一种重组菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种重组菌，是含有mTFP-ftsZ的重组节杆菌Arthrobactersp.A3，mTFP-ftsZ的基因序列如序列表中SEQIDNo.1所示。本发明还提供一种快速检测抑制与FtsZ相关的抗生素的方法，是将待测化合物接入节杆菌，培养至对数生长期前中期后，对新生细胞壁进行荧光标记，与空白对照对比，观察新生细胞壁环的定位情况与比例，若新生细胞壁环形成或比例发生改变，则该待测化合物具有抑制FtsZ相关抗生素的能力。本发明提供的方法可以一次检测一个发酵产物或者多种化学衍生物中是否有抑制ftsZ活性物质，具有操作简单，效率高，仅需2个小时就可以得到确定的结果，具有很好的推广使用价值。
【专利说明】—种重组菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组菌及其应用。
【背景技术】
[0002]自从1928年人类首次发现抗生素一青霉素以来，在这几十年中，抗生素工业飞速发展，为人类的身体健康做出了巨大的贡献。但由于人们不合理的使用抗生素，尤其是我国，抗生素耐药性的问题逐渐爆发出来。解决这一问题，除了注意抗生素的合理使用外，开发新的对耐药性病菌有抑制活性的新抗生素也是非常重要的。
[0003]目前，研究新的抗生素主要有以下两种方法，一是对现有的抗菌药进行全面的结构改造，它们作用于细菌靶位点包括细菌蛋白质合成、核酸合成、细胞壁合成以及叶酸合成等；另一种方法是寻找具有全新靶位点或者具有全新化学结构的化合物。
[0004]大多数细菌都以二分裂方式进行分裂繁殖。在细菌细胞正常分裂时，细胞膜和细胞壁在细菌中部内陷并在两个新复制的染色体间形成环状复合物，膜结构的肽聚糖随后水解将细胞一份为二(Harry et al.，2006)。在这一过程中，细胞分裂蛋白FtsZ在GTP的参与下最早在细胞中部聚合成环状骨架Z环，再与其他相关蛋白结合，从而引发并控制原核生物的细胞分裂过程(Beuria et al.，2009)。Z环位于细胞分裂处胞膜的内表面，受到多种调控水平的调控，同时标志着将来分裂的位置(Huang et al.，2007)。 [0005]FtsZ是最保守的细菌分裂蛋白，几乎存在于所有的细菌中。它由Rossmann折叠形成的N-端GTP酶区域和分支酸变位酶折叠的C-端GTP酶激活区域通过中心的螺旋H7和环?相连接(Lowe and Amos, 1998)。FtsZ是人类微管蛋白的结构相似物,有证据表明这两种蛋白在进化上具有相关性，不过只有10%_18%蛋白质序列相似(Ayaz et al.，2012; dePereda et al.，1996)。人类微管蛋白已经是用于抗肿瘤药物设计的一个成熟祀点。然而，经典的微管蛋白抑制剂如nocodazole和paclitaxel等不能显著抑制FtsZ聚合或GTP酶的活性(Wang et al.，2003)。这表明，FtsZ和微管蛋白在化学结构和生物学功能等方面存在很大差异，有可能设计出选择性抑制FtsZ而不抑制人类微管蛋白的化合物。同时FtsZ和人类微管蛋白的同源性也为设计选择性抑制剂提供了有一个很好的切入点。基于FtsZ蛋白在细菌细胞分裂的重要作用，人们希望以它为靶点发现新型抗菌药物。
[0006]随着基因组学、蛋白质组学及近期发展的细胞生物技术在细菌研究上的应用，对于全新抗菌药作用靶位点的研究取得了重要进展。细胞分裂是细菌繁殖的基本过程，其中关键蛋白FtsZ作为一个具有潜力的药物作用全新靶点，已有用于研发新型抗菌药物的报道(Lock and Harry, 2008)。
[0007]现在已经发现了多种对FtsZ蛋白有抑制作用的化合物。见表l(Foss et al.,2011)。很多抑制剂的筛选都花了很多人力物力。如Zantrin Zl是Margalit等人在筛选18320个化合物鉴定出的23个化合物对FtsZ蛋白的GTP酶有活性的化合物(Margalit etal.，2004)。PC170942的筛选范围更大，Stokes等人在筛选105000个化合物后发现了活性物质 PC58538，然后再经改造得来(Kaur et al., 2010; Rai et al., 2008)。A189 是通过对95000个化合物筛选得到的4种对FtsZ蛋白GTP酶有活性的化合物之一(Ito etal., 2006; Stokes et al., 2005)。
[0008]表1 FtsZ抑制剂
【权利要求】
1.一种重组菌,是含有《TF/h/tsZ的重组节杆菌AriAroAacier sp.k?>,积访jnTFP-ftsZ的基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所不。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于:所述《TF/hftsZ是通过重组表达载体导入节杆菌AriAroAacier sp.A3中，得到重组节杆菌AriAroAacier sp.A30
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于:所述重组表达载体为PART2。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于:所述导入的方法为电击导入，电击条件为:2500V/cm，25 μ F，700 Ω，200 μ I感受态细胞，I μ I重组质粒，电击后用LB培养基+0.5Μ山梨醇800 μ I孵育6-8h。
5.一种重组蛋白，其编码蛋白序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。
6.一种快速检测抑制FtsZ相关抗生素的方法，是将待测化合物接入权利要求1-4所述的重组菌，培养至对数生长期前中期后，对新生细胞壁进行荧光标记，与空白对照对比，观察新生细胞壁环的定位情况与比例，若新生细胞壁环形成或比例发生改变，则该待测化合物具有抑制FtsZ相关抗生素的能力。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:是用万古霉素和Van-Flu进行荧光标记的。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:是用万古霉素、Van-Flu和DAPI进行荧光标记的。
9.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于:所述待测化合物为一个或多个。
10.权利要求1-4所述的重组菌在快速检测抑制FtsZ相关抗生素中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK103540560SQ201310375563
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年8月26日 优先权日:2013年8月26日
【发明者】陈熙明, 张昺林, 张威, 张满效, 陈拓, 刘光琇 申请人:中国科学院寒区旱区环境与工程研究所