专利名称：人转录共激活因子pc4在制备诊断、治疗或预防肿瘤的制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人转录共激活因子PC4的应用，尤其是人转录共激活因子PC4 在制备诊断、治疗或预防肿瘤的制剂中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的重大疾病。肿瘤危害的关键在于其 侵袭性生长和广泛转移。正常人体细胞的功能受到基因的调控，肿瘤相关基因 的发现为肿瘤的诊断提供了重要途径。目前尽管发现了众多基因与肿瘤有关， 但这些基因缺乏肿瘤细胞组织特异性，特别是对肿瘤转移发生的预警尚缺乏有 效的分子标志。对多数肿瘤尚缺乏特异性的早期诊断方法和有效的治疗措施。
骨转移是前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤经过手术、放疗或化疗 等现有措施治疗后肿瘤再次复发常可发生的转移类型，是造成肿瘤患者死亡的 主要原因之一。据统计，在美国2/3以上的因癌症死亡的病例是骨转移。肿瘤发 生骨转移后，对已有治疗措施(如激素治疗、放疗、化疗等)均无反应。目前 对恶性肿瘤骨转移发生的分子机制尚未阐明，尚无有效的诊断和治疗手段，亟 需在分子水平寻找诊断和治疗的新靶标。
人转录共激活因子PC4 (transcriptional coactivatorPC4)是参与基因转录调 控过程的一个辅助激活因子，持续外源性过表达PC4基因可诱导间充质干细胞 形态发生改变，表现为细胞增殖速度加快，并成复层生长；将转染PC4基因的 多能干细胞移植给裸鼠皮下，可形成纤维组织细胞瘤，上述结果表明PC4基因 具有致癌基因的特性(程天民，史春梦,粟永萍,宗兆文.成体干细胞在体外培养扩 增中的自发恶性转化.中华医学杂志，2005,85(27):1883-1884; Shi C, ChengT, Su Y Molecular alterations of dermis-derived multipotent stem cells after spontaneous and malignant transformation in vitro. Journal of Tumor Marker Oncology, 2004; 19(S4):
23; Shi C， Zhu Y, Chung LW， Su Y， Cheng T. PC4 is a novel oncogenic gene for mesenchymal stem cell transformation and mediates the reciprocal actions between mesenchymal stem cells and prostate cancer cells. Experimental Hematology. 36 (Suppl.l): S82-83，2008.)但目前对PC4的生物学意义尚不清楚。
发明内容
发明人研究了人转录共激活因子PC4在临床肿瘤组织中的表达，结果发现， 人转录共激活因子PC4基因在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种人类肿瘤组织中 均高表达，而在正常组织中，几乎检测不到人转录共激活因子PC4蛋白表达； 进而发现，人转录共激活因子PC4的表达随肿瘤的恶性程度增加而增强，在转 移癌中表达最高，揭示人转录共激活因子PC4的高表达与临床肿瘤进展具有相 关性。在发生骨转移的肿瘤组织中表达最高，并可以调控肿瘤细胞骨转移；通 过从肿瘤组织基因文库中分离扩增人转录共激活因子PC4基因并进行核苷酸序 列分析，发现人转录共激活因子PC4基因在肿瘤组织中没有发生突变。因此， 人转录共激活因子PC4基因可用于多种肿瘤的检测标志基因，特别是可作为晚 期肿瘤骨转移肿瘤的预警的标志分子。
本发明的目的是提供人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗或预防肿瘤的 制剂中的应用。
本发明的优选实施例中，所述人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗或预 防肿瘤制剂为诊断、治疗或预防肿瘤复发和转移的制剂；例如具体为诊断、治 疗或预防肿瘤骨转移的制剂。
本发明的另一优选实施例中，所述诊断、治疗或预防肿瘤的制剂为诊断、 治疗或预防干细胞恶性转化的制剂。
本发明所述的诊断、治疗或预防肿瘤的制剂包括诊断、治疗或预防前列腺 癌、乳腺癌或肺癌的制剂。
本发明所述的人转录共激活因子PC4具有如SEQ ID NO:l所示的氨基酸序 列，或缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的仍具有所述SEQIDNO:l所示的
氨基酸序列活性的氨基酸序列。
本发明所述的编码所述人转录共激活因子PC4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2的核苷酸序列所示或其中具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入变异 后仍具有所述SEQIDNO:2编码功能的核苷酸序列。
本发明旨在提供PC4基因制备诊断、治疗或预防肿瘤制剂中的应用。通过 PC4基因的表达检测，PC4基因mRNA和蛋白的表达丰度与多种人类恶性肿瘤 (包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、)相关，在肿瘤组织中表达增强，而在正常组 织中表达很少，甚至不表达；特别是PC4基因的表达与上述肿瘤的病程进展阶 段具有相关性，在早期、晚期肿瘤和发生转移的肿瘤中表达依次增强。因此， 该基因可用于多种肿瘤的诊断标志基因，特别是可作为晚期肿瘤的判断和转移 肿瘤的预警的标志分子。PC4基因的过表达可以促进肿瘤细胞恶性行为的发展， 而下调或阻断PC4基因，可抑制肿瘤的生长。因此，PC4基因可应用于多种肿 瘤早期诊断的一个广谱标志基因，特别是可作为肿瘤晚期发生骨转移的预警分 子；同时也可作为肿瘤基因治疗的耙基因。
本发明的主要优点在于本发明首次发现了该肿瘤相关基因PC4对多种人 类肿瘤均具有诊断价值，并可根据表达强度区分肿瘤的恶性程度，填补了检测 的盲区；特别是，该基因还可对原发肿瘤经过治疗后发生的复发或转移进行预 警和诊断；而且该基因还可作为肿瘤治疗的新耙点。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳 实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图1 A和图1B分别表示PC4蛋白在恶性程度低的LNCaP和恶性程度高的C4-2 人肿瘤细胞中的表达；
图2A表示PC4蛋白在人正常前列腺组织中的表达；
图2B表示PC4蛋白在人高分化前列腺癌中的表达；
图2C表示PC4蛋白在人低分化前列腺癌中的表达； 图2D表示PC4蛋白在人前列腺癌骨转移中的表达； 图3A表示PC4蛋白在人正常乳腺组织中的表达； 图3B表示PC4蛋白在人高分化乳腺癌中的表达； 图3C表示PC4蛋白在人低分化乳腺癌中的表达； 图3D表示PC4蛋白在人乳腺癌骨转移中的表达；
图4A和4B，分别表示空载体对照组(无PC4基因表达)和PC4基因转染 组(PC4基因高表达)对人肿瘤细胞C4-2在裸鼠体内恶性生长行为的影响。
图5A和图5B，分别表示对照组的和处理组的siRNA技术阻断PC4基因表 达诱导肿瘤细胞TDMC凋亡。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
定义
PC4基因的核酸
如本发明所用，术语"本发明的肿瘤相关基因"指在肿瘤中表达上调的PC4;
术语"本发明的肿瘤相关蛋白"指在肿瘤中表达上调的PC4蛋白。本发明所指
的PC4蛋白具有SEQ IDNO:l所示的氨基酸序列，编码PC4的基因具有SEQ ID
NO:2所示的核苷酸序列。本发明所用的PC4多核苷酸序列是人的PC4多核苷
酸序列，是由GEH等人首先克隆出来的(GeH, RoederRG. Purification, cloning, and characterization of a human coactivator, PC4， that mediates transcriptional
6activation of class II genes. Cell. 1994;78(3) :513-23.)，本发明所用的PC4基因 可以是DNA或RNA形式。PC4基因可以是SEQ ID NO:2中的部分或全部序列， 或其中具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入变异后仍具有所述SEQ ID NO:2编码功能的核苷酸序列，或各种与人PC4基因同源性大于60%的同源物。
PC4蛋白和抗体
基于本发明所揭示的肿瘤相关基因PC4的序列信息，利用本领域常规技术 来产生肿瘤相关蛋白或片段以及利用相应的蛋白或片段来产生抗PC4的抗体。
(GeH， Roeder RG. Purification, cloning, and characterization of a human coactivator: PC4，that mediates transcriptional activation of class II genes. Cell. 1994:78(3) :513-23.;黄培堂等译《分子克隆实验指南》，科学技术出版社，2002 年8月，第3版。)
本发明的PC4基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重 组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据公开的有关核苷酸序列 设计引物，并用市售或cDNA库本领域技术人员己知的常规方法制备的cDNA 作为模板，扩增而获得有关序列。 一旦获得序列，可用重组法大量制备。通常 是将其克隆到载体，再转入细胞，然后通过常规方法分离获得。此外，还可通 过人工合成的方法制备有关序列。
本发明蛋白的片段除了可用重组方法产生外，还可通过直接化学合成而制 备。在体外合成肽可用手工或自动进行。另一方面，本发明还包括对PC4基因 或其片段编码的多肽具有特异性的多克隆或单克隆抗体。不仅包括完整的抗体， 还包括具有免疫活性的抗体片段。本发明的抗体或片段可以通过本领域技术人 员已知的各种技术进行制备。本发明的抗体包括能阻断PC4基因功能的抗体以 及不影响PC4基因功能的抗体。
检测方法
技术领域：
本发明还提供了检测肿瘤的方法，通过检测PC4在待测组织或细胞中基因 或蛋白的表达，观察PC4表达是否高于正常对照，其中高于正常对照表示该个体患有肿瘤或肿瘤易感性高于正常人群。对于原法肿瘤已经过常规治疗(主要
指手术切除、放疗和化疗等)的患者通过检测待测组织中PC4蛋白或基因的表 达，如果PC4基因的表达高于正常对照，表明该患者可能发生了复发或转移。 用于检测某一基因在待测细胞或组织中的表达的方法是本领域已知的，代表性 的例子，包括Northern杂交、定量和半定量PCR (RT-PCR)、 DNA芯片检测 法、蛋白质芯片检测法、抗原-抗体检测法(如免疫组织化学法、western blot和 ELISA法)。此外，也可以使用原位杂交法。上述方法都可适用于本发明。相关 仪器和设备可以购自Sigma等公司。
试剂盒
本发明还提供了诊断PC4基因异常的诊断试剂盒。在优选例中，试剂盒包 括针对PC4基因的探针。该试剂盒还可含有封闭探针以及描述如何使用试剂盒 来检测PC4基因的说明材料。试剂盒还可含有下组中的一种或多种用于协助 探针检测的各种标记物或标记试剂；用于杂交的试剂；以及阳性和阴性杂交对 照等。
另一种优选的检测肿瘤易感性和复发或转移的试剂盒包括特异性扩增PC4 基因的引物和说明书。
另一种优选的检测肿瘤易感性和复发或转移的试剂盒包括特异性结合PC4 基因表达产物的抗体和说明书。
实施例1 PC4蛋白在人肿瘤细胞和组织中的表达 材料与方法
将PC4的cDNA通过内切酶处理克隆入真核表达载体，制备出 pcDNA3.0-PC4重组质粒(Ge H, Roeder RG. Purification, cloning, and characterization of a human coactivator, PC4， that mediates transcriptional activation of class II genes. Cell. 1994;78(3):513國23)。
人肿瘤细胞模型选用国际上公认并广泛应用的代表性低恶性程度前列腺癌 细胞株LNCaP和由LNCaP来源的恶性程度高的C4-2细胞开展研究(购买自美 国ATCC)。
PC4抗体购买自美国Santa Cruz Biotechnology公司。采用免疫组化SABC法检 测PC4蛋白在细胞和组织中的表达， 一抗工作浓度为1 : 100，室温孵育2h ，其 余操作按照常规方法进行(Zhu G Zhau HE, He H, Zhang L, Shehata B， Wang X， Cerwinka WH， Elmore J， He D. Sonic and desert hedgehog signaling in human fetal prostate development. Prostate. 2007;67(6):674-84.)。
结果如图1A、 1B所示，分别表示PC4蛋白在恶性程度低的LNCaP和恶 性程度高的C4-2人肿瘤细胞中的表达；PC4蛋白在恶性程度低的LNCaP细胞 中PC4基因表达很低，而在其来源的恶性程度高的C4-2细胞中表达显著增强。 这一结果与mRNA水平检测结果一致。进一步检测了 PC4在人肿瘤组织标本中 的表达，选择不同病程阶段的前列腺癌和乳腺癌肿瘤样本，进行免役组织化学 染色。结果显示在正常前列腺和乳腺组织中，几乎检测不到PC4蛋白表达， 在恶性程度低的高分化肿瘤组织中低表达，在恶性程度高的低分化肿瘤组织中 表达增高，而在发生骨转移的肿瘤组织中，表达进一步增高(图2A、 2B、 2C、 2D， 3A、 3B、 3C、 3D)。这一结果在临床肿瘤组织水平首次发现，PC4基因与 人肿瘤病程进展具有一定相关性。
实施例二 PC4基因过表达促进肿瘤细胞生长
材料与方法PC4全长基因真核重组表达载体的构建按照常规方法参照文 献进行(Cell. 1994;78(3):513-23.) (PCDNA3.0)，通过电转移法进行基因转染。 肿瘤细胞选用C4-2人前列腺癌细胞。在转染前一天，把C4-2细胞培养到六孔 板内，使第二天细胞能达到约70-80%满。然后把六孔板每孔内换成新鲜的细胞 培养液。培养液,的体积约为2ml左右，可以含有血清和抗生素。把Lipotap脂质 体转染试剂轻轻混匀。按照试剂说明书的要求，对于待转染的六孔板中一个孔 的细胞，在一洁净无菌离心管内依次加入适量不含抗生素和glutamine的DMEM 溶液，15微升Lipotap，及2.5微克DNA，使最终体积为75微升，用枪轻轻吹 打混匀。25 °C孵育15分钟。细胞培养箱内培养3-6小时后，去除含有Lipotap-DNA 的培养液。每孔加入2ml新鲜细胞培养液继续培养。对照细胞转染空载体，不
含有PC4目的基因。在转染后48小时加入筛选药物G418，进行稳定表达细胞 株的筛选。将筛选的细胞克隆进行鉴定，获得稳定高表达PC4的基因细胞克隆 和含有空载体的对照细胞克隆，进行大量培养。将培养后的两组细胞以相同的 细胞数量接种裸鼠两侧胫骨内，每只胫骨接种1000000个细胞，观察肿瘤生长 情况。
结果如图4A和4B所示，细胞接种8周后，高表达PC4基因的C4-2细 胞在裸鼠体内的生长速度显著高于空载体对照组，表明PC4基因可诱导肿瘤细 胞的恶性行为增加。
实施例三RNA干扰PC4基因表达抑制肿瘤细胞生长
材料与方法选用高表达PC4的肿瘤细胞系TDMC开展研究(In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2007;43(8-9):290-6.)。 PC4特异性siRNA购买自Santa Cruz Biotechnology公司。脂质体转染试剂Lipofectamine2000购买自Invitrogen公司。 按照Lipofectamine2000操作说明进行siRNA转染实验，于转染后3天，观察细 胞形态的改变。
结果见图5A和图5B，分别表示对照组的和处理组的siRNA技术阻断 PC4基因表达诱导肿瘤细胞TDMC调亡。应用PC4序列特异性siRNA (购自美 国Santa Cruz公司)作用于TDMC，发现阻断或下调PC4蛋白的表达，可诱导 肿瘤细胞形态发生改变，发生凋亡，表明通过下调或阻断PC4基因可能是抑制 肿瘤细胞增殖和诱导细胞调亡的新的耙分子，在肿瘤治疗中具有重要意义。
本发明应用PC4特异性siRNA (购自美国Santa Cruz公司)作用于间充质 干细胞，发现阻断或下调PC4蛋白的表达，可诱导肿瘤细胞形态发生改变，发 生凋亡，并具有量效关系，lug/ml中和多肽作用3天可诱导几乎全部细胞发生 凋亡，随剂量增大，诱导时间也相应减少；机制研究揭示，siRNA可通过激活 caspase9， 3和PARP信号途径而促进细胞凋亡；上述结果表明，PC4对肿瘤生 长的调控作用，该基因也可用于肿瘤治疗的新耙点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术 内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任
何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同， 也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
序列表
〈110>中国人民解放军第三军医大学
<120>人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗或预防肿瘤的制剂中的应用
〈130〉
<腦> 2
〈170〉 Patentln version 3. 2
<210〉 1
〈211> 127
〈212〉 PRT <213〉人转录共激活l
<400〉 1
Met Pro Lys Ser Lys 1 5 Ser Asp Ser Glu Val 20
Pro Glu Lys Pro Val 35
Leu Ser Ser Ser Lys 50
Gin lie Gly Lys Met 65
Val Leu lie Asp lie 85
Lys Pro Gly Arg Lys 100
Leu Lys Glu Gin lie 115
〈210〉 2 <211> 1336 〈212〉 ■
〈213〉人转录共激活因子PC4基因核苷酸序列
<400> 2
gtcagtcgcg鄉g肌cgaccaagagggtgttcgactgct卿gccgagcg卿cgatgc60
ctaaatcaaagg38Cttgtttcttcaggctcttctggcagtgattctgac兆tgaggttg120
aagcaagttgacctgtaaag180
caggtg卿cttcgagagccctgtcatcttcagcagcagc240
acatgtttcag3ttggga犯atg鄉tacgttagtgttcgcgatttt犯aggc咖gtgc300
taattgatattagagaatattgg3tgg3tCCtg卿gtg3aatgaaaccagg犯ga肌3g360
gtatttctttcaatggagcc3gCtg卿g3acagatttctg3C3ttgatg420
aattcgagccatataaataa犯cctgtactgttctagttg480
12
因子PC4氨基酸序列
Glu
Asp
Lys
Gin
Arg
70
Arg
Gly
Ser
Leu
Lys
Lys
Ser
55
Tyr
Glu
lie
Asp
Val
Lys
Gin
40
Ser
Val
Tyr
Ser
lie 120
Ser
Leu
25
Lys
Ser
Ser
Trp
Leu 105 Asp
Ser
10
Lys
Thr
Ser
Val
Met
90
Asn
Asp
Gly
Arg
Gly
Arg
Arg
75
Asp
Pro
Ala
Ser Ser
Lys Lys
Glu Thr
45 Asp Asp 60
Asp Phe
Pro Glu
Glu Gin
Val Arg 125
Gly Ser Asp 15
Gin Val Ala 30
Ser Arg Ala
Asn Met Phe
Lys Gly Lys 80
Gly Glu Met 95
Trp Ser Gin 110
Lys Leu
ttttaatctg tctttttaca ttagcttttg tttggattgc agaag肌ttt gtaagatgaa attgagtgaa gctaattgtc aactttatta taaaataaaa tcaagtaata caatcttaac gtactgttta aggccaaaag taacagtttt ac幼t犯aaa ggatttgtat tgcsttgagt ttgatctttt ctcttccaat caaatgtcta ttcactcttt ttatttactt cattttcctt tacttcactc tttattcttt tctttgatta tgtc犯肌tg ttatctc犯t a^gatactts attcaatatt agcagatcta atttgataaa gtttgtttac ccatagtgtt ctgtgtagtt gatgagatgt ctgacttgct ttcacttatt acatcagata ttgttcaact agactaggat
ttttctaaatgttctccaagctattgtatg540
tacttttttttaatgtgcat600
aggattactttgtctgcccaccacctagtg660
tgttgtggccttttttgatcat冊g3gttg720
tatagatcttttagtttcaactcagctttt780
ttat犯acttttggtttgtgaacttcatat840
ggcttgtttgacttccaccccc犯tggttt900
taataacttaatctcttcatgttcagtttt960
tggtatgcttatttggaaagtcagtgaaac1020
tatgag肌ctacaatcaccgaatctactgt1080
caacatggcttgtgtg犯犯ctgagcaggt1140
attgcttagtctgcag肌犯t幼tg3Ctt31200
aaeicatgttc3CC3tggg3tg￡ltgtCtgt3函
ttaataaaaattgtgaaagctt肌犯aaaa1320 133权利要求
1. 人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗或预防肿瘤的制剂中的应用。
2. 根据权利要求1所述的人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗或预防肿 瘤制剂中的应用，其特征在于所述诊断、治疗或预防肿瘤的制剂为诊断、治疗 或预防肿瘤复发和转移的制剂。
3. 根据权利要求2所述的人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗或预防肿 瘤制剂中的应用，其特征在于所述诊断、治疗或预防肿瘤复发和转移的制剂为 诊断、治疗或预防肿瘤骨转移的制剂。
4. 根据权利要求1所述的人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗或预防肿 瘤的制剂中的应用，其特征在于所述诊断、治疗或预防肿瘤的制剂为诊断、治 疗或预防干细胞恶性转化的制剂。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗 或预防肿瘤制剂中的应用，其特征在于所述诊断、治疗或预防肿瘤的制剂包括 诊断、治疗或预防前列腺癌、乳腺癌或肺癌的制剂。
6. 根据权利要求5所述的人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗或预防肿 瘤的制剂中的应用，其特征在于所述的人转录共激活因子PC4具有如SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列，或缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的仍具有所 述SEQIDNO:l所示的氨基酸序列活性的氨基酸序列。
7. 根据权利要求5所述的人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗或预防肿 瘤的制剂中的应用，其特征在于编码所述人转录共激活因子PC4的核苷酸序列如 SEQIDNO:2的核苷酸序列所示或其中具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或插 入变异后仍具有所述SEQ ID NO:2编码功能的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及人转录共激活因子PC4在制备诊断、治疗或预防肿瘤的制剂中的应用，具体地，所述诊断、治疗或预防肿瘤的制剂为诊断、治疗或预防肿瘤复发和转移的制剂或诊断、治疗或预防干细胞恶性转化的制剂，本发明所述诊断、治疗或预防肿瘤的制剂包括诊断、治疗或预防前列腺癌、乳腺癌或肺癌的制剂。本发明结果表明人转录共激活因子PC4基因在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种人类肿瘤组织中均高表达，人转录共激活因子PC4基因可用于多种肿瘤的检测标志基因，特别是可作为晚期肿瘤骨转移肿瘤的预警的标志分子。
文档编号A61P35/00GK101377487SQ20081007028
公开日2009年3月4日 申请日期2008年9月11日 优先权日2008年9月11日
发明者冉新泽, 史春梦, 超 张, 毅 彭, 颖 朱, 王少军, 程天民, 粟永萍 申请人:中国人民解放军第三军医大学