与Genbank登录号为FJ614823的瘦叶带绿蚬(Hemipyrellia Iigurriens)序列相似性为100%。由此说明，本实施例的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法是准确可行的。
[0038]实施例3:不同退火温度下扩增DNA条形码序列
[0039]裂解液和缓冲液的配制方法和实施例1相同。
[0040]取16个蝇1/5后足跗节(约为10 μ g)分别放入16个1.5ml离心管中，加入液氮，用研磨棒研磨成粉状，再向离心管中分别加入50mM的NaOH溶液180 μ 1，95°C放置IOmin后4000rpm短暂离心5s,然后分别加入20 μ I缓冲液，95°C放置lOmin, 12000rpm离心lmin,弃沉淀，所得的上清即为蝇的DNA溶液。
[0041 ] PCR扩增反应体系和实施例1相同。
[0042]16 个样品的退火温度分别为 32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62。。。
[0043]其他扩增反应 条件为与实施例1相同。
[0044]扩增结果如图3所示，由此可见，通过本实施例的方法制备出的极微量样品DNA模板在上述退火温度范围内所扩增出的DNA条形码序列都是非常清晰准确的，而退火温度为50°C条件下扩增出来的DNA模板扩增效果是最优的。
[0045]通过本实施例的方法扩增出的产物经测序得到的长度为658bp (去除引物序列)，如SEQ ID N0.1所示，GenBank登录号为KF437544，与NCBI比对，最高相似结果与Genbank登录号为FJ614823的瘦叶带绿蚬(Hemipyrellia Iigurriens)序列相似性为100%。由此说明，本实施例的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法是准确可行的。
[0046]实施例4:不同DNA模板浓度扩增DNA条形码序列
[0047]裂解液和缓冲液的配制方法和实施例1相同。
[0048]取I个蝇1/5后足跑节(约为10 μ g)放入I个1.5ml离心管中，加入液氮,用研磨棒研磨成粉状，再向离心管中分别加入50mM的NaOH溶液180 μ 1,95°C放置IOmin后4000rpm短暂离心5s，然后加入20 μ I缓冲液，95°C放置lOmin，12000rpm离心lmin，弃沉淀，所得的上清即为蝇的DNA溶液。
[0049]以本实施例制备的DNA溶液为PCR扩增反应的模板，同时将该DNA溶液分别稀释
1、2、10、100、1000倍也作为PCR扩增反应的DNA模板。
[0050]PCR扩增反应体系和反应条件与实施例1相同。
[0051]扩增结果如图4所示，由此可见，通过本实施例的方法制备出的极微量样品DNA模板在稀释I?10倍范围内所扩增出的DNA条形码序列都是非常清晰准确的。
[0052]通过本实施例的方法扩增出的产物经测序得到的长度为658bp (去除引物序列)，如SEQ ID N0.1所示，GenBank登录号为KF437544，与NCBI比对，最高相似结果与Genbank登录号为FJ614823的瘦叶带绿蚬(Hemipyrellia Iigurriens)序列相似性为100%。由此说明，本实施例的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法是准确可行的。
[0053]实施例5:扩增不同极微量样品DNA条形码序列
[0054]取I个蝇1/5后足跗节(约为10 μ g)、I只蚤、蜱及螨分别放入4个1.5ml的离心管中，加入液氮，用研磨棒研磨成粉状，再分别向离心管中分别加入50mM的NaOH溶液180 μ 1，95°C放置IOmin后4000rpm短暂离心5s，然后分别加入20 μ I缓冲液，95 °C放置IOmin,12000rpm离心lmin,弃沉淀,所得的上清即为蝇、蚤、蝶及螨的DNA溶液。
[0055]PCR扩增反应体系和反应条件与实施例1相同。
[0056]扩增结果如图5所示，由此可见，通过本实施例的方法制备出的蝇及单个个体的蚤、蜱及螨的DNA模板所扩增出的DNA条形码序列都是非常清晰准确的。
[0057]通过本实施例的方法扩增出的螨的DNA条形码序列经测序得到的长度为658bp(去除引物序列)，如SEQ ID N0.1所示，GenBank登录号为KF437544，与NCBI比对，最高相似结果与Genbank登录号为FJ614823的瘦叶带绿蚬(Hemipyrellia Iigurriens)序列相似性为100%ο
[0058]通过本实施例的方法扩增出的蚤的DNA条形码序列经测序得到的长度为658bp(去除引物序列)，如SEQ ID N0.2所示，GenBank登录号为KF437545，与NCBI比对，最高相似结果与Genbank登录号为JN008922的蚤(Echidnophaga sp.)序列相似性为84%。
[0059]通过本实施例的方法扩增出的蜱的DNA条形码序列经测序得到的长度为658bp(去除引物序列)，如SEQ ID N0.3所示，GenBank登录号为KF437543，与NCBI比对，最高相似结果与Genbank登录号为JX416325的血红扇头蝶(Rhipicephalus sanguineus)序列相似性为99%。
[0060]通过本实施例的方法扩增出的螨的DNA条形码序列经测序得到的长度为658bp(去除引物序列)，如SEQ ID N0.4所示，GenBank登录号为KF437542，与NCBI比对，最高相似结果与Genbank登录号为JX837922的螨(Ameroseiidae sp.)序列相似性为81%。
[0061]由此说明，本实施例的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法是准确可行的。.
【权利要求】
1.一种免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)、DNA模板的制备:取一只极微小动物个体或动物个体的部分组织，加入裂解液，研磨，95°C放置lOmin，4000rpm短暂离心5s，然后加入缓冲液，所加入的缓冲液与裂解液的体积比为O?9:1,95°C放置lOmin, 12000rpm离心Imin,弃沉淀,所得的上清液即为极微量样品的DNA溶液；所述裂解液为10?IOOmM的NaOH溶液，所述缓冲液，其成分及制备方法为:IOOmM Tris, IM KCl，IOmM EDTA，调 pH 为 9.5，高压灭菌； (2)、DNA条形码序列的扩增:以步骤(I)的极微量样品的DNA溶液为模板，采用正向引物 LC01490:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ 和反向引物 HC02198:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’进行PCR扩增，即得到极微量样品的DNA条形码序列。
2.根据权利要求1所述的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法，其特征在于，所述的动物个体的部分组织，重量为10 μ go
3.根据权利要求1所述的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法，其特征在于，所述的裂解液为50mM的NaOH溶液。
4.根据权利要求1所述的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法，其特征在于，所述的缓冲液与裂解液的体积比为1:9。
5.根据权利要求1所述的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法，其特征在于，所述的步骤(2)的PCR扩增，其扩增反应体系为:2XK0D FX DNA聚合酶buffer25 μ 1，2mMdNTPlOy I,KOD FX DNA 聚合酶 I μ 1，20mM 正向引物 LC01490 和 20mM 反向引物 HC02198 各I μ 1，DNA 模板 2 μ 1，加 ddH20 补足至 50 μ I。
6.根据权利要求1所述.的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法，其特征在于，所述的步骤(2)的PCR扩增，其扩增反应条件为:95°C 3min ；98°C 10s，50°C 30s,68°C lmin，35 个循环；68°C 7min。
7.根据权利要求1所述的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的方法，其特征在于，所述的极微量样品为螨、蚤、蜱的单个个体或蝇的部分组织。
8.一种免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的试剂盒，包括裂解液、缓冲液、DNA聚合酶buffer、正向引物LC01490、反向引物HC02198、dNTP、KOD FX DNA聚合酶，其特征在于，所述的裂解液为10?IOOmM的NaOH溶液，所述的缓冲液其成分及制备方法为:IOOmMTris, IM KCl，IOmM EDTA，调 pH 为 9.5，高压灭菌。
9.根据权利要求8所述的免提取直接扩增极微量样品DNA条形码的试剂盒，其特征在于，所述的裂解液为50mM的NaOH溶液。
【文档编号】C12N15/10GK103436526SQ201310375667
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】岳巧云, 胡佳, 邱德义, 陈健, 刘德星, 魏晓雅, 吴可量, 刘国雄 申请人:岳巧云